Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS MICROBIOLOGÍA GENERAL TECNICATURA UNIVERSITARIA EN LABORATORIOS BIOLÓGICOS GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS Profesor Responsable: Dra. Lucía Alcaraz Profesor Co-Responsable: Dra. Alba Edith Vega Jefes de Trabajos Prácticos Dr. Hugo Centorbi Dr. Javier Elicabe Dra. Ma. Cecilia Villa Lic. Daniela Echenique Técnicos Daniel Molina Ma. Inés Videla Marcelo Villegas ÁREA MICROBIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE QUÍMICA, BIOQUÍMICA Y FARMACIA UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS Año: /2015 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRACTICO Nº1 Parte A: BIOSEGURIDAD Objetivos: 1. Conocer los riesgos potenciales de trabajar en el laboratorio y la forma de evitarlos o minimizarlos. 2. Promover actitudes responsables y seguras de las personas que operan en el laboratorio de Microbiología. La seguridad en el laboratorio de Microbiología. El riesgo y los niveles de Bioseguridad Las personas que trabajan en un laboratorio están expuestas a una gran serie de riesgos potencialmente graves. Comúnmente están en contacto con sustancias y vapores tóxicos y explosivos, carcinógenos, sustancias cáusticas, altos voltajes, radiaciones, etc. En un laboratorio de Microbiología hay que agregar otro riesgo: la infección. La infección difiere de la mayoría de los otros riesgos en que los efectos no están limitados a quien trabaja individualmente ni a sus compañeros de trabajo, sino que la infección también, puede transmitirse fuera del laboratorio a partir de su persona a remotas situaciones o individuos, ya sea en forma primaria o secundaria (su familia, contactos humanos casuales, animales domésticos o de experimentación, etc.). No debe olvidarse que pueden diseminarse agentes no patógenos para los seres humanos, pero capaces de contaminar medios de cultivo, reactivos o afectar la vida de las plantas. El Riesgo Biológico es aquel susceptible de ser producido por una exposición no controlada a agentes biológicos. Se entiende por agente biológico a microorganismos, incluidos los modificados genéticamente, los cultivos celulares y los endoparásitos humanos, que pueden provocar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad. Existe un símbolo internacional que representa el Riesgo Biológico (Figura 1). Este símbolo y signo internacional de peligro biológico debe colocarse en las puertas de los locales donde se manipulen agentes biológicos del grupo de riesgo 2 o superior (Cuadro 1) Figura 1: Símbolo Internacional de Riesgo Biológico Área Microbiología 2 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Es necesario entonces tener claridad sobre las diferentes situaciones de riesgo, así como sobre los niveles de Bioseguridad que permitan proteger internamente y externamente al ser humano. Finalmente, la asignación de un nivel de Bioseguridad (Tabla 1) deberá tener en consideración el agente biológico utilizado, las instalaciones disponibles y el equipo; y las prácticas y los procedimientos necesarios para trabajar con seguridad en el laboratorio. Vías de infección Las vías de infección en el laboratorio pueden ser: Tracto digestivo: ingestión o transferencia de microorganismos desde dedos contaminados. Mucosas: nasal, conjuntiva. Aerosoles, salpicaduras y manos contaminadas. Piel-vía percutánea: inyección, cortes o escoriaciones. Respiratoria: es la más importante. El 80% de las infecciones contraídas en el laboratorio son de origen aéreo por inhalación de aerosoles. Los aerosoles pueden generarse por dos mecanismos: Atomización de suspensiones líquidas Molido muy fino de material sólido infectado. Muchas técnicas de laboratorio producen distintos aerosoles mediante burbujeo, salpicadura, espuma, quemado del ansa y dos mecanismos adicionales: vibración de alta frecuencia y fuerza centrífuga. Los aerosoles también se producen cuando se manipulan cultivos secos, liofilizados o secados con acetona (ej. cuando se destapan tubos o ampollas). Los agentes biológicos se clasifican en cuatro grupos dependiendo de su nivel de riesgo de infección. Cuadro 1. Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo) Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales. Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo) Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces el riesgo de propagación es limitado. Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo) Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado) Área Microbiología 3 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Tabla 1. Requerimientos recomendados para niveles de bioseguridad Nivel de bioseguridad Prácticas y técnicas Equipamiento de seguridad 1 Prácticas microbiológicas estándares Ninguno 2 Ídem 1 más ropa de laboratorio, Gabinetes de seguridad Clase I descontaminación de deshechos, ó II para disminuir alto riesgo acceso limitado, guantes protectores y de exposición a aerosol. señales de peligro biológico. 3 Ídem 2 más ropa de laboratorio especial y acceso controlado Gabinetes de bioseguridad 4 Ídem 3 mas cambio de ropa antes de entrar y salir de la sala. Todos los deshechos son descontaminados Gabinete de seguridad Clase III mas traje presurizado para protección total. Prácticas microbiológicas estándares El elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas estándar. Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Gabinetes de seguridad biológica Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (GSB) destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales biológicos peligrosos. El GSB es el dispositivo principal utilizado para proporcionar contención de salpicaduras o aerosoles infecciosos generados por diversos procedimientos microbiológicos. Existen 3 clases de GSB (Clase I, II, III) utilizados en laboratorios microbiológicos. Los GSB Clase I y Clase II de frente abierto son barreras primarias que ofrecen niveles significativos de protección del personal de laboratorio y del medio ambiente cuando se los utiliza en combinación con buenas técnicas microbiológicas. El GSB Clase II también brinda protección contra la contaminación externa de los materiales que se manipulan dentro del gabinete. El GSB Clase III ofrece el mayor nivel de protección posible para el personal y el medio ambiente. Área Microbiología 4 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Reglas generales a tener en cuenta en el laboratorio Reportar los accidentes, no importa lo insignificante que puedan parecer. Debe reportar toda enfermedad o lastimadura tan rápido como sea posible. La perdida de tiempo en la identificación de una infección de laboratorio puede tener graves consecuencias. Tratar a todos los microorganismos como patógenos potenciales o contaminantes para los cultivos vecinos. Rotular todo el material infectivo para prevenir confusiones. Los números en código no son adecuados. Usar ropa para protegerse y elementos de seguridad (ej. guantes, máscaras, etc.). Manejar los materiales cuyo potencial patógeno se desconoce (ej. esputo, suero, materia fecal, microorganismos no identificados) como si fueran infectivos, ya que probablemente lo son. El laboratorio debe permanecer siempre limpio. La mesada debe estar libre de todo material que no sea esencial. La superficie debe limpiarse antes y después de cada sesión de laboratorio con una solución germicida. Todo el material contaminado, cultivos, pipetas, tapones, etc., deberá ser esterilizado antes de ser lavado. Antes de dejar el laboratorio, sacarse el guardapolvo, lavarse cuidadosamente las manos con agua y jabón y desinfectarlas. Tener un desinfectante listo para ser usado en suficiente volumen para llevar a cabo una descontaminación de emergencia en el caso de salpicaduras. Asegurarse que el desinfectante sea activo contra el organismo que está siendo manejado. Nunca comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio, o pipetear con la boca. Siempre recordar que las manos o guantes pueden estar contaminados y ser capaces de transferir la infección al cuerpo. Nunca llevar a cabo una acción apresuradamente, en particular aquellas que pueden producir burbujeo, salpicaduras, volcaduras o contaminar superficies que es necesario mantener limpias (ej. las tapas de las botellas). Bibliografía recomendada: Ferrari SG, Mattana CM, Di Genaro, MS y Favier, GI. “Manual de Seguridad en el Laboratorio de Microbiología”, Nueva Editorial Universitaria, UNSL (2011) http://www.ua.es/va/centros/facu.ciencies/seguridad/seguridad/hab_seg_lab_biol.htm Fuente: Universidad de Alicante, Organización Mundial de la Salud (OMS) Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 3° Edición. Ginebra. 2005. Área Microbiología 5 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRACTICO Nº1 Parte B: ESTERILIZACIÓN Objetivos: 1. Adquirir criterios y destreza en la preparación del material a esterilizar por calor húmedo. 2. Conocer el funcionamiento y manejo del autoclave. 3. Conocer el funcionamiento y manejo de estufas de esterilización. 4. Conocer el funcionamiento y manejo del equipo de filtración. 5. Conocer el funcionamiento y manejo de gabinete de seguridad biológica. La esterilización se aplica en la práctica médico-quirúrgica diaria de las enfermedades trasmisibles, en el trabajo de laboratorio de microbiología e incluso en la higiene y el saneamiento diario de locales, personas, alimentos, etc. Es una etapa esencial en el procesamiento de cualquier producto destinado a la administración parenteral, o que entre en contacto con pieles dañadas, superficies mucosas u órganos internos donde exista posibilidad de infección. Además, se realiza esterilización de vestimentas y otros materiales contaminados para minimizar el riesgo de infección asociado a estos artículos. El objetivo de un proceso de esterilización es destruir todos los microorganismos que existan en un objeto o preparado, o sobre él y asegurar que permanezca libre de riesgos infecciosos. En los últimos años ha aumentado la variedad y cantidad de materiales que se requieren en la asistencia de la salud, industria farmacéutica y alimenticia, las técnicas de esterilización han adquirido importancia creciente. Términos relacionados con el tema: Esterilización: Es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de vida microbianas contenidos en un objeto o sustancia, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes, hongos y sus esporas, y virus. Se entiende por muerte, la pérdida irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo. Desinfección: En este proceso, que se aplica únicamente a objetos inanimados, se eliminan los agentes patógenos reconocidos, pero no necesariamente todas las formas de vida microbianas. Asepsia: (a: sin, sepsis: infección) conjunto de medidas destinadas a impedir toda contaminación microbiana. Antisepsia: (anti: contra, sepsis: infección) es el proceso que por su baja toxicidad, se utiliza para la destrucción de microorganismos presentes sobre la superficie cutáneo-mucosa. Este término Área Microbiología 6 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos tampoco implica la destrucción de todas las formas de vida. Existen agentes como los alcoholes que son antisépticos y desinfectantes a la vez. METODOS DE ESTERILIZACION A- Esterilización por agentes físicos: 1. Esterilización por calor 2. Esterilización por filtración: fluidos líquidos y gaseosos 3. Esterilización por radiación B- Esterilización por agentes químicos: Oxido de etileno, glutaraldehído A.1. Esterilización por calor Llama directa: al rojo, flameado Calor seco Aire caliente (estufa): 160-180ºC (1,5h o 1h respectivamente) Autoclave a presión: 121ºC durante 15-20 minutos Calor húmedo Tyndalización: Baño María a ebullición fraccionado Fundamento: El calor húmedo produce la muerte celular por coagulación de las proteínas y enzimas celulares, mientras que el calor seco destruye principalmente por complejos procesos de oxidación. A.2. Esterilización por filtración Fluidos líquidos: Se aplica a aquellas sustancias que se alteran por contacto con el agua ó por acción del calor. Membranas Filtrantes: Filtros standard, filtros especiales, ultrafiltros. Bujías filtrantes: Bujía de Chamberland, filtro de yeso, filtro de vidrio poroso, filtro de Seitz, etc Fluidos gaseosos: Se aplica en la industria farmaceutica, en cirugía, etc. para disminuir al mínimo la probabilidad de contaminación del aire. La mayoría de los contaminantes ambientales son partículas submicroscopicas que se mantienen en el aire un lapso de tiempo y según su tamaño pueden recorrer largas distancias. Estas áreas reducen al mínimo la probabilidad de contaminación. Eisten 2 tipos de áreas estériles 1- Area esteril convencional Son empleadas en la práctica de la medicina y de la industria farmacéutica. Consisten en recintos cerrados, levemente presurizados, provistos de aire filtrado, donde por medios físicos (como lámparas UV, calor) o químicos, se esterilizan las superficies, elementos de trabajo y el aire. En el local se introduce un gran caudal de aire acondicionado y filtrado por filtros absolutos a través de Área Microbiología 7 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos conductos y grillas difusoras, colocadas en paredes y cielorrasos y se extrae a través de rejillas colocadas a pocos centímetros del piso, de modo que existan zonas de movimiento turbulento de aire y zonas donde permanece quieto.La contaminación se reduce mucho, aunque no puede bajarse de 120.000 partículas / pie3 (Figura 1) Estas áreas presentan los siguientes inconvenientes: Por distribuirse el aire en forma turbulenta, las partículas dispersan en todas direcciones y se depositan sobre la superficie del área, debiéndose limpiar manualmente. La contaminación generada dentro del local no puede eliminarse, por lo que la contaminación aumentará con el tiempo, debiéndose interrumpir el trabajo para efectuar la limpieza. Deben extremarse los controles sobre el personal y equipo que se introducirá en el área, ya que no se podrá evitar la contaminación dentro del local. Para evitar las contaminaciones las paredes se pintarán con pintura epoxi y se utilizarán equipos de acero inoxidable, deben evitarse rendijas y recobecos, se mantendrá una presión positiva respecto a los cuartos contiguos para evitar la entrada del aire no filtrado. La necesidad de estas áreas surgió como consecuencia del auge de la industria aeroespacial y de la mecánica de precisión, lo que trajo aparejado la necesidad de ambientes desprovistos de partículas que afecten el funcionamiento de microrrodamientos, semiconductores, circuitos integrados, etc. Debido a que las áreas estériles convencionales no aportan suficiente seguridad, ya que el máximo permitido es de 100.000 partículas /pie3, aparecieron las áreas estériles de flujo laminar que tuvieron luego su aplicación en medicina y en la industria farmacéutica. Fig.1. Área estéril convencional 2- Areas de flujo laminar Las principales fuentes de contaminación son el aire exterior y elementos localizados en el área. Se trata de solucionar ambos problemas, el primero mediante el uso de filtros absolutos y el segundo mediante un mecanismo que sirviera como autolimpiante del área (contaminación interior). Área Microbiología 8 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Para ello se construyen laboratorios cuyo cielo raso está formado por filtros HEPA (filtro de alta eficiencia para la filtración de partículas) que tiene una eficacia del 99.97% para partículas de 0.3 m de diámetro y el piso formado íntegramente por una rejilla metálica suspendida. El aire se hace fluir uniformemente y a una velocidad mayor que las convencionales a través de toda el área y hacia fuera de la misma a través del piso. Los resultados que se obtienen son notables, dieron menos de 100 partículas/pie3 (Figura 2 y 3). Las ventajas que presenta el flujo laminar frente a las demás áreas convencionales son: Provee aire limpio sin turbulencia Tiene capacidad autolimpiante El flujo vertical elimina las contaminaciones cruzadas Reduce los cuidados a que se debe someter el personal Tiene menores costos de operación en cuanto a trabajos accesorios Área Microbiología 9 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Se deben realizar los controles para determinar la eficacia de la esterilización: Para la detección de microorganismos: en placas de petri abiertas en distintas zonas del área. Para la detección de partículas: se realiza por distintos métodos: gravedad o peso, mancha o conteo de partículas. El ejemplo más claro de flujo laminar horizontal son las cabinas de flujo laminar que permiten trabajar y realizar operaciones críticas, aunque éstas presentan mayores desventajas que las habitaciones de flujo laminar, sobre todo en lo referente a los riesgos de contaminación. A.3. Esterilización por radiación Luz ultravioleta Radiaciones Gamma Radiaciones ionizantes B- Esterilización por agentes químicos: Oxido de etileno, glutaraldehído Líquidos: glutaraldehído Gaseosos : Oxido de Etileno IMPORTANTE: La eficacia de un proceso de esterilización depende de la elección apropiada del método de esterilización. En todos los artículos a ser esterilizados existe un riesgo potencial de daño del producto. Por lo tanto, es necesario alcanzar un balance entre el riesgo máximo aceptable de falla en el proceso de esterilización y el nivel máximo aceptable de daño en el producto. PARTE PRÁCTICA Preparación del material de vidrio para esterilizar en autoclave: Todos los materiales deben estar perfectamente limpios y secos. Pipetas: Se introduce un trozo pequeño de algodón en la boca de la pipeta, se envuelve en papel y se indica su capacidad con una flecha en la boca de la misma. O bien se pueden utilizar tambores metálicos para su esterilización Tubos de ensayo, centrífuga, etc: Se coloca un tapón de algodón en la boca del tubo, se empaquetan en grupos de 4-6 y se rotula. Erlenmeyers, probetas y frascos en general: Se coloca un tapón de algodón, se recubre con papel y se ata. Si la boca del recipiente es muy ancha se tapa solo con papel doble y se ata. Placas de Petri: Se envuelven individualmente en papel o se colocan en recipientes metálicos adecuados, diseñados para contener 10 o más placas. Jeringas: Se separan sus partes y se envuelven en papel. Bibliografía recomendada: A.D. Russell, W.B. Hugo & G.A. J. Ayliffe. “Principles and practice of disinfection, Preservation and Sterilization” Ed Blackwell Science (1999) Área Microbiología 10 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRACTICO Nº2 MEDIOS DE CULTIVO Objetivos: 1) Preparar distintos medios de cultivos microbiológicos. 2) Acondicionar los medios de cultivo para su esterilización 3) Conocer diferentes formas de envasado Cada microorganismo debe contar en su medio ambiente con todas las sustancias químicas necesarias para generar energía y más material celular, y las condiciones físicas o ambientales óptimas para crecer: pH adecuado, temperatura óptima y presencia o ausencia de O2. Fuera de su hábitat, los microorganismos pueden crecer en medios artificiales. Definición: Los medios de cultivo son ambientes nutritivos, naturales ó artificiales, que pueden ser líquidos, sólidos o semisólidos, que le proveen al microorganismo todos los requerimientos necesarios para su crecimiento y multiplicación y que se debe aproximar lo más posible a su hábitat natural o nicho ecológico Las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo se denominan frecuentemente “cultivos” y pueden ser: - puros o axénicos, cuando la población está constituida por una única clase de microorganismos. - mixtos, cuando la población está constituida por más de una clase de microorganismos. En la actualidad, la mayoría de los gérmenes patógenos se pueden cultivar fuera de su hábitat natural. Existe gran diversidad de condiciones químicas y físicas en las cuales puede ocurrir el crecimiento microbiano, pero siempre se requieren una fuente de energía y una fuente de carbono. COMPOSICION QUIMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Al preparar un medio de cultivo, es necesario conocer en qué categoría está incluido el microorganismo a cultivar para elegir acertadamente los componentes del medio: generalmente compuestos inorgánicos para microorganismos fototrofos y quimiolitotrofos, y orgánicos para quimioorganotrofos. Un medio de cultivo está integrado por: 1. Elementos energéticos y constitutivos: A) Macroelementos (se agregan al medio de cultivo en g/l): Fuente de carbono: pueden ser: CO2 para autotrofos, ó azúcares para heterotrofos. Área Microbiología 11 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Los azúcares se consideran fuente de carbono y energía por excelencia en los quimioorganotrofos. Los más comunes son: glucosa y otras hexosas: fructosa y galactosa; pentosas: arabinosa, xilosa, ramnosa; disacáridos: lactosa, sacarosa, maltosa; trisacáridos: rafinosa; polisacáridos: almidón, glucógeno; alcoholes: glicerol, sorbitol, manitol; glucósidos. Otros compuestos carbonados orgánicos para heterotrofos: aminoácidos, ácidos grasos, ácidos orgánicos, compuestos aromáticos. Fuente de nitrógeno: muchos organismos son autotrofos respecto de la fuente de nitrógeno y pueden crecer utilizando moléculas sencillas como NO3-, NH3 ó N2. El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared. Otros microorganismos pueden incorporar nitrógeno en forma de aminoácidos, bases púricas o pirimídicas. Fuente de fósforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio que también confieren poder buffer al medio de cultivo (pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de cultivo, el aporte de P es realizado por los glicerofosfolípidos de la yema. El fósforo se incorpora a ácidos nucleicos, fosfolípidos, polímeros de membrana, ATP, y sustancias de reserva (gránulos de volutina) dentro de la célula. Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, tiosulfato o sulfuro. En la célula se incorpora a aminoácidos (cisteína y metionina) y diferentes coenzimas. Fuente de calcio, magnesio y potasio: estos cationes se adicionan como sales inorgánicas. Estabilizan macromoléculas aniónicas y actúan como cofactores de enzimas. Mg2+ es estabilizador de ribosomas, membranas celulares y ácidos nucleicos y puede integrarse a clorofila en organismos fotosintéticos. Ca2+ estabiliza la pared bacteriana y abunda en las esporas como dipicolinato de calcio. Fuente de sodio: sodio contribuiría a equilibrar la presión osmótica del medio extracelular. Es un catión requerido por bacterias halofílicas. Se suele suministrar como NaCl. Fuente de Fe: se aporta como FeSO4 o FeCl3. Forma parte de citocromos, catalasa, proteínas Fe/S y flavoproteínas implicadas en la función respiratoria. B) Microelementos o trazas (se agregan al medio de cultivo en mg ó ug/ml) Son metales que se requieren en muy pequeñas cantidades. Participan en la estructura de las enzimas. Son contaminantes de los macroelementos y se incorporan junto a ellos en los medios de cultivo. Pueden ser: Frecuentemente esenciales: Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor que 10-4 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos. C) Factores de crecimiento Área Microbiología 12 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas concentraciones y que no pueden ser sintetizados por la célula. Por esta razón, deben ser agregados al medio de cultivo. Ejemplos de factores de crecimiento : vitaminas, algunos aminoácidos, purinas y pirimidinas 2. Agua El agua representa el 80-90% del peso total de una célula y es fundamental para la realización de todos los procesos metabólicos, funciones enzimáticas, solvatación de materiales orgánicos e inorgánicos, y donación de electrones para organismos fotosintéticos. Los medios de cultivo se preparan en el laboratorio con agua destilada lo que estandariza su composición y asegura la ausencia de iones como Ca2+ y Mg2+ que pueden precipitar con fosfatos o generar reacciones indeseables. 3. Agentes solidificantes : Su agregado al medio de cultivo es opcional. El más usado: - el agar, es un polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato cada 10 a 50 restos. Se usa sin problemas en medios de cultivo complejos para quimioorganotrofos. Se agrega al: - 1,5-2% consistencia sólida normal, - 0,2-0,3% medios semisólidos o blandos, - 5% consistencia muy firme para detener el crecimiento de gérmenes muy móviles - 0% cuando se preparan medios líquidos (caldos). - Sus características: Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C. A 45-55°C se pueden agregar suspensiones de células sin afectar la viabilidad (supervivencia) de las mismas. Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la mayoría de las bacterias patógenas del hombre. No es tóxico para las bacterias, ni es degradado por éstas. Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos derivadas de una única célula). Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias. Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para permitir la difusión de los nutrientes del medio de cultivo en todas direcciones, y suficientemente cerrada –según la concentración empleada- para impedir la movilidad de los microorganismos. Otros solidificantes: - Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa intensamente para fines específicos en Inmunología y Biología Molecular. - Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se prefiere para el cultivo de autotrofos, donde debe excluirse materia orgánica del medio de cultivo. Área Microbiología 13 2014 Microbiología General - - Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Gelatina: es una proteína obtenida por hidrólisis del colágeno. Fue el primer solidificante usado en Microbiología, pero es degradado por la mayoría de las bacterias (lo comen, por lo que el medio inicialmente sólido termina convertido en medio líquido) y la temperatura de incubación no puede ser mayor a 22°C (es el punto de fusión) con lo que cultivos sólidos a temperaturas más altas resultan inviables. Albúmina de huevo, suero: a 80°C estas proteínas coagulan y solidifican el medio de cultivo. Se han usado en el medio de Lowestein-Jensen para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Condiciones fisicas de un medio de cultivo Aún cuando las condiciones químicas del medio de cultivo estén cubiertas, el crecimiento y desarrollo de los microorganismos no tendrá lugar si se desconocen las siguientes condiciones físicas: - temperatura: cada especie tiene su temperatura óptima de crecimiento. * mesófilos: 35-37°C * psicrófilos: 15-20°C * termófilos: 50-60°C -presión osmótica: la mayoría de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl. Las halófilas requieren concentraciones superiores. -presencia de oxígeno: según sus requerimientos de O2 las bacterias se clasifican en: *aerobios estrictas: requieren oxígeno para crecer. Metabolismo respiratorio. *microaerófilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una atm enriquecida en CO2. Pueden realizar respiración aerobia. *anaerobios obligados: el O2 les resulta tóxico. Crecen en medios muy reducidos (sin O2). Metabolismo fermentativo. *anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2 (metabolismo fermentativo) y cuando son expuestos al O2 no mueren. *anaerobios facultativos: pueden crecer tanto en condiciones aerobias (metabolismo respiratorio) o en condiciones anaerobias (metabolismo fermentativo). -humedad: todas las bacterias necesitan un ambiente mucho más húmedo para su desarrollo que los hongos. En condiciones ambientales adversas, algunas especies producen estructuras de resistencia a la desecación llamadas esporas que permanecen viables durante tiempo prolongado hasta que el ambiente sea propicio para la germinación. Producen esporas los géneros Clostridium (ej. C. tetani,, C. botulinum), Bacillus (ej. B. cereus, B. subtilis), Sporosarcina, entre otros. - luz: es importante para los microorganismos fotosintéticos. -pH: la mayoría de las bacterias crece en medio neutro o levemente alcalino (7 – 7.6). Existen excepciones: son los lactobacilos (pH 5, acidófilos), Vibrio cholerae (pH 8.6). Los hongos crecen a pH menor que 7. Área Microbiología 14 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Clasificacion de los medios de cultivo a) Por su origen: - químicamente definidos o sintéticos: su constitución química se conoce con exactitud. -naturales o complejos: su composición química exacta es desconocida. Se preparan a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal de composición química no rigurosamente constante: leche, suero, macerado de maíz, peptonas, extractos de carne, levadura. Son aptos para el cultivo de quimioorganotrofos. En estos medios, el aporte de nitrógeno puede ser realizado por las peptonas, que son productos de la hidrólisis ácida o enzimática de proteínas de origen animal o vegetal (ej. peptona de carne, peptona de soja, peptona de caseína). En los medios naturales o complejos, también se utilizan: -Extracto de carne: su función es ser complemento vitamínico de las peptonas. Pero también aporta: - sustancias nitrogenadas como: aminoácidos, bases púricas y pirimídicas, ácidos orgánicos, creatina, xantina, hipoxantina, ácido úrico, urea, - sustancias no nitrogenadas como glucógeno, fosfatos de hexosas, ácido láctico, sales inorgánicas. -Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de las células de levadura. Su función es ser suplemento vitamínico de las peptonas, pero también aporta mezclas de aminoácidos y péptidos, y carbohidratos. -Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de levadura ya que posee adecuado contenido de vitaminas, carbohidratos y aminoácidos. Es el extracto soluble en agua de la malta de cebada. b) Por su consistencia, los medios de cultivo pueden ser (esto depende de la inclusión o no de un agente solidificante). -líquidos (no permiten el aislamiento de colonias) Ej.: caldo nutritivo: -sólidos (permiten el aislamiento y observación de colonias) Ej.: agar nutritivo c) Por su composición: - comunes: incluyen una fórmula nutritiva básica que permite el crecimiento de microorganismos poco exigentes. Ej.: agar nutritivo -enriquecidos: mejoran su calidad nutritiva por el agregado de componentes muy ricos como leche, sangre, huevo, líquido ascítico, extracto proteico de cianobacterias. Se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes. Ej.: agar sangre d) Por su función: - Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que sembrados con poblaciones mixtas de microorganismos, favorecen la multiplicación de ciertos grupos e inhiben el desarrollo de las especies restantes. Área Microbiología 15 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Para funcionar de esta manera incluyen compuestos químicos específicos o requieren condiciones físicas especiales (temperatura, pH, atm). -Medios selectivos: son medios sólidos que de manera parecida a los anteriores, permiten el desarrollo de ciertos microorganismos e impiden el desarrollo de otros. La selectividad se logra alterando las condiciones físicas del medio de cultivo o agregando compuestos químicos inhibidores. Por ejemplo cambiando pH, altas concentraciones osmóticas, agregando antisépticos o agregando antibióticos. -Medios diferenciales: permiten discriminar entre diferentes tipos de bacterias basándose en características metabólicas particulares de cada uno. Por ej.: -Medios de transporte: se usan cuando transcurre cierto tiempo entre la toma de muestra y su procesamiento. Incluye compuestos que aseguran la supervivencia de las células hasta que sean sembradas en un medio de cultivo adecuado. Ej. medio de Stuart. Desde se comenzó con la desecación de medios de cultivo con la finalidad de conservarlos. Diversos laboratorios se dedicaron a la preparación industrial de estos medios, es así que actualmente existe un número considerable de medios, frecuentemente complejos al estado desecado. El empleo de estos medios es muy simple. Es suficiente con pesar una cantidad determinada de polvo, disolverlo (primero en frío y luego en caliente) en la cantidad especificada de agua destilada: el medio está listo para repartirlo en tubos, que después de ser tapados se esterilizan por los métodos habituales. La composición exacta del medio, los pesos a usar por volumen, están indicados en cada frasco. Estos medios deshidratados son muy higroscópico, por consiguiente, los frascos que contienen los polvos deben ser conservados cuidadosamente tapados y si es posible, en un desecador o una habitación seca. Como ejemplo podemos mencionar: TSI, caldo tioglicolato, etc. Con la finalidad de obtener colonias separadas que hacen el aislamiento más fácil se emplean los medios solidificados que son obtenidos agregando al caldo común, sustancias susceptibles de solidificarlos a temperatura ambiente y aún en estufa, dejándole su transparencia. Las sustancias mas comúnmente utilizadas son el agar y la gelatina. Los medios gelatinados se obtienen mediante la adición de un 10-15 % de gelatina a los diversos medios líquidos, por ejemplo caldo común. En la actualidad la gelatina se ha dejado de usar como solidificante. Área Microbiología 16 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos PARTE PRÁCTICA Fórmula de algunos medios de cultivo para bacterias aerobias 1. Caldo nutritivo Extracto de carne..........................................3 g Peptona.........................................................5 g NaCl .............................................................5 g Disolver estos componentes en 1000 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7 (6.8-7.2). Envasar 3 ml en tubos de hemólisis. Tapar. Esterilizar en autoclave 15-20 min a 121°C. 2. Agar nutritivo Extracto de carne..........................................3 g Peptona.........................................................5 g NaCl..............................................................5 g Agar..............................................................15 g Agua destilada...........................................1000 ml Disolver estos componentes en 1000 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7 (6.8-7.2), llevar a autoclave durante 10 min a 120°C. Una vez fundido, enfriar a 75-80°C y envasar en tubos en cantidades de 10-14 ml si se desea obtener agar derecho (para volcar en Placa de Petri), o 7ml si se desea obtener agar inclinado o en pico de flauta. Luego tapar con algodón, tapa a rosca o tapa de plástico, esterilizar en autoclave a 121°C durante 15-20 minutos. Antes de solidificar los tubos que contienen 7 ml se inclinan sobre una tabla para obtener el pico de flauta. Cuando se desea realizar la prueba de la movilidad, se emplea agar nutritivo al 0,3% 3. Agar sangre Agar nutritivo en volumen adecuado y estéril. Glóbulos rojos de carnero o humanos del grupo 0. Fundir el agar a Baño María a ebullición y enfriarlo a 45-50°C. Adicionar la cantidad adecuada de sangre para lograr una proporción final igual al 5%. Mezclar bien y distribuir asépticamente en cajas de Petri estériles. Imprimir suaves movimientos de rotación para lograr una buena distribución en el fondo de la caja. Secar y sembrar. 4. Agar Chocolate Se prepara de la misma manera que 4 pero la sangre debe agregarse al agar nutritivo fundido y enfriado a 75-80°C. Área Microbiología 17 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos 5. Agar Müeller Hinton Infusión de carne vacuna………………………………300 g Hidrolizado ácido de caseína……………………………17,5 g Almidón………………………………………………….1,5 g pH 7,4 Agar………………………………………………………17 g Agua destilada……………………………………………1000 ml 6. SIM Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Se siembra por punción profunda con ansa recta (no usar ansa en anillo). Tripteína…………………………… 20.0 Peptona……………………………. 6.1 Sulfato de hierro y amonio………….0.2 pH final: 7.3 ± 0.2 Tiosulfato de sodio …………………0.2 Agar…………………….....................3.5 Medios de cultivo para bacterias anaerobias 7. Caldo Tioglicolato Extracto de levadura......................................................................5 g Casitone.......................................................................................15 g Glucosa.........................................................................................5 g Cloruro de sodio.............................................................................5 g L-cisteína...................................................................................0,75 g Ac. Tioglicólico.............................................................................0,3 g Agar...........................................................................................0,75 g Resazurina..............................................................................0,0001 g Agua destilada........................................................................1000 ml Ajustar el pH a 7-7.2. Envasar. Esterilizar 15 min a 120°C. antes de sembrar, hervir 15 min y enfriar rápidamente. 8. Medio de transporte de Cary y Blair modificado (PRAS) Tioglicolato de sodio.....................................................................................1.5g Cloruro de calcio...........................................................................................0.1g Fosfato disódico............................................................................................0.1g Área Microbiología 18 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Bisulfito de sodio...........................................................................................0.1g NaCl................................................................................................................5g Agar.................................................................................................................5g Sol. de resazurina..........................................................................................4ml AD.............................................................................................................1000ml Mezclar y calentar hasta disolución de los componentes. Gasear con CO2. Añadir 0.5g de clorhidrato de L-cisteína. Ajustar pH final a 8.4. Colocar en tubos giratorios (roll tube) gaseados con nitrógeno. Cerrar con tapones de butilo. Tindalizar por 15 min 3 días consecutivos. Medios de cultivos para hongos 9. Medio Saboureaud-dextrosa (glucosa) Peptona.................................10 g Dextrosa................................40 g Agar.......................................15 g AD....................................1000 ml Se disuelven los componentes en agua destilada, homogeneizar bien. Ajustar el pH a 5,6. Distribuir en tubos para la obtención de picos de flauta. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 120°C. Área Microbiología 19 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRACTICO Nº3 SIEMBRAS Y TRANSPLANTES I OBJETIVOS 1- Destacar la presencia de los gérmenes en todos los hábitats naturales, en los animales y los seres humanos y el riesgo que esto supone en el trabajo microbiológico 2- Conocer los distintos instrumentos, materiales y medios de cultivo que se utilizan más frecuentemente en la siembra de muestras y transplante de microorganismos 3- Adquirir conocimiento y destreza en el manejo de la técnica aséptica INTRODUCCIÓN SIEMBRA: se entiende por siembra al acto de transferir o colocar un microorganismo en un medio de cultivo adecuado. La transferencia se efectúa desde el hábitat natural (nicho ecológico) al medio de cultivo. Por ejemplo, se efectúan siembras desde distintos materiales biológicos (esputo, orina, materia fecal, etc.) cuando existe sospecha de infección y se quiere aislar el agente causal. También se pueden efectuar siembras desde los más diversos materiales, por ej. agua, tierra, aire, etc. Con esto se demuestra la universalidad de los gérmenes. TRANSPLANTE O REPIQUE: es la transferencia de gérmenes desde un medio de cultivo a otro. Se efectúan transplantes cuando se desea obtener un cultivo puro a partir de uno mixto, mantener cepas, o efectuar estudios químicos, bioquímicos o culturales. ¿Con qué se siembra? 1. Según la finalidad de la siembra con: Ansa: recta en anillo Pipetas: Comunes (de 1, 2, 5, 10 y 25 ml) Pasteur rectas Pasteur a bolas Micropipetas: de 2, 10, 20, 100, 200 y 1000 µl Espátula de Drigalski: y “palo de hockey” Hisopo: Área Microbiología para sembrar en superficies grandes (caja de Petri, botellas de Roux, etc.) ídem anterior. 20 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos 2. Según el tamaño y el estado físico del inóculo con qué elemento se siembra: Pequeño (líq. o sól.): ansa recta: siembra por punción siembra para aislamiento Abundante: líquido: sin medir (pipeta Pasteur recta o a bola) medido (pipeta graduada) sólido: ansa en anillo ¿En qué medios de cultivo se siembra? medios incoloros (ansa recta) Medios líquidos medios coloreados medios para observar producción de gas(con campana de Durham) inclinado o en pico de flauta agar nutritivo u otro medio en caja de Petri Medios sólidos agar nutritivo u otro medio en botella de Roux gelatina tubos cilíndricos de agar ¿Cómo se siembra? ansa en anillo Diseminación o estrías en placa ansa recta espátula de Drigalski Difusión: inóculo más agar fundido y enfriado a 45-50°C En medios sólidos Punción en superficie inclinada En estrías Por contacto en medio derecho (agar blando) En medios líquidos Área Microbiología por punción con ansa recta (preferentemente) 21 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TÉCNICAS PARA SIEMBRAS Y TRANSPLANTES MATERIALES Y MÉTODOS - Elementos de siembra: ansas rectas y en anillo, hisopos, pipetas, micropipetas y tips Material preparado y esterilizado listo para ser usado: placas de Petri, frascos con tips, tubos de ensayo y de hemólisis estériles. Frascos de descarte Medios de cultivo : agar nutritivo derecho, agar nutritivo inclinado, agar SIM (semisólido o blando), caldo nutritivo. Botellas con solución fisiólogica estéril Cámara de bioseguridad tipo II. Alcohol yodado y algodón Elementos de protección personal: guaradapolvo, guantes, barbijo. Técnicas para siembras y transplantes Las operaciones que se describen a continuación están dirigidas a personas diestras. Proceder de modo similar pero con las manos opuestas en caso de personas zurdas. 1. Siembras en agar semisólido o blando por punción o picadura: Esterilizar a la llama (al rojo) el alambre del ansa. Dejarlo enfriar 5 seg. Tomar el tubo del cual se va a extraer el inóculo con la mano izquierda, con el meñique de la mano derecha quitar el tapón del tubo, flamear la boca y mantenerlo oblicuo, casi horizontal, para reducir al mínimo el peligro de contaminación. Retirar con el alambre esterilizado una pequeña cantidad de cultivo (inóculo), flamear nuevamente la boca del tubo, taparlo y dejarlo en la gradilla. Tomar el tubo que se va a sembrar con la mano izquierda, quitarle el tapón con el meñique de la derecha, flamear la boca del tubo y con el alambre cargado de inóculo picar el medio hasta aproximarse al fondo del tubo. Retirar con cuidado el ansa, flamear la boca del tubo, taparlo y esterilizar el ansa antes de dejarla sobre la mesa. El tubo sembrado se marca para identificarlo colocando en el rótulo el medio, lo que se sembró y la fecha. Luego se lleva a incubar a temperatura adecuada durante el tiempo necesario. 2. Siembras sobre medios inclinados (en pico de flauta) Esterilizar a la llama (al rojo) el alambre del ansa. Dejarlo enfriar 5 seg. Tomar el tubo del cual se va a extraer el inóculo con la mano izquierda, con el meñique de la mano derecha quitar el tapón del tubo, flamear la boca y mantenerlo oblicuo, introducir el ansa estéril, retirar una pequeña cantidad de cultivo, flamear la boca del tubo, taparlo y dejarlo en la gradilla. Tomar el tubo que se va a sembrar con la mano izquierda, quitarle el tapón con el meñique de la derecha, flamear la boca del tubo, mantenerlo inclinado, introducir el ansa cargada al tubo y extender el inóculo sobre la superficie del medio trazando estrías a intervalos de pocos mm empezando por abajo, retirar el ansa, flamear la boca del tubo y taparlo. También esterilizar el ansa antes de Área Microbiología 22 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos dejarla sobre la mesa. Como en la siembra anterior, rotular el tubo y luego llevarlo a incubar. Fundir en baño de María hirviente un tubo de agar derecho. Enfriarlo a 45-50°C en un baño. Secarlo. Destaparlo. Flamear la boca del tubo y volcar el contenido en una caja de Petri estéril, rotar la caja sobre la mesa de manera que se forme una capa uniformeDejar solidificar. Secar en estufa a 37°C 5 min y luego sembrar. Se puede sembrar con hisopo, espátula de Drigalski o ansa. Una vez sembrada y rotulada, la caja se lleva a estufa en posición invertida para incubar. 3. Siembra en placa de Petri: Fundir en baño de María hirviente un tubo de agar derecho. Enfriarlo a 45-50°C en un baño. Secarlo. Destaparlo. Flamear la boca del tubo y volcar el contenido en una caja de Petri estéril, rotar la caja sobre la mesa de manera que se forme una capa uniformeDejar solidificar. Secar en estufa a 37°C 5 min y luego sembrar. Se puede sembrar con hisopo, espátula de Drigalski o ansa. Una vez sembrada y rotulada, la caja se lleva a estufa en posición invertida para incubar. 4. Siembra en medios líquidos en general: (caldo, leche, agua peptonada, medio mineral de fosfato, etc.) Los medios transparentes se deben sembrar con ansa recta, tratando de transportar poco inóculo. Los demás se pueden sembrar con ansa, o bien con pipetas estériles. 5. Siembra en medios líquidos con ansa: Una vez que el ansa esterilizada fue cargada con el inóculo, tomar con la mano izquierda el tubo con medio líquido a sembrar, con el meñique de la mano destaparlo, flamear la boca del tubo y mantenerlo inclinado, introducir el ansa y descargar el inóculo. Retirar el ansa, flamear la boca del tubo, taparlo, esterilizar el ansa antes de dejarla sobre la mesa, rotular el tubo y llevarlo a incubar. 6. Siembras de medios líquidos con pipetas: Tomar la pipeta estéril (puede estar en tambores de aluminio o bien envuelta en papel), pasarla ligeramente por la llama. En la mano izquierda tenemos el tubo del cual vamos a extraer el inóculo, con el meñique de la derecha lo destapamos, flameamos y mantenemos inclinado, introducimos la pipeta, aspiramos el volumen deseado, flameamos el tubo, tapamos y dejamos en la gradilla con la mano izquierda. Tomamos el tubo con el medio de cultivo que vamos a sembrar, con el meñique derecho lo destapamos, flameamos e introduciendo la pipeta sin llegar hasta el líquido sembramos el volumen deseado (gotas, ml, etc.). Flamear la boca del tubo, Área Microbiología 23 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos taparlo y colocar la pipeta en recipientes que contengan mezcla sulfocrómica o solución desinfectante. Una vez hecho esto, el tubo se rotula y se incuba. 7. Siembras de medios líquidos o sólidos con micropipeta Colocar el volumen deseado en el visor de la micropipeta (siempre dentro del rango de microlitros permitidos en cada una de ellas), y pinchar un tip estéril en el extremo de la micropipeta. Ante un roce o toque con elemento extraño, descartar el tip y reemplazarlo por uno estéril. Tomar el tubo con la muestra líquida en la mano izquierda y sostener la micropipeta con la mano derecha. Acercar el tubo a la mano que sostiene la micropipeta y con el dedo meñique quitar y sostener el tapón del tubo y flamear. Con el pulgar de la derecha bajar el pistón de la micropipeta hasta el primer tope e introducir el tip en el líquido donde está la muestra o inóculo. Soltar suavemente el pistón para que el líquido ascienda, retirar la micropipeta, y tapar el tubo acercando al dedo que sostiene el tapón. Llevar la muestra a otro tubo con medio de cultivo líquido o sólido fresco, para lo cual, se destapa el tubo o la placa de Petri con la mano izquierda y se introduce el tip; con el pulgar de la derecha se baja el pistón suavemente hasta el 2do. tope para descargar la muestra. Soltar el pistón suavemente y tapar tubo o placa. En el caso de la placa, el líquido sembrado debe ser extendido superficialmente mediante espátula de Drigalski o “palito de hockey”. Actividades a desarrollar: 1. Descontaminar área de trabajo 2. Preparar agar nutritivo en Placa de petri (3). 2. Siembra de las siguientes muestras: - aire del medio ambiente, en placa de Petri (siembra espontánea) - tierra de jardín, en: caldo nutritivo, agar nutritivo inclinado, agar semisólido y agar en placa de Petri (usando los distintos elementos de siembra). 3. Transplante de Enterobacter de agar nutritivo inclinado a placa de Petri, con preparación previa del inóculo en solución fisiológica (manejo de recipientes, pipetas y otros elementos). 4. Observación del funcionamiento de cámara de bioseguridad. 5. Usar cámara de incubación. 6. Al concluir el trabajo, repetir descontaminación de mesada y clasificar residuos desechar. Área Microbiología 24 2014 para Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Figura 1. Transferencia aséptica (a) el ansa de siembra se calienta hasta la incandescencia y se enfría brevemente al aire, (b) el tubo se destapa (c) se pasa el extremo del tubo por la llama, (d) se extrae la muestra con el ansa esterilizada, (e) tras tomar la muestra con el ansa, se vuelve a flamear el extremo del tubo y la muestra se deposita en un medio estéril, (f) se vuelve a tapar el tubo. El ansa se recalienta de nuevo antes de finalizar su utilización.Tomado de Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. Pearson-Prentice Hall Área Microbiología 25 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRACTICO Nº4 SIEMBRAS Y TRANSPLANTES II - COLORACIONES I (GRAM) OBJETIVOS 1. Caracterizar el desarrollo macroscópico de los microorganismos en medios de cultivo líquidos y sólidos 2. Adquirir entrenamiento en la realización de exámenes en fresco y coloración de Gram para la observación microscópica de los microorganismos 3. Entrenar en el manejo del microscopio óptico INTRODUCCION A. SIEMBRAS Y TRANSPLANTES II Qué debe observarse en los cultivos de microorganismos? 1. En medios sólidos - en agar semisólido: crecimiento con o sin movilidad -en agar nutritivo inclinado: desarrollo abundante, escaso o negativo -en placa de Petri: toda especie bacteriana forma un tipo característico de agrupación llamada colonia. Una colonia es la progenie de una sola célula al proliferar en un medio de cultivo sólido. Imp.: No se forman colonias en medios de cultivo liquidos! Las colonias se diferencian por su tamaño, forma, altura o elevación, color y grado de adherencia al medio (consistencia). Forma: puntiforme: muy pequeñas, pero visibles a simple vista, diámetro menor de 1 mm. circular: diámetro mayor de 1 mm rizoide: ramificada en forma de raíces en forma de huso Elevación, altura o perfil: plana realzada: desarrollo grueso con bordes escalonados convexa pulvinada pitting Margen, contorno o borde: entero Área Microbiología 26 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos ondulado: borde sinuoso lobulado mellado: con muescas irregulares filamentosa: forma de largos hilos festoneado Olor: Brillo: ausente * vivo pronunciado *opaco parecido a ......... *metálico Características ópticas: Consistencia: (usar ansa recta) opaca *butírica traslúcida *viscosa o mucoide opalescente *membranosa iridiscente *quebradiza color . 2. En caldo: Crecimiento superficial: floculento: contiene masas de formas diversas que flotan en el medio líquido. en anillo: desarrollo adherido al vidrio en el borde de la superficie del líquido de cultivo. película: desarrollo de una capa delgada uniforme Sedimento: compacto, granular, grumoso, escamoso, viscoso. Cantidad de sedimento: abundante, escaso, nulo. Turbidez: ligera, regular, intensa, transitoria, persistente, nula. Área Microbiología 27 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Figura 1. Características (forma, borde, perfil) de colonias B. COLORACIONES I La observación de los microorganismos puede realizarse: - sin teñirlos - teñidos con colorantes Es necesario utilizar el microscopio óptico con el aumento apropiado en cada caso. Área Microbiología 28 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos En los exámenes en fresco, los microorganismos no se tiñen y esto permite: - establecer si están vivos - visualizar si son móviles - realizar recuentos En las tinciones, los microorganismos se fijan, con lo cual mueren, y luego son coloreados por distintas técnicas con el propósito de: - proporcionar el contraste suficiente entre la célula y el medio que la rodea, permitiendo diferenciar tipos morfológicos. - estudiar estructuras propias de la célula. - realizar recuentos. -La coloración simple utiliza un solo colorante y permite observar forma y tamaño de las bacterias. -La coloración de Gram utiliza 2 colorantes y una etapa de decoloración entre ambos. Permite diferenciar los microorganismos en 2 grandes grupos, Gram positivos y Gram negativos, según la composición química de su pared y está ampliamente difundida en el ámbito de la Microbiología. MATERIALES Y METODOS A. SIEMBRAS Y TRANSPLANTES II - Cultivos obtenidos en el TP anterior - Ansas, lupas B. COLORACIONES I - Cultivos obtenidos en el TP anterior - Repiques frescos de Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae y Staphylococcus sp - Preparados de Gram pertenecientes a la colección de nuestro laboratorio - Equipo de coloración de Gram - Portaobjetos y cubreobjetos limpios - Solución fisiológica - Microscopios de campo óptico - Aceite de inmersión - Ansas Reactivos de la coloración de Gram (listos para usar): - Cristal violeta o (Violeta de Genciana) Cristal violeta ................................................................ 10 g Fenol al 50% en alcohol .............................................. 50 ml Alcohol puro ............................................................... 75 ml Dejar madurar en la estufa a 37°C durante una semana y agregar: Agua destilada ......................................................... 1000 ml Filtrar antes de usar. Área Microbiología 29 2014 Microbiología General - Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Lugol Yodo ............................................................................. 5 g Ioduro de potasio ........................................................ 10 g Agua destilada ...................................................... 1000 ml - - Fucsina de Ziehl Fucsina básica ............................................................. 10 g Fenol al 50% en alcohol ......................................... 100 ml Alcohol ..................................................................... 50 ml Dejar madurar en estufa a 37°C durante una semana y agregar: Agua destilada ...................................................... 1000 ml Filtrar antes de usar. Fucsina de Ziehl diluida 1/10 Hacer una dilución 1/10 en agua destilada de la fórmula anterior. Esta misma fucsina 1/10 se utiliza en la coloración simple. ACTIVIDADES A REALIZAR A. SIEMBRAS Y TRANSPLANTES II - A partir del material del TP anterior, estudiar los cultivos en medio líquido, determinando la producción de película superficial, turbidez y/o sedimento Analizar el desarrollo obtenido en agar semisólido y agar nutritivo inclinado Distinguir los distintos tipos de colonias en cultivos en placa de Petri por sus características morfológicas más sobresalientes. Elegir las más representativas e informar. B. COLORACIONES I - Examen en fresco 1. Colocar en el centro del portaobjetos bien limpio, una ansada de cultivo joven (18-24 hs) en caldo nutritivo. Utilizarmaterial de cultivos propios o de los repiques propuestos. 2. Cubrir la gota con un cubreobjetos evitando formar burbujas de aire. 3. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio, enfocar con poco aumento: 10 x y luego pasar a 40 x. 4. Observar si los microorganismos presentan verdadero movimiento, diferenciándolo del movimiento browniano por el agregado de una gotita de formol por capilaridad. - Coloración simple 1. Preparación del frotis: Colocar una ansada de cultivo líquido en el centro de un portaobjetos bien limpio; si el examen se debe realizar desde un cultivo sólido, colocar previamente sobre el portaobjetos una gota de solución fisiológica y sobre ella emulsionar perfectamente el inóculo de manera de lograr una película delgada y uniforme. Utilizar material de cultivos propios o de los repiques propuestos. 2. Secar la preparación en la parte alta de la llama. 3. Fijación: Fijar tomando el preparado desde un extremo, pasándolo rápidamente tres veces por la llama de un mechero. 4. Coloración: Área Microbiología 30 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Una vez frío, cubrir el preparado con una solución diluida de fucsina 1/10 durante 1 minuto. Lavar con agua corriente, secar, observar por inmersión a 100 x. - Coloración de Gram 1. Hacer el frotis con material de cultivos propios o de los repiques propuestos. Secarlo. Fijarlo a la llama. 2. Cubrir la preparación con cristal violeta y dejar actuar 2 min. Lavar 3. Tratar con lugol dos veces consecutivas durante 30 seg. O una vez durante 1 minuto. Volcar. Lavar. 4. Decolorar con alcohol o alcohol-acetona. 5. Lavar con agua corriente y efectuar la coloración de fondo con la fucsina 1/10. Dejar actuar un minuto. 6. Lavar. Secar. Observar por inmersión. Las bacterias Gram positivas se ven violetas y las Gram negativas rojas. Bibliografía - Madigan, Martincko. 2009. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. PearsonPrentice Hall. SM. Finegold, Bailey, WR Bailey “Bailey-Scott Diagnóstico Microbiológico”. Ed. Panamericana (1996) JF MacFaddin “MacFaddin Pruebas bioquímicas para la identidad de bacterias de importancia clínica. 3ºEd. Ed. Panamericana (2003) Área Microbiología 31 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRACTICO Nº5 COLORACIONES II (ZIEHL NEELSEN Y OTRAS) - AISLAMIENTO OBJETIVOS 1. Adquirir entrenamiento en la realización de la coloración de Ziehl Neelsen para bacterias ácidoalcohol resistentes. 2. Conocer el fundamento de otras tinciones para estructuras especiales de los microorganismos: esporas (Moeller y Wirtz-Conklin), cápsula (Burri) y flagelos (impregnación argéntica). 3. Relacionar diferencias en el metabolismo microbiano con distintas técnicas de aislamiento en cultivo. INTRODUCCION A. COLORACIONES II (ZIEHL NEELSEN Y OTRAS) Por la naturaleza de su pared, algunos microorganismos no pueden ser visualizados por la técnica de Gram. Es el caso de las bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) en cuyo caso se aplica la coloración de Ziehl Neelsen. Otras estructuras bacterianas requieren también procedimientos especiales para ser observados, por ej. las esporas se colorean por los métodos de Moeller o WirtzConklin, la cápsula requiere una tinción negativa según Burri y los flagelos pueden ser visibles mediante la impregnación argéntica. B. AISLAMIENTO TECNICAS DE AISLAMIENTO a) en placa vertida 1. Aislamiento de bacterias aerobias en medios b) por agotamiento en tubos en cajas sólidos c) por dilución (para recuento) 2. Aislamiento de bacterias anaerobias 3. Aislamiento de bacterias esporuladas aerobias anaerobias Métodos para generar anaerobiosis Para generar anaerobiosis se requiere un sistema que elimine el oxígeno de la atmósfera de cultivo. Área Microbiología 32 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Existen varias alternativas: 1. Sistema de evacuación-reemplazo Consiste en extraer el aire contenido en una jarra o desecador mediante una bomba de vacío e introducir gases inertes libres de O2. Se puede sustituir el aire por gas de garrafa o por N2 libre de oxígeno con agregado de 5-10% de CO2. Repetir la operación 5 a 6 veces para eliminar el aire. 2. Gas-Pak Se trata de sobres comerciales que contienen 2 tabletas, una de borohidruro de sodio (BH4Na) y otra de ácido cítrico y NaHCO3. Al agregar agua dentro del sobre se produce la activación de las tabletas: BH4Na + 2 H2O C6H6O7 + 3 NaHCO3 2 H2 + O2 atm BO2Na + 4 H2 Na3 (C6H5O7) + 3 H2O + 3 CO2 H2O catalizador El agua formada en la última reacción se observa como vapor condensado en las paredes de la jarra. La anaerobiosis se establece por la conversión catalítica del oxígeno de la atmósfera de la jarra por el H2 liberado desde la tableta, para formar agua. El catalizador está compuesto por paladio (bolitas o sobres metálicos). Este se inactiva por la humedad, H2S y otros gases. Se debe reactivar después de cada uso, caléntandolo en horno a seco a 160-180°C durante 2 hs como mínimo, previo lavado con agua acidulada con HCl durante 24 h. 3. Anaerocult A y P Son planchas comerciales con reactivos químicos que fijan el O2 y liberan CO2. Contienen gel de sílice, polvo de hierro, ácido cítrico y NaCO3. La adición de agua en el interior de la plancha inicia la reacción que consiste en una oxidación del hierro finamente dividido. La reacció no requiere catalizador. *Anaerocult A es apto para jarras de 3 litros de capacidad. *Anaerocult P es apto para usar en bolsas donde se colocan cajas de Petri. Una vez que comenzó la reacción de anaerobiosis, sellar la bolsa perfectamente. 4. Pirogalol alcalino Permite el cultivo de anaerobios en la superficie de un medio sólido en caja de Petri. En la tapa se adapta previamente un saquito de papel de filtro conteniendo aproximadamente 2 g de la siguiente mezcla reductora (que debe prepararse en el momento de usar): Carbonato de potasio ............................................... 3 g Acido pirogálico ...................................................... 3 g Tierra de infusorios o tiza ...................................... 15 g Área Microbiología 33 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos La hermeticidad del sistema cápsula-tapa se asegura con la ayuda de plastilina o una cinta adhesiva de buena calidad de PVC. Valor de la técnica Es útil para gérmenes anaerobios de crecimiento rápido, pero no es aconsejable para aquéllos de crecimiento lento, en razón de la hidratación de la mezcla reactiva al cabo de 24 a 48 h, lo que aumenta el riesgo de contaminación. 5. Cámaras anaeróbicas Pueden ser cámaras de plástico flexible o gabinetes rígidos herméticos. La manipulación de muestras, placas y otros elementos de trabajo dentro de la cámara se efectúa por medio de guantes sellados a la pared anterior. Se introduce y se retira el material de la cámara a través de un sistema automático de compuertas. Una vez lograda la atmósfera anaerobia en la precámara, el sistema de compuertas se abre para introducir las placas. La anaerobiosis se realiza por un flujo rápido de gas libre de oxígeno, de manera análoga al de las jarras. El número de evacuaciones necesarias depende de la porosidad del material que se está procesando. La propia cámara se mantiene continuamente en anaerobiosis mediante el uso de un catalizador de paladio con una atmósfera del 3 al 10% de N2. La cámara cuenta con una estufa de incubación, de manera que desde que ingresa la muestra hasta la totalidad de su procesamiento, en ningún momento queda expuesta al aire. 6. Vas-Par (vaselina-parafina) Cuando se siembra en tubos puede bloquearse el contacto del medio de cultivo sembrado con la atmósfera, mediante el agregado de una mezcla estéril de 3 partes de vaselina y 2 partes de parafina, hasta formar un tapón de + 1 cm de altura. Una vez solidificado, impedirá el intercambio gaseoso. 7. Medios pre-reducidos (PRAS) y tubos giratorios Los medios PRAS se preparan mezclando los componentes del medio, hirviendo el líquido para extraer el O2 del aire, y tratándolo después con un gas libre de O2. Mientras los medios siguen su proceso de esterilización, inoculación y subcultivo, se impide la entrada de aire en los recipientes por medio de un tratamiento con gas o manteniendo el recipiente tapado o sellado. Para reducir el Eh del medio se agrega, antes de la esterilización, un agente reductor como cisteína. Ej.: medio de transporte de Cary y Blair modificado. Los medios PRAS pueden ser inoculados por métodos cerrados o abiertos. En el método cerrado, también conocido como método de Hungate, se usa una jeringa con aguja para inocular a través de un tapón de goma. En el método abierto, se quita el tapón de goma y se inserta una cánula de cuyo extremo fluye gas libre de O2. Mientras el tubo está abierto, se puede efectuar la inoculación con ansa o pipeta Pasteur. Es factible adquirir en el comercio un equipo especial para inoculación. Área Microbiología 34 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Los medios PRAS se utilizan tanto para el aislamiento como para pruebas bioquímicas en cuyo caso se siembran con ansa o pipeta Pasteur. También se pueden emplear para determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos. Indicadores de oxido-reducción a. Resazurina. Es incolora en su forma reducida y rosada en estado oxidado. Este indicador se incorpora en la fórmula de los medios de cultivo. b. Azul de metileno: es incoloro al estado reducido y azul al estado oxidado. Este indicador se puede adquirir en el comercio en forma de tiras indicadoras las que se pueden utilizar tanto en jarras como en las bolsas especiales que llevan una sola caja de Petri. A 35°C, el viraje de color se observa 5 h después de comenzar la incubación. MATERIALES Y METODOS A. COLORACIONES II - coloración de Ziehl Neelsen (para BAAR) Reactivos (listos para usar): - Alcohol-ácido: Solución al 5% de HCl o H2SO4 en alcohol de 96°. - Azul de metileno diluido: Azul de metileno........................................................ 0.3 g Alcohol de 96° .......................................................... 30 ml Disolver. Agua destilada .......................................................... 10 ml Se emplea una dilución 1/10. - Fucsina de Ziehl (ver coloración de Gram) Usar sin diluir. - coloración de Moeller (para esporas) Reactivos: - Acido crómico: solución acuosa al 5%. - Acido sulfúrico: solución acuosa al 5%. - Fucsina de Ziehl: concentrada - Azul de metileno: el mismo utilizado en Ziehl Neelsen. - tinción negativa de Burri (cápsula) Reactivos: - tinta china comercial. - cristal violeta (de Gram) Área Microbiología 35 2014 Microbiología General - Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Coloración argéntica de flagelos Reactivos (listos para usar): a. Solución I: mordiente - Solución acuosa saturada de sulfato de potasio y aluminio (14 g/100 ml A.D.) ......................... 25 ml - Acido tánico al 10% (p/v) ...................................................... 50 ml - Solución de FeCl3 al 5% (p/v) .................................................... 5 ml Mezclar y conservar en frasco oscuro a temperatura ambiente. La solución es estable durante varios meses. - b. Solución II: colorante argéntico Preparar 100 ml de solución de nitrato de plata al 5% (p/v). Adicionar hidróxido de amonioi concentrado (2-5 ml) gota a gota a 80 ml de solución de nitrato de plata al 5% hasta que el precipitado marrón formado se redisuelva. Adicionar algo del remanente de la solución de nitrato de plata al 5%, gota a gota a la solución, hasta ligera opalescencia persistente. Conservar la solución en frasco oscuro a temperatura ambiente. La solución es estable durante varios meses. B. AISLAMIENTO - Tubos con cultivos de gérmenes anaerobios cubiertos con vaselina estéril Jarras de anaerobiosis Bomba de vacío Sobres anaerocult Serie de tubos con solución fisiológica estéril para realizar diluciones de una muestra de agua y proceder al aislamiento por placa vertida para recuento Agar nutritivo fundido y templado a 50-55°C ACTIVIDADES A REALIZAR A. COLORACIONES II Técnica de Ziehl Neelsen: 1. Hacer el frotis con Mycobacterium smegmatis, secarlo y fijarlo a la llama. 2. Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar, para lo cual se pasa un hisopo encendido debajo del portaobjetos manteniendo la emisión de vapores durante 10 minutos, sin ebullición y agregando reactivo si se evapora. 3. Decolorar con alcohol-ácido unos min. Repetir hasta obtener frotis libre de fucsina. 4. Lavar con abundante agua y cubrir con azul de metileno diluido. 5. Lavar. Secar. Observar por inmersión. Los gérmenes ácido-alcohol resistentes se ven rojos, y las demás bacterias y estructuras celulares se ven azules. Restantes coloraciones: se observarán preparados de la colección del Laboratorio B. AISLAMIENTO: Bacterias aerobias a) Placa vertida Material necesario: - 3 tubos de agar derecho, gradilla para tubos 3 pipetas Pasteur 3 cajas de Petri estériles Área Microbiología 36 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Procedimiento: 1. Fundir 3 tubos de agar nutritivo derecho en B.M hirviente. Enfriar a 45-50°C en baño termostatizado. 2. Marcar 3 tubos de ensayo conteniendo 9 ml de solución fisiológica (SF) estéril con los números 1, 2 y 3, y 3 cajas de Petri estériles vacías con los números 1, 2 y 3. 3. Colocar con pipeta, 1 ml del material a cultivar en el tubo N°1 (primera dilución). Para mezclar se rota el tubo entre las manos de modo tal que no se moje el tapón de algodón, o se utiliza un vortex, y se vuelve a la posición vertical. 4. Con otra pipeta extraer 1 ml del tubo N°1 y transferir al tubo N°2 (segunda dilución). Mezclar como se explicó. Análogamente se prepara el tubo 3 partiendo del 2 (tercera dilución). 5. Desde el tubo N°1 transferir 1 ml a la caja de Petri N°1 con pipeta estéril. Hacer lo mismo desde el tubo N°2 a la caja de Petri N°2 y desde el tubo N°3 a la caja de Petri N°3. 6. Retirar un tubo con agar derecho desde el baño termostatizado, secar las paredes externas del tubo con repasador y volcar asépticamente en la caja N°1. Tapar y rotar suavemente sobre la mesada para distribuir uniformemente la muestra en el agar antes que solidifique el agar. En forma idéntica se preparan las cajas 2 y 3. 7. Una vez solidificado el agar, incubar. 1. Bacterias anaerobias Preparar una caja de Petri con agar sangre al 5% o agar glucosado al 4%. Dejar solidificar. Secar. Sembrar por estrías para lograr aislamiento de colonias. Incubar en atmósfera libre de oxígeno. 2. Bacterias esporuladas Procedimiento - Se colocan unos ml de la muestra en un tubo estéril y se calienta en B.M. hirviente durante 5 min. - Enfriar la base del tubo bajo canilla. - Sembrar, según se desee aislar esporulados aerobios o anaerobios en: a) esporulados aerobios: en agar nutritivo. Siguiendo cualquiera de los procedimientos ya descriptos. b) esporulados anaerobios: en agar sangre o agar glucosado, siguiendo los mismos métodos para anaerobios. c) Por agotamiento en cajas Material necesario: -agar derecho -cajas de Petri estériles Procedimiento: Para preparación de las cajas con agar nutritivo, ver el práctico de Siembras. Si se dispone de una sola caja, se divide la superficie del agar (con lápiz marcador del lado externo) en 3-4 sectores, sembrando por orden en cada uno de ellos. Si son 3-4 cajas, se siembra por estrías en la caja 1, sin cargar se pasa a la 2, y así sucesivamente. Una vez sembradas, las cajas se incuban invertidas. Transcurrido el tiempo de incubación, observar y estudiar las colonias. d) Por dilución: Material necesario: 3 tubos de agar inclinado. Agregar a cada tubo 0.5 ml de agua destilada o caldo estéril. Marcar los tubos: 1, 2 y 3. Procedimiento: 1. Se toma el material a aislar con ansa. Área Microbiología 37 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos 2. Se introduce el ansa en el agua de condensación del tubo 1, donde se descarga, sacar el ansa, y sin cargar nuevamente introducir en el agua de condensación del tubo 2 y proceder idénticamente en el tubo 3. 3. Inclinar todos los tubos de manera que el agua moje toda la superficie de los mismos, diseminando así las bacterias. Se incuban en posición vertical, al finalizar la misma se procede al estudio de las colonias. 3. AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS Preparar una caja de Petri con agar sangre al 5% o agar glucosado al 4%. Dejar solidificar. Secar. Sembrar por estrías para lograr aislamiento de colonias. Incubar en atmósfera libre de oxígeno. 4. AISLAMIENTO DE BACTERIAS ESPORULADAS Figura 1. Procedimiento para la determinación de viables usando diluciones seriadas de la muestra y el método del vertido en placa. El líquido estéril usado para hacer diluciones puede ser simplente agua, pero una solución salina equilibrada o medio de cultivo suele dar mejor recuperación. El factor de dilución es el inverso de la dilución. En el caso de siembra por extensión (Figura 2) pueden ser necesarias más diluciones para extender muestras de 0,1 ml. (Tomado de Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. Pearson-Prentice Hall). Área Microbiología 38 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Procedimiento Se colocan unos ml de la muestra en un tubo estéril y se calienta en B.M. hirviente durante 5 min. Enfriar la base del tubo bajo canilla. Sembrar, según se desee aislar esporulados aerobios o anaerobios en: a. esporulados aerobios: en agar nutritivo. Siguiendo cualquiera de los procedimientos ya descriptos. b. esporulados anaerobios: en agar sangre o agar glucosado, siguiendo los mismos métodos para anaerobios. Figura 2 . Dos métodos de realizar una determinación de células viables (recuento en placa). En cada caso la muestra se diluye normalmente antes de sembrar. Tomado de Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. Pearson-Prentice Hall. BIBLIOGRAFIA - Madigan, Martincko. 2009. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. PearsonPrentice Hall. - Sadebac, Asoc. Arg. de Microbiología, 1995. BACTERIAS ANAEROBIAS: GUIA PRACTICA PARA EL PROCESAMIENTO DE MUESTRAS CLINICA Área Microbiología 39 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRÁCTICO Nº 7 PARTE A: PRUEBAS BIOQUIMICAS Una vez obtenido el cultivo puro, el paso siguiente para la identificación del microorganismo es la realización de una serie de pruebas de caracterización entre las que se incluyen: forma y disposición celular, tipo de metabolismo, propiedades tintoriales, etc. 1. Fermentación de azúcares Fundamento: determina la capacidad de un microorganismo de fermentar (degradar) un hidrato de carbono específico incorporado a un medio básico, produciendo ácido, o ácido con gas visible. Medio: para esta prueba se utiliza caldo nutritivo adicionado del hidrato de carbono a probar, el que se agrega en concentración del 1% para glucosa y disacáridos, y 0.5% para los demás glúcidos. Estos deben ser esterilizados por filtración o tyndalización. Envasar en tubos con campanita de Durham. El medio debe ir adicionado con un indicador que puede ser: azul de bromo timol, rojo de fenol, etc., añadiéndose en razón de 1.25%. Indicadores: Rojo fenol......................1 g Azul de bromo timol ...........................1 g NaOH N/10................40 ml NaOH N/10.................................... 20 ml A.d. .........................460 ml A.D. .............................................500 ml Interpretación: Cuando el indicador utilizado es azul de bromo timol, se considera: - POSITIVO a) color amarillo: viraje hacia la zona ácida (A). b) Producción de gas, variable: - positivo para gas (G). Se observan burbujas de gas en la campana de Durham. El desalojo de aproximadamente 1/3 de líquido basta para registrar la producción de gas. El microorganismo es aerogénico. - negativo para gas: el microorganismo es anaerogénico (no se observan burbujas de gas). - NEGATIVO Color azul: viraje del indicador hacia zona alcalina. Área Microbiología 40 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos -Reacción retardada: color verde: no hay viraje del indicador. Volver a incubar 24 h más. 2. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER – ROJO DE METILO Para la realización de ambas pruebas se utiliza el medio de Clark y Lubs que es una solución buffer de peptona glucosada. K2HPO4.............................5 g Peptona.............................5 g Glucosa .............................5 g A.D. c.s.p. ................1000 ml pH 7 – 7.2 Esterilizar la glucosa por separado. Sembrar. Incubar a 37°C durante 48-96 h. 2.a. Prueba de Voges Proskauer Fundamento: se utiliza para determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir un metabolito neutro, el acetil metil carbinol (acetoína), intermediario en la producción de 2,3butanodiol a partir de la fermentación de glucosa por vía butilenglicólica. Reacción de color: en presencia de O2 atmosférico y álcali, los productos finales neutros, acetoína y 2,3-butanodiol son oxidados a diacetilo. Este, en presencia de núcleos guanidina (que se encuentran en la peptona), el alfa-naftol y creatinina, produce compuestos de color rojo. Reactivos: a) alfa naftol......................... 5 g alcohol 95°................1000 ml b) KOH ...............................40 g Creatina ........................0.3 g A.D. ............................ 100 ml A una alicuota de cultivo adicionar 0.2 ml de solución a), añadir a continuación 0.1-0.2 ml de solución b). Agitar. Interpretación: -POSITIVO: color rojizo oscuro en la superficie del medio indica la presencia de acetoína. -NEGATIVO: color amarillo en la superficie del medio (el mismo color del reactivo). En caso de observar un color cobrizo, la reacción es negativa. Área Microbiología 41 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Precauciones: - en caso de reacción negativa, se debe calentar suavemente. - El período de incubación del cultivo no debe exceder 3 días. - Respetar el orden de agregado de los reactivos: primero alfa-naftol y luego KOH. La inversión puede dar resultados falsamente negativos. - El volumen de KOH no debe exceder los 0.2 ml. El exceso podría ocultar una reacción débilmente positiva. 2.b. Prueba de Rojo de Metilo Fundamento: -Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. -Es una prueba cualitativa de la producción de ácidos. Reacción de color: La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo de metilo, para determinar la concnentración de H+ (pH) presente cuando un organismo fermenta la glucosa por vía ácido-mixta. El indicador señala los cambios en el grado de acidez por reacciones de color: pH = 4.4 ó menor, el reactivo se mantiene rojo. pH = 5 a 5.8, diferentes tonos de anaranjado pH = 6, color amarillo Reactivo: Rojo de metilo.............................. 0.1 g Alcohol........................................300 ml A.D. ............................................200 ml A la otra porción del cultivo en Clark y Lubs, agregarle 2-3 gotas de la solución de rojo de metilo. Interpretación: -POSITIVO: color rojo definido (pH 4.4) -NEGATIVO: color amarillo (pH 6) -REACCION RETARDADA: color anaranjado. Continuar la incubación hasta 4 días y repetir la prueba. Validez de la prueba: La misma depende del tiempo de incubación, que debe ser de 2 a 5 días. Esto se basa en que a las 18-24 h todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacción positiva, y sólo aquellos Área Microbiología 42 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos microorganismos rojo de metilo positivos continúan dando positiva la reacción a los 2-5 días de incubación. 3. PRUEBA DE UTILIZACION DEL CITRATO Fundamento: permite determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo. Algunas bacterias pueden suministrar energía en ausencia de fermentación o producción de ácido láctico, usando el citrato como única fuente de carbono, de acuerdo con la siguiente reacción: citrato oxalacetato + formato oxalacetato piruvato + CO2 Los medios utilizados para la prueba de fermentación de citrato contienen también sales de NH4 inorgánicas, dado que un germen capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono también utiliza las sales de NH4 como única fuente de nitrógeno, desdoblando éstas a NH3 con producción de alcalinidad. El indicador azul de bromo timol señala el cambio de pH. Medios utilizados: -Medio citratado de Simmons MgSO4...............................................................0.2 g NaCl...................................................................5.0 g NH4H2PO4 .........................................................1.0 g Citrato de sodio .................................................2.0 g Azul de bromo timol al 1-2% ...........................3.0 ml Agua destilada c.s.p. ...................................1000 ml. Agar .................................................................15.0 g Ajustar a pH = 6.8- 7.0, color del medio: verde Se inocula por estrías 3nicamente sobre la porción inclinada del medio en pico de flauta. Incubación: 37°C durante 24-48 h. Interpretación: 1. POSITIVO: crecimiento con viraje al azul intenso en el pico de flauta (a veces todo el medio). 2. NEGATIVO: no se observa crecimiento ni cambio de color del medio (permanece verde). Área Microbiología 43 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos 4. PRUEBA DEL INDOL Fundamento: Determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar al triptofano produciendo indol. El triptofano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indólicos principales: indol, escatol e indolacético. Diversas enzimas intracelulares intervienen en este proceso formando un sistema completo vinculado con la producción de indol y reciben el nombre de “triptofanasas”. Para la realización de la prueba se utilizan medios a base de peptona, dentro de cuyos aminoácidos se encuentra el triptofano, en caso de ser éste hidrolizado el indol puede ser detectado por un reactivo que produzca una combinación química con desarrollo de color. Medio utilizado: agar sulfuro de hidrógeno, indol, movilidad (SIM) Tripteína...................................................2.0 g Peptona ...................................................0.5 g Sulfato de hierro y amonio..................... 0.02 g Tiosulfato de sodio...................................0.02 g Agar....................................................... 0.35 g Agua destilada c.s.p. ...........................100 ml pH = 7.3 ± 0.2 Se siembra por punción e incuba a 37°C durante 24-48 h. Transcurrido ese tiempo se adiciona el reactivo de Kovacs o el de Erlich. -Reactivo de Kovacs Alcohol amílico............ ........................150 ml p-dimetilaminobenzaldehido................. 2 g HCl concentrado .................................. 50 ml Se adicionan 5 gotas y se agita suavemente. Se lee. -Reactivo de Erlich: Alcohol etílico.......................................190 ml p-dimetilaminobenzaldehido................ 2g HCl concentrado.................................. 40 ml Se adiciona 1 ml de éter para extraer el indol y luego 0.5 ml del reactivo por las paredes del tubo. Se lee. Interpretación: -POSITIVO: anillo rojo en la superficie del medio, en la capa alcohólica. -NEGATIVO: toma el color del reactivo (amarillo). Área Microbiología 44 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Reacción de color Fundamento: la estructura pirrólica del indol reacciona con el p-dimetilaminobenzaldehido presente en cualquiera de ambos reactivos formando una estructura quinoide de color violáceo. Este complejo es extraído y concentrado por el alcohol amílico del reactivo de Kovacs o por el éter adicionado previamente al agregado del reactivo de Ehrlich. 5. PRUEBA DE PRODUCCION DE ACIDO SULFHIDRICO Fundamento: determinar si un microorganismo es capaz de liberar ácido sulfhídrico por acción enzimática sobre los aminoácidos que contienen azufre, produciendo una reacción visible de color negro. Algunas especies heterotróficas de bacterias son capaces de liberar H2S a partir de los aminoácidos azufrados que contienen las proteínas. Estos aminoácidos son metionina, cistina, y cisteína. Un germen productor de H2S cultivado en un medio orgánico como la peptona (agua peptonada, Triple azúcar hierro, agar hierro de Kliger, etc), reduce el azufre por hidrogenación liberando H2S el que es detectado por una reacción de formación de un sulfuro metálico oscuro. Medio utilizado: agar SIM (ver prueba del indol) Se siembra por punción y se incuba a 37ºC durante 24-48 h. El germen por acción enzimática reduce el S2O3= (tiosulfato) a H2S, el cual reacciona con el sulfato férrico amoniacal produciendo la formación de un precipitado negro de FeS. Interpretación POSITIVO: coloración negro-parduzca en la línea de punción. NEGATIVO: no hay cambio de color. 6. PRUEBA DE LA MOVILIDAD Fundamento: muchos microorganismos poseen flagelos, que son responsables de su movilidad, la que se puede poner de manifiesto por observación en fresco, o bien, sembrando en agar blando y observando el crecimiento. Medio: se puede utilizar agar SIM en tubos de hemólisis, sembrado por punción con ansa recta; o agar nutritivo al 0.3% (agar blando). Incubar y observar. Interpretación: -POSITIVO: se observa crecimiento por debajo de la línea de siembra. -NEGATIVO: el crecimiento se circunscribe a la línea de punción. Área Microbiología 45 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos 7. PRUEBA CON AGAR TRIPLE AZUCAR (TSI) Y AGAR HIERRO DE KLIGER Fundamento: el principio de esta prueba es determinar la capacidad de un microorganismo para: 1) atacar un hidrato de carbono (que se encuentra incluido en el medio de cultivo), 2) producir gas y, 3) la posible producción de H2S. La producción de H2S y/o las diversas formas de fermentación de azúcares son características de los grupos, géneros o especies bacterianas y, sobre todo entre la familia Enterobacteriaceae, ayudan además a determinar género. Medio: agar triple azúcar hierro (TSI) Polipeptona...........................................................20 g Lactosa..................................................................10 g Sacarosa................................................................10 g Glucosa.................................................................. 1 g NaCl....................................................................... 5 g Citrato férrico de amonio (mezcla 50:50)............. 0.5 g Na2S2O3 ............................................................... 0.5 g Rojo de fenol......................................................0.025 g Agar ..................................................................... 15 g Agua destilada...................................................1000 ml pH = 7.4 Este medio se obtiene en el comercio como polvo el cual se rehidrata según las instrucciones del fabricante. Se funde y se envasa en tubos de hemólisis (2.5 ml por tubo). Se tapan los tubos y se autoclava durante 15 min a 120°C.Para solidificar, se coloca semiinclinado y se obtienen agar en pico de flauta. Se siembra por punción con ansa recta y luego, sin cargar, se estría toda la superficie. Incubar a 35-37°C por 18-24 h. Interpretación A) Utilización de hidratos de carbono B) 1. Si utiliza solamente glucosa: a) pico de flauta (superficie): reacción alcalina (color rojo) b) profundidad: amarillo (reacción ácida). Si produce H2S: color negro puede enmascarar el color amarillo. 2. Fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa: a) pico de flauta: amarillo b) profundidad: amarillo. Si produce H2S puede enmascarar el color. Área Microbiología 46 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos 3. No fermenta glucosa, sacarosa ni lactosa: para organismos no entéricos: a) superficie alcalina, color rojo b) profundidad: si es aerobio no hay crecimiento: no cambia el color. Si es facultativo hay crecimiento: no cambia el color. C) producción de H2S Hay precipitación del FeS de color negro, que se observa como: -color negro en toda la capa profunda -color negro en la parte superior de la capa profunda -color negro en la parte profunda pero sin enmascarar la acidez. Es fundamental que la lectura se realice entre las 18-24 h, ni antes ni después, puesto que puede llevar a interpretaciones erróneas. D) producción de gas Si el microorganismo es aerogénico: hay producción de CO2 e H2 y se observan burbujas en el medio de cultivo, desdoblamiento y/o desplazamiento del medio, ligera muesca producida por el gas en el medio que se observa en el costado del tubo. Nota: la razón por la cual cuando el microorganismo utiliza solamente glucosa, el pico de flauta es de color rojo y la profundidad amarilla, se debe a que en superficie el microorganismo utiliza glucosa por un metabolismo oxidativo llevando los productos del metabolismo a CO2 y H2O, y para poder seguir creciendo metaboliza la peptona con producción de NH3 y alcalinización de la superficie. En cambio, en profundidad, los productos formados son ácidos estables de alguna de las distintas vías de fermentación, lo que produce color amarillo. Si la lectura se realiza después de las 24 h, estos ácidos pueden difundir hacia la superficie y se obtienen interpretaciones erróneas. Área Microbiología 47 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRACTICO Nº 7 PARTE B: PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS Antibióticos: son sustancias antimicrobianas de origen microbiano, ejemplo penicilina. Quimioterápicos: son sustancias antimicrobianas de origen no microbiano, por ejemplo: sulfamidas. Antibiograma: es un procedimiento de laboratorio para determinar la susceptibilidad de un microorganismo frente a los antimicrobianos. Los principales métodos utilizados por el laboratorio son: Método de dilución: A. En tubos con caldo B. En placas con agar Método de difusión en agar: A. Kirby-Bauer B. Kirby-Bauer modificado por Barry La técnica actualmente utilizada para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales desde hace mas de 2 décadas enfocados a normatizar el método. Sin embargo, la falta de un acuerdo general sobre los puntos de corte para la interpretación de estas pruebas continúan siendo un tema de importantes discusiones internacionales. Europa está dividida en varias regiones de influencia con diferentes sistemas de sensibilidad antimicrobiana: Grupo Sueco de Referencia de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de Microbiología y el Comité de estandarización de Laboratorios clínicos (NCCLS). En nuestro país y en la mayoría de los países latinoamericanos se siguen las pautas del NCCLS (National Commite for Clinical Laboratory Standars) con algunas modificaciones. El principio del método involucra el uso de una cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicado sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestión. Se formará así por difusión, un gradiente de concentración del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del reservorio. El diámetro obtenido dependerá no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino también del espesor de la capa de agar, su pH y composición, de la capacidad de difusión de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de duplicación bacteriana, y el tamaño y fase de crecimiento del inóculo. Área Microbiología 48 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos El método recomendado por la NCCLS se basa en los estudios de Bauer y col. Este es el método descripto de manera mas completa para el cual se han desarrollado tablas de interpretación que están respaldadas por datos clínicos y de laboratorio. El único método alternativo que ha sido estudiado adecuadamente y que demostró datos comparables de los diámetros de las zonas de inhibición, con precisión similar y correlación satisfactoria con la CIM, es la modificación de doble capa de Barry, García y Thrupp. Este método es una alternativa aceptable para la normalización del inóculo en las pruebas de sensibilidad de gérmenes de rápido crecimiento como S.aureus, Enterobacterias y P.aeruginosa, no es aplicable a bacterias como Streptococcus spp., Haemophilus spp., etc. Las pruebas por cualquiera de los dos métodos pueden interpretarse con las mismas tablas de medida de los halos de inhibición si los resultados de las pruebas con las cepas controles se encuentran dentro de los rangos esperados. DIFUSIÓN POR DISCO TÉCNICA SEGÚN KIRBY-BAUER (recomendada por NCCLS) Preparación de las placas: el medio que se utiliza es el agar Mueller-Hinton. este se considera el mejor para los test de sensibilidad ya que muestra buena reproducibilidad lote a lote, contiene bajo nivel de inhibidores para determinados antibióticos y permite un desarrollo adecuado en la mayoría de los microorganismos. 1- Preparar el agar a partir de la base deshidratada, esterilizar en autoclave 15 minutos. Enfriar a 45-50°C 2- Colocar unos 25 ml aproximadamente en cada placa (diámetro de 100 mm) de manera tal de obtener un espesor del agar de 4 mm. El medio debe tener un pH de 7,2-7,4. 3- Secar las placas en estufa durante 15-30 minutos si la superficie tuviera exceso de humedad antes de inocularlas. 4- Las placas que no se usan en el día pueden mantenerse refrigeradas (2-8°C) Preparación del inóculo: para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez (0,5 de la escala de Mc Farland). Dicho estándar se prepara agregando 0,5 ml de BaCl2 0,048 M (1,75 % p/v BaCl2.H2O) a 99,5 ml de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% v/v) 1-Seleccionar 4-5 colonias bien aisladas de igual morfología de la placa de cultivo. Preparar una suspensión en 4 o 5 ml de un caldo apropiado (tripteína soja) tocando la parte superior de cada colonia. 2-Incubar a 35°C hasta que este alcance o exceda la turbidez del estandar (2-6 h) 3-Ajustar la turbidez del inóculo con solución salina o caldo hasta el tubo 0,5 de la escala de Mc Farland, por comparación visual con el estándar. Esta suspensión contendrá aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/ ml. Área Microbiología 49 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos 4- Como método alternativo al descripto puede ser realizado la estandarización del inóculo a partir de las colonias aisladas llegando directamente al 0,5 de la escala sin previa incubación. Esto se usa en microorganismos de difícil desarrollo. Inoculación de las placas: se siembra dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo 1- Utilizar hisopo estéril, embeberlo con la suspensión, presionarlo contra las paredes del tubo a fin de escurrir el exceso de inóculo. 2- Inocular la superficie seca de MH por hisopado en tres direcciones para asegurar una completa distribución del inóculo. Las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y el desarrollo confluente o casi confluente. 3- Esperar de 3 a 5 minutos y no mas de 15 antes de aplicar los discos de antibióticos. 4- Incubar las placas invertidas 16 a 24 horas en aerobiosis, a 37°C. Interpretación de los resultados: se mide el diámetro de la zona de inhibición de cada disco y se determina según las tablas de puntos de corte la categoría de: sensible, intermedio o resistente. El punto final deberá tener en cuenta el área que no muestre desarrollo obvio a ojo desnudo, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeñas que puedan ser detectadas con mucha dificultad en el borde de la zona. TÉCNICA DE DISEMINACIÓN CON CUBIERTA DE AGAR, KIRBY –BAUER MODIFICADA POR BARRY. Debe utilizarse también agar MH, se vierten 18 ml en placas de Petri, se pueden preparar en el momento o bien almacenarlas a 2-8° C no más de 7 días. Secar en estufa ante de usar. Para preparar el inóculo se seleccionan 4-5 colonias bien aisladas que pertenezcan al mismo tipo morfológico, se tocan con ansa estéril y se siembran en tubo que contengan 0.5 ml de caldo infusión cerebro corazón, se incuba 4 a 6 horas a 35-37 °C, luego de este tiempo se traspasan de allí, con un ansa calibrada de 0,001 ml, a un tubo que contiene 7 ml de agar fundido y enfriado (solución acuosa de Bacto agar Difco al 1,5 %), se mezcla bien y se disemina sobre la superficie entibiada de la placa de MH, esto proporciona una distribución muy uniforme del inóculo. A los 3-5 minutos de la inoculación se aplican los discos con una pinza estéril y se incuban en aerobiosis a 35°C durante 1924 horas. El principio importante de esta técnica es la manera de uniformar el inóculo por desarrollo en pequeños volúmenes de caldo. El método de diseminación con cubierta de agar para inocular las placas no solo es mas rendidor que el hisopado, también produce zonas de inhibición mejor definidas, mas nítidas y mas fáciles de medir. Área Microbiología 50 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos MÉTODO DE DILUCIÓN EN TUBO Las técnicas de dilución en caldo o agar, se pueden utilizar para medir cuantitativamente la actividad “in vitro” de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano. Estos métodos se basan en la preparación de una serie de tubos o placas con caldo o agar, respectivamente, a los cuales se les agrega el antibiótico en distintas concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos o las placas con una suspensión estandarizada del microorganismo ensayado. El valor de la CIM obtenido por estos métodos, orienta al clínico sobre que concentración de antibiótico necesita alcanzar en el sitio de infección para inhibir el microorganismo infectante. La metodología más común para la determinación de la CIM es la que utiliza diluciones al medio. Preparación de la solución de antibiótico: la droga pura puede obtenerse directamente del laboratorio productor o de otras fuentes comerciales. No se recomienda la utilización de las preparaciones para aplicación parenteral. Debe conocerse el lote, la potencia (generalmente expresada en µg o UI/mg de polvo) y la fecha de vencimiento, debe almacenarse según las recomendaciones del productor, generalmente a – 20 °C. Se deben preparar soluciones madres de por lo menos 1000 µg /ml o de una concentración 10 veces mayor que la mas alta del rango establecido y conservarse en alícuotas a –6°C por 6 meses o mas. Preparación de las diluciones: La prueba se realiza en tubos de hemólisis tapados con algodón o tapas de plástico o metal. El medio recomendado es el caldo Mueller Hinton. 1-Tomar una gradilla con 12 tubos. 2-Colocar 0,5 ml de caldo en cada uno de los tubos, dejando el primero vacío. El 11 será el control de inóculo (control positivo) que contenga caldo más inóculo, y el 12 el control de esterilidad o control negativo (tubo que contenga caldo solo). 3-Partimos de una solución de antibiótico de trabajo de 256 µg/ml, (que contendrá el doble de concentración de antibótico que se desee obtener en el primer tubo de la CIM). Colocar 0,5 ml del mismo en el primer tubo y 0,5 ml en el segundo. Mezclar el tubo 2 y transferir 0,5 ml al tubo 3, con la misma pipeta transferir 0,5 al tubo 4, y así sucesivamente, hasta llegar al tubo 10. Descartar 0,5 ml de la dilución del tubo 10. Así obtendremos diluciones al medio del antibiótico. Preparación del inóculo: Obtener una turbidez equivalente al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland, por cualquiera de los métodos descriptos en la técnica de difusión. 1-Una vez obtenido el inóculo de turbidez 0,5 tomar 0,1 ml del mismo colocarlo en 9,9 ml del caldo (dilución 1/100) de manera que contenga aproximadamente 5x106 UFC/ml. Siembra del inóculo de trabajo: Distribuir 0,5 ml de inóculo de trabajo (1x106) en los 11 tubos de la CIM (tubo 1 al 10) y en el control de desarrollo (tubo 11). El tubo 12 es el control de esterilidad del caldo Los tubos 1 al 11 ahora tendrán 5x105 UFC/ml. Área Microbiología 51 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos El inóculo debe ser agregado a las diluciones dentro de los 15 minutos de estandarizado. Incubación: Incubar 16-20 horas a 37 °C en aerobiosis. Lectura de los resultados: La CIM es la menor concentración de antibiótico capaz de inhibir completamente el desarrollo bacteriano en el tubo, el punto final queda definido a simple vista por la falta de turbidez del caldo Luego de realizadas las diluciones se agrega 0,5 ml de inóculo en cada tubo excepto en el control negativo. Área Microbiología 52 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRÁCTICO Nº 8 REACCIONES ANTIGENO-ANTICUERPO Se denomina antígeno (Ag) a cualquier sustancia extraña que, introducida en el interior del organismo, provoque una respuesta inmunitaria, estimulando la producción de anticuerpos. Los anticuerpos (Ac) se encuentran en el suero del paciente. Son producidos únicamente en respuesta a un antígeno específico: una persona producirá anticuerpos contra un antígeno determinado (bacteria, virus, etc) sólo cuando ese antígeno ingrese a su cuerpo. La unión Ag-Ac es específica, cada anticuerpo reconoce y se une sólo a un determinado Ag. En general para poner en evidencia los anticuerpos, una muestra de suero del paciente se mezcla con antígeno conocido correspondiente a la enfermedad que se sospecha. Luego se observa el resultado de la reacción. Los anticuerpos son proteínas pertenecientes al grupo de las gammaglobulinas o inmuno- globulinas, formadas por 4 cadenas polipeptídicas (2 pesadas y 2 livianas) unidas entre sí por puentes disulfuro. Incluyen una región variable por donde se unen al antígeno, y una región invariable reaccionan con por donde anticuerpos antigamma-globulina. Existen cinco cadenas pesadas distintas que forman los cinco tipos de inmunoglobulinas. El nombre de cada inmunoglobulina viene dado por su cadena pesada (Cadena gamma = Inmunoglobulina gamma (Ig G)). En cuanto a las cadenas ligeras, solo existen dos tipos, κ (kappa) y λ (lambda). Existen por tanto cinco tipos de inmunoglobulinas, una por cada cadena pesada. Algunas de ellas pueden formar agrupaciones, como el caso de la Ig G y la Ig A. Los cinco tipos de inmunoglobulinas son: Área Microbiología 53 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Ig M (cad. µ). Pentámero. Ig G (cad. γ). Atraviesa la placenta. Ig A (cad. ). Sérica y secretoria. Se encuentra como dímero. Ig D (cad. δ). Ig E (cad. ε). Son las regiones N terminales las responsables de reconocer al antígeno. El resto, que se denomina región constante, es la que cumple la función del anticuerpo. La región variable cambia mucho entre anticuerpos. Las dos cadenas tienen región variable. La combinación entre la región variable de la cadena ligera y la de la cadena pesada constituye la región que reconoce el determinante antigénico. Los dos brazos de son iguales, pudiendo unir dos determinantes antigénicos iguales. Este es el número de valencia de un anticuerpo (2), pero existen dos excepciones. En el caso de la Ig M, esta se encuentra en pentámeros, que se forman al unirse los anticuerpos al denominado segmento J, con lo cual presenta una valencia potencial de 10. Algo similar ocurre con la Ig A, que formar agregados por el segmento J, forma dímeros o trímeros, con valencias potenciales de 4 y 6, respectivamente. Los tres tipos restantes son monómeros. Regla nemotécnica: GAMDE. Los anticuerpos se encuentran circulantes. La de mayor concentración es la IgG seguida de la IgA y la IgM. La IgG puede pasar a través de la placenta. El niño tiene sus primeras inmunoglobulinas de la madre. No forma anticuerpos a menos que se produzca una infección, por lo que sintetizaría IgM. Ventajas de los anticuerpos en las técnicas de inmunología. La interacción antígeno-anticuerpo es específica, pudiendo determinar la presencia del antígeno que buscamos en una mezcla de sustancias, sin necesidad de purificar. Nos permiten realizar técnicas muy específicas. Hay que saber la concentración de lo que queremos medir, además de contar con el tamaño de aquello que buscamos. También hay que conocer el mayor o menor grado de especificidad, que depende de pureza de la muestra y del anticuerpo que utilicemos. La selección de reactivos es importante. Podemos determinar muchas veces el anticuerpo y el antígeno. Hay que conocer el grado de afinidad entre ellos. Avidez: Es la sumatoria de fuerzas que se establecen entre un antígeno y un anticuerpo multivalentes. Una IgM uniéndose por varios brazos tendrá alta avidez aunque su afinidad Área Microbiología 54 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos sea pequeña. Depende de la afinidad y de las valencias, así como de la estructura en el espacio. Especificidad: El anticuerpo reconoce y se une sólo a un determinado antígeno. Los anticuerpos deben estar en condiciones correctas, para ello se usa el denominado buffer fisiológico. Podemos utilizar matrices para desarrollar las técnicas. A veces son semisólidas, plásticas, de vidrio, etc. En resumen, las ventajas del uso de las técnicas de inmunología son dos, la especificidad y la rapidez. Clasificación de las técnicas inmunológicas según la forma de visualizar la reacción: Reacciones 1rias: * La visualización depende de una interacción simple Ag-Ac. * Necesita un sistema auxiliar de revelado. * Tiene una alta sensibilidad. * Ejemplos: IF, EIA (ELISA, Inmunoblotting, quimioluminiscencia), RIA,. Reacciones 2rias: * La visualización depende de fenómenos donde intervienen muchas moléculas de antígeno y anticuerpo. * No requieren sistema de revelado. Cambio físico. Observación visual. * Tienen una baja sensibilidad. * Ejemplos: Aglutinación (directa, indirecta), Precipitación. Reacciones 2rias: Técnica de aglutinación. Se basa en la propiedad de los anticuerpos de tener dos brazos o sitios de unión al antígeno. Unen los antígenos aproximándolos en el espacio, formando complejos insolubles. En una primera fase las moléculas de anticuerpo se van uniendo, y siempre que tengan más de un determinante antigénico igual, se producirá la aglutinación. Otra propiedad que deben tener los antígenos para que aglutinen es que deben ser particulados (bacterias, hematíes, etc). En el caso que fuesen solubles, se adsorben sobre una partícula (hematíes, látex, etc). Necesitamos que el antígeno tenga mas de un determinante antigénico igual, para poder ser reconocido por más de un anticuerpo a la vez, formando redes que sean insolubles y aglutine. Área Microbiología 55 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos La concentración de antígeno y anticuerpo debe ser homogénea, con un poco de exceso de anticuerpo. Si el exceso de anticuerpo es grande, este no formará redes. El momento óptimo estará en proporciones bastantes homogéneas, donde la aglutinación será máxima y se conoce como zona de equivalencia. En excesos de antígeno los anticuerpos estarán bloqueados y no aglutinan. Podemos realizar una curva. 1. Aglutinación Anticuerpos presentes en el suero del paciente provocan la agrupación o aglutinación de antígenos particulados (esto significa que los antígenos están adheridos a soportes ó partículas insolubles más grandes). Esto puede ocurrir naturalmente cuando pensamos en antígenos que forman parte de bacterias o glóbulos rojos, o artificialmente cuando los antígenos son intencionalmente adheridos a perlas de látex o partículas de carbón. En el primer caso se habla de aglutinación directa y el segundo caso de aglutinación indirecta o pasiva. Área Microbiología 56 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos En aglutinación un Ac puede unirse a la vez a 2 Ag. A su vez cada Ag puede S S unirse a varios Ac. Se forma una trama de complejos Ag-Ac que aglutina y se puede observar a ojo desnudo. Ag Ag S = Soporte (eritrocito, bacteria, perla Ac de látex) Aglutinación directa: El antígeno es particulado por naturaleza. Ej: glóbulos rojos, linfocitos, bacterias, parásitos, etc. Determinación de antígeno de grupo sanguíneo y factor Rh Los sistemas ABO y Rh pueden resumirse en el siguiente cuadro: Grupo Sanguíneo A B O AB Rh Ag en eritrocito A B ninguno AyB Rh (ó D) Reacciona con: Anti-A Anti-B ninguno Anti-A y Anti-B Anti-D Aglutinación indirecta El antígeno no es particulado por naturaleza y por lo tanto debemos particularlo adsorbiéndolo a y una partícula como látex o hematíes. Puede usarse el tanino como pegamento, entre otros. Incubación: Hematíes o látex + antígeno. El antígeno particulado obtenido será empleado para la determinación de anticuerpos en los diferentes tipos de muestra. La reacción será visible con la formación de grumos. A pesar de ser una técnica diseñada para su uso cualitativo, puede hacerse semicuantitativa mediante el uso de diluciones. Esta técnica es capaz de detectar 0,001 µg/ml. Se denomina título a la última dilución del suero que da reacción positiva. Aglutinación pasiva (o indirecta) reversa: se denomina al anticuerpo particulado para la determinación de antígeno mediante una técnica de aglutinación. Ej: anticuerpo unido a latex. Área Microbiología 57 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Reacciones 1rias: Técnicas de ligando. En este tipo de reacciones podemos visualizar la unión antígeno-anticuerpo marcando cualquiera de los dos inmunorreactivos, sin modificar sus propiedades de reconocimiento antígeno-anticuerpo. Podemos realizar el marcaje con: Radioisótopos (RIA). Enzima (EIA, ELISA, quimioluminiscencia). Fluorocromos (Inmunofluorescencia). 1. Enzyme Link Inmuno Solvent Assay (ELISA) Se basan en dos fenómenos biológicos importantes: 1.- elevada especificidad de los Ac 2.- alta actividad de algunas enzimas, lo que permite la amplificación de la señal generada por la muestra Por lo tanto se emplean anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Clasificación Homogéneos: fase líquida Heterogéneos: fase sólida ELISA heterogéneo En todos los ensayos inmunoenzimáticos en fase sólida, independiente de las numerosas estrategias existentes, se pueden distinguir 3 etapas: 1.- inmunovilización del inmunorreactante (Ag o Ac) en fase sólida 2.- incubación con la muestra de modo que esta reaccione con el inmunorreactante inmovilizado 3.- amplificación o modulación por medio de la utilización de un conjugado enzimático (etapa que puede ser realizada en más de un paso). Área Microbiología 58 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos *Competitivo (o de modulación). Determinación de anticuerpo *No competitivo (o de amplificación). Determinación de Ag Determinación de Ac Determinación de Ag Bloqueo El procesamiento de los datos y expresión de los resultados puede llevarse a cabo de a cuerdo a tres tipos de ensayo. Área Microbiología 59 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Cualitativo: se necesita un punto de corte con controles negativos. Semicuantitativo: se necesita un punto de corte con controles negativos. Cuantitativo: se necesita una curva patrón con testigos de concentración conocida 2. Inmunofluorescencia (IF). Los fluorocromos reciben luz a una determinada longitud de onda (excitación), y emiten a otra longitud de onda mayor (menor energía) que podrá ser detectado dentro el espectro en la región visible. A este fenómeno se lo denomina fluorescencia. La inmunofluorescencia es una técnica menos sensible a ELISA y se diferencian en: En IF el anticuerpo está unido a un fluorocromo. En vez de utilizar antígenos pegados a placas, se utilizan improntas de tejidos o células aisladas sobre la cual se va a producir la reacción. La ventaja en la conservación de estructuras. La visualización se realiza con un microscopio de fluorescencia. Es una técnica cualitativa y semicuantitativa pero no es cuantitativa Área Microbiología 60 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Inmunofluorescencia directa (IFD) En esta técnica el primer anticuerpo está marcado directamente con el fluorocromo. La impronta puede ser una biopsia de un tejido del paciente. Se busca, en la impronta, el antígeno. Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Es más utilizada para diagnóstico. En este caso el primer anticuerpo no está marcado (el cual se trata del suero del paciente). Usamos un anticuerpo secundario que reconozca el primer anticuerpo. Puede aplicarse para la búsqueda de Ag, en la impronta, o la búsqueda de Ac en suero u otros fluidos. Área Microbiología 61 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRÁCTICO Nº 9 PARTE A: UROCULTIVO Las infecciones bacterianas del tracto urinario afectan a personas de todas las edades y ambos sexos y la gravedad varía desde aquellas que pasan inadvertidas a las que comprometen seriamente al organismo. El único medio seguro para el diagnóstico específico de infección urinaria (IU) es la demostración de las bacterias por métodos de cultivo adecuados. La orina es un excelente medio de cultivo para los gérmenes patógenos más comunes del tracto urinario y cuando las bacterias pasan a la orina, se multiplican en forma extraordinaria superando a veces el millón por ml. Las enterobacterias se reproducen cada 20 min, o sea que en ese tiempo se duplican dentro de la vejiga. Normalmente la orina de la vejiga es estéril, pero hay factores que favorecen o facilitan la IU, ellos son: Anormalidad funcional y/o estructural en riñón, uréteres, vejiga y uretra. Susceptibilidad del paciente debido a leucopenias, agranulocitosis, agamaglobulinemias, anemias, lesiones orgánicas, etc. Virulencia de la bacteria. Trastornos circulatorios que favorecen la localización de las bacterias en vejiga. Trastornos de tipo obstructivo por malformación congénita en vías urinarias. Vaciamiento incompleto de la vejiga en el momento de orinar. Vías urinarias A las vías urinarias las podemos dividir en: vías urinarias altas que comprenden riñón y uréteres vías urinarias bajas que comprende vejiga y uretra. Tanto riñón como uréteres y vejiga son estériles y la orina en vejiga es estéril, pero al pasar por uretra arrastra la flora que es propia de ésta. Mecanismo de las infecciones urinarias Vía hemática: en cuyo caso el foco infeccioso o séptico se encuentra lejos del riñón (oído, pulmón, etc). El ejemplo clásico es la tuberculosis renal. El bacilo de koch que se encuentra en pulmón, en un determinado momento de la enfermedad pasa a sangre y esta lo transporta a riñón, y dependiendo del estado inmunitario del paciente se instala o no. Área Microbiología 62 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Las bacterias de uretra, debido a la proximidad con la zona del ano, penetran a la vejiga y desde allí por los uréteres hasta riñón. Esta es la vía más común y la siguen por lo general las enterobacterias. Vía linfática: la infección se produce porque ocurre una anastomosis de vasos linfáticos intestinales con los renales. Esta vía la siguen las enterobacterias u Streptococcus fecalis. Agentes etiológicos más comunes de IU En un 97% las IU son monomicrobianas, es decir el agente etiológico es uno solo, y en solamente un 3% las IU son polimicrobianas. Las bacterias gramnegativas en especial las enterobacterias son los agentes etiológicos más frecuentes de las IU, ocupando E. coli el primer lugar, seguida por otras enterobacterias tales como Klebsiella, Enterobacter y Proteus mirabilis .Aunque poco frecuente, es característica la infección por estafilococos coagulasa negativos en la mujer joven sexualmente activa. Tipos de infección Pielonefritis: comprende la pelvis y parénquima renal. Es muy común. Cistitis: infección localizada en la vejiga, con bacteriuria. Glomerulonefritis difusa: (GN): El sedimento urinario es muy patológico ( hematuria, cilindruria, leucocituria). No hay bacterias en orina, aparecen esta GN después de una infección a Streptococcus beta hemolítico del grupo A y de escarlatina. Se forma un complejo antígeno- anticuerpo que se fija al complemento a pesar que los antígenos estreptococicos rara vez se han demostrado en los glomérulos. Glomerulonefritis focal: hay bacterias en riñon llegadas a él por vía hemática (septicemia Aparecen focos sépticos que supuran y el agente etiológico más común es el Streptococcus. Hay bacterias en orina. Tuberculosis renal: es una complicación secundaria de una tuberculosis pulmonar. Si la caverna no está abierta, en orina sólo observan cilindros y hematíes. En caso de estar las cavernas abiertas además se observan piocitos. Cuando se sospecha de tuberculosis renal se debe hacer coloración de Zielh Neelsen para observar bacilos ácido alcohol resistentes. Toma de muestra a) Condiciones previas: Se examinará de preferencia la orina de la mañana, o bien con una retención mínima de 3 horas. No deben administrarse antibióticos 72 h antes de la recolección b) Higiene: Área Microbiología 63 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos En hombres y niños con control de esfínteres se debe realizar limpieza de la zona prepucial y glande con agua hervida y enfriada y jabón preferentemente nuevo. También se puede usar desinfectante diluido. Enjuagar con abundante agua hervida. Mujeres y niñas con control de esfínteres: se efectúa limpieza de la zona vulvo-vaginal y del introito uretral en las mismas condiciones indicadas para hombres. Es conveniente, en casos que sea posible, la colocación de tapón vaginal. Lactantes y niños sin control de esfínteres: se retiran los pañales y se lava bien la zona anal y perianal con algún desinfectante recientemente diluido (espadol, fisohex, etc) y se enjuaga con agua hervida tibia o agua destilada estéril. c) Recolección - Técnica del “chorro medio” Se debe eliminar un chorro prolongado de orina (100-150 ml), y luego se recolecta la segunda parte de la micción en un recipiente estéril. En casos de niños sin control de esfínteres se queda al acecho con el recipiente preparado esperando a que el niño orine tratando de recolectar la parte media de la micción. Será conveniente mantener el recipiente tapado hasta que el niño comience a orinar; en casi de no ser posible, se aconseja cambiarlo cada 30 min. - Punción suprapúbica Se usa generalmente para pacientes que están inconcientes, en coma. Se llega con aguja hasta vejiga y se extrae orina, es muy dolorosa y la realiza el médico. Cuando se extrae orina por este método, no es necesario hacer recuento de colonias ya que de encontrarse alguna bacteria, ésta es la responsable de la infección debido a que la vejiga normalmente es estéril. - Sondeo vesical No es conveniente, pues se corre el riesgo que al introducir la sonda se infecte la vejiga y le provoque IU. c) Transporte de la orina Lo ideal es que se procese inmediatamente luego de tomada la muestra, en caso de no ser posible, se la debe conservar en heladera a 4-8°C para impedir la proliferación de los gérmenes y de resultado falso positivo. Observaciones NO debe quedar antiséptico que pase a la orina e interfiera en el cultivo. NO se debe instrumentar , es decir, en los posible no obtener la muestra por sondeo. NO conservar la muestra a temperatura ambiente sino en heladera hasta ser procesada. Determinaciones que ayudan al diagnóstico de la IU Área Microbiología 64 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos a.- Examen microscópico del sedimento en fresco para poner de manifiesto la presencia de hematíes, leucocitos, cilindros, cristales. Leucocitos: normalmente hay 2-3 por campo. Si están aumentados y aglutinados indica inflamación. Una leucocituria patológica puede deberse a una infección de las vías excretoras altas. Hematíes: normalmente 1-2 por campo. La existencia de una hematuria patológica puede estar en relación tanto de una lesión de las vías excretoras altas o bajas o una lesión parenquimatosa renal localizada o difusa. Cilindros en orina, es sinónimo de proteinuria, pues el papel de la albúmina es preponderante en su formación; además, el estudio de sus inclusiones permite reconocer el origen renal de los elementos celulares contenidos en la orina. Cristales pueden ser componentes normales ó no, depende de su naturaleza. b) Coloración de Gram : ayuda a seleccionar los medios a sembrar c) Determinación de la densidad de la orina : normal 1010-1030. d) Determinación de proteínas: valor normal 30-90 mg/24 h. e) Determinación de pH: valor normal 5,5-6-5 CULTIVO-SIEMBRA La siembra debe realizarse de la orina sin centrifugar con un ansa calibrada (5 μl), lo que permitirá obtener una estimación semicuantitativa del desarrollo microbiano (Técnica del ansa calibrada). Existen numerosos medios de cultivo para sembrar una muestra de orina. La elección del medio de cultivo debe contemplar la relación costo- beneficio, de modo de elegir la opción que permita la recuperación de la mayoría de patógenos con el menor costo posible. En Argentina se ha estandarizado el empleo de los siguientes medios: Agar CLDE (Cistina-LactosaDeficiente en Electrolitos) y Agar sangre que se incuban a 37 ºC 48 h. Técnica del ansa calibrada Procedimiento: Mezclar bien la orina, cargar el ansa de 5 ul y sembrar en media placa de CLDE tres estrías sin recargar el ansa. Incubar 24-48 h a 37°C y realizar recuento considerando: Crecimiento en la primer estría: 1.000 ufc/ml Crecimiento hasta la segunda estría: 10.000 ufc/ml Crecimiento hasta la tercer estría: más de 100.000 ufc/ml. Las bacterias aisladas deben identificarse mediante pruebas bioquímicas y debe estudiarse también su sensibilidad a los antimicrobianos. Área Microbiología 65 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos TRABAJO PRACTICO Nº 9 PARTE B: COPROCULTIVO El término coprocultivo se aplica en sentido estricto al aislamiento de las diferentes especies microbianas presentes en una muestra fecal. Esto es difícil de realizar en el laboratorio por la infinidad de microorganismos que pululan en el intestino, por eso, la búsqueda se orienta habitualmente a los gérmenes más frecuentes de reconocida acción patógena. Bacteriología intestinal Anteriormente se pensaba que la flora bacteriana intestinal era predominante en coliformes, actualmente se ha comprobado que las bacterias que predominan en el intestino normalmente son anaerobios no esporulados. De manera general se acepta que el tracto digestivo superior (estómago, duodeno, yeyuno e íleon superior) es estéril en el 69 a 71% de los casos o que presentan una escasa microflora constituida por microorganismos facultativos, predominantemente grampositivos: estreptococos, lactobacilos aerobios, difteroides y hongos. Estos microorganismos son capaces de sobrevivir a la acidez gastrica y provienen de la cavidad oral colonizando el estómago y el intestino superior después de las comidas, aunque en personas en ayunas se observa la presencia de reducida cantidad de microorganismos. La porción terminal de ileon presenta una zona de transición y la microflora empieza a cambiar con la aparición de microorganismos como coliformes y bacteroides anaerobios. La válvula ileocecal actúa como una verdadera barrera entre las especies grampositivas predominentes en el intestino delgado superior y los microorganismos gramnegativos del colon. En esta porción del intestino es de particular importancia el aumento en la población de anerobios: bacteroides, lactobacillus anaerobios y clostridios que son los mayores constituyentes de la flora colónica en concentraciones que varían de 108 y 1011 por ml. La flora fecal es predominante en microorganismos anaerobios gramnegativos encontrándose en una concentración de 1012 microorganismos por gramo de materia fecal. Las bacterias estrictamente anaerobias representan mas del 90% de la flora fecal. El tracto digestivo del feto es estéril. En el momento de nacer ocurre una masiva invasión bacteriana por la microflora de la piel de la madre y del medio ambiente, resultando una rápida colonización del tracto digestivo incluyendo el meconio. Bajo la influencia de la leche materna una microflora consistente en un 90% de Bifidumbacterium bifidus se desarrolla entre el 3 y 4 dia de vida. La importancia de Bifidumbacterium bifidus radica en que ejercen acción antibacteriana, producen vitaminas y son capaces de producir ahorro proteico. Área Microbiología 66 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos En niños alimentados con leche de vaca las bifidobacterias permanecen como una importante parte de la flora cultivable y los bacteroides estan presentes en igual número o mas que ellas. También están presentes algunos componentes regulares de la microflora fecal, principalmente los aerobios, entre ellos los coliformes, estreptococos y lactobacilos en un 5% aproximadamente. Los clostridios, estafilococos, proteus y hongos están en pequeño número. Factores que regulan el desarrollo y mantenimiento de la flora intestinal El tracto gastrointestinal no puede funcionar normalmente si no existe una microflora adecuada que debe mantenerse en equilibrio, para ello, el organismo posee mecanismos reguladores que impiden un sobredesarrollo de la microflora y la colonización del intestino por bacterias patógenas. Estos factores son: Barrera bactericida gástrica Sales biliares y motilidad intestinal (controlan la población bacteriana del intestino delgado) Sistema inmunosecretor del intestino que regula la flora intestinal y también tiene actividad en la resistencia intestinal contra la invasión patógena. Existe un marcado predominio en la mucosa intestinal de células conteniendo IgA. Importancia del coprocultivo El coprocultivo tiene especial valor porque nos permite realizar el diagnóstico etiológico de las infecciones intestinales, como así también permite detectar los portadores sanos. Estadísticamente se ha visto que solo un 15 a 30% de las diarreas se deben a gérmenes patógenos, por este motivo, se debe tratar con antibióticos siempre que se encuentre el agente causal, porque las diarreas pueden ser de origen virósico, deficiencias enzimáticas que llevan a mala absorción de hidratos de carbono, grasas, etc. Los tratamientos injustificados con antibióticos pueden producir efectos secundarios tales como la destrucción de la flora normal, se puede crear resistencia a antibióticos, como así también inducir a la colitis pseudomembranosa producida por Clostridium difficile. A veces las diarreas curan por seguir el curso natural de una enfermedad de carácter benigno, en otros casos el solo régimen dietético, el transitorio reposo del tubo digestivo y la reposición hidroelectrolítica y de flora intestinal es de gran utilidad, ya que el mayor peligro de las diarreas es la deshidratación y el desequilibrio electrolítico. Área Microbiología 67 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Patógenos que se deben investigar en un coprocultivo: En la práctica, la búsqueda se orienta habitualmente hacia la familia Enterobacteriaceae por comprender gérmenes de reconocida acción patógena. Escherichia coli patógenas Salmonella sp. Enterobacterias Shigella sp. Yersinia enterocolítica Vibrio cholerae y V. parahaemolyticus Campylobacter jejuni Mycobacterium tuberculosis Candida sp. Staphylococcus aureus Microorganismos de sobreinfección Clostridium difficile Pseudomonas aeruginosa Otros agentes causantes de infecciones intestinales pertenecen a virus, parásitos y hongos. Técnica de coprocultivo Recolección de la muestra a.- En adultos: por deposición espontánea en recipientes esterilizados. Es conveniente, a partir de heces recientemente emitidas, el uso de hisopo estéril, seleccionando las porciones mucosas, purulentas o sanguinolentas que provienen de regiones inflamadas del intestino. b.- En lactantes es útil el hisopado rectal. Es aconsejable evitar la toma directa del pañal salvo cuando la deposición es reciente. Conservación del material: se recomienda la siembra inmediata. Cuando esto no es posible, las heces pueden mantenerse en solución salina glicerinada y tamponada para su conservación hasta el momento de su procesamiento. Examen macroscópico de la muestra Es importante para determinar la presencia de sangre, mucus, parásitos, etc. en la materia fecal. Área Microbiología 68 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Examen microscópico Con lugol 1.- En fresco Con azul de metileno 2.- Previa coloración En fresco: colocar entre porta y cubreobjeto una gota de lugol y emulsionar en ella una ansada de materia fecal con el objeto de detectar la presencia de parásitos. En otro extremo del mismo portaobjeto, colocar una gota de azul de metileno de Loefler y emulsionar en ella una ansada de materia fecal (porción muco-pio-sanguinolenta), colocar el cubreobjeto, dejar actuar 2 a 3 min. antes de observar para una buena coloración nuclear; permite diferenciar leucocitos polimorfonucleares de los mononucleares. Se observan leucocitos fecales en shigelosis, salmonelosis, fiebre tifoidea, enteritis a Escherichia coli invasiva. No se observan leucocitos en diarreas a E. coli toxigénica no invasiva ni en diarreas virales. Previa coloración: extender una ansada de materia fecal en un portaobjetos y luego de secar y fijar, colorear por técnica de Gram. Es importante establecer el equilibrio entre la flora grampositiva y gramnegativa presente. Cultivo Una vez realizado el estudio macro y microscópico, junto a datos epidemiológicos que orientan acerca de la posible etiología, se procede a sembrar la muestra. Si las heces son líquidas se siembra directamente, de lo contrario se hace una suspensión en solución fisiológica estéril. Investigación de bacterias pertenecientes a los géneros Salmonella y Shigella 1.- Siembra en medios de enriquecimiento (líquidos): se emplean frecuentemente caldo selenito de sodio o caldo tetrationato de Mueller-Kauffman. Se siembra 1 g de materia fecal por 10 ml de medio. 2.- Siembra en medios de aislamiento (sólidos) :Los más usados son agar Salmonella- Shigella (SS), Agar Verde Brillante (VB), Bismuto sulfito agar (BiSA). 3.- Selección de colonias y siembra en medios diferenciales: Los diferentes tipos de colonias se eligen de acuerdo a su acción sobre la lactosa. En cada tubo se repica una colonia pura, es decir totalmente aislada. Además se siembra un agar inclinado de cada una para estudio serológico. Incubar durante 24 h a 37°C. Área Microbiología 69 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos 4.-Pruebas bioquímicas: se siembra una "pequeña batería" de medios para pruebas bioquímicas. Se incuba 24 h a 37°C y se interpreta los resultados. De acuerdo a los resultados obtenidos se seleccionan los tubos de agar inclinado correspondientes, a fin de efectuar los estudios serológicos para la identificación de la bacteria. 5.- Pruebas serológicas: colocar una gota de cada uno de los sueros polivalentes "O" de Salmonella y se suspende una ansada de cultivo. Si se produce aglutinación con alguno de ellos se ensayará con los monovalentes de ese grupo La serología para Shigella se hace suspendiendo una ansada de cultivo en los sueros de las diferentes especies. Observaciones: cuando en las siembras efectuadas el primer día no se aislan colonias sospechosas debe intentarse aislamiento a partir de medios de enriquecimiento En caso de aislar Salmonella o Shigella se realiza antibiograma a partir de cultivo puro. Investigación de Escherichia coli patógena La especies de Escherichia coli incluyen un gran número de serotipos. Algunos de estos son miembros de la flora intestinal normal, mientras que otros causan infección intestinal. Los serotipos que causan infección intestinal en el hombre son: - E. coli enterotoxigénica (ECET) - E. coli enteroinvasiva (ECEI) - E. coli enteropatógena (ECEP) - E. coli enterohemorrágica (ECEH) - E. coli enteroadherente (ECEA) Las ECET producen infecciones que se localizan en el intestino delgado y se adquieren por ingestión de alimentos, agua. Pueden producir una o dos clases de enterotoxinas denominadas LT (termolábil) Y ST (termoestable). Los serotipos de ECEI actúan por penetración en el epitelio del intestino grueso, es decir invaden. Los serotipos de ECEP son los asociados con diarreas infantiles, se adhieren al ribete en cepillo y los destruyen. No producen LT ni ST y no invaden la mucosa. Las ECEH están asociadas a la ingestión de hamburguesas contaminadas con E. coli O157:H7. Producen una verotoxina que inhibe la síntesis proteica. Ha sido descripta en EE.UU y Canadá. Las ECEA probablemente sean citotóxicas. Área Microbiología 70 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Investigación de ECEP Se basa en el estudio de propiedades bioquímicas y serológicas: 1.- Siembra en medios de aislamiento poco selectivos : agar EMB o agar Mac conkey 2.- Selección de colonias fermentadoras de lactosa: En EMB: colonias negras u oscuras con brillo metálico verdoso. En MC: colonias rosadas. Se selecciona 7-8 colonias y se siembran cada una de ellas en agar inclinado para estudios serológicos y en agar citrato de Simmons para descartar cepas citrato positivo que no son E. coli. 3.- Pruebas serólogicas presuntivas: si no hubo desarrollo en el medio citrato de realiza suspensión en SF a partir de los tubos de agar inclinado correspondientes para hacer pruebas de aglutinación. 4.- Pruebas bioquímicas: se realizan para confirmar la determinación serológica. Investigación de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus La mayoría de las infecciones clínicas causadas por especies de Vibrio son de naturaleza entérica y varían desde el cólera epidémico a casos esporádicos de diarrea. Su hábitat natural es el agua. El género Vibrio comprende microorganismos gramnegativos en forma de coma, y cuando se mueven lo hacen por flagelos polares. Contiene algunos patógenos intestinales más importantes para el hombre: Vibrio cholerae : agente del cólera asiático epidémico y Vibrio parahaemolyticus, que produce gastroenteritis invasiva a nivel de intestino grueso (colon). Su patología está asociada a la ingestión de productos de mar contaminados (crustáceos). Determinantes de patogenicidad V. cholerae produce neuraminidasa, mucinasa y proteasa, enzimas importantes para penetrar la capa de moco que recubre las células del intestino delgado; también tiene una adhesina que le permite adherirse al epitelio, flagelo para su movilidad y una enterotoxina. Esta enterotoxina conduce a un aumento de actividad de la adenilato ciclasa, aumenta el nivel AMP cíclico y esto lleva a la rápida secreción de electrolitos hacia la luz del intestino delgado con gran eliminación de líquido. Investigación en muestras fecales Las heces se recogen en las primeras 24 h de la enfermedad directamente o por hisopado rectal, antes de que el paciente reciba tratamiento con antimicrobianos, deben sembrarse inmediatamente o colocarse en medio de transporte, el que mantiene la viabilidad por 4 semanas. Investigación a partir de muestras de agua y alimentos Área Microbiología 71 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos 1.- Medios de enriquecimiento: Si la muestra es agua:se filtran 1-10 litros de agua y se siembra en agua peptonada alcalina (pH 9) y en un medio no selectivo como por ejemplo gelatina fosfato sal (GPS), se incuba a 35 °C y las colonias sospechosas se pasan a un medio selectivo como Agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS). Si la muestra es de alimentos: se pesan 25 g de alimento y se procede como el caso anterior. 2.- Aislamiento: no crecen bien en medios altamente selectivos usados para enterobacterias. El medio de elección es el (TCBS) donde V. cholerae desarrolla dando colonias planas, grandes y amarillas (por fermentación de sacarosa). V. parahaemolyticus forma colonias con centro verde azulado. 3.- Siembra en medios diferenciales (TSI) y para pruebas bioquímicas (oxidasa, actividad hemolítica, fermentación de hidratos de carbono, movilidad, producción de indol, etc) 4.- serología Campylobacter sp. Algunas especies del género Campylobacter son importantes enteropatógenos para el hombre, capaces de producir diarrea. Entre ellas: C. jejuni, C. coli, y C. lari . Existen otras especies como C. fetus, que producen infertilidad y aborto en ganado vacuno y diarreas y septicemias en el hombre. Son bacilos gramnegativos, espiralados, móviles por flagelo polar: Son microaerófilos. El reservorio es amplio, se han aislado de ganado ovino, porcino, vacuno y caprino; animales silvestres, agua, leche, aves migratorias y de corral, animales domésticos. Los subproductos de pollo tienen gran importancia en la transmisión de C jejuni en el hombre . El mecanismo de acción es por invasión, pasaje a la submucosa y ganglios linfáticos mesentéricos y producción de enterotoxina. El cuadro clínico se inicia con dolor abdominal y síntomas generales de infección, derivando luego en diarrea líquida o con sangre mucus, piocitos. Se limita a 3-7 días pero en algunos casos puede llevar a grave desnutrición o deshidratación. Diagnóstico microbiológico Se recomienda la toma de una porción de la deposición espontánea en un recipiente estéril y refrigerar a 4 °C hasta su siembra. También se puede obtener la muestra con hisopado rectal utilizando el medio de transporte de Cary Blair. Área Microbiología 72 2014 Microbiología General Tecnicatura Universitaria en Laboratorios Biológicos Examen directo: es útil para la rápida identificación presuntiva en caso de diarrea aguda. Se puede realizar con microscopio de contraste de fase o campo oscuro. La coloración de Gram permite observar morfología típica: curvas en S o en espiral alargada. Cultivo: se usa agar Mueller Hinton suplementado con 5-7% de sangre de carnero, mezcla antibiótica y suplemento de aerotolerancia (FBP): sulfato ferroso, metabisulfito de sodio y piruvato de sodio. La incubación se realiza en microaerofilia a 42°C, 24-48 h. El examen en fresco de las colonias muestra bacilos con activos movimientos en tirabuzón. Área Microbiología 73 2014