biología celular y molecular del cáncer metástasis - U

PRIMERA PARTE – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
DEL CÁNCER
QUÍMICA FISIOLÓGICA Y
PATOLOGÍA INTEGRADA I
2015
Generalidades y Conceptos
Oncogenes y Supresores de Tumores
Características del Cáncer (“hallmarks”)
Proliferación, Diferenciación y Muerte Celular
Angiogénesis
BIOLOGÍA CELULAR Y
MOLECULAR DEL CÁNCER
METÁSTASIS
Marcadores Emergentes
Invasión de Tejidos y Metástasis
SEGUNDA PARTE
Vicente A. Torres, PhD
Laboratorio de Biología Celular y Molecular
La Cascada de Metástasis
Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cáncer
Instituto de Investigación en Ciencias Odontológicas
Facultad de Odontología – Universidad de Chile
Centro FONDAP-ACCDIS
Muertes en Chile: años 1970, 1990, 2004
Prevalencia de Distintos Tipos de Cáncer en Chile
órgano/tejido vs ranking
mujeres
biliar
1o
2o
3o
6º
7º
11º
10º
hombres
El Cáncer de Colon como Modelo de Estudio
¿Qué sucede a nivel celular y
molecular durante el cáncer?
PÉRDIDA DE LA
HOMEOSTASIS CELULAR
TUMORIGÉNESIS
HOMEOSTASIS CELULAR
En un determinado tejido, las células deben co-existir de manera
organizada e interdependiente. En relación a ésto, se destacan una serie
de características que deben ser finamente reguladas:
tejido normal
pólipos y adenomas
adenocarcinoma
⇒PROLIFERACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR
⇒INTERACCIONES DE LA CÉLULA CON SU ENTORNO
⇒RESPUESTA A SEÑALES EXTRACELULARES
(MITÓGENOS Y FACTORES INHIBITORIAS DEL CRECIMIENTO)
⇒
“TRANSFORMACIÓN CELULAR”
tejido normal
Ejemplo en el cáncer de colon
muerte celular
Se han definido una serie de eventos característicos o marcadores
(hallmarks) asociados al cáncer
Proliferación
Douglas Hanahan &
Robert Weinberg
Cell 2000: 100: 57-70
Proliferación sostenida
cáncer colorectal
Evasión de la muerte celular
Douglas Hanahan &
Robert Weinberg
Cell 2011: 144: 646-674
muerte celular
muerte
celular
Proliferación
Proliferación
Normal
normal
cáncer
Hallmarks del Cáncer
INMORTALIDAD REPLICATIVA
SEÑALIZACIÓN PROLIFERATIVA SOSTENIDA
PÉRDIDA DE LA RESPUESTA A SEÑALES DE DIFERENCIACIÓN E
INHIBIDORAS DEL CRECIMIENTO
RESISTENCIA A LA MUERTE CELULAR
INDUCCIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS
INVASIÓN DE TEJIDOS Y METÁSTASIS
El orden y la temporalidad de
cada uno de estos
marcadores es propio de
cada neoplasia en particular
PROLIFERACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR
INTERACCIONES DE LA CÉLULA CON SU ENTORNO
La capacidad de proliferación en una célula somática es limitada. Esta
proliferación ocurre hasta alcanzar el “Límite de Hayflick” (Exp Cell Res
1965; 37: 614). Este límite restringe hasta 40-50 divisiones, luego del
cual se llega a un estado de “senescencia” y muerte celular
Dependencia de anclaje a sustrato: La proliferación celular está directamente
asociada a la interacción célula-matriz extracelular, mediada por integrinas
Inmortalización celular
Poblaciones clonales con
crecimiento continuo
Senescencia
(alteraciones teloméricas y
cromosomales, aneuploidía)
Pérdida de la dependencia de anclaje a sustrato
Las células pueden crecer en suspensión
Inhibición por contacto: En cultivos celulares, el contacto entre células del
“mismo tipo” inhibe su movimiento
Pérdida de la “inhibición por contacto”:
Las células pueden crecer por sobre la capacidad
permitida en una monocapa
Transformación Celular:
SUPRESORES DE
TUMORES
Proliferación Celular
PROTEÍNAS
ONCOGENES
Viabilidad Celular
ONCOGENES
Interacción Célula-Célula
1. Son genes cuya sobre-expresión o mutación con “ganacia de función”
favorecen la tumorigénesis
Respuesta a Señales Extracelulares
2. Descubiertos a raíz de virus con acción transformante
¿Cuál célula será más transformada?
1
2
SUPRESORES DE TUMORES
1. Son genes cuya “pérdida o disminución de su función” favorece la
tumorigénesis
2. Inicialmente se describieron en el contexto de mutaciones, ya sean
de la línea germinal (hereditarias) o de origen somático. Ejemplos,
pRb, p53, APC, BRCA1
RESPUESTA A SEÑALES EXTRACELULARES
(MITÓGENOS)
ALTERACIONES
EN LA
PROLIFERACIÓN Y
CRECIMIENTO
CELULAR
Dependencia de factores de crecimiento: La proliferación depende de la
disponibilidad de factores de crecimiento específicos para el tejido. En
cultivos celulares, la privación de estos factores (por ejemplo, suero
suplementario) lleva a muerte celular. Otro factor importante es la
producción autocrina de estos factores
Pérdida completa o parcial de la dependencia de factores de
crecimiento
Factores de suplemento en cultivo (suero)
In vitro
Crecimiento a menor densidad inicial
SEÑALIZACIÓN POR FACTORES DE CRECIMIENTO
RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA
RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA
1. Son proteínas integrales de membrana
2. Poseen actividad tirosina kinasa
intrínseca
3. Sus ligandos son usualmente
MITÓGENOS
EGF, PDGF, FGF, VEGF, insulina
4. La unión de ligando lleva a la
dimerización del receptor
5. Catalizan la transfosforilación en
residuos de tirosina (autofosforilación)
SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR POR RECEPTORES DE
TIROSINA KINASA
La cascada de proteínas MAP kinasa (MAPK, Proteína Kinasa
Activada por Mitógeno)
Las MAPK son kinasas que fosforilan en residuos de Ser o Thr
Estas enzimas se activan en respuesta a estímulos extracelulares,
como MITÓGENOS, shock térmico y citoquinas
La cascada de señalización MAPK se inicia por Ras-GTP
Ras
MAPKKK
MAPKK
MAPK
Proliferación y
Diferenciación Celular
Apoptosis
Mitosis
Expresión génica
1.Sobre-producción de ligando (mitógeno)
Mecanismos moleculares por
los cuales las células
tumorales sobre-activan las
vías de señalización de
mitógenos (RTKs)
VIABILIDAD Y
MUERTE CELULAR
2.Mutaciones activadoras del receptor (RTK)
3. Mutaciones en la cascada río abajo: Ras
Mecanismos de Control de la Viabilidad y Muerte
Celular
Receptor de factor
de crecimiento
Receptor de la MEC
(integrinas)
muerte celular
En el modelo de
adenocarcinoma de
colon
Receptor de
muerte celular
Proliferación
MEMBRANA
PLASMÁTICA
MUERTE CELULAR PROGRAMADA
DESARROLLO Y PROCESOS
FISIOLÓGICOS
Principal forma caracterizada:
apoptosis
Otras formas: autofagia, necrosis
programada
Señales de
sobrevivencia
www.invesmed.com
APOPTOSIS: DOS VÍAS PRINCIPALES CON UN MISMO FIN
ANGIOGÉNESIS,
INVASIÓN DE TEJIDOS
Y METÁSTASIS
ANGIOGÉNESIS
“Crecimiento de nuevos vasos a partir de vasos sanguíneos pre-existentes”
Angiogénesis de “sprouting”
(brotante)
Factores de regulación importantes:
Factores de crecimiento: FGF, VEGF, PDGF
Receptores: VEGFR
El ”sprouting” de vasos sanguíneos ocurre a razón
de varios milímetros por día (dependiendo del
estímulo)
Receptores de adhesión célula-célula: VE-cadherina
Enzimas: eNOS, COX2
VEGFR (Tirosina kinasa receptora)
El receptor VEGF (VEGFR) es una proteína tirosina kinasa receptora, del tipo
PDGFR
PRIMERA PARTE – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
DEL CÁNCER
Generalidades y Conceptos
Oncogenes y Supresores de Tumores
Características del Cáncer (“hallmarks”)
Proliferación, Diferenciación y Muerte Celular
Angiogénesis
Marcadores Emergentes
Invasión de Tejidos y Metástasis
SEGUNDA PARTE
La Cascada de Metástasis
Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cáncer
La METÁSTASIS ocurre a través de una serie de
pasos interrelacionados, en donde cada uno de ellos
puede ser una etapa limitante
MIGRACIÓN CELULAR
E INVASIVIDAD
Composición del Tejido
(ECM y células vecinas)
Receptores de Superficie
Señalización Intracelular
MIGRACIÓN CELULAR
E INVASIVIDAD
Remodelamiento de la ECM
INTRAVASACIÓN
TRANSPORTE
EXTRAVASACIÓN
CRECIMIENTO DE
TUMOR 2RIO
Cada uno de estos procesos son
muy ineficientes: < 0,1% células
Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816
MIGRACIÓN CELULAR
E INVASIVIDAD
diseminadas formarán mets
Composición del Tejido
(ECM y células vecinas)
Receptores de Superficie
MIGRACIÓN CELULAR
Señalización Intracelular
(Medición Experimental en Ensayo de
Cierre de Herida)
Remodelamiento de la ECM
MIGRACIÓN CELULAR: composición del microambiente
INTERACCIÓN
CÉLULA – ECM
Mol Biol Cell 2010; 21: 369
INTERACCIÓN
CÉLULA – CÉLULA
La migración celular es
un proceso fundamental,
tanto durante el
desarrollo, como en el
organismo adulto
Célula de cáncer de mama (MCF10A)
sr.burnham.org
Células de melanoma
murino B16-F10
Durante la migración celular existen alteraciones en estas uniones
E-cadherina
actina
núcleo
¿Qué Sucede con estas Interacciones
entre la Célula y su Entorno Durante el
Cáncer?
Célula de cáncer de mama (MCF10A)
sr.burnham.org
La célula sufre una serie de transformaciones, tanto
a nivel morfológico, como bioquímico
ALTERACIONES EN LA INTERACCIÓN CÉLULA-CÉLULA
↓ Expresión de E-cadherina
Características
de tipo epitelial
“EMT”
Características
de tipo
mesenquimáticas
TRANSICIÓN
EPITELIO-MESÉNQUIMA
(epithelial-mesenchymal transition, EMT)
Cancer Res 2006;
66 (17): 9
BioEssays 2001; 23: 912
DIFERENCIAS PRINCIPALES
Polaridad Apical
y Basolateral
Adhesión celular e
inhibición por contacto
↓ Expresión de componentes
estructurales de Uniones Adherentes
MORFOLOGÍA
AJ, TJ, GJ y
desmosomas
CARACTERÍSTICAS
FÍSICAS
UNIONES
INTERCELULARES
E-cadherina y
citoqueratinas
MARCADORES
MOLECULARES
Microtúbulos longitudinales
actina circunferencial
ORGANIZACIÓN
CITOESQUELETO
Asimetría: extremo
líder y posterior
Movilidad celular e
invasividad
Adhesiones focales /
GJ transitorios
N-cadherina, vimentina,
metaloproteasas
Microtúbulos astrales /
Fibras de estrés
MECANISMOS DE DISMINUCIÓN EN LA EXPRESIÓN DE
E-CADHERINA
MIGRACIÓN
CELULAR
Adhesiones Focales
(sitios de adhesión celular)
Citoesqueleto Celular
Una célula de carcinoma pulmonar migrando
sobre matriz extracelular de fibronectina
MIGRACIÓN CELULAR: MECANISMOS MOLECULARES
Cancer Sci 2007;
98(10): 1512-1520
FACTORES QUE INFLUYEN EN
LA MIGRACIÓN CELULAR
ADHESIÓN CELULAR
Adhesión celular
CITOESQUELETO
FACTORES EXTRACELULARES
(ECM, QUIMIOQUINAS, ETC)
Remodelamiento
del citoesqueleto
PROTEÍNAS DE SEÑALIZACIÓN
INTRACELULAR
Desensamble de
adhesiones
EXPRESIÓN GÉNICA
TRENDS Cell Biol 2004; 14(5)
Modelo de estudio: migración celular sobre sustrato 2D
¿Cuáles son los mecanismos moleculares implicados en la
migración celular?
Según este modelo, la migración celular puede ser descrita como una serie
sucesiva de etapas
MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas
MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas
Polarización celular (Cdc42, Rac)
POLARIZACIÓN CELULAR
POLARIZACIÓN CELULAR
EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN
(“leading edge”)
EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN
(“leading edge”)
FORMACIÓN DE CONTACTOS
CON LA ECM
CONTRACCIÓN CELULAR
Science 2003; 302: 5
golgi
núcleo
MDA-MB-231
Contracción (Rho)
DESENSAMBLE Y
LIBERACIÓN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO
GTPasas de la Familia Rho
Cdc42
Rac
Rho
FORMACIÓN DE CONTACTOS
CON LA ECM
CONTRACCIÓN CELULAR
DESENSAMBLE Y
LIBERACIÓN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO
MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas
Polarización celular, filopodios
Protrusiones celulares, lamelipodios,
polarización celular
Contracción celular, maduración de
adhesiones focales, fibras de estrés
Importancia del citoesqueleto en la
adhesión y migración celular
POLARIZACIÓN CELULAR
EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN
(“leading edge”)
FORMACIÓN DE CONTACTOS
CON LA ECM
15‛
Dev Biol 2004: 265: 23
Tanto la regulación,
como la actividad de
estas GTPasas se ven
alteradas en cáncer
45‛
60‛
CONTRACCIÓN CELULAR
DESENSAMBLE Y
LIBERACIÓN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO
Célula expandiéndose sobre fibronectina. Tinción de actina con
faloidina. J Cell Sci 2013; 126(17): 3835
DINÁMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMÁTICA
Queratocito, microscopía de luz
Fibroblasto, microscopía electrónica de barrido
Molecular Biology of the Cell (Alberts, cap 16)
Lamelipodios y
procesos de membrana
Podosomas
DINÁMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMÁTICA
FIBRAS DE ESTRÉS (fibras de tensión)
Mol Cancer Ther 2005; 4 (5): 772-778
Invadopodios
www.lifetechnologies.com
Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647
MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
Formación y desensamble de los sitios
de contacto celulares
INTEGRINAS
POLARIZACIÓN CELULAR
EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN
(“leading edge”)
FORMACIÓN DE CONTACTOS
CON LA ECM
TRENDS Cell Biol 2004; 14(5)
Estos sitios de contacto se encuentran
principalmente en la interfase célula-ECM
CONTRACCIÓN CELULAR
DESENSAMBLE Y
LIBERACIÓN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
Complejos Focales
1. Unión ligando extracelular (ECM)/Activación
Filamentos de Actina
Paxilina
2. Reclutamiento de proteínas adaptadoras
Complejos Macromoleculares Formados por las
Integrinas
3. Anclaje del
citoesqueleto (actina o
filamentos intermedios)
Sitio de
Iniciación
4. Formación de
complejos
macromoleculares
CONTACTOS
FOCALES
ADHESIONES
FOCALES
Madurez del complejo de adhesión
DESENSAMBLE DE CONTACTOS CON LA ECM
Sitio de
Iniciación
CONTACTOS
FOCALES
Adhesiones
Focales
ADHESIÓN
FOCAL
Madurez del complejo de adhesión
ADHESIÓN
FOCAL
MARCACIÓN DE ADHESIONES Y CONTACTOS FOCALES
CONTACTOS
FOCALES
Sitio de
Iniciación
?
MECANISMO POCO CLARO
Proteínas de señalización:
Kinasa de Adhesión Focal
(FAK), Pyk2, Src, MAPK
Traffic 2009; 10: 811–818
Se ha postulado que el tráfico
endosomal es esencial en el
desensamble de los complejos de
adhesión
Proteasas: Calpaínas
Componentes de la endocitosis:
Dynamin, AP-2, Clathrin, Rabs
(GFP-vinculina, transfección transitoria de células de cáncer de mama
MDA-MB-231)
REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ EXTRACELULAR
1. Migración celular
2. Estructuras derivadas
del citoesqueleto y la
membrana
3. Proteasas de la matriz
extracelular
REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ
EXTRACELULAR
Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647
VÍA
LINFÁTICA
VÍA
SANGUÍNEA
EVENTOS ASOCIADOS A LA METÁSTASIS
MIGRACIÓN CELULAR
E INVASIVIDAD
INTRAVASACIÓN
TRANSPORTE
EXTRAVASACIÓN
Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816
CRECIMIENTO DE
TUMOR 2RIO
Mutation Research 2011; 1-12
CRECIMIENTO DE TUMOR SECUNDARIO
MMPs
Integrinas
MICROMETÁSTASIS
COLONIZACIÓN
METÁSTASIS
CLÍNICAMENTE
DETECTABLE
Integrinas
MIGRACIÓN CELULAR
E INVASIVIDAD
VEGFR
INTRAVASACIÓN
S Inmune
Asentamiento reciente
En estado de “dormancia”
No detectable mediante
técnicas convencionales
Técnicas convencionales de
detección macroscópicas
Características similares
al tumor primario
VEGFR
TRANSPORTE
EXTRAVASACIÓN
VEGFR
MMPs
CRECIMIENTO DE
TUMOR 2RIO
EL PROCESO DE COLONIZACIÓN INVOLUCRA DIVERSOS EVENTOS:
Interacción con el nuevo estroma (ECM, células parénquima, etc)
Adquisición (o re-adquisición de hallmarks observados en tumor
primario): viabilidad, proliferación
Modificaciones en el programa migratorio
FEBS Journal 2011; 278: 16
MODELOS DE ESTUDIO: in vitro versus in vivo
Técnicas de estudio in vitro
APROXIMACIONES
EXPERIMENTALES Y MODELOS DE
ESTUDIO EN LA INVESTIGACIÓN
DEL CÁNCER
√
Proteínas de señalización
√
Ensayos de transformación celular
√
Proliferación, viabilidad y muerte celular
√
Adhesión y migración celular
Técnicas de estudio in vivo
√
Tumorigenicidad
√
Modelos experimentales de metástasis
Modelos de Estudio in vitro
Ensayos de Transformación Celular
Ensayos de Viabilidad
Tumorigenicidad
Agar blando
(crecimiento independiente de
anclaje)
(formación de tumores
primarios)
14-21
días
Análisis
Los ensayos de proliferación y
viabilidad celular son ampliamente
usados en la caracterización de nuevos
fármacos antineoplásicos
Conteo de
colonias
Sal tetrazolium
Formazán (A490-500nm)
Muerte Celular / Apoptosis
Proliferación y Ciclo Celular
El taxol (paclitaxel) actúa estabilizando
microtúbulos. ¿Qué efecto tendrá
sobre el histograma de DNA?
DNA laddering
Microscopía de
Fluorescencia
NT
¿qué sucede si la célula es privada de
factores de crecimiento (mitógenos)?
Histograma de DNA
(ciclo celular)
Citometría de Flujo
Tinción de DNA vs tamaño celular
Otras Técnicas:
Incorporación de 5-bromo2-desoxiuridina
DNA content
3H-timidina
Microscopía de Fluorescencia
Cell Size
Cell number
Expresión de Ciclinas
Marcación con
APOP
TOSIS
necrosis
Apoptosis
viable
Microscopía
Electrónica
apoptosis
DNA content
Otras Técnicas:
Activación de caspasas
Proteínas señalización (WB)
Autofagia
Modelos de Estudio in vitro
MIGRACIÓN CELULAR
Ensayos de Migración e Invasión Celular
Ensayo de cierre de herida
EXP 1
t=0h
t=12h
EXP 2
Cámara Boyden
Matrigel
Sustrato ECM
Invasión
Migración celular
(quimiotaxis – haptotaxis)
Matriz compuesta de
múltiples proteínas ECM
Depende de MMP‛s
t=0h
Parámetros cinéticos, como
velocidad de migración,
polarización y direccionalidad
t=12h
¿Qué se puede decir de EXP2
en relación a EXP1?
Modelos de Estudio in vivo
Modelos de Estudio in vivo
ANGIOGÉNESIS
Membrana corioalantoide de pollo
(Chick CAM assay)
MODELOS EXPERIMENTALES
DE METÁSTASIS
1. Metástasis Espontánea
14-21
días
2. Metástasis Experimental
Análisis
Imagen
membrana
corioalantoide
¿Qué agente
contiene este
disco?
Disco de
papel filtro
¿qué ventajas y desventajas
destacan?
Análisis
Modelos de Estudio in vivo
MODELOS EXPERIMENTALES
DE METÁSTASIS
3. Micrometástasis
Chick CAM Assay
Sembrar células de
tumor humano sobre
la CAM de embriones
de 10 días
Cosechar el
tumor
Tumor
primario
Extraer
pulmones y
médula ósea
PCR de
secuencia Alu
7-8 días
Metástasis
PRIMERA PARTE DE LA CLASE
Cell 2000: 100: 57-70
Cell 2011: 144: 646-674
SEGUNDA PARTE DE LA CLASE
Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816
Mutation Research 2011; 1-12