NIVEL III AIDIS Activadid Bactericida del KMnO4 en Agua Superficial para el Riego de Campos Agrícolas Por Cristobal Chaidez Quiroz*, Marcela Soto Beltrán, Celida Martínez Rodríguez, Andrés Medrano Félix Resumen de hepatitis A y Norovirus, están presentes en productos frescos (Cifuentes et al., 2000). E. coli O157:H7 ha sido aislada de productos El agua de uso agrícola puede constituir un factor importante de contaminación de frutas y hortalizas, cuando es utilizada para la frescos como manzana, melón, hojas de lechuga y espinacas (Solomon irrigación, lo que hace necesario el control de su calidad microbiológica. et al., 2002; FDA, 2006), su presencia se ha asociado al uso de suelo En México, el 42% del agua de uso agrícola es de fuentes superficiales. y agua de riego contaminada. Se estima que cada año se presenta en Los compuestos elaborados a base de cloro son la alternativa química EUA, 76 millones de enfermos y 5,000 muertes, asociados al consumo más empleada para desinfectar el agua superficial, sin embargo ciertas de alimentos (DeWaal et al., 2000). Recientemente y debido a la desventajas del cloro motivan la búsqueda de nuevas alternativas de consistencia de brotes, existe la percepción que los microorganismos desinfección. La estabilidad en agua turbia y su capacidad oxidante presentes en frutas y hortalizas frescas son la principal causa de hacen del permanganato de potasio una alternativa de desinfección. enfermedades (Beuchat, 1996). Actualmente el KMnO4 se emplea en la desinfección del agua superficial En los últimos años, se ha intensificado la búsqueda de alternativas que permitan reducir o eliminar patógenos sobre la sin sustento científico por lo tanto, el objetivo de la presente superficie de productos frescos. Estudios previos han demostrado investigación fue evaluar la actividad bactericida del KMnO4 contra que los métodos de desinfección solo reducen de manera parcial las Escherichia coli y Bacillus subtilis, usando dos concentraciones de poblaciones microbianas presentes en las desinfectante, tres tiempos de contacto y agua Tabla 1. superficie de los productos (Beuchat, 2001). turbia. Se utilizó la técnica de extensión en placa Características del suelo en estudio No existe un método estándar que y los datos fueron estadísticamente analizados Parámetro Resultado permita evaluar la efectividad de un mediante análisis de varianza. Los resultados pH (25ºC) 7.38 desinfectante sobre productos frescos demostraron la efectividad del KMnO4 contra (Beuchat, 1998). Por el contrario existen ambas bacterias. Se obtuvieron porcentajes de Conductividad eléctrica (ds/m) 0.39 recomendaciones como las descrita por la reducción de 99.9999% y 99.99% para E. coli 2 Materia orgánica 2.07 Agencia de Protección Ambiental de Estados y B. subtillis, respectivamente. Por lo tanto, el 1 Nitrógeno N-NO3 4.0 Unidos (USEPA, siglas en inglés) la cual KMnO 4 puede considerarse como una Fósforo P-PO4 1 38.5 menciona una reducción de al menos 2 Log10 alternativa para la desinfección del agua Sodio 1 117.038 superficial. Palabras clave: Desinfección, de la población bacteriana presente en la superficie de los mismos (USEPA, 1997) Escherichia coli, Bacillus subtilis, KMnO4. Potasio 1 403.534 Bitton (1994) y Gelderich (1996) establecen 1 Calcio 5194 que un agente puede considerarse como un Introducción Magnesio 1 1936.29 desinfectante efectivo si logra reducir un La calidad microbiológica del agua Fierro 1 49.03 99.9999% (6 log 10 ). Mientras tanto el utilizada para irrigar cultivos agrícolas es de Manganeso 1 177.66 vital importancia, ya que esto contribuye a “Método Oficial 960.09 de la AOAC, Acción reducir la presencia de microorganismos de Sanitización Germicida y Detergente de Cinc 1 3.39 patógenos en frutas y hortalizas (FDA, 2001). Desinfectantes” sugiere que la evaluación de Cobre 1 2.27 La principal fuente de contaminación son las sanitizantes para superficies pre-limpiadas, ClC (meq/100g) 43.65 aguas residuales tratadas y no tratadas vertidas no porosas que estén en contacto con Textura Arcillosa en aguas de ríos y canales usadas para riego alimentos, debe reducir un 99.999% de de cultivos agrícolas (Thurston-Enriquez et al., bacterias (5 Log10) (Sapers, 2003). Arcilla 2 46.48 2002; FAO, 2003, Craun y Castro, 1996) y con La eficacia de la desinfección depende Limo 2 27.28 menor frecuencia en el lavado y desinfección del tipo de microorganismo, la temperatura, 2 Arena 26.24 de productos frescos. nivel de pH del agua y tiempo de contacto, Tamaño de partícula 425µm El riesgo de infección aumenta cuando así como la estructura de la superficie de 1 ppm; 2 % patógenos, como Salmonella, Shigella, virus productos frescos (FDA, 1998). volumen 8, número 1 A G U A L A T I N O A M É R I C A El cloro es el desinfectante más utilizado en empaques agrícolas. Su capacidad oxidante elimina rápidamente a los microorganismos, sin embargo la materia orgánica limita su actividad oxidante, lo cual ha motivado la búsqueda de alternativas de desinfección en aguas turbias (Chaidez et al., 2007). El KMnO4, obtenido a partir del dióxido de manganeso (MnO2) es utilizado para control de olor y color, mejora el sabor e inactiva a coliformes, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, poliovirus y bacteriófagos en el tratamiento de agua para consumo (EPA, 1999). El KMnO4 oxida y/o destruye enzimas celulares, siendo el ión MnO4 el responsable de esta acción (EPA, 1999). El KMnO 4 también forma dióxido de manganeso, el cual tiene una capa externa de grupos oxidrilos capaces de fijar, por absorción, partículas neutras o cargadas, incluyendo microorganismos que son fijados al precipitado coloidal para ser inactivados (EPA, 1999). Actualmente el permanganato de potasio se emplea en actividades agrícolas para la desinfección del agua superficial, sin embargo, la información científica que demuestre su eficacia como agente desinfectante y lo respalde para su uso, resulta insuficiente. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad bactericida in vitro del permanganato de potasio en agua superficial de uso agrícola, utilizando como microorganismos indicadores Escherichia coli y Bacillus subtilis. Materiales y Métodos Purificación de la bacteria 6 ), y 0.1mL de cada dilución decimal fue colocada en cajas petri conteniendo agar selectivo mFC (DifcoTM, Maryland, USA) y agar papa dextrosa (Bioxon, México) e incubadas a 37°C durante 24h para E. coli y B. subtilis, respectivamente. Finalmente, la concentración bacteriana se cuantificó en base a las unidades formadoras de colonia observadas en el medio y el resultado fue expresado en Log10 UFC/mL. La concentración inicial de las bacterias fueron 3.4x107UFC/mL y 3.3x10 7 UFC/mL para Escherichia coli y Bacillus subtilis , respectivamente. Preparación del KMnO4 El desinfectante se adquirió de manera comercial (CAS 7722-647). El KMnO4 tiene como ingrediente activo el ión permanganato (MnO4). Las concentraciones utilizadas durante el experimento fueron de 1.5 y 3 mg/L para Escherichia coli y 3 y 4.5 mg/L para Bacillus subtilis. Estas concentraciones fueron determinadas de acuerdo a las empleadas empírica-mente en actividades agrícolas para la desinfección del agua superficial. Dato proporcionado por los técnicos de empaques agrícolas. Preparación de turbidez en el agua Se utilizó una concentración de 170UNT, simulando la materia orgánica presente en agua superficial de uso agrícola, la cual fue ajustada con tierra estéril obtenida de la localidad de Culiacán, Sinaloa (Tabla 1). Para ajustar dicha turbidez se adicionaron 0.85g de tierra estéril en un litro de agua purificada estéril. La muestra se homogenizó y se colocó en una celda para ser leída utilizando un espectro-fotómetro marca HACH modelo DR 2010, de acuerdo a la APHA (1998). Los valores de turbidez se expresaron en unidades nefelométricas (UNT). Se seleccionaron E. coli (ATCC 15597) y B. subtilis, como microorganismos indicadores debido a la incidencia de las mismas en agua de uso agrícola (Cazarez Diarte et al., 2004). E. coli y B. subtilis, fueron obtenidos del laboratorio de Microbiología Ambiental y de Evaluación del KMnO4 Alimentos y del laboratorio de Fitopatología, ambos del Centro de Se utilizó un recipiente de cuatro litros de capacidad, el cual fue Investigación en Alimentación y Desarrollo, Unidad Culiacán llenado con un litro de agua purificada estéril; se adicionaron 0.85g de respectivamente. tierra estéril para ajustar la turbidez a Cada bacteria fue purificada Tabla 2. Porcentaje de reducción de Escherichia coli 170UNT. Una vez ajustada la turbidez empleando la metodología descrita por se inoculó el agua con concentraciones con permanganato de potasio Ukuku y Sapers (2001). Una colonia por de 3.4x107 y 3.3x107UFC/mL de E. coli Permanganato Tiempo de Porcentaje de separado, de cada bacteria, fue y B. subtilis respectivamente, adicionacontacto 2 Turbidez 3 reducción % de potasio 1 inoculada en 5mL de caldo de soya y das en recipientes separados, y se 1 98.83 b tripticaseina (TSB, Difco; Detroit, MI), aplicaron las concentraciones del e incubadas por 24h a 37°C. 1.5 3 99.90 b desinfectante KMnO4, 1.5 y 3mg/L para c Posteriormente se adicionó 1mL del E. coli y 3 y 4.5mg/L para B. subtilis, 6 99.99 170 crecimiento bacteriano en 25mL de todo esto con agitación constante. 1 99.9999 a caldo TSB, y se incubó por 24h a 37ºC. Se procedió a tomar alícuotas 3 3 99.9999 a La suspensión bacteriana fue después de transcurrir 1, 3 y 6h de 6 99.9999 a centrifugada a 13, 080 X g (Beckman, tiempo de contacto, simulando el tiempo J2-MI, USA) durante 10min a 4ºC. El Tabla 3. Porcentaje de reducción de Bacillus subtilis en el que se lleva acabo la desinfección sedimento obtenido se lavó y con permanganato de potasio en el agua superficial de uso agrícola, resuspendió en 25mL de solución buffer dato proporcionado por técnicos del Permanganato Tiempo de Porcentaje de estéril (PBS, 0.1M, pH de 7.2) y se laboratorio de Microbiología Ambiental de potasio 1 contacto 2 Turbidez 3 reducción % centrifugó nuevamente a las mismas y de Alimentos del Centro de Investiga1 98.98 a condiciones. El procedimiento de ción en Alimentación y Desarrollo. La 3 3 99.90 a lavado, se repitió dos veces. La bacteria reducción bacteriana por efecto del 6 99.99 a purificada se mantuvo a 4ºC antes de permanganato de potasio se determinó 170 b ser utilizada. utilizando la técnica de extensión en 1 99.94 La concentración inicial de la placa (APHA, 1998). Se realizaron 4.5 3 99.87 b suspensión bacteriana fue determinada diluciones decimales por triplicado (106 99.94 b 2 utilizando la técnica de extensión en ,10-4 y 10-6), y 0.1mL de cada dilución placa (APHA, 1998), diluciones Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos decimal fue colocada en cajas petri 1 ppm; partes por millón; 2 horas; 3 Unidades Nefelométricas de turbidez decimales por triplicado (10-2,10-4 y 10conteniendo agar selectivo mFC (Difco™, A G U A L A T I N O A M É R I C A volumen 8, número 1 Maryland, USA) y agar papa dextrosa (Bioxon, México) e incubadas a 37°C durante 24h para E. coli y B. subtilis, respectivamente. Finalmente, la concentración bacteriana se cuantificó en base a las unidades formadoras de colonia observadas en el medio y el resultado fue expresado en porcentaje de reducción. Tabla 4. Determinación del perfil fisicoquímico del agua turbia inoculada con Escherichia coli Potencial de hidrogeno 25°C Determinación del perfil fisicoquímico del agua 1.5 3 6.02 6.02 El diseño estadístico empleado fue de bloques con dos factores totalmente al azar. Los factores fueron las concentraciones y el tiempo de contacto, y los microorganismos fueron bloqueados. Al realizar los análisis de varianza y encontrar diferencias significativas, se aplicó la prueba de comparación de medias de Tukey con un a=0.05. Los resultados se expresaron en porcentajes de reducción. El paquete estadístico empleado fue Stata versión 8 (2003). Resultados y disusción Escherichia coli El análisis de varianza mostró que la concentración del desinfectante fue significativo (P=0.036) en la reducción de Escherichia coli , mientras que el tiempo de contacto no mostró diferencias significativas. El mejor tratamiento se obtuvo al utilizar la concentración de 3mg/L donde se logró un porcentaje de reducción de 99.9999 (6 log10) para cada tiempo de contacto analizado (Tabla 2). Los resultados concuerdan con los criterios de reducción bacteriana descritos por Bitton (1994) y Geldreich (1996), quienes establecen que un agente químico es efectivo si logra una reducción de 99.9999% (6 log10). El menor porcentaje de reducción obtenido fue de 98.83%, el cual se obtuvo al utilizar 1.5mg/L y 1h de tiempo de contacto, con un nivel de significancia de P=0.05, seguido de 1.5mg/L y 3h de tiempo de contacto (99.90%) y 1.5mg/L y 6h de tiempo de contacto (99.99%). Chaidez et al., (2003), observaron que los desinfectantes reducen su efectividad cuando se utilizan a bajas concentraciones y en presencia de materia orgánica. Wei et al., (1995) y Karch y Loftis (1998), han demostrado que la presencia de turbidez en el agua permite que los microorganismos puedan adherirse a partículas del suelo y protegerse del desinfectante. La EPA (1999), menciona que la presencia de materia orgánica reduce la efectividad del permanganato de potasio debido a que este puede ser consumido al oxidar la materia orgánica e inorgánica presente en el agua. Un estudio realizado en 1976 en el Distrito Sur de Las Vegas Nevada del lago Mead mostró que al utilizar bajas dosis de permanganato (1, 2, 3, 4 y 5mg/L) era necesario tiempos de contacto prolongados (30min), para reducir la presencia de coliformes, mientras que solo fue necesario 10min de tiempo de contacto cuando se emplearon 6mg/L (EPA, 1999). Al comparar la concentración y tiempo de contacto, el tratamiento de 3mg/L a 1, 3, 6h logró una reducción de 99.9999% con un nivel de significancia de P=0.05, demostrando que el porcentaje de reducción bacteriana es dependiente de la concentración del desinfectante y no necesariamente del tiempo de contacto. Se requieren altas concentraciones de permanganato para lograr una reducción total de la bacteria en estudio, como lo muestra la EPA (1999), donde fue necesario dosis de 2.5mg/L para obtener una reducción total de coliformes, así mismo fueron necesarias dosis de 20mg/L con tiempo de contacto de 24h para reducir Vibrio cholerae, Salmonella typhi y 2 T1 3 T2 4 T3 5 6.02 6.13 6.24 6.05 6.24 6.23 Tabla 5. Determinación del perfil fisicoquímico del agua turbia inoculada con Bacillus subtilis Potencial de hidrogeno 25°C Análisis de datos A G U A Blanco pH La medición del potencial de hidrógeno (pH), se realizó utilizando un potenciómetro portátil marca Oakton wppH y un electrodo HgTaylor 21433. La temperatura se verificó a 25ºC mediante un termómetro de vidrio previamente calibrado. volumen 8, número 1 Concentración KMnO41 Concentración KMnO41 Blanco 3 4.5 6.02 6.02 pH 2 T1 3 T2 4 T3 5 5.83 5.97 6.15 6.30 6.09 6.11 1 Concentración de KMnO4 expresado en partes por millón (ppm): Blanco: Muestra de agua con 170 UNT inoculada con bacteria, sin aplicación de KMnO4; 3 T1 1 hora de tiempo de contacto; 4 T2 3 horas de tiempo de contacto; 5 T3 6 horas de tiempo de contacto 2 Shigella flexneri . Por lo tanto, el permanganato de potasio a concentraciones de 3mg/L y 1, 3 y 6h de tiempo de contacto, puede ser utilizado como bactericida en agua superficial de uso agrícola, ya que puede alcanzar una reducción del 99.9999% (6 log10). Bacillus subtilis Los resultados obtenidos en la evaluación de KMnO4 contra B. subtilis no mostraron diferencias significativas con el factor tiempo; sin embargo, el análisis de varianza mostró diferencias significativas con el factor concentración P=0.05 (Tabla 3). La concentración de 3mg/ L de KMnO4 resultó ser la más efectiva, alcanzando un porcentaje de reducción de 99.99% (4 log10). Mientras que la concentración de 4.5mg/ L de KMnO4 logró reducir un 99.9% de bacteria, equivalente a 3 logaritmos de reducción. De acuerdo a la EPA (1999), la actividad bactericida del permanganato de potasio se ve favorecida en condiciones ácidas (pH 5.9) a 20ºC. Los resultados obtenidos muestran que la efectividad del KMnO4 se vio reducida al utilizar concentraciones de 4.5mg/L, debido a que el agua inoculada con B. subtilis a esta misma concentración y una temperatura de 25°C, alcanzó un pH que osciló entre 5.97 y 6.11, condiciones menos ácidas a las observadas al utilizar 3mg/L de KMnO4, donde el pH osciló entre 5.89 y 6.09 a la misma temperatura (Tabla 4 y 5). Cuando se comparó el porcentaje de reducción de E. coli y B. subtilis, a la concentración de 3mg/L, se observó una reducción del 99.9999% de Escherichia coli y un 99.99% para B. subtilis, demostrando que Bacillus presenta una mayor resistencia a los procesos de desinfección. Conclusiones La concentración de 3mg/L de KMnO4 resultó ser efectiva para E. coli y B. subtilis, lográndose un porcentaje de reducción de 99.9999% y 99.99%, respectivamente. Concentraciones de 1.5mg/L no fueron suficientes para reducir Escherichia coli, al no alcanzar más de 3 logaritmos de reducción bacteriana, sin embargo, de acuerdo a las recomendaciones descrita por la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos, una reducción de al menos 2 Log10 de la población de bacteriana, son suficientes para considerarse buen desinfectante. La efectividad del desinfectante contra B. subtilis se vio limitada al utilizar concentraciones de 4.5mg/L de KMnO4, debido al pH final del agua L A T I N O A M É R I C A empleada durante la inoculación. Por lo tanto, se concluye que el KMnO4 puede considerarse como una alternativa en los procesos de desinfección del agua superficial de uso agrícola, siempre y cuando se tomen en cuenta consideraciones como el pH de la solución, el cual debe oscilar entre 5.9 o menor, para tener mayor concentración del ión MnO 4 , el cual oxida y destruye las enzimas celulares de los microorganismos, así mismo son necesarias temperaturas de 25ºC para que la efectividad del permanganato de potasio se vea favorecida. Finalmente, es importante hacer hincapié en la necesidad de generar información científica sobre la acción del permanganato de potasio contra otros grupos microbianos (bacteriófagos, virus entéricos, quistes de protozoarios y bacterias patógenas) que generalmente se encuentran presentes en aguas superficiales. Esta información permitirá darle un uso más amplio al permanganato de potasio como agente desinfectante. Agradecimientos Los autores agradecen al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, Unidad Culiacán, por las facilidades otorgadas en la realización del presente trabajo de investigación. 12. Environmental Protection Agency (1997). A Set of Scientific Issues Being Considered by the Agency in Connection with the Efficacy Testing Issues Concerning Public Health Antimicrobial Pesticides. Scientific Advisory Panel September 1997 Meeting Final Report. EPA Office of Science Coordination and Policy, Washington, D.C. Sitio web: http://www.epa.gov/scipoly/sap/ 1997september/finalsep.htm#3. Acceso: Marzo 20, 2007. 13. Environmental Protection Agency (1999) Guidance, Manual Alternative Disinfectants and Oxidants. Chapter 5 Potassium Permanganate, p. 5-12. 14. Food and Drug Administration (1998) Center for Food Safety and Applied Nutrition. Guide to Minimize Microbial Food Safety Hazards for Fresh Fruits and Vegetable. http://www.foodsafety.gov/~dms/prodguid.html. 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