PRACTICA No - biblioteca upibi - Instituto Politécnico Nacional

Laboratorio de Bioquímica Clínica
INSTITUTO POLITÉCNICO
NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA
MANUAL DE LABORATORIO
DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
ELABORARON:
Biol. Leonor Patricia Rodríguez Pascual
Biol. Gerardo Rodríguez Muñoz
Q.B.P. Martha Morales Martínez
M. en C. Rodrigo Martínez Zúñiga
2da. edición. Enero 2013
Nombre del alumno_______________________________ Grupo _________
EQUIPO_________________
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
ÍNDICE
Práctica 1. Seguridad en el laboratorio
6
Práctica 2. Desarrollo de un método espectrofotométrico para la determinación de proteínas en
suero humano.
12
Práctica 3. Electroforesis de suero.
22
Práctica 4. Uso de enzimas en el diagnóstico clínico: perfil cardiaco y perfil hepático
27
Práctica 5. Curva de calibración para la determinación de glucosa en suero humano.
35
Práctica 6. Obtencion de valores de referencia de triglicéridos y colesterol en suero humano
43
Práctica 7. Determinación de urea, creatinina y acido urico.
51
Práctica 8. Determinación de hormona gonadotropina coriónica.
57
Práctica 9. Potenciometría
62
Apéndice A. Uso de las pipetas automáticas
69
Apéndice B. ¿Cómo se elabora el reporte?
70
Apéndice C. Preparación de Reactivos
75
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
PROLOGO
El curso de laboratorio de Bioquímica Clínica, tiene como objetivo capacitar al estudiante en el
manejo de sustancias, métodos y equipos utilizados en el área de Bioquímica, de manera que al
finalizar el curso pueda desarrollar procesos bioquímicos y en el futuro pueda implementarlos en su
vida profesional.
El manual esta integrado por prácticas representativas y secuenciales de las unidades del
curso teórico. Los criterios que se tomaron en cuenta para seleccionar el material incluido en este
manual fueron:
1) Que el experimento ilustrara un principio fundamental teórico.
2) Que fuera lo mas simple posible permitiendo al alumno llevarlo a cabo en un tiempo de 3h.
3) Que fuera de utilidad para sus cursos posteriores y para su vida profesional.
Cada una de las prácticas contiene la metodología necesaria para el desarrollo experimental
de la práctica, así como los antecedentes teóricos necesarios para la comprensión de cada uno de
los experimentos. Se pretende además que el estudiante sea capaz de analizar e interpretar el
significado de los resultados obtenidos, de una manera crítica y racional.
Para alcanzar estos objetivos es necesario que el estudiante:
a. Lea sus experimentos antes de ejecutarlos.
b. Realice cuidadosamente sus experimentos, procurando entender el porque de los hechos.
c. Realice observaciones minuciosas y críticas de los experimentos.
d. Anote sus observaciones y busque la explicación científica.
e. Que debe recurrir a sus libros de consulta, normas, instructivos de funcionamiento, etc., para aclara
dudas y comprender el porque de las operaciones que se han de ejecutar.
Con el fin de realizar análisis y discusión de sus resultados, el estudiante puede consultar la
bibliografía recomendada al final de cada práctica o bien la sugerida al inicio del curso.
Este manual no sustituye a la participación y guía de los profesores en el desarrollo
experimental, ni a la discusión de los resultados obtenidos.
ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS
1.- Se impartirá una sesión por semana de 3horas, cada sesión principiará y terminará a la hora
indicada.
2.- Antes de iniciar la sesión práctica, el alumno deberá leer en el Manual de Prácticas, la introducción
teórica, y el desarrollo de la práctica, de manera que esté enterado de las actividades que realizará
en el laboratorio. Para verificar esto, el profesor realizará una actividad con los alumnos antes de
iniciar la práctica.
3.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:

Una bata limpia y con botones, de preferencia debe ser de algodón, manga larga y blanca.

Este manual de laboratorio.

Una fotografía de tamaño infantil
4.- Por equipo deberán traer:

Un rollo de masking tape
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Laboratorio de Bioquímica Clínica

Un marcador indeleble

Un metro de franela

Encendedor o cerillos

El material extra que indique el profesor al inicio del curso
DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.
1.- Se pasará lista cada día al empezar la práctica.
2.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que el
alumno adquiera habilidades y destrezas mediante estas experiencias.
3.- La lista de asistencia se efectuara a la hora indicada para la práctica, con una tolerancia de 10
min.
4.- No habrá retardos y se pondrá falta a quien no llegue a la hora establecida con la bata
debidamente abrochada. En caso de llegar tarde no se permitirá la entrada.
5.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin consentimiento del
profesor, se considera que no asistió a la práctica.
6.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero.
7.- El alumno utilizará el manual de laboratorio, obligatoriamente en cada sesión, apegándose a la
metodología a seguir, así como a las instrucciones del profesor.
8.- Utilizará como bitácora el manual de laboratorio en cada sesión para anotar todos los datos
obtenidos en el momento de la práctica.
9.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un
lugar de trabajo.
10.- Durante el desarrollo de la práctica, queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo que
visiten a los alumnos.
11.- El alumno revisará el material que reciba antes de entregar el vale y reportará cualquier anomalía
antes de iniciar el trabajo práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se
le entregue.
12.- El material biológico se manejará con guantes desechables. Todo el material contaminado con
sangre se depositará en el lugar en el lugar asignado para su esterilización y/o se tratará con
desinfectante (benzal o cloro).
13.- El alumno deberá lavarse las manos al final de cada práctica.
14.- Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar, comer, ingerir bebidas y
masticar chicle dentro del laboratorio.
15.- Está prohibido el uso de celular durante la práctica, por lo que se le pide al alumno que lo apague
durante la explicación, desarrollo y discusión de la misma.
16.- En la sesión de discusión de resultados el estudiante deberá traer sus datos y los cálculos que
solicite el manual.
17.- El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión.
18.- Después de terminada la práctica, el material deberá ser entregado limpio, a la persona
encargada del almacén del laboratorio y deberá limpiar la mesa al iniciar y terminar la práctica.
19.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por la persona o
personas responsables de él.
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
EVALUACIÓN
1.-El laboratorio representa el 30% de la calificación del curso, la cual solo se registrará en el SAES si
se presenta el examen de teoría del parcial.
2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas y
obtener un promedio mínimo de seis.
3.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero. Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero
en la actividad que se realiza en esa sesión. Si justifica la falta no se cuenta la falta para el computo
final de asistencias, pero la calificación se mantiene.
4.-El laboratorio se evalúa como sigue:
Trabajo en la sesión
Discusión.
3.5 puntos
3.0 puntos
Reporte de la práctica 3.5 puntos
5.- Si el alumno no cumple con alguno de los tres aspectos, se le calificará con cero en la parte
correspondiente.
6. En el trabajo se evalúan:
Antecedentes (lectura de la práctica*)
0.5 puntos
Limpieza en todos los aspectos
0.5 puntos
Organización (para trabajar en equipo)
1.0 puntos
Habilidad
1.0 puntos
Resultados obtenidos y registrados al momento 0.5 puntos
*Elaborar y llevar el diagrama de flujo del desarrollo práctico el día de la sesión de laboratorio. Después,
pegar este diagrama firmado en el reporte de la práctica.
7. El reporte de la práctica se elabora con tinta, en un cuaderno tamaño profesional forrado del color
que indique el profesor, con una etiqueta grande en la parte superior derecha con el equipo, y en la
parte inferior con el nombre de los integrantes del equipo, subrayando el nombre del propietario del
cuaderno.
8. En el reporte se evalúa:
Objetivo y bibliografía
0.5 puntos
Manejo de resultados
1.5 puntos
Discusión
1.0 puntos
Conclusiones
0.5 puntos
9. Cada profesor elegirá un reporte para evaluarlo y revisará que todos los alumnos miembros del
equipo hayan elaborado el reporte. Si no es así, el alumno que no lo presente tendrá cero en el
reporte.
10. Se asignará un punto extra a la tercera calificación parcial de laboratorio, a los alumnos que
hayan entregado el 90% de los reportes completos.
11. En el apéndice B se dan las instrucciones para la elaboración correcta de un reporte y la
forma correcta de referenciar la bibliografía.
12. Es requisito aprobar el curso de laboratorio para aprobar la asignatura de Bioquímica Clínica
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA No. 1
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
UNIDAD I: Introducción a la bioquímica clínica y estructura celular.
1. OBJETIVOS
1.1. Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Aplica las normas y medidas de seguridad en el laboratorio clínico.
1.2. Objetivos específicos.
1.2.1. Identifica las normas mexicanas que tienen relación con la seguridad en un laboratorio clínico.
1.2.2. Aplica las normas en el manejo de residuos biológicos infecto contagiosos.
1.2.3. Aplica las normas para evitar daños al equipo y mejorar la calidad del trabajo
2. INTRODUCCIÓN
Las personas que trabajan en laboratorios con sustancias químicas, residuos biológicos o
materiales potencialmente infecciosos deben conocer los posibles riesgos y también deben estar
capacitados y ser expertos en las técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma
segura. La persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación
adecuada del personal.
La Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente, define como residuos
peligrosos a todos aquellos residuos que por sus características corrosivas, reactivas, explosivas,
tóxicas, inflamables y biológico-infecciosas, que representan un peligro para el equilibrio ecológico o
el ambiente; mismos que serán manejados en términos de la propia ley, su Reglamento y las Normas
Oficiales Mexicanas que expida la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales,
correspondiéndole a la citada SEMARNAT su regulación y control.
La NOM-087-ECOL-SSA1-2002 es de observancia obligatoria para los establecimientos que
generen residuos peligrosos biológico-infecciosos y los prestadores de servicios a terceros que
tengan relación directa con los mismos, así mismo también debemos de seguir la ley general de salud
sobre todo en el artículo 1128 que establece los productos biológicos que requieren de control.
Asimismo la NOM La Norma Oficial Mexicana NOM-018-STPS-2000, proporciona la normatividad
vigente para la identificación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros
de trabajo. Esta Norma proporciona la codificación para identificar y señalizar correctamente estas
sustancias a fin de evitar accidentes. Asimismo proporciona las hojas de datos de seguridad para tal
efecto. La Norma Oficial Mexicana NOM-026-STPS-1998, indica el código de identificación que
deberán emplear los laboratorios y centros de trabajo en las tuberías que conducen fluidos, excepto
para las plantas potabilizadoras de agua.
La OMS en su tercera edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio de 2005 alienta a los
países a aceptar y aplicar conceptos básicos en materia de seguridad biológica y a elaborar códigos
nacionales de prácticas para la operación de los laboratorios clínicos, biológicos y químicos. En este
manual se establece una clasificación del nivel de bioseguridad de los laboratorios, basada en una
combinación de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y
procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos
de riesgo. Los niveles van desde nivel 1 al nivel 4.
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
A continuación se presenta un Resumen de las prácticas y los procedimientos de laboratorio
esenciales en materia de seguridad que recomienda la OMS.
Acceso
1. El símbolo y signo internacional de peligro biológico (figura 1) deberá colocarse en las puertas de
los locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior.
2. Sólo podrá entrar en las zonas de trabajo del laboratorio el personal autorizado.
3. Las puertas del laboratorio se mantendrán cerradas.
4. No se autorizará ni permitirá la entrada de niños en las zonas de trabajo del laboratorio.
Protección personal
1. Se usarán en todo momento batas o uniformes especiales para el trabajo en el laboratorio.
2. Se usarán guantes protectores apropiados para todos los procedimientos que puedan entrañar
contacto directo o accidental con sangre, líquidos corporales y otros materiales potencialmente
infecciosos o animales infectados. Una vez utilizados, los guantes se retirarán de forma aséptica y a
continuación se lavarán las manos.
3. El personal deberá lavarse las manos después de manipular materiales y animales infecciosos, así
como antes de abandonar las zonas de trabajo del laboratorio.
4. En las zonas de trabajo estará prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosméticos o manipular
lentes de contacto.
5. Estará prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en las zonas de trabajo del
laboratorio.
Procedimientos
1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca.
2. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la
formación de aerosoles.
3. Se limitará el uso de jeringuillas y agujas hipodérmicas, que no se utilizarán en lugar de
dispositivos de pipeteo ni con ningún fin distinto de las inyecciones por vía parenteral o la aspiración
de líquidos de los animales de laboratorio.
4. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se
comunicarán al supervisor del laboratorio. Se mantendrá un registro escrito de esos accidentes e
incidentes.
5. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.
6. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios químicos o físicos) antes de
eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de
efluentes, según lo que indique la evaluación de riesgos del agente con el que se esté trabajando.
Zonas de trabajo del laboratorio
1. El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo.
2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame de material
potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo.
3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser descontaminados antes de
eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar.
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
Gestión de la bioseguridad
1. Incumbirá al director del laboratorio (la persona que tiene responsabilidad inmediata respecto del
laboratorio) garantizar la elaboración y la adopción de un plan de gestión de la bioseguridad y de un
manual de seguridad o de operación.
2. El supervisor del laboratorio (que dependerá del director) velará por que se proporcione
capacitación periódica en materia de seguridad en el laboratorio.
3. Se informará al personal de los riesgos especiales y se le exigirá que lea el manual de seguridad o
de trabajo y siga las prácticas y los procedimientos normalizados. El supervisor del laboratorio se
asegurará de que todo el personal los comprenda debidamente. En el laboratorio estará disponible
una copia del manual de seguridad o de trabajo.
Diseño e instalaciones del laboratorio. Características de diseño
1. Se dispondrá de espacio suficiente para realizar el trabajo de laboratorio en condiciones de
seguridad y para la limpieza y el mantenimiento.
2. Las paredes, los techos y los suelos serán lisos, fáciles de limpiar, impermeables a los líquidos y
resistentes a los productos químicos y desinfectantes normalmente utilizados en el laboratorio. Los
suelos serán antideslizantes.
3. La iluminación será adecuada para todas las actividades. Se evitarán los reflejos y brillos molestos.
4. El mobiliario debe ser robusto y debe quedar espacio entre mesas, armarios y otros muebles, así
como debajo de los mismos, a fin de facilitar la limpieza.
5. Habrá espacio suficiente para guardar los artículos de uso inmediato, evitando así su acumulación
desordenada sobre las mesas de trabajo y en los pasillos. También debe preverse espacio para el
almacenamiento a largo plazo, convenientemente situado fuera de las zonas de trabajo.
6. En cada sala del laboratorio habrá lavabos, a ser posible con agua corriente, instalados de
preferencia cerca de la salida.
7. Las puertas irán provistas de mirillas y estarán debidamente protegidas contra el fuego; de
preferencia se cerrarán automáticamente.
8. En el nivel de bioseguridad 2 se dispondrá de una autoclave u otro medio de descontaminación
debidamente próximo al laboratorio.
9. Los sistemas de seguridad deben comprender medios de protección contra incendios y
emergencias eléctricas, así como duchas para casos de urgencia y medios para el lavado de los ojos.
Material de bioseguridad indispensable
1. Dispositivos de pipeteo para evitar que se pipetee con la boca. Existen muchos modelos diferentes.
2. Cámara de Seguridad Biológica, que se utilizarán siempre que se manipule material infeccioso.
3. Autoclaves u otros medios apropiados para esterilizar el material contaminado.
4. Pipetas de Pasteur de plástico desechables, cuando estén disponibles, en sustitución del vidrio.
Vigilancia médica y sanitaria
La entidad que emplea al personal del laboratorio tiene la obligación de cerciorarse, por medio del
director de éste, de que la salud de dicho personal esté sometida a la debida vigilancia. El objetivo de
esa vigilancia es detectar posibles enfermedades
Capacitación
Los errores humanos y las técnicas incorrectas pueden poner en peligro incluso las mejores medidas
destinadas a proteger al personal de laboratorio. En consecuencia, la formación continua en el
servicio acerca de las medidas de seguridad es primordial. La capacitación del personal debe
comprender siempre la enseñanza de métodos seguros para utilizar procedimientos peligrosos que
habitualmente afectan a todo el personal de laboratorio y que entrañan los siguientes riesgos:
Manipulación de desechos
Se considera desecho todo aquello que debe descartarse. En los laboratorios, la descontaminación y
la eliminación de desechos son operaciones estrechamente relacionadas. En el trabajo cotidiano, son
pocos los materiales contaminados que es preciso retirar del laboratorio o destruir. La mayor parte de
la cristalería, los instrumentos y la ropa del laboratorio vuelve a utilizarse o se recicla.
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
El principio básico es que todo el material infeccioso ha de ser descontaminado, esterilizado en
autoclave o incinerado en el laboratorio.
Descontaminación
El tratamiento en autoclave de vapor constituye el método de elección para todos los procesos de
descontaminación. El material destinado a la descontaminación y eliminación debe introducirse en
recipientes (por ejemplo en bolsas de plástico resistentes al tratamiento en autoclave) que tengan un
código de color para indicar si el contenido ha de pasar a la autoclave o a la incineración.
Procedimientos de manipulación y eliminación de material y desechos contaminados
Deberá adoptarse un sistema de identificación y separación del material infeccioso y sus recipientes.
Se seguirán las normas nacionales e internacionales y se tendrán en cuenta las siguientes
categorías:
1. Desechos no contaminados (no infecciosos) que puedan reutilizarse o reciclarse o eliminarse como
si fueran «basura» en general (algodones con poca sangre
2. Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos): agujas hipodérmicas, bisturís, cuchillas,
vidrio roto; se recogerán siempre en recipientes a prueba de perforación dotados de tapaderas y
serán tratados como material infeccioso.
3. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave que después pueda lavarse y volverse
a utilizar o reciclarse.
4. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave y a la eliminación.
5. Material contaminado destinado a la incineración directa.
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Aparte de los objetos cortantes y punzantes mencionados más arriba, todo el material contaminado
(potencialmente infeccioso) debe ser introducido en recipientes impermeables (por ejemplo en bolsas
de plástico que resistan el tratamiento en autoclave marcadas con un código de color) y tratado en
autoclave antes de proceder a su eliminación. Después de pasar por la autoclave, el material puede
colocarse en recipientes apropiados para ser transportado al incinerador.
Si es posible, el material procedente de actividades relacionadas con la atención sanitaria no debe
desecharse en vertederos, ni siquiera después de haber sido descontaminado.
El material contaminado se coloca en recipientes especialmente marcados (por ejemplo, bolsas con
un código de color) y se transporta directamente al incinerador.
Cuando se utilicen desinfectantes, los materiales de desecho deben permanecer en contacto íntimo
con éstos es decir, durante el tiempo apropiado.
Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de
bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique
las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se
debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las
prácticas y procedimientos requeridos.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
 NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Protección ambiental – salud ambiental – residuos peligrosos
biológico – infecciosos- clasificación y especificaciones de manejo.
 NOM-005-STPS-1998. Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el
manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas.
 NOM-018-STPS- 2000. Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por
sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo..
 NOM-026-STPS-2008. Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por
fluidos conducidos en tuberías.
 NOM-007-SSA3-2009. Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos.
 Diferentes reactivos químicos.
 Instalaciones del laboratorio.
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1. Por equipo leer cada una de las normas y realizar un breve resumen para exponer y discutirse en
grupo.
4.2 El profesor te proporcionará 4 frascos de diferentes reactivos químicos. Busca el código de
rectángulo y el código de rombo.
4.3 Anota los números y colores que aparecen en el frasco, y de acuerdo a la NOM-018-STPS-2000
determina las características de cada sustancia en relación a la Salud, Inflamabilidad, Reactividad, y
el Equipo de Protección que debe usarse para su manipulación. Anótalos en el cuadro 5.1.
4.4 Ahora revisa los señalamientos que tiene el laboratorio en materia de seguridad como marca la
NOM- 026-STPS-1998. Determina cuáles están y cuáles no están. Anótalos en la tabla 5.2. Elabora
los señalamientos faltantes en el tamaño que marca esta norma.
4.5 De acuerdo a la NOM-005-STPS-1998, indica si el botiquín del laboratorio cumple la norma y
toma nota de lo que se requiere. Anótalos también en la tabla 5.2.
4.6 Revisa el PROY-NOM-007-SSA3-2009 e indica que puntos de la norma competen al Laboratorio
de Bioquímica Clínica de la UPIBI, cuáles de ellos se cumplen y cuáles no.
4.7 De acuerdo al Código recomendado por la OMS, elabora un cuadro sinóptico de las medidas de
seguridad que se deberán en el laboratorio de Bioquímica Clínica.
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
5.1 Llena los datos de los reactivos revisados en la tabla siguiente:
Tabla 5.1
Nombre
Reactivo
del Salud
Inflamabilidad
Reactividad
Equipo
protección
de
Tabla 5.2
Señalamientos presentes
Señalamientos ausentes
Materiales presentes en el botiquín
Materiales ausentes necesarios en el botiquín
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
5.2 Elabora en el tamaño adecuado los señalamientos necesarios que no se encuentren en el
laboratorio.
5.3 Incluye en tu reporte los puntos de la PROY-NOM-007-SSA3-2009 que competen al Laboratorio
de Bioquímica Clínica de la UPIBI, cuáles de ellos se cumplen y cuáles no.
5.4 También elabora un cuadro sinóptico de las normas de seguridad que la OMS recomienda para
los laboratorios como el de Bioquímica Clínica de la UPIBI.
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia de su aplicación en el laboratorio clínico. Otras normas de observancia en un
laboratorio clínico.
7. CONCLUSIONES
7.1 En función de tus resultados y la discusión que realizaste, elabora tus conclusiones y verifica si se
cumplieron los objetivos planteados.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1. MÉXICO. SECRETARÍA DE SALUD. Reglamento de la ley general de salud en materia de
control sanitario de actividades, establecimientos, productos y servicios. Diario Oficial de la
Federación. 18 de enero de 1988.
8.2. MÉXICO. SECRETARÍA DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES. Norma Oficial
Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental – Salud ambiental – Residuos
peligrosos biológico – infecciosos- Clasificación y especificaciones de manejo. NOM-087-ECOLSSA1-2002. Diario Oficial de la Federación. 17 de febrero de 2003.
8.3. MÉXICO. SECRETARÍA DE TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL. Norma Oficial Mexicana NOM005-STPS-1998, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para
el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas. NOM-005-STPS1998. Diario Oficial de la Federación. 2 de febrero de 1999.
8.4. MÉXICO. SECRETARÍA DE TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL. Norma Oficial Mexicana NOM018-STPS-2000, Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por
sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo. NOM-018-STPS-2000. Diario Oficial de
la Federación. 27 de octubre de 2000.
8.5. MÉXICO. SECRETARÍA DE TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL. Norma Oficial Mexicana NOM026-STPS-1998, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por fluidos
conducidos en tuberías. NOM-026-STPS-2008. Diario Oficial de la Federación. 25 de noviembre
de 2008.
8.6. MÉXICO. SECRETARÍA DE SALUD. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2009, Para la
organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos. NOM-007-SSA3-2009. Diario Oficial
de la Federación. 13 de enero de 2009|.
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA No. 2
DESARROLLO DE UN MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO
PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN SUERO
HUMANO.
UNIDAD I: Introducción a la Bioquímica clínica y estructura Celular.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Desarrolla un método espectrofotométrico para la determinación de proteínas en suero
humano.
1.2 Objetivos específicos
El alumno:
1.2.1. Calibra un espectrofotómetro, empleando los fundamentos teóricos de su uso y diseño.
1.2.2. Determina los factores que afectan el desarrollo de color de un método de análisis.
1.2.3. Establece las condiciones óptimas para realizar un método para determinación de proteínas en
clínica.
2. INTRODUCCIÓN
En bioquímica clínica es de suma importancia el análisis de sustancias en los pacientes, para la
determinación de estados de salud o enfermedad. Muchas enfermedades tienen su origen en
alteraciones del metabolismo celular o en la fisiología corporal y el diagnóstico de estas se apoya en
pruebas bioquímicas. Las pruebas bioquímicas son importantes en la diagnosis, prognosis y
monitorización de las enfermedades. Se entiende por prognosis a la determinación de la probabilidad
de que se desarrolle una enfermedad basándose en pruebas bioquímicas. La monitorización de una
enfermedad es el seguimiento del curso de una enfermedad.
Es por esto que una de las funciones más importantes de la Bioquímica Clínica es la de diseñar,
realizar e interpretar pruebas bioquímicas, que proporcionen información relevante y significativa en el
diagnóstico de enfermedades. Muchas de estas pruebas bioquímicas emplean métodos
espectrofotométricos para su realización.
En un análisis espectrofotométrico se aprovecha la absorción selectiva que tiene una sustancia
sobre una longitud de onda específica del total del espectro.
La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las
moléculas, y es característica para cada sustancia química. Cuando una molécula es sometida a una
radiación electromagnética, absorbe parte de la energía de la radiación y se excita, es decir aumenta
su estado energético. Del total de radiación policromática, (luz de varios colores, es decir de muchas
longitudes de onda) se absorbe solo un tipo preferente de longitud de onda, que depende de la
naturaleza molecular de la sustancia, (de las partículas subatómicas, del tipo de enlaces y de la
distribución de electrones). Ésta energía es después emitida con menos energía (longitud de onda
mayor). Se puede analizar el espectro de radiación que absorbe la molécula, con lo que se tendrá un
espectro de absorción, o se puede estudiar el espectro de la radiación que emite, para obtener un
espectro de emisión. Como parte de la radiación de una longitud de onda determinada se absorbe, su
intensidad disminuye, y se puede medir la cantidad de luz que ha sido absorbida.
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
Cuando se realiza un análisis espectrofotométrico se emplea la longitud de onda de máxima
absorción, pues así se tiene una mayor sensibilidad en el método, que se refleja en una mayor
absorción.
La espectroscopia es la medición e interpretación de la radiación electromagnética absorbida o
emitida por las moléculas ó átomos de una muestra. Un espectrofotómetro es un equipo conformado
generalmente de una fuente de radiación, un monocromador, un contenedor de la muestra
(portaceldas), un fotodetector y el dispositivo de lectura.
Las fuentes de radiación empleadas para la región visible son filamentos incandescentes
(tungsteno ó tungsteno – halógeno) que suministran la energía radiante necesaria para el análisis y
mantienen la energía y densidad de flujo de la luz durante el tiempo de operación. Para el espectro de
luz ultravioleta se emplean lámparas de descarga de hidrógeno o deuterio, que operan a bajas
presiones y voltajes reducidos (40 V aprox.) y que trabajan muy bien en el rango de 380 – 160 nm.
Los monocromadores tienen como función proporcionar un haz de luz con un valor específico de
longitud de onda y ancho determinado de una banda del espectro. Ya que la fuente de luz emite una
ancho de banda de toda la radiación del visible, es necesario, para el análisis de muestras, el uso de
luz monocromática, es decir de una sola longitud de onda. Entre la fuente de luz y el monocromador y
entre este y el contenedor de la muestra existen un sistema de espejos que actúan de colimadores
para hacer paralelos a los haces de luz y mejorar las determinaciones. También existen filtros
después del monocromador para mejorar la definición de la longitud de onda saliente.
Una vez que sale el haz de luz monocromático, de estrecho intervalo espectral, éste incide sobre
la muestra, colocada en una celda dentro del contenedor. Las celdas empleadas son de vidrio para el
uso de luz visible y de cuarzo para el empleo de luz UV. El vidrio absorbe la radiación por abajo de
350 nm, y por ello no debe emplearse para las determinaciones con luz UV.
Un detector es un transductor que transforma la radiación (luz) en flujo de corriente eléctrica y si se
hace necesario, amplifica esa señal. Los detectores pueden ser celdas fotovoltaicas, fotodiodos de
estado sólido, tubos fotoemisores y tubos fotomultiplicadores. Los tubos fotoemisores al vacío están
formados de un cátodo sensible a la luz como un semicilindro de metal y un ánodo de alambre
situado a lo largo del eje del cilindro, encerrado en una cubierta al vacío. Cuando la radiación incide
sobre la cubierta sensible del cátodo, se emiten electrones que son captados por el ánodo,
constituyéndose una corriente. La corriente generada se evidencia en un módulo de lectura, que
puede ser analógica o digital, y que nos permite establecer la cantidad de luz que fue absorbida por la
muestra, o la de luz transmitida, según se desee determinar absorbancia o transmitancia, y que
estará en función de la concentración y naturaleza de la muestra.
Antes de emplear un espectrofotómetro para determinaciones del laboratorio, es necesario
calibrarlo, para evitar errores en las determinaciones. El equipo puede descalibrarse por fallas en el
sistema óptico, sobre todo espejos sucios, rayados o movidos. Si la lámpara esta sucia o pierde
potencia, puede generar problemas en las lecturas. El sobrecalentamiento o las variaciones del
voltaje también pueden descalibrar el espectrofotómetro.
La absorbancia (As) ó densidad óptica (DO), de una luz monocromática (de una sola longitud de
onda), se define como el logaritmo decimal de la relación entre la intensidad de la radiación no
absorbida (It) y la intensidad de la radiación incidente (I0).
A = - log It / I0
¿Y de que depende la magnitud de la absorción de radiación de una sustancia? Depende de la
cantidad de moléculas que haya. Dicho en otros términos la cantidad de luz absorbida depende de la
concentración de la muestra. Esto lo describió Beer en 1852. Pero también depende del espesor de la
capa que atraviese la luz, ó la distancia que ésta recorra, como describieron Bouguer y Lambert
(1730-1760). Combinando ambos factores se obtiene lo que se conoce como la Ley Básica de
espectrofotometría o Ley de Bouguer – Beer –Lambert (BBL), la cuál indica que la relación entre la
13
Laboratorio de Bioquímica Clínica
intensidad de luz incidente y transmitida depende de la concentración de la muestra (c) y el diámetro
de la celda, esto es la distancia que la luz atraviesa por el cuerpo (l)
It = I0 10-αcl
ó
log I0 / It = cl
Generalmente se emplean celdas de un centímetro de paso y la concentración se expresa en
moles/L; entonces el factor α se convierte en ε o coeficiente de absorción molar.
La relación I0 / It se llama transmitancia y es representada como T, expresándose en porcentaje
(%). La relación -log I0 / It se llama absorbancia y se representa As, expresándose en numerales. Por
lo tanto la absorbancia será proporcional al diámetro de la celda y la concentración de la muestra.
As = c l
Como el diámetro de la celda (l) generalmente es de 1cm, podemos decir que la absorción
depende de la concentración de la muestra (c). Esta relación se emplea para la determinación de
concentración de sustancias en el laboratorio clínico, y lo que hay que conocer es el coeficiente de
extinción o absorción molar.
Comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo de absorción de luz de una muestra
contra la de soluciones estándar es posible determinar la identidad y la concentración de los
componentes de una muestra. Los métodos de análisis basados en los principios de la absorción
antes mencionados se conocen como métodos colorimétricos y espectrofotométricos. Las ventajas de
los métodos espectrofotométricos son varias: son rápidos, precisos, versátiles, fáciles de usar y
eficientes en costo. Por ello, la determinación de la presencia y concentración de sustancias de
importancia clínica emplea en muchos casos éstos métodos.
Es necesario establecer las condiciones exactas del método: la longitud de onda a la que absorbe
la sustancia; cuando la sustancia en cuestión no absorbe el espectro visible o UV, es necesario llevar
a cabo una reacción colorimétrica para evidenciarla, entonces es necesario establecer muy bien las
condiciones de la reacción y cuáles son los factores fisicoquímicos que la afectan. También es
necesario determinar la especificidad, sensibilidad y exactitud del método, así como su rango de uso.
La especificidad se refiere a si la reacción, el método o la λ empleada son exclusivos de la
sustancia a determinar o existen varias sustancias que se pueden medir con este método. La
sensibilidad se refiere a observar una variación en la absorbancia, cuando se presenta una variación
en la concentración. La exactitud se refiere a establecer la concentración real o verdadera de la
sustancia sin temor a cometer errores, o con márgenes confiables de determinación. La linearidad se
refiere a las concentraciones entre las cuáles el método es útil.
La precisión tiene que ver con la concordancia que se presentan en los valores obtenidos en
diferentes ensayos o por diferentes personas; también se conoce como reproducibilidad. La precisión
esta influida por el error aleatorio del método. Se determina al realizar varias replicas del método, y se
expresa como la dispersión de los datos, o desviación estandar (s). Para saber la significancia de
este valor se tienen que analizar en función del valor medio ()
Finalmente se debe saber la estabilidad de la reacción que genera color. Como siempre se
presentan pequeñas variaciones debidas a la eficiencia de cada aparato, a difracciones por defectos
en las celdas, a errores de pipeteo en la toma de muestra, es necesario en todo momento elaborar
una curva de calibración. Una curva de calibración se elabora con varios de tubos con
concentraciones conocidas (casi siempre en orden ascendente) de la muestra, que darán valores
ascendentes en las lecturas de absorción.
Una vez que se tiene el método apropiado es necesaria una interpretación de los datos que éste
método está produciendo, esto es, que resultados de un paciente pueden ser considerados “sanos”, y
cuales significativamente diferentes “enfermos”, y si las diferencias entre estos son consistentes.
Todos los datos presentan cierta variación, y las variables biológicas muestran, por lo general, una
distribución Gaussiana, también llamada Normal. Se considera un intervalo normal o de referencia
14
Laboratorio de Bioquímica Clínica
aquel que se encuentra entre la media +/- dos veces la desviación estándar, la cual abarca el 95% de
los datos.
La consideración de un resultado como enfermo, depende de la precisión y exactitud del ensayo,
así como de la variabilidad biológica natural, por lo que es necesario considerar la desviación
estándar global, que incluya tanto la biológica como la analítica.
En esta práctica se establecerá un método espectrofotométrico para determinar proteínas en suero
humano, y los parámetros que lo caracterizan. La albúmina es la más abundante de las proteínas
séricas. Su función en el cuerpo es transportar substancias tales como medicamentos, antibióticos,
bilirrubina y ácidos y sirve como almacén de proteínas de estructura, necesarias para el crecimiento
de los tejidos. Los niveles bajos de albúmina se presentan en enfermedades como el síndrome
nefrítico, enfermedades hepáticas, infecciones agudas y mala nutrición haciendo así a las
determinaciones de albúmina de primordial importancia. Muchos métodos han sido descritos para
determinar a la albúmina sérica. La reacción de la albúmina humana con el púrpura de bromocresol
(BCP) se usa ampliamente y se basa en la capacidad de la albúmina sérica de copularse con
colorantes, en este caso con el BCP.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL











Espectrofotómetro visible
Centrífuga clínica
Celdas de 1 cm de paso
Tubos vacutainer con gel
Agujas verdes para vacutainer
Torundas, ligadura y adaptador
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Pipetas de 2 mL
Pipetas de 5 mL
Micropipetas automáticas de 100 L
Puntas para micropipeta automática de 100 L
3.2 REACTIVOS Y MATERIAL BIOLÓGICO
 Púrpura de Bromocresol (BCP) 80 molar, pH 4.9 - 5.2.
 Soluciones de Albúmina Humana de 4 mg/mL, 6 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, 60
mg/mL 100 mg/mL, 160 mg/mL, 200 mg/mL, en ssf.
 Colágeno (gelatina) 60 mg/mL en ssf.
 Glicina 60 mg/mL en ssf.
 Solución de albúmina humana 60 mg/mL emulsionada con aceite de oliva (3:1 albúmina:aceite
de oliva).
 Solución de albúmina humana 60 mg/mL emulsionada con ampicilina 1 mg/mL (1:1
albúmina:ampicilina).
 Solución de albúmina humana 60 mg/mL emulsionada con hemoglobina (9:1, albúmina :
hemoglobina).
 Suero humano.
15
Laboratorio de Bioquímica Clínica
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
PRIMERA SESIÓN.
A. CALIBRACIÓN DE ESPECTROFOTÓMETRO
1.
Encender el equipo 5 minutos antes de usarlo, y seleccionar la λ o λ ‘s que se emplearán.
2.
Introducir una celda con agua destilada y ajustar a cero de As y 100% de T. Después calibrar
con el blanco.
B. MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO. SELECCIÓN DE LA  DE As MÁXIMA.
3.
Preparar dos tubos de 13 x 100 mm como marca la tabla 4.1. Emplear la micropipeta para
tomar los microlitros (L).
Tabla 4.1
Tubo Púrpura de bromocresol (BCP) Sol. Tipo de Albúmina
Agua
(mL)
de 60 mg/mL (L)
(L)
Blanco
1.5
15 L
1
1.5
15 L
4.
5.
6.
7.
Permitir el desarrollo de color a temperatura ambiente (18 – 30 °C) durante 5 minutos.
Calibrar con el tubo blanco el intervalo de λ, que es de 400 – 650 nm (visible)
Leer la As del tubo 1 de 400 – 650 nm (visible). Anotar los datos en la tabla 5.1.
Determinar la λ de absorción máxima.
C. MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO. LINEARIDAD, RANGO UTIL, SENSIBILIDAD,
EXACTITUD Y PRECISION DEL MÉTODO.
8.
Previo a este experimento se obtendrá el suero de uno de los alumnos del equipo, a partir de
5 mL de sangre periférica empleando tubos Vacutainer con gel. Centrifugar a 3000 rpm
durante 5 minutos.
9.
Preparar una serie de tubos como marca la tabla 4.2.
Tabla 4.2
Tubo
Púrpura de bromocresol
(BCP)
(mL)
15 uL de una Solución de
Albúmina de
Agua
(L)
Blanco
1.5
-
15 L
1
1.5
4 mg/mL
-
2
1.5
6 mg/mL
-
3
1.5
10 mg/mL
-
4
1.5
20 mg/mL
-
5
1.5
40 mg/mL
-
6
1.5
60 mg/mL
-
7
1.5
100 mg/mL
8
1.5
160 mg/mL
9
1.5
200 mg/mL
-
Suero*
1.5
(se calculará)
-
Este tubo se empleará como calibrador
-
* El Suero no se empleará en la construcción de la curva de calibración.
16
Laboratorio de Bioquímica Clínica
10.
11.
12.
13.
Permitir el desarrollo de color a temperatura ambiente (18 – 30 ° C) durante 5 minutos.
Tomar la lectura del blanco a la λmax seleccionada y anotarla en la tabla 5.2. Después calibrar a
cero de As y 100% de T con ese mismo blanco (Este paso se realizará solo para esta práctica,
pues en condiciones normales, la lectura del blanco no se realiza, sino que se ajusta
directamente)
Determinar la As y el % de T de cada tubo a la λmax seleccionada en el punto A.
Anotar los resultados en la tabla 5.2. Además se utilizarán los datos de varios equipos.
SEGUNDA SESIÓN
C. ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓN.
14.
Preparar una serie de tubos como marca la tabla 4.3
Tubo
15.
16.
17.
Blanco
Púrpura de bromocresol
(BCP) (mL)
1.5
1
2
Tabla 4.3
15 L de solución de
-
Agua
(L)
15
1.5
Colágeno (gelatina) 60 mg/mL
-
1.5
Glicina 60 mg/ mL
-
Permitir el desarrollo de color a temperatura ambiente (18 – 30 ° C) durante 5 minutos.
Determinar la As de cada tubo a la λmax seleccionada en el punto A, empleando el blanco para
calibrar a cero de As.
Anotar los resultados en la tabla 5.5.
D. INTERFERENCIAS CON EL MÉTODO.
18.
Preparar una serie de tubos como marca la tabla 4.7.
Tubo
Blanco
19.
20.
21.
Tabla 4.7
Púrpura de
15 L de Sol. de Albúmina
bromocresol (BCP) mL
de 60 mg/mL
1.5
-
1
1.5
2
1.5
3
1.5
Agua
15 L
Emulsionada con aceite de
oliva
Emulsionada con ampicilina
-
Emulsionada con
hemoglobina
-
-
Desarrollar color por 5 minutos y leer la absorbancia, empleando el blanco para calibrar.
El testigo positivo es el tubo 1 del experimento D, de modo que habrá que registrar esa lectura
para este experimento.
Anotar los resultados en la tabla 5.6.
17
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.
A. Selección de la λ de As máxima.
5.1 Explica para que se realiza el ajuste o calibración con agua destilada, y con el blanco a 100 % T y
0 de As.
5.2 Anota la lectura del Blanco _________________________
5.3 Indica cuáles son las posibles causas de descalibración del equipo
5.4 Anota los las lecturas de As obtenidas en la Tabla 5.1
Tabla 5.1
λ
As
400
410
420
430
440
450
460
470
480
490
500
510
520
λ
As
530
540
550
560
570
580
590
600
610
620
630
640
650
5.5 Elabora la gráfica de As en el eje Y (ordenadas) contra λ en el eje X (abscisas).
5.6 ¿Cuál es la λ de máxima absorbancia? ¿Cuál es el uso que se da a esta información?
B. Linearidad, Rango útil, Sensibilidad, Exactitud y Precisión del método.
5.7 Anota los resultados en la Tabla 5.2
Tabla 5.2
Tubo
Concentración de
As
albúmina mg/mL
=
Blanco
1
2
4
6
3
10
4
20
5
40
6
60*
7
100
8
160
9
%T
200
3
Suero
* Este tubo actúa como calibrador
18
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5.8 Anotar en la tabla a que longitud de onda (en nm) se hizo la determinación ().
5.9 Elaborar la curva tipo colocando en las ordenadas la Absorbancia (a la λ seleccionada) y en las
abscisas la concentración de albúmina en mg/mL :
5.10 Anota la ecuación obtenida con esta gráfica, así como el coeficiente de correlación.
Determinar si la relación es lineal y porque se conoce esto.
5.11 ¿Sigue éste método la ley de Bouger –Beer –Lambert? Explica porque.
5.12 Marcar dos puntos en el eje Y de As, con una separación de 0.1 de As, y extrapolar cada uno
en la gráfica. Obtener la diferencia en concentración. Esta es la sensibilidad. Anotar la
sensibilidad obtenida en la tabla 5.4
5.13 ¿Cómo se define la sensibilidad?
5.14 Con tus resultados calcular lo que se pide en la tabla 5.3
Tubo
Concentración de
albúmina mg/mL*
Tabla 5.3
Logaritmo de la
As
Estos datos ya los
concentración
tienes de la tabla
%T
Absortancia
(100 – %T)
anterior.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
5.15 Elaborar en papel milimétrico la gráfica de Ringbom, colocando en la ordenadas la
absortancia y en las abscisas el logaritmo de la concentración.
5.16 Señalar en esa gráfica los puntos de inflexión de la misma, es decir los puntos donde la
gráfica deja de ser lineal. Para ello, sobre la gráfica (que seguramente es un poco curva), trazar
una línea recta de diferente color, que incluya la mayor parte de los puntos posible. Los valores de
concentración fuera de la línea recta indican los valores de concentración donde el método ya no
sigue la Ley de BBL, es decir no es lineal. Los puntos de inflexión proporcionan el Rango Útil de
Concentración del método. Anotar este rango en la tabla 5.4
5.17 Ahora calcula la sensibilidad del método de la siguiente manera: En la zona de la gráfica de
Ringbom que es lineal, calcula la ecuación de la recta. En esta recta elige dos puntos de
absortancia que tengan una diferencia de 0.1 y con la ecuación interpola los valores para obtener
la concentración. La variación en la concentración entre estos dos puntos es la sensibilidad
5.18 Anotar la sensibilidad obtenida en la tabla 5.4. Explica si corresponde con la obtenida en la
curva tipo.
Tabla 5.4
Sensibilidad con la curva tipo
Sensibilidad con la gráfica de Ringbow
Rango útil de concentración del método
% de error
Desviación estándar (SD)
19
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5.19 Anota el valor de As obtenido con el calibrador de albúmina.
5.20 Empleando la ecuación de la Curva tipo y este valor de As, calcula la concentración del
calibrador y anotarla ____________ ¿Corresponde con la concentración teórica?
5.21 Calcula el % de desviación obtenida, considerando la concentración teórica, que es de 60
mg/mL como el 100%. Anotar el % de desviación en la tabla 5.4. La desviación debe ser menor al
10% para considerar un método con buena exactitud. ¿Consideras que éste método tiene buena
exactitud? Explica porque.
5.22 Tomando los datos empíricos de concentración del calibrador de todo el grupo, se calculará la
media (𝑥̅ ) y la desviación estándar (SD) del método para todo el grupo. Anotar la SD en la tabla
5.4
5.23 Para considerar un método preciso la SD no debe ser mayor al 10%. Según tus resultados
explica si éste método tiene buena precisión.
5.24 En la tabla 5.2 se anotó el valor de As obtenida para el suero humano. Empleando la ecuación
de la curva tipo, calcula la concentración de albúmina en ese suero y anótala en la misma tabla
5.2.
5.25 Explica si consideras éste método útil para determinar la concentración de albúmina en suero
humano.
C. Especificidad de la reacción.
5.26 Anota los resultados en la tabla 5.5.
Tabla 5.5
Proteína
Tubo
1
2
Colágeno 60 mg/mL
Glicina 60 mg/mL
calibrador
Albúmina 60 mg/mL
As
5.27 Explica la diferencia en los resultados obtenidos entre el colágeno (proteínas) y la glicina
(aminoácido) y el calibrador de albúmina.
D. Interferencias con el método.
5.28 Anotar los resultados obtenidos en este experimento en la tabla 5.6
Tabla 5.6
Tubo
Condición
1
2
Albúmina + lípido
Albúmina + amp
3
Albúmina + Hb
calibrador
Albúmina sola
As
5.29 Explica la diferencia entre los datos obtenidos en los diferentes tubos con los del calibrador,
¿dirías que hay interferencias? ¿Ante estas interferencias que debe hacerse al realizar la técnica?
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia de la calibración de un equipo espectrofotométrico en un laboratorio clínico, los
cuidados que deben tenerse con un equipo espectrofotométrico para evitar que se descalibre.
Los aspectos tomarse en cuenta cuando se va a implementar un método espectrofotométrico para un
análisis clínico, así como la importancia de los aspectos de linealidad, rango útil de concentración,
20
Laboratorio de Bioquímica Clínica
sensibilidad, precisión, exactitud, las interferencias y la especificidad. Discutir si este método
ensayado cumple con estas especificaciones. La posibilidad de usar este método en equipos
automatizados
7. CONCLUSIONES
7.1
En función de los resultados y la discusión que se realizó, elaborar las conclusiones de la
práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1. Skoog, D., Holler, J. y Crouch, S. 2006. Principios de análisis instrumental. 6a. edición. Ed. Mc
Graw-Hill Co. México.
8.2. Willard, H., Merritt, L., Dean, J. y Settle, F. 1991. Métodos Instrumentales de Análisis. 7a.
edición. Grupo Editorial Iberoamericana, Mexico.
8.3. Kaplan, L. y Pesce, A. 2002. Química clínica: Métodos. 4a. edición. Ed. Médica Panamericana.
8.4. Louderback, A., Mealy, E. y Taylor, NA. 1968. A new dye binding technique using bromocresol
purple for determination of albumin in serum. Clin. Chem. 14: 793.
8.5. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioquímica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. México.
21
Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA No. 3
ELECTROFORESIS DE SUERO.
UNIDAD VII: Equipos empleados en la clínica para el estudio del metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Desarrolla la electroforesis vertical en gel de poliacrilamida para separar las proteínas del suero
humano.
1.2 Objetivos específicos
El alumno:
1.2.1. Determina los principios de operación de la técnica y el equipo de electroforesis PAGE.
1.2.2. Determina el peso molecular de las principales proteínas que se encuentran en el suero y
plasma.
2. INTRODUCCIÓN
De la fase líquida de la sangre, el 90% es agua, y del 10 % restante el 70% corresponde a
proteínas, las cuales son de gran importancia en la Bioquímica Clínica, ya que estas varían sus
concentraciones en diferentes condiciones fisiológicas. Existen más de 100 proteínas con una función
fisiológica en el plasma, las funciones que tienes estas proteínas van desde transporte (Albúmina,
Apolipoproteína, Transferrina), inmunidad (Inmunoglobulinas), mantenimiento de presión osmótica
(todas, especialmente la Albúmina), inhibidores de proteasas (Antitripsina α1), regulación del pH, etc.
Algunas proteínas plasmáticas son enzimas (Renina, Factores de coagulación) principalmente
plasmáticas, pero también se encuentran de origen intracelular debido al reciclaje celular normal, o a
daño celular.
La electroforesis es una técnica analítica que permite separar sustancias en función de su carga
eléctrica, para separar una mezcla de proteínas en muestras biológicas. Debido a que una proteína
está cargada cuando se encuentra en un pH diferente de su punto isoeléctrico (pI), ésta migrará en
un campo eléctrico de un modo dependiente de su densidad de carga.
Las principales propiedades que determinan la migración de una proteína bajo condiciones dadas
en una técnica electroforética son: tamaño, carga neta, forma e hidrofobicidad relativa). La separación
es llevada a cabo en un medio de soporte para contrarrestar los efectos de la convección y difusión
que ocurren durante la electrofóresis, y para facilitar la inmovilización de las proteínas separadas,
entre los materiales de soporte o matrices se pueden mencionar el almidón, agarosa, acetato de
celulosa, así como poliacrilamida, cuya aplicación se denota como PAGE (electroforesis en gel de
poliacrilamida).
La acrilamida-bisacrilamida son compuestos que polimerizan en presencia de iones catalizadores
(persulfato o TEMED), formando una malla o red con poros. El tamaño de estos poros depende de la
concentración de bisacrilamida. Por estos poros podrán pasar moléculas, como proteínas, según su
tamaño. Así el gel de poliacrilamida se comporta como un tamiz (coladera) molecular.
22
Laboratorio de Bioquímica Clínica
La electrofóresis se puede realizar en condiciones no desnaturalizantes como desnaturalizantes, la
primera permite retener la actividad biológica y propiedades enzimáticos, en contraste, la segunda
implica condiciones más vigorosas, desnaturalizantes y comunes para separar proteínas menos
solubles, implica la participación del detergente duodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y de βMercaptoetanol, con esto se logra la adquisición de carga negativa y una forma homogénea de todas
las proteínas presentes en la muestra así como la separación de las cadenas polipeptídicas que
forman parte de una proteína por la ruptura de los puentes disulfuro. Las proteínas tratadas de esta
manera se comportan como si tuvieran una forma similar y una relación carga/masa idéntica, lo que
da como resultado que la movilidad electroforética esté únicamente relacionada con el peso
molecular de la proteína a causa de la acción del gel como tamiz molecular.
Si una serie de proteínas de peso molecular conocido son sometidas a electroforesis, se separan
en una serie de bandas y la representación gráfica de la distancia recorrida en función del logaritmo
del peso molecular da una recta. De este modo, si una proteína de peso molecular desconocido es
sometida a una electrofóresis de modo simultáneo con proteínas de peso molecular conocido, el de
aquella se puede calcular con una exactitud variable entre el 5 y el 10%.
La electrofóresis para el fraccionamiento de proteínas ha resultado ser una valiosa técnica de
separación y cuantificación en el laboratorio clínico, para análisis de proteínas séricas o plasmáticas
así como para el análisis de líquido cefalorraquídeo y para análisis de lipoproteínas, se puede hacer
la evaluación de las diferentes fracciones proteicas en diversos estados patológicos.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL












Baño maría a ebullición
Cámara de Electroforesis para Poliacrilamida
Parrilla con agitador magnético
Una fuente de poder de 100 V
Soporte universal completo
Un baño Maria
Mechero
Pipeta Pasteur
Pipeta automática de 10 L
Pipeta automática de 20 L
Pipeta automática de 100 L
Puntas para pipetas automáticas
23
Laboratorio de Bioquímica Clínica






Agitador magnético
Agujas para vacutainer
Tubos vacutainer con gel y con EDTA
Torundas, ligadura y adaptador
2 matraces de 125 ml
Agitador de vidrio
3.3 REACTIVOS











Amortiguador 4X a pH 8,8 (Tris HCl 1.5 M)
Amortiguador 4X a pH 6.8 (Tris HCl 0.5M)
Acrilamida- bisacrilamida 29:1%
TEMED
Persulfato de amonio 10%
Amortiguador de Laemmli 2x (Tris-HCl 120mM, glicerol 20%, SDS 2 %, EDTA 2 mM, azul de
bromofenol 0.02%, ditiotreitol 0.2 M)
Fibrinógeno sérico 1 mg/mL
Marcador de peso molecular para proteínas
Solución de trabajo para la tinción de proteínas en gel con Azul de Coomassie
Solución desteñidora (metanol al 50%, ácido acético glacial al 10%)
Buffer de corrimiento 1X. (Tis-HCl 25mM, Glicina 192mM, SDS 0.1%)
3.3 MUESTRA BIOLÓGICA
 5 ml de sangre
24
Laboratorio de Bioquímica Clínica
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. ENSAMBLADO DEL EQUIPO Y PREPARACIÓN DEL GEL
4.1 Se ensamblan los componentes del sistema para gelificación en el soporte para tal efecto, de
acuerdo a las instrucciones del profesor.
4.2 Preparar el gel separador (al 10%) en un vaso de precipitados mezclando con agitador magnético
y de acuerdo a lo que indica el cuadro:
Amortiguador 4x pH 8,8 (1,5M)
1.5 ml
Acrilamida-bisacrilamida al 29:1%
1.98 ml
H2O destilada
2.54 ml
TEMED 8.4%
30 μL
Persulfato de amonio 10% (PSA)
60 μL
4.3 Inmediatamente al adicionar el PSA homogenizar y con ayuda de una pipeta Pasteur transferir la
mezcla al sistema para gelificación, dejar reposar 15 minutos.
4.4 Una vez formado el gel separador preparar el gel concentrador considerando los cuidados
anteriores y de acuerdo a la siguiente tabla.
Amortiguador 4x pH 6.8 (0.5M)
0.5 ml
Acrilamida-bisacrilamida al 29:1%
0.33 ml
H2O destilada
1.16 ml
TEMED 8,4%
13 μL
Persulfato de amonio 10| % (PSA)
27 μL
4.5 Preparada la mezcla vaciarla al sistema.
4.6 Colocar el peine y dejar gelificar.
4.7 Ensamblar el sistema de gelificación al sistema de sujeción que tiene a los electrodos, y colocarlo
en la cámara de electrofóresis.
4.8 Retirar el peine y llenar la cámara con amortiguador de corrida.
B. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
4.9 Obtener sangre por equipo, la mitad de los equipos obtendrán suero, y la otra mitad plasma.
4.10 Disolver 10ul de las muestras en 10
amortiguador de Laemmli suplementado.
4.11 Calentar en baño María en ebullición durante 5 minutos y cargar en el gel.
25
Laboratorio de Bioquímica Clínica
C. CARGADO DEL GEL
4.12 Con ayuda de la pipeta automática colocar en el primer carril el marcador de peso molecular,
en el segundo carril cargar una muestra con fibrinógeno y en los otros carriles las muestras de
cada uno de los equipos.
4.13 Colocar la tapa de la cámara de electrofóresis y conectar las terminales a la fuente de poder.
4.14 Aplicar un voltaje de 100 V
D. TINCIÓN DEL GEL
4.15 Una vez que el colorante se haya recorrido la mayor parte del gel, desconectar de la fuente, y
retirar el gel siguiendo las instrucciones del profesor.
4.16 Colocar el gel en la solución de azul de Coomassie, y dejarlo en agitación durante toda una
noche.
4.17 Desteñir el gel agitando en la solución de Metanol al 50% y ácido acético al 10% poniendo en
agitación de una a dos horas.
4.18 Poner el gel en una solución de metanol al 7% y metanol acético al 10% para finalizar el
proceso.
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
5.1 Realizar un esquema detallado del gel obtenido señalando clara y de manera precisa la posición
de las diferentes bandas evidenciadas, al cual llamamos electroferograma.
5.2 Medir con regla la distancia recorrida para cada una de las bandas en cada uno de los carriles y
anota las distancias medidas en tu esquema.
5.3 Graficar el log peso molecular de las diferentes proteínas que componen al marcador de peso
molecular, contra la distancia recorrida en el gel de cada una de ellas.
5.4 De esta gráfica realizar la regresión lineal, para determinar el peso molecular de las proteínas
evidenciadas en el gel.
5.5 Ahora buscar en la bibliografía principales proteínas que se encuentran en el suero y el plasma,
así como su peso molecular y comparar con los pesos moleculares obtenidos en el gel para
determinar a qué proteína puede corresponder cada banda. Indica también la intensidad de la
banda que obtuviste en el gel con la concentración en la que se encuentra en el suero.
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia de la Electroforesis en suero, mencionando su aplicación tanto en el área clínica como
en la investigación biomédica con ejemplos reales y específicos. Los resultados obtenidos,
comprando lo obtenido entre suero y plasma, y que significan estas diferencias.
7. CONCLUSIONES
7.1 Con los resultados obtenidos, el análisis y la discusión, los objetivos de la práctica y a la
bibliografía consultada elaborar las conclusiones de esta práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1. Hames, B. D. and D. Rickwood. 1990. Gel Electrophoresis of Proteins. 2nd. edition. Irl Press.
New York, USA.
8.2. Nelson, D. L., M. M. Cox y C. M. Cuchillo. 2001. Lehninger Principios de Bioquímica. 2ª.
edición. Omega. Barcelona, España.
8.3. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioquímica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. México.
26
Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA 4
USO DE ENZIMAS EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO: PERFIL
CARDIACO Y PERFIL HEPÁTICO
Unidad II. Aminoácidos, proteínas y enzimas.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
El alumno:
1.1.1. Determina los niveles séricos de las enzimas empleadas en el diagnóstico cardiaco y hepático.
1.2 Objetivos particulares:
El alumno:
1.2.1. Ensaya métodos espectrofotométricos cinéticos para determinar actividad enzimática.
1.2.2 Realiza la determinación cuantitativa de las enzimas ALT y AST, LDH y CK en suero humano
haciendo uso de un kit de diagnóstico clínico.
1.2.2. Evalua la importancia de los resultados obtenidos de las muestras sanguíneas procesadas en
la determinación de las enzimas y su contribución en las pruebas de laboratorio para la
determinación de afecciones cardiacas y hepáticas.
2. INTRODUCCIÓN
La enzimología encuentra aplicación práctica en el laboratorio clínico, en la medición de los niveles
enzimáticos y de las concentraciones de sustrato en plasma y tejidos de los pacientes para la
determinación de los estados de salud. Los cambios en los niveles enzimáticos en el plasma reflejan
alteraciones en un tejido u órgano específico.
Las enzimas plasmáticas son de dos tipos: las que están presentes en altas concentraciones en el
plasma y tienen una función específica, como las enzimas asociadas a la coagulación de la sangre
(trombina, plasmina, etc) y las que se encuentran normalmente en muy bajas concentraciones y no
tienen una función en el plasma. Estas son importantes en la determinación de las enfermedades de
los tejidos y los órganos ya que un proceso patológico puede provocar cambios en la permeabilidad
de la membrana celular o incrementar la muerte celular, lo que da origen a la liberación de enzimas
intracelulares en el plasma. Las enzimas citosólicas aparecen en el plasma antes que las enzimas
mitocondriales y cuanto sea mayor la cantidad de tejido dañado, mayor será el incremento en la
sangre.
En el diagnóstico de un proceso patológico sería ideal poder identificar enzimas específicas para
cada órgano, aunque el metabolismo de todos los tejidos es muy parecido. Sin embargo la
concentración de diferentes enzimas varía de tejido a tejido, y la cinética de aparición y desaparición
de determinadas enzimas en el plasma, permite un diagnóstico de un órgano específico. Como
ejemplos, la enzima creatinfosfocinasa (CPK) se encuentra en el músculo cardiaco, esquelético y
cerebro, la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) en el músculo cardiaco, esquelético e hígado, y la
enzima aspartato amino transferasa (AST o TGO) en el hígado y corazón, lo que implica que la
alteración de cualquiera de éstos órganos o tejidos provocará una alteración de los niveles de las
enzimas plasmáticas mencionadas.
En esta práctica se realizarán los ensayos enzimáticos de las principales enzimas involucradas en
el infarto al miocardio y en la lesión hepática, en lo que constituye el Perfil Cardiaco y Perfil
Hepático.
27
Laboratorio de Bioquímica Clínica
El infarto del miocardio es la muerte celular de las miofibrillas, causada por falta de aporte
sanguíneo a una zona del corazón, que es consecuencia de la oclusión (taponamiento) aguda y total
de la arteria que irriga dicho territorio. La causa de la oclusión coronaria, en la mayoría de los casos,
es debida a la trombosis (coágulo) consecutiva a la fractura de una placa de ateroma. También puede
ocurrir cuando existe una obstrucción significativa de una arteria coronaria por una placa de ateroma
y los cambios de tono normales de la arteria pueden obstruirla completamente, con o sin ruptura de la
placa.
La isquemia (falta de oxígeno) aguda y total o casi total comienza a producir áreas de necrosis en
el tejido cardiaco dentro de la primera hora posterior a la falta de sangre en la región. Después de las
primeras 3 horas posteriores a la oclusión coronaria comienzan a aparecer extensiones de la necrosis
hacia el tercio medio de la pared en la región isquémica. La figura 1 muestra la cinética de liberación
de enzimas cardiacas después de un infarto al miocardio. Este perfil permite establecer cuándo ha
tenido lugar el ataque y si el tratamiento es efectivo.
Fig. 1. Cinética de liberación de enzimas cardiacas después de un infarto
El síntoma característico del infarto es el dolor retro esternal (85% de los casos), opresivo, intenso,
con sensación de muerte inminente, que se proyecta hasta el cuello, hombros, maxilar inferior, brazo
izquierdo o ambos brazos. Habitualmente dura más de 30 minutos, puede prolongarse por varias
horas. No se alivia ni con el reposo ni con los vasodilatadores. Las mujeres tienden a experimentar
síntomas marcadamente distintos que los de los hombres. Los síntomas más comunes en las
mujeres son la disnea, debilidad, fatiga e incluso somnolencia, por lo que el dolor de pecho puede ser
menos predictivo de una isquemia coronaria que en los hombres. Sin embargo, existen otras
enfermedades en las que se presenta dolor torácico, como en la pericarditis aguda, el reflujo
gastroesofágico, y otras, por lo que son necesarias pruebas específicas para cada enfermedad. Estas
pruebas son: electrocardiograma, revisión de síntomas clínicos, y el uso de marcadores bioquímicos
de daño al músculo cardiaco.
La determinación de éstos marcadores bioquímicos es lo que se concoe como Perfil Cardiaco. La
elevación en la concentración de las enzimas creatinfosfoquinasa (CPK), la transaminasa glutámico
oxaloacética o aspartato amino transferasa (TGO, AST) y la deshidrogenasa láctica (LDH), y
proteínas como la Troponina son las que tienen valor diagnóstico.
La enzima que se eleva primero es la CPK, lo hace en las primeras 8 horas, alcanza su máximo a
las 24 horas y regresa a las cifras normales de 48 a 72 horas. Sin embargo esta enzima también se
eleva en miopatías, diabetes, intoxicación etílica, trauma muscular, ejercicio exagerado e infarto
pulmonar. Se eleva incluso por la administración de inyecciones intramusculares. De ahí que sea más
específica la medición de la fracción miocárdica (MB) de la CPK, o CPK-2 que es una isoenzima de la
CPK, presente en el corazón. La actividad de la fracción CK-MB se encuentra entre 6 -25% de la
actividad total de la CK.
28
Laboratorio de Bioquímica Clínica
La LDH se eleva en el suero a las 24 o 48 horas alcanzando su máximo a los 4 o 6 días
descendiendo a cifras normales en 1 o 2 semanas después del infarto.
La troponina es un componente del aparato contráctil del músculo, y los niveles arriba de lo normal
son un buen marcador de daño cardiaco en enfermedades como infarto, miocarditis, angina y cirugía
cardiaca. Sus niveles aumentan a las 4-6 horas después del infarto, con un pico a las 24 h, y
permanecen altos por 7-10 días dando un margen mas amplio que la CK-MB para determinar daño
cardiaco.
El perfil hepático es un conjunto de exámenes de sangre que indican si el hígado está
funcionando normalmente. El hígado se encuentra en el abdomen y está ubicado cerca del estómago.
Es un órgano muy importante, porque descompone y almacena sustancias como azúcares, grasas y
vitaminas. El hígado también remueve las drogas y otros químicos del cuerpo. La ictericia (piel y ojos
amarillos) casi siempre es causada por problemas en el hígado. Una lista común de exámenes
incluye la búsqueda de enzimas hepáticas que provienen de los tejidos hepáticos dañados. Otras
pruebas pueden buscar las sustancias producidas o cambiadas por el hígado, como la bilirrubina.
Las Aminotransferasas ó transaminasas, son las enzimas más útiles en reconocer la enfermedad
hepática aguda. La Aspartato aminotransferasa AST (GOT) se localiza en mitocondria y citoplasma
del hepatocito y en otros tejidos (corazón y músculo). La Alanina aminotransferasa ALT (GPT), con
vida media más corta, sólo en citoplasma, y es indicador más sensible y específico de daño
hepatocelular.
Las pruebas bioquímicas realizadas para el diagnóstico de enfermedad hepática incluyen otras
como:
 Enzimas de necrosis: ALT, AST, LDH.
 Enzimas de colestasis: FA, GGT.
 Enzimas de masa ocupante: GGT, LDH.
 Enzimas de síntesis: CHE
 Enzimas de fibrinogénesis: GGT
Estudio metabólico:
 Proteico: Albúmina, Igs, Alfafetoproteína.
 Lipídico: Colesterol, TG, Bilirrubina y Ácidos biliares.
 Coagulación: Factores dependientes de vitamina K, (IP) Fibrinógeno.
La utilidad es la detección de una lesión hepática, aunque sea leve, y establecer un diagnóstico
específico, dar seguimiento a la enfermedad, hacer una evaluación del tratamiento, determinación de
la gravedad y pronóstico. Ninguna prueba cubrirá todos los aspectos, siendo precisa la utilización
conjunta de varias de ellas.
Un buen ensayo enzimático se basa en el control de temperatura y pH, así como de las
concentraciones saturantes de sustratos, y cofactores. Para obtenerse esto último debe de conocerse
la Km, y las condiciones de pH y fuerza iónica, que van a utilizarse en el ensayo. Se recordará que la
Km es la concentración de sustrato a mitad de la velocidad máxima (1/2 Vmáx), para asegurarse que el
sistema está saturado, la concentración de sustrato se incrementa entre 5 y 10 veces sobre la Km.
Con la saturación de la enzima por el sustrato, la reacción es de orden cero. En estas condiciones los
cambios de velocidad son proporcionales a la concentración de la enzima. En el laboratorio clínico las
condiciones de ensayo se optimizan de manera rutinaria para las determinaciones enzimáticas. En
estos análisis las enzimas que utilizan a las coenzimas NAD+, NADP+ y FAD (reacciones acopladas)
son fáciles de medir gracias a sus propiedades ópticas. El NADH presenta un máximo de absorción a
340 nm y el FAD absorbe fuertemente a 450 nm.
Fundamento de los métodos de determinación de enzimas y metabolitos empleados en clínica.
En bioquímica clínica la determinación de enzimas y metabolitos puede llevarse a cabo mediante dos
métodos básicos:
29
Laboratorio de Bioquímica Clínica

Métodos químicos colorimétricos: En ellos el metabolito se hace reaccionar con un
compuesto para producir un derivado colorido que pueda detectarse
espectrofotométricamente, ya que la intensidad del color será directamente proporcional a la
concentración de la sustancia a determinar. La reacción general sería:
Metabolito + Reactivo cromógeno
Producto colorido
Estas reacciones pueden ser de:

o
punto final, si la reacción ocurre y se concluye en un solo momento,
o
cinéticos, si se lee a diferentes tiempos.
Métodos enzimáticos: en estos, la enzima reacciona con el sustrato (s) y se obtienen
productos. Estos métodos también pueden ser de punto final, o cinéticos.
Enzima
Sustrato 1 + Sustrato 2
Producto 1 + Producto 2
La determinación de los productos, puede ser:
o
colorimétrica, en donde el producto de la enzima se hace reaccionar con un compuesto
para dar un derivado colorido. Las reacciones tipo Trinder son las mas usadas.
o
espectrofotométricos, donde generalmente se emplea la luz UV para detectar el
producto.
o
reacciones acopladas, en donde el producto de la enzima se acopla a otra reacción
enzimática (es decir actúa como sustrato de otra enzima, para dar el producto 2). En
estos casos, lo que se detecta es el producto 2, ya sea por métodos colorimétricos o
espectrofotométricos.
Enzima 1
Sustrato
Producto 1
Enzima 2
Producto 1
Producto 2
La reacción que cataliza la AST es la siguiente:
ASAT
α-Cetoglutarato + Aspartato
Glutamato + Oxalacetato
Valores de referencia*: Hombres hasta 19 U/L , Mujeres hasta 16 U/L a 25°C
La reacción que cataliza la ALT es la siguiente:
ALAT
L-Alanina + 2-Oxoglutarato
Piruvato + L Glutamato
Valores de referencia*: Hombres hasta 22 U/L , Mujeres hasta 18 U/L a 25°C
La reacción que cataliza la LDH es la siguiente:
LDH
Piruvato + NADH + H
+
Lactato + NAD +
30
Laboratorio de Bioquímica Clínica
Valores de referencia*: 120-240 U/L a 25°C
La reacción de la CPK es como sigue:
CPK
Fosfocreatina + ADP
Valores de referencia*:
Creatina + ATP
CK: Hombres hasta 80U/L, Mujeres hasta 70U/L a 25°C
CK-MB > 10U/L a 25°C
*Estos valores deberán servir solamente como guía. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio intervalo
de valores normales ya que existen diferencias entre instrumentos, laboratorios y población local.
La actividad de éstas enzimas se determinará por alguno de los métodos arriba descritos. En el caso
de la CPK, se determinará la fracción CK-MB, y para determinar ésta se empelan anticuerpos que
inhiben la actividad de las otras fracciones. Generalmente se emplean los métodos enzimáticos
espectrofotométricos.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL













Espectrofotómetro visible
Centrífuga clínica
Baño maria a 25 -30 °C
Celdas de 1 cm de paso
Tubos vacutainer con gel
Torundas, ligadura y adaptador
Aguja para vacutainer
Gradilla para tubos
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Pipetas de 2 mL
Pipetas de 1 mL
Micropipetas automáticas de 100 L
Puntas para micropipeta automática de 100 L
3.2 REACTIVOS Y MATERIAL BIOLÓGICO





Kit Kit Spinreact ALT/GPT
Kit Spinreact AST/GOT
Kit Spinreact LDH.
Kit Spinreact CPK
Kit Spinreact CK-MB
31
Laboratorio de Bioquímica Clínica
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.
4.1 Obtener aproximadamente 5 mL de sangre periférica en un tubo vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
B. DATOS DEL PACIENTE
4.4 Anotar los datos generales del paciente en la tabla 5.1, antes de tomar la muestra.
C. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS ASPARTATO AMINO
TRANSFERASA (AST), ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALAT) , LACTATO
DESHIDROGENASA (LDH) Y CREATINA FOSFOQUINASA-FRACCIÓN MB (CK-MB).
Dependiendo de la marca del Kit que se tenga para la práctica, las concentraciones, cantidades y condiciones
de las reacciones pueden variar.
4.5 En los kits, el sustrato y las enzimas y reactivos usados se encuentran liofilizados y deben ser
reconstituidos, es decir solubilizados, para su uso. Esto lo realizará el profesor previo a la práctica.
4.6 Seguir las instrucciones que indique el inserto de cada uno de los kits que serán proporcionadas
por el profesor, y revisar en ellos:
4.6.1 Como se prepara el blanco de reactivos
4.6.2 como se procesará la muestra de suero obtenida y la temperatura del ensayo
4.6.3 a que longitud de onda (λ) de realiza la determinación
4.6.4
como se realizarán los cálculos para determinar el nivel de enzimas
4.6.5
como se define una Unidad de enzima
4.6.6
el fundamento de las reacciones que se usan para determinar la actividad de las
enzimas.
4.6.7
las interferencias, precisión y exactitud del método
4.7 Calibrar el espectrofotómetro con agua destilada.
4.8 Tomar las lecturas cada 30 segundos durante 5 minutos, a 340 nm, según las instrucciones del
inserto y las indicaciones del profesor.
4.9 Anotar los resultados en la tabla 5.2
32
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
A. DATOS DEL PACIENTE
5.1 Anotar los datos del paciente en la tabla 5.1
Tabla 5.1
Sexo
Edad
Condición de salud o fisiológica
Toma algún medicamento (cuál)
Ayuno
B. DETERMINACIÓN DE ENZIMAS AST, ALT, LDH, CK
5.2 Anotar los resultados obtenidos desde tiempo 0 a 5 minutos en la tabla 5.2
Tabla 5.2
As 340 nm
Tiempo
(seg)
AST
ALT
LDH
CK
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
ΔAs/minuto
5.3 Elaborar las gráficas de As contra tiempo para cada enzima.
5.4 Para cada curva determinar la zona que se comporta de forma lineal, y delimitarla. De esta zona,
determinar la ecuación y anotar la pendiente.
5.5 Calcular las unidades de enzima empleando la pendiente de la ecuación obtenida por el factor
que indica el inserto del kit.
U/L =
pendiente X
FACTOR
5.6 Ahora realizar el cálculo usando el A/min que se calculó en la tabla 5.2
33
Laboratorio de Bioquímica Clínica
U/L =
A/min
Absortividad
U/L =
A/min
X
X
Volumen Total
Volumen de la muestra
FACTOR
5.7 Anotar los valores obtenidos de unidades de enzima por litro U/L obtenidas por los dos métodos
en la tabla 5.3
Tabla 5.3
Método usado en
AST
ALT
LDH
CPK
el cálculo
Pendiente de la
gráfica
A/min
5.8 ¿Existieron diferencias entre los valores de la Unidades de enzima obtenidos entre ambos
métodos de cálculo? Explica porque.
5.9 ¿Qué significan los valores obtenidos de cada enzima? Indicar si son valores normales y
considera los datos anotados del paciente.
5.10
¿Cuál es la importancia clínica de estas enzimas? Explicar en relación con el perfil hepático y
el perfil cardiaco.
5.11
¿Qué otras determinaciones se pueden realizar en el perfil cardiaco y en el perfil hepático,
además de las realizadas en la práctica?
5.12
Mencionar 3 estados patológicos en donde se vean alterados los valores de las enzimas LDH,
AST, ALT y CPK
5.13
Anotar las reacciones que se llevan a cabo en los métodos empleados para la determinación
de actividad de cada enzima e indicar cuál es el principio en el que se basa esta detección
(químico, enzimático, punto final, cinético, espectrofotométrico o colorimétrico).
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
Los resultados obtenidos, así como los métodos utilizados. Para qué sirven los valores de referencia.
La importancia del uso de las enzimas en el diagnóstico clínico.
7. CONCLUSIONES
7.1 Con los resultados obtenidos, análisis y discusión y en base a los objetivos de la práctica y la
investigación bibliográfica, realizar las conclusiones.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1. Davidson I., Henry J. B. 1979. Todd-Sanford. Diagnóstico clínico por el laboratorio. 6ª.
edición. Salvat editores. Barcelona, España.
8.2. Devlin. T. M. 1997. Bioquímica con aplicaciones clínicas. Tomo I y II. 3ª edición. Editorial
Reverté. España.
8.3. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioquímica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. México.
8.4. Canto JG, Goldberg RJ, Hand MM. 2007. Symptom presentation of women with acute coronary
syndromes: myth vs. reality. Arch. Intern. Med. 167 (22): 2405–13.
34
Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA 5
CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE
GLUCOSA EN SUERO HUMANO.
Unidad III. Carbohidratos y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
El alumno:
1.1.1. Elabora una Curva de Calibración para la determinación de glucosa en sangre.
1.2 Objetivos particulares:
El alumno:
1.2.1. Emplea un método enzimático para la cuantificación de glucosa en sangre.
1.2.2 Evalua la importancia de los resultados obtenidos de las muestras sanguíneas y su contribución
en las pruebas de laboratorio para la determinación de patologías como la diabetes.
2. INTRODUCCIÓN
La glucosa es la principal fuente de energía de todos los organismos, la cuál es utilizada para el
sostenimiento de todos los procesos vitales del individuo así como para su perpetuación.
En los seres humanos la concentración de glucosa en sangre considerada normal se encuentra
entre los valores de 70 a 100 mg/dL. Los valores por fuera de estos límites, se deben a y provocan
alteraciones en la fisiología del organismo propios de la hipoglucemia (valores bajos) o de la
hiperglicemia (valores altos). Si bien la hipoglicemia puede convertirse en algún momento en un
problema grave, la hiperglicemia, es la condición más común en la población mundial y sus efectos
sobre quien la padece son mas severos.
La enfermedad es conocida como diabetes y es una alteración metabólica que afecta a varios
órganos y tejidos del cuerpo, por lo que la cuantificación de la glucosa en sangre es primordial para
establecer un diagnostico o para evaluar la efectividad del tratamiento aplicado. El diagnostico
temprano de la enfermedad es de suma importancia para evitar problemas crónicos y efectos
secundarios muchos de los cuales terminan con la vida del paciente.
Se tiene diabetes cuando la concentración de la glucosa del plasma en ayunas es mayor que, o
igual a 126 mg/dL y se tiene una concentración de glucosa del plasma casual (tomada a cualquier
hora del día) igual o mayor a 200 mg/dL. El valor del examen oral de la tolerancia a la glucosa (sus
siglas en inglés son OGTT) es mayor que, o igual a 200 mg/dL cuando se mide en un intervalo de dos
horas. El OGTT es dado sobre un periodo de tres horas. Los niveles entre 100 y 126 mg/dL se
denominan como alteración de la glucosa en ayunas o prediabetes.
Las causas de la diabetes no están bien definidas, es posible que alteraciones genéticas y los
factores ambientales, como pueden ser las malas costumbres de las personas (alimentación,
sedentarismo, obesidad, estrés) sean la causa de que una tolerancia normal a la glucosa se convierta
en patológica, desarrollando la diabetes.
Si bien es posible hacer el análisis en plasma, es más común realizarlo en suero. La determinación
de glucosa en suero puede llevarse a cabo por métodos químicos o enzimáticos, sin embargo, los
métodos químicos han caído en desuso en la mayoría de los laboratorios de análisis clínicos y los
métodos enzimáticos han tomado su lugar, e incluso se han automatizado lo que permite
determinaciones rápidas. Los métodos enzimáticos son altamente específicos y se emplean
35
Laboratorio de Bioquímica Clínica
diferentes enzimas, con reacciones acopladas, en las que la determinación del analito es indirecta
pues lo que propiamente es evaluado por el aparato es el producto final de la reacción que puede ser
una sustancia colorida o no, pero que tiene una absorción especifica a cierta longitud de onda.
En el método de la glucosa-oxidasa, esta enzima reacciona sobre la glucosa para transformarla en
ácido glucónico y producir peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno reacciona con un aceptor
de oxígeno cromogénico (por ej. la aminofenazona) en una reacción catalizada por la peroxidasa.
Glucosa Oxidasa
Glucosa + O2
No enzimático
D- Gluconolactona + H2O2
Acido glucónico
Peroxidasa
2 H2O2 + p - hidroxibenzoato + 4-Aminofenazona
Quinominina colorida
Este aceptor cambia de color y la intensidad del mismo se puede determinar por el
espectrofotómetro, siendo el color directamente proporcional a la concentración de glucosa presente
al inicio de esta cadena de reacciones. El método tiene algunas interferencias como sería la
presencia de ácido úrico, creatinina, ácido ascórbico y sustancias reductoras en general. El método
del electrodo de glucosa oxidasa-oxígeno determina la concentración de la glucosa mediante un
electrodo, en el que el peróxido generado se elimina por reacción con etanol y yodo, lo que evalúa el
electrodo es la tasa de consumo de oxígeno. El método es preciso y lineal y carece de interferencias.
Todo análisis químico requiere ciertas consideraciones antes de realizarlo, entre otras; las
condiciones de obtención de la muestra para el análisis, el tratamiento de la muestra, la preparación
de materiales y la utilización de estándares de referencia.
Para tener la certeza que el método dará el resultado correcto, el método se prueba con muestras
en composición similar y con un contenido de analito exactamente conocido.
Curva tipo, Curva estándar o Curva de Calibración
La determinación de cualquier sustancia, puede ser evaluada utilizando un equipo o instrumento.
En el laboratorio de análisis clínicos el instrumento más comúnmente usado es el espectrofotómetro
el cuál determina la Transmitancia (%T) o la Absorbancia (As). El % de T o la As obtenida son
proporcionales a la cantidad o concentración de x presente en la muestra (Cx). Esto se expresa en la
ecuación 4.1:
As o %T = KCx + b
Ec. 4.1
Donde K es una constante de proporcionalidad, indicada por la pendiente de la recta, que entre
mayor sea, indica una mayor sensibilidad del método. Es muy posible que aún si la concentración de
x (Cx) es igual a cero de todos modos se genere una respuesta aunque muy pequeña (es la
respuesta en blanco b).Es claro que el aparato no da valores de Cx sino que da valores de As o %T,
por lo que para conocer Cx se deben emplear estándares de referencia o patrones.
Los estándares de referencia que contienen la sustancia X se preparan en las mismas condiciones
que la muestra de tal manera que cubran el rango que se supone para Cx en la misma. Además se
incluye un blanco que contiene todos los reactivos empleados en la prueba, excepto la sustancia X. El
instrumento se ajusta a cero con agua destilada (blanco) y determina la As o el %T para la serie de
patrones. Un paso previo al ajuste del instrumento es la selección de la longitud de onda (λ), que
debe ser aquella que proporcione los resultados con la máxima absorbancia, para asegurar una
mayor sensibilidad.
Con los resultados obtenidos a partir de los estándares se construye una gráfica de Cx vs As (o
%T) ó Curva de calibración y se debe obtener una ecuación como la 4.1. A partir de la ecuación y una
vez calculadas las constantes m y b, podemos despejar el valor de Cx:
Cx = As – b / m
36
Laboratorio de Bioquímica Clínica
Una curva estándar ideal es aquella donde los puntos de la gráfica se encuentran en una línea
recta, sin desviación y con una b igual a cero. Las curvas estándar o de calibración reales deben
encontrarse cerca de este ideal, para lo cual se determina el coeficiente de correlación r y el valor de
b. El coeficiente de correlación determina la relación lineal entre dos variables, en este caso entre la
As y la concentración de nuestro analito, la glucosa y es un indicativo de la desviación de cada punto
de la recta ideal. Un r igual a 1.0 indica una correlación perfecta entre ambas variables, y si una varia,
la otra lo hace en la misma proporción. Si r es 0 (cero) no existe correlación. Para nuestros fines se
busca lo más cercano a este ideal y que sería un r de 0.9 o mayor y una b cercana a 0.
En esta práctica construiremos una curva tipo de glucosa y se empleará en la determinación de
glucosa en sangre mediante una técnica enzimática.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL









Espectrofotómetro visible
Baño Maria a 37°C
Dos celdas de vidrio para el espectrofotómetro.
Agujas para vacutainer
Tubos vacutainer con gel
Torundas, ligadura y adaptador
8 tubos de ensaye de 13x100
1 pipeta serológica de 2ml.
Pipetas automáticas de 10uL
3.2 REACTIVOS Y MATERIAL BIOLÓGICO
 Kit para determinación de glucosa, por el método de glucosa oxidasa (GOD)
 Muestra biológica: suero
 Serie estándares de referencia de glucosa de 30 mg/dL, 60 mg/dL, 90 mg/dL, 120 mg/dL y 150
mg/dL
 Control o Patrón de glucosa de 100 mg/dL
37
Laboratorio de Bioquímica Clínica
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.
4.1 Obtener aproximadamente 5 mL de sangre periférica en un tubo vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
B. ELABORACIÓN DE LA CURVA TIPO DE GLUCOSA.
4.4 Rotular una serie de 6 tubos de ensayo de 13 x 60 como indica la tabla 4.1
4.5 Seguir las instrucciones de la misma tabla para adicionar los reactivos.
Tubo
Tabla 4.1
Adicionar 10 μL de:
1
Estándar de glucosa de 30 mg/dL
Reactivo para color
(mL)
1
2
Estándar de glucosa de 60 mg/dL
1
3
Estándar de glucosa de 90 mg/dL
1
4
Estándar de glucosa de 120 mg/dL
1
5
Estándar de glucosa de 150 mg/dL
1
6
Patrón del kit de 100 mg/dL
1
7
Muestra de suero
1
8
Blanco (agua)
1
4.6 Colocar los tubos en Baño Maria a 37°C durante 10min.
4.7 Dejarlos enfriar y leer la absorbancia a 505nm en el espectrofotómetro. Ajustar a cero de As con
el blanco.
4.8 Registrar los resultados en la tabla 5.1
38
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
5.1 Anotar los resultados de la curva tipo de los otros equipos en la tabla 5.1.
Tabla 5.1
As de los tubos
1
2
3
4
5
Patrón
Serie del equipo
1
Serie del equipo
2
Serie del equipo
3
Serie del equipo
4
Serie del equipo
5
Serie del equipo
6
Serie del equipo
7
Serie del equipo
8
Serie del equipo
9
Serie del equipo
10
Serie del equipo
11
5.2 Observar los datos. Algunos se alejan mucho de un valor promedio. Esto son datos dispersos.
Para estos datos realizar la prueba de Q según la siguiente fórmula y rechazar o aceptar esos
datos.
(Valor sospechoso) – (Valor de vecino más cercano)
QR =
(Valor más alto) – (Valor más bajo)
El valor sospechoso es aquel dato que está muy alejado del promedio. Si QR < Q para N numero
de datos el resultado se acepta, para este caso N = 5 y Q = 0.76. Sombrear en rojo los datos
rechazados. Consultar la tabla 5. 3 de la pag. 43, e los valores críticos de Q.
5.3 Con los datos aceptados calcular la media y la desviación estándar para cada concentración y
anotar los resultados en la tabla 5.2.
39
Laboratorio de Bioquímica Clínica
1
2
Tabla 5.2
As de los tubos
3
4
5
Serie del equipo 1
Serie del equipo 2
Serie del equipo 3
Serie del equipo 4
Serie del equipo 5
Serie del equipo 6
Serie del equipo 7
Serie del equipo 8
Serie del equipo 9
Serie del equipo 10
Serie del equipo 11
x
S
5.4 Con los promedios de los datos aceptados elaborar en papel milimétrico una gráfica colocando
en el eje de las X el valor de concentración de los estándares y en el eje de las Y el valor
promedio de las As a 505nm.
5.5 Realizar el análisis matemático para determinar la ecuación que describe la mejor curva
estándar.
5.6 Escribir en el cuadro la ecuación calculada en términos de As y la concentración de glucosa [Glc].
Recordar que Y = As y que X = [Glc].
5.7 Calcular el valor de la concentración de la muestra problema y del patrón empleando esa gráfica.
Comparar los valores con los obtenidos a partir del cálculo con la ecuación.
5.8 Con los datos de As obtenidos a partir del análisis de las muestras problema llenar la tabla 5.3.
Tabla 5.3
[Glc] calculada
[Glc] calculada con
No de
As del suero
gráficamente
la ecuación mg/dL
equipo
mg/dL
1
2
3
4
5
6
x
S
40
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5.9 Anotar también el valor del patrón empleado y verificar que el valor calculado a partir de la
ecuación coincide con el valor real de concentración.
[Glc] calculada con
la ecuación mg/dL
As del patrón
[Glc] real
mg/dL
5.10
Calcular el % de error que se tuvo en la concentración de glucosa del patrón con la siguiente
ecuación:
% Error =
5.11
5.12
5.13
5.14
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜−𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙
x 100
¿Cuál es el papel del blanco en la curva tipo?
¿Que es un control o patrón en bioquímica clínica?
Mencionar cinco causas de error en los resultados experimentales.
Explicar que es un error sistemático y que un error aleatorio.
Tabla de Valores críticos de Q para el test de Dixon, en función del número de
determinaciones y del nivel de confianza
Probabilidad
n
3
4
5
6
7
8
9
10
12
14
16
18
20
25
30
90%
0.941
0.765
0.642
0.560
0.507
0.468
0.437
0.412
0.376
0.349
0.329
0.263
0.300
0.277
0.260
95%
0.970
0.829
0.710
0.625
0.568
0.526
0.493
0.466
0.426
0.396
0.374
0.356
0.342
0.317
0.298
99%
0.994
0.926
0.821
0.740
0.680
0.634
0.598
0.568
0.522
0.508
0.463
0.442
0.425
0.393
0.372
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia de la curva tipo en los análisis clínicos, y que sucede con los equipos automatizados.
Para que se hizo el análisis estadístico en ésta práctica, y cuál es su importancia en el laboratorio
clínico.
41
Laboratorio de Bioquímica Clínica
7. CONCLUSIONES
7.1 En función de los resultados y la discusión que se realizó, elaborar las conclusiones y verificar si
se cumplieron los objetivos planteados.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1. Bernard H, John. 1988. Todd-Sanford-Davidson: Diagnostico y Tratamiento Clínicos por el
Laboratorio. Tomo I. 8ª edición. Salvat Editores. Barcelona, España.
8.2. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioquímica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. México.
8.3. Day R. A. and Underwood A. L. 1997. Química Analítica Cuantitativa. 5a edición. Prentice Hall
Latinoamérica. México.
8.4. Ramette W, Richard. 1983. Equilibrio y Análisis Químico. Fondo Educativo Interamericano.
E.U.A.
8.5. Dean, R.B. y Dixon, W. J. 1951. Simplified statistics for small number of observations. Analytical
chemistry. 23: 4, 636-638.
42
Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA No. 6
OBTENCION DE VALORES DE REFERENCIA DE
TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN SUERO HUMANO
UNIDAD IV: Lípidos y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Determina experimentalmente valores de referencia de triglicéridos y colesterol..
1.2 Objetivos específicos
El alumno:
1.2.1. Realiza el análisis enzimático de triglicéridos y colesterol en suero humano
1.2.2. Obtiene valores de referencia con base a las determinaciones realizadas
1.2.3. Analiza la relación entre los valores obtenidos y las hiperlipidemias.
2. INTRODUCCIÓN
Los lípidos son un conjunto heterogéneo de moléculas orgánicas compuestas principalmente por
carbono, hidrógeno y oxígeno, y cuya característica principal el ser hidrofóbicas o insolubles en agua
y solubles en solventes orgánicos como el benceno, cloroformo, éter, etc.
Los lípidos tienen diferentes funciones en el organismo, entre las cuales están las siguientes:
1.- Estructural.
2.- Reserva energética.
3.- Transporte de algunos compuestos energéticamente activos (lipoproteínas)
4.- Vitaminas (vitamina D) y hormonas (progesterona, testosterona, estrógenos, corticoides).
5.- Aislante térmico y como protección alrededor de ciertos órganos.
Los ácidos grasos se almacenan como triglicéridos (TG). Para utilizar la energía de los ácidos
grasos, primero deben ser liberados de los triacilgliceroles (TAG), y después ser transportados de los
tejidos periféricos a las mitocondrias para su degradación metabólica. El catabolismo se realiza por la
vía de la β-oxidación, que es un proceso de cuatro etapas que genera acetil CoA. Este compuesto
posteriormente continúa su degradación en el ciclo de Krebs.
Otro lípido importante es el colesterol, el cuál es un esteroide presente en las células de los tejidos
animales, hidrofóbico, poco soluble en medio acuoso, donde se puede encontrar libre o esterificado
con ácidos grasos. Se une a diversas proteínas formando las lipoproteínas plasmáticas. La
determinación de la concentración plasmática de colesterol tiene gran interés clínico, pues está
demostrada la relación entre los niveles altos de colesterol y la incidencia de aterosclerosis y
cardiopatía isquémica.
Los lípidos se transportan en la sangre como complejos lipoproteícos, los cuales se componen de
proteínas específicas y de combinaciones de triacilglicéridos, colesterol y ésteres de colesterol,
denominadas lipoproteínas o apolipoproteínas. Los lípidos y las proteínas están asociados como
complejos hidrosolubles no covalentes.
Las principales lipoproteínas se clasifican en:
43
Laboratorio de Bioquímica Clínica
Quilomicrones: Estas lipoproteínas son las menos densas y se componen de 98 a 99% de
lípidos, principalmente de TAG. Se pueden considerar como gotas de grasa cubiertas con una capa
de proteínas y lípidos polares. Estos se ensamblan en el intestino con los lípidos de la dieta y se
absorben al torrente sanguíneo para ser transportados a los tejidos periféricos. Ahí, una lipoproteína
lipasa libera los ácidos grasos de los TAG.
Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL): Son agregados moleculares que se forman en el
hígado con los TAG que ahí se sintetizan, su función es llevarlos hacia el tejido adiposo y otros tejidos
periféricos para ser almacenados o para utilizarse como fuente de energía. Los ácidos grasos se
liberan por acción de la lipasa.
Lipoproteínas de baja densidad (LDL): Estas partículas son las principales transportadoras de
colesterol en la sangre, movilizan a los ésteres de colesterol del hígado donde se sintetizan, hacia los
tejidos periféricos. Los lípidos predominantes son los ésteres de colesterol que contiene un ácido
graso poli insaturado (ácido linoleico).
Lipoproteínas de alta densidad (HDL): Éstas son las que tienen mayor contenido de proteínas
de todas las lipoproteínas (55% de proteína, 45% de lípidos) por lo que son más densas. Los
principales lípidos que transportan son el colesterol y ésteres de colesterol, y a diferencia de las LDL,
movilizan al colesterol en dirección contraria, es decir, desde el tejido periférico hacia el hígado.
Durante su recorrido por el torrente sanguíneo atrapan el exceso de colesterol y lo llevan al hígado. A
las HDL, se les conoce como el colesterol “bueno” porque disminuyen los niveles plasmáticos de
este.
En la siguiente tabla se resumen las propiedades físicas y composición de las principales
lipoproteínas:
Composición (% peso)
Lipoproteína
Densidad
(g/ml)
Diámetro
(Å)
Proteínas
Colesterol
Fosfolípidos
Triacilglicéroles
TAG
Quilomicrones
<0.95
800-5000
2
4
9
85
VLDL
0.95-1.0
300-800
10
20
20
50
LDL
1.0-1.063
180-280
25
45
20
10
HDL
1.063-1.2
50-120
55
17
24
4
Implicaciones clínicas.
Sabemos que el colesterol es necesario para el adecuado crecimiento y desarrollo celular, pero en
exceso es potencialmente dañino. Su transporte por las lipoproteínas y la captura por las células está
regulado. El proceso de captación inicia con la unión de las LDL que contienen colesterol con lugares
de unión específicos en las células, conocidos como receptores proteicos de la membrana
plasmática. Las LDL se invaginan en la membrana plasmática y se fusionan como parte de ella para
formar una vesícula endocítica. Dentro de la célula, la vesícula se fusiona con los lisosomas, y las
enzimas lisosomales catalizan la hidrólisis de los ésteres de ácido graso dejando al colesterol libre
para la construcción de membranas.
Una de las causas de hipercolesterolemia (niveles elevados de colesterol sanguíneo hasta de 700
mg/100 ml) es un defecto genético donde las personas carecen de receptores de LDL funcionales y
desarrollan el síndrome conocido como hipercolesterolemia familiar. El colesterol se deposita como
placas en las arterias y provoca aterosclerosis (endurecimiento de las arterias). Muchas de las
personas que padecen esta enfermedad mueren jóvenes e ataques cardiacos.
La aterosclerosis es una de las principales causas de muerte en el mundo occidental. Existe una
correlación entre los niveles de colesterol sanguíneo y la concentración de lipoproteínas. Los
44
Laboratorio de Bioquímica Clínica
individuos con altos niveles séricos de LDL con respecto a las HDL tienen una mayor incidencia de
ataques cardiacos. Los niveles altos de HDL se relacionan en forma inversa, es decir a mayor
concentración de HDL es menor el riesgo de sufrir enfermedades cardiacas.
Determinación de lípidos y valores de referencia.
La determinación de TG y Colesterol en suero se realiza mediante métodos enzimáticos. Es
necesaria una interpretación de los datos obtenidos para determinar si un paciente puede ser
considerado “sano”, y cuál “enfermo”, y si las diferencias entre estos son consistentes.
Todos los datos presentan cierta variación, y las variables biológicas muestran, por lo general,
una distribución Gaussiana, también llamada Normal. Se considera un intervalo normal o de
referencia aquel que se encuentra entre la media +/- dos veces la desviación estándar, la cual abarca
el 95% de los datos.
Un resultado fuera de este intervalo indica la probabilidad de enfermedad, pero existe un 2.5%
de los valores de personas sanas que pueden caer fuera del límite, a estos se les conoce como falsos
positivos. Por otro lado la enfermedad tiene su propia distribución normal, que puede traslaparse al
intervalo de referencia, a estos se les conoce como falsos negativos.
El límite que se establezca para determinar cuales pacientes son sanos, y cuales enfermos se
establece de acuerdo a cual de los errores se considera más importante, variando la especificidad y
sensibilidad de la prueba, de tal forma que si se intenta eliminar los falsos negativos, se tendrá una
prueba con alta especificidad, pero baja sensibilidad, ya que habrá un mayor número de falsos
positivos. Estos límites se conocen como valores de referencia y deben calcularse en cada población.
Fundamentos de los métodos empleados:
Los métodos empleados para la determinación de Triglicéridos (TG) y Colesterol (CHL) en general
son:

Métodos enzimáticos: emplean enzimas para la detección de éstos metabolitos
45
Laboratorio de Bioquímica Clínica
Sustrato + Enzima
Producto
Del tipo de:
o
punto final, es decir, la reacción ocurre y se concluye en un solo momento,
Y la determinación de los productos, es:
o
colorimétrica, del tipo Trinder
Los primeros métodos para la determinación del colesterol se basaban en la formación de
compuestos coloridos mediante reacciones químicas del colesterol. No obstante, debido a los líquidos
corrosivos que utilizan, estos métodos actualmente no se suelen emplear para los análisis de rutina, y
se prefieren los métodos enzimáticos, específicos, de fácil manejo y de gran sensibilidad.
En estos métodos enzimáticos, la primera reacción consiste en la hidrólisis de los ésteres de
colesterol por acción de esterasas bacterianas inespecíficas con respecto al ácido graso esterificado;
a continuación se produce la oxidación del colesterol (el formado en la reacción anterior y el
preexistente, o colesterol libre en plasma) por una colesterol oxidasa, produciéndose H2O 2, el cual
con la participación de peroxidasa da lugar a la formación de un compuesto colorido. El esquema de
las reacciones acopladas es el siguiente:
CHE
CHOD
Ésteres colesterol
Colesterol + O2
4-Colestenona + H2O2
POD
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona + 4H+
Quinonimina (Compuesto colorido)
CHE: Colesterol esterasa
CHOD: Colesterol oxidasa
POD: Peroxidasa
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de colesterol presente en la
muestra ensayada.
Los triglicéridos incubados con la enzima lipoprotein lipasa (LPL), liberan glicerol y ácidos grasos
libres. El glicerol es fosforilado por la acción de la enzima glicerol quinasa (GK) para producir glicerol3-fosfato (G3P) y adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es convertido a dihidroxiacetona fosfato (DAP)
y peróxido de hidrogeno (H2O2) por GPO. Al final, el peróxido de hidrogeno (H2O2) reacciona con 4aminofenazona (4-AF) y p-clorofenol, reacción catalizada por la peroxidasa (POD) dando una
coloración roja, cuya intensidad es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la
muestra:
LPL
Triglicéridos + H2O
Glicerol + Ácidos grasos libres
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP
G3P+ ADP
GPO
G3P + O2
H2O2+ DAP
POD
H2O2 + 4-AF + p-Clorofenol + H
Quinona (Complejo de color rojo)
LPL: Lipoproteín lipasa
GPO: Glicerol -3- oxidasa
POD: Peroxidasa
46
Laboratorio de Bioquímica Clínica
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL











Baño maría a 25 o 30o C
Centrífuga clínica
Espectrofotómetro para luz UV
celdas espectrofotométricas y portaceldas
gradilla
5 tubos de 13 x 100
2 pipetas de 2 ml
2 pipetas de 1 ml
Aguja para vacutainer
Tubo vacutainer con gel.
Torundas, ligadura y adaptador
3.2 REACTIVOS
 Kit para la determinación de Triglicéridos en suero.
 Kit para la determinación de Colesterol en suero.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.
Para estas determinaciones el paciente deberá guardar ayuno de al menos 6 horas, y evitar el
consumo de grasas durante 24 horas previas.
4.1 Obtener aproximadamente 5 mL de sangre periférica en un tubo vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
B. DATOS DEL PACIENTE
4.4 Anotar los datos generales del paciente en la tabla 5.1
B. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL Y TRIGLICÉRIDOS EN SUERO.
Dependiendo de la marca del Kit que se tenga en la práctica, las concentraciones, cantidades y
condiciones de las reacciones pueden variar.
4.5 En los kits, el sustrato y las enzimas y reactivos usados se encuentran liofilizados y deben ser
reconstituidos, es decir solubilizados, para su uso. Esto lo realizará el profesor previo a la práctica.
4.6 Seguir las instrucciones que indique el inserto de cada uno de los kits que serán proporcionadas
por el profesor, y revisar en ellos:
4.6.1 como preparar el blanco de reactivos
4.6.2 como se procesará la muestra de suero obtenida y la temperatura de reacción
4.6.3 a que longitud de onda se realizará la lectura
4.6.4 como se calcula la concentración de TG y CHL en el suero
4.6.5 el fundamento de las reacciones que se usan en la determinación
4.6.6 interferencias, precisión y exactitud del método
4.7 Calibrar el espectrofotómetro con agua destilada.
4.8 Tomar la lectura de acuerdo a las instrucciones del inserto y las indicaciones del profesor.
4.9 Anotar los resultados del equipo en la tabla 5.2
4.10 Se emplearán los datos obtenidos por todos los equipos del grupo, y datos de años anteriores
para el análisis estadístico, los cuáles serán proporcionados por el profesor.
47
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
A. DATOS DEL PACIENTE
5.1 Anotar los datos del paciente en la tabla 5.1
Tabla 5.1
Sexo
Edad
Condición de salud o fisiológica
Ayuno
IMC
B. COLESTEROL
5.2 Anotar los resultados de las lecturas de As en la tabla 5.2.
Tabla 5.2
Tubo
As 505 nm para
TG
Patrón
As 505 nm para
CHL
Muestra de suero
5.3 Anotar las fórmulas para el cálculo de la concentración de TG y CHL en el suero
5.4 Calcular la concentración de colesterol y triglicéridos en la muestra empleando la fórmula
anterior.
5.5 Anotar el resultado en la tabla 5.3
Tabla 5.3
Tubo
Concentración
de
Concentración de
triglicéridos mg/dL
colesterol mg/dL
Patrón
Muestra de suero
5.6 ¿Cual es la importancia clínica de las determinaciones de colesterol y triglicéridos?
5.7 ¿Cuáles son las diferencias entre las HDL, LDL y VLDL?
5.8 ¿Existe alguna correlación entre el IMC y los valores de TG y CHL obtenidos?
5.9 ¿Qué es un valor de referencia y para que se determinan?
5.10
¿Por qué es importante que cada laboratorio establezca sus valores normales y que tomarías
en cuenta para calcular estos valores?
5.11
Anotar los resultados obtenidos de cada equipo del grupo en la tabla 5.4, realiza el cálculo de
la media x .
Tabla 5.4
mg/dL
TG
CHL
Valores del equipo 1
Valores del equipo 2
Valores del equipo 3
Valores del equipo 4
Valores del equipo 5
Valores del equipo 6
48
Laboratorio de Bioquímica Clínica
Valores del equipo 7
Valores del equipo 8
Valores del equipo 9
Valores del equipo 10
Valores del equipo 11
x
S
5.12 En función de estos resultados establecer los valores normales de cada sustancia en tu grupo
y anota los datos:
Colesterol
Triglicéridos
5.13 El profesor te proporcionará los datos de otros años de los alumnos de bioquímica clínica.
Determina la frecuencia de todos los datos (pasados y presentes) en los intervalos señalados en
la tabla 5.5
Tabla 5.5
Intervalo
de valores
0-9.9
Colesterol
Frecuencia
Intervalo
de valores
200-209.9
Frecuencia
Intervalo
de valores
0-9.9
Triglicéridos
Frecuencia
Intervalo
de valores
200-209.9
10-19.9
210-219.9
10-19.9
210-219.9
20-29.9
220-229.9
20-29.9
220-229.9
30-39.9
230-239.9
30-39.9
230-239.9
40-49.9
240-249.9
40-49.9
240-249.9
50-59.9
250-259.9
50-59.9
250-259.9
60-69.9
260-269.9
60-69.9
260-269.9
70-79.9
270-279.9
70-79.9
270-279.9
80-89.9
280-289.9
80-89.9
280-289.9
90-99.9
290-299.9
90-99.9
290-299.9
100-109.9
300-309.9
100-109.9
300-309.9
110-119.9
310-319.9
110-119.9
310-319.9
120-129.9
320-329.9
120-129.9
320-329.9
130-139.9
330-339.9
130-139.9
330-339.9
140-149.9
340-349.9
140-149.9
340-349.9
150-159.9
350-359.9
150-159.9
350-359.9
160-169.9
360-369.9
160-169.9
360-369.9
170-179.9
370-379.9
170-179.9
370-379.9
180-189.9
380-389.9
180-189.9
380-389.9
190-199.9
390-399.9
190-199.9
390-399.9
Frecuencia
5.14 Una vez agrupados, realiza un histograma de frecuencias y calcula la media y la desviación
estándar.
49
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5.15
En el histograma, marca la media de los datos y señala, dos veces la desviación estándar (S)
a ambos lados de la media. Con estos puntos representa la forma de la curva normal.
5.16 Los datos que queden fuera de esta curva se pueden considerar que no pertenecen a la
población de personas “sanas” por lo que deben de descartarse para la determinación de los
valores de referencia, tomando únicamente los datos que queden dentro de la curva determina la
media y el intervalo de referencia, solo que ahora para la población de alumnos de la UPIBI.
5.17 Compara los valores de referencia obtenidos en tu grupo con los de la población de alumnos
de la UPIBI. ¿Son diferentes? Si lo son ¿a qué se deben las diferencias?
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia de las determinaciones de TG y CHL en clínica: Los métodos empleados en esas
determinaciones y su uso en equipos automatizados.
Que son y para que sirven los valores de referencia en una población y como se determinan.
Los valores de referencia que se obtuvieron con los datos proporcionados, de que población son, y
que utilidad tienen.
Los valores de referencia de la población mexicana en relación con los datos que se obtuvieron en
esta práctica.
7. CONCLUSIONES
7.1 Con el análisis y discusión de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos de la práctica y
la investigación bibliográfica, elaborar las conclusiones.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1. Davidson I., Henry J. B.Todd-Sanford. 1979. Diagnóstico clínico por el laboratorio. 6ª. edición.
Salvat editores. Barcelona.
8.2. Devlin. T. M. 1997. Bioquímica con aplicaciones clínicas. Tomo I y II 3ª. Ed- Reverté S.A.,
España.
8.3. Boyer R. 1999. Conceptos en Bioquímica. International Thomson Editores. México.
8.4. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioquímica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. México.
50
Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA No. 7
DETERMINACIÓN DE UREA, CREATININA Y ACIDO URICO.
UNIDAD V: Compuesto nitrogenados y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Realiza la determinación cuantitativa de urea, creatinina y ácido úrico en suero humano
mediante el empleo de kits de diagnóstico clínico.
1.2 Objetivos específicos
El alumno:
1.2.1. Realiza el diagnóstico clínico de las muestras sanguíneas procesadas a través del análisis de
los resultados obtenidos.
2. INTRODUCCIÓN
Existen en circulación en la sangre más de 15 compuestos nitrogenados no proteicos diferentes,
como aminoácidos, urea, ácido úrico, creatinina y amoniaco.
La urea es el principal compuesto nitrogenado no proteico del plasma (45% del total) y es el
metabolito resultante del metabolismo de las proteínas. Se forma en el hígado a partir de la
destrucción de las proteínas. Durante la digestión, las proteínas son separadas en aminoácidos; éstos
contienen nitrógeno que se libera como ión amonio, y el resto de la molécula se utiliza para generar
energía en las células y tejidos. El amonio se une a pequeñas moléculas para producir urea, la cual
aparece en la sangre y es eliminada por la orina. Si el riñón no funciona bien la urea se acumula en la
sangre y se eleva su concentración.
Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en:
 Dietas con exceso de proteínas
 Enfermedades renales
 Fallo cardiaco
 Hemorragias gastrointestinales
 Hipovolemia (quemaduras, deshidratación)
 Inanición
 Obstrucciones renales (piedras, tumores)
Puede aparecer la urea disminuida en:
 Dieta pobre en proteínas
 Fallo hepático
 Embarazo
 Exceso de hidratación
 Malnutrición
La creatinina es el resultado de la degradación de la creatina, que es un componente de los
músculos y no es reutilizable en el metabolismo del cuerpo. La creatinina puede ser transformada en
ATP que es una fuente de alta energía para las células. La formación de la creatina es constante, y
los niveles suelen ser muy estables, teniendo una relación directa con la masa muscular por lo que en
varones su concentración es mayor que en mujeres. La creatina se filtra libremente por los
51
Laboratorio de Bioquímica Clínica
glomérulos en el riñón y de modo normal no se reabsorbe. Actualmente se emplea la determinación
de nitrógeno ureico y creatinina para evaluar la función renal.
Puede aparecer la creatinina elevada en sangre en:
 Deshidratación
 Distrofia muscular
 Eclampsia
 Glomerulonefritis
 Neuropatía diabética
 Obstrucciones renales (piedras, tumores)
 Pielonefritis
 Problemas cardiacos
Puede aparecer la creatinina disminuida en:
 Distrofia muscular avanzada
 Miastenia gravis
El ácido úrico es el principal producto de degradación de las purinas (partes de DNA y RNA). La
mayor parte de la formación de ácido úrico se lleva a cabo en el hígado y se excreta por el riñón, y un
poco por el sistema intestinal
Los valores normales de ácido úrico varían ampliamente por diversos factores tales como edad,
orígenes raciales, sexo, sociales y geográficos, además del método analítico utilizado. Igualmente
numerosas enfermedades y alteraciones fisiológicas modifican la concentración de ácido úrico en la
sangre, siendo el aumento más significativo lo que se denomina hiperuricemia. Cuando aumenta la
destrucción de los tejidos (como en diversos tipos de cáncer) el ácido úrico aparece elevado en
sangre, aunque la causa más común de su elevación es la gota.
Puede aparecer el ácido úrico elevado en sangre (hiperuricemia) en:
 Dieta rica en purinas (carnes rojas, vísceras de animales, embutidos, mariscos, frutos
secos)
 Eclampsia en el embarazo
 Fallo renal
 Diabetes mellitus
 Gota
 Hipoparatiroidismo
 Alcoholismo
 Quimioterapia del cáncer
Puede aparecer el ácido úrico disminuido (hipouricemia) en:
 Dietas bajas en purinas (proteínas)
 Síndrome de Faconi
 Enfermedad de Wilson
Fundamento de los métodos de determinación de metabolitos.
En bioquímica clínica la determinación de metabolitos como la UREA, la CREATININA y el ACIDO
ÚRICO puede llevarse a cabo mediante dos métodos básicos:

Métodos químicos colorimétricos: En ellos el metabolito se hace reaccionar con un
compuesto para producir un derivado colorido que pueda detectarse
espectrofotométricamente, ya que la intensidad del color será directamente proporcional a la
concentración de la sustancia a determinar. La reacción general sería:
Metabolito + Reactivo cromógeno
Producto colorido
52
Laboratorio de Bioquímica Clínica
Estas reacciones pueden ser de:

o
punto final, si la reacción ocurre y se concluye en un solo momento,
o
cinéticos, si se lee a diferentes tiempos.
Métodos enzimáticos: en estos, la enzima reacciona con el sustrato (s) y se obtienen
productos. Estos métodos también pueden ser de punto final, o cinéticos.
Enzima
Sustrato 1 + Sustrato 2
Producto 1 + Producto 2
La determinación de los productos, puede ser:
o
colorimétrica, en donde el producto de la enzima se hace reaccionar con un compuesto
para dar un derivado colorido. Las reacciones tipo Trinder son las mas usadas.
o
espectrofotométricos, donde generalmente se emplea la luz UV para detectar el
producto.
o
reacciones acopladas, en donde el producto de la enzima se acopla a otra reacción
enzimática (es decir actúa como sustrato de otra enzima, para dar el producto 2). En
estos casos, lo que se detecta es el producto 2, ya sea por métodos colorimétricos o
espectrofotométricos.
Enzima 1
Sustrato
Producto 1
Enzima 2
Producto 1
Producto 2
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL













Baño maría a 25 o 30°C
Centrífuga clínica
Espectrofotómetro para luz UV
celdas espectrofotométricas y portaceldas
cronómetro
gradilla
9 tubos de 13 x 100
2 pipetas de 5 ml
6 pipetas de 1 ml
6 Pipetas automáticas de 100 μL
Aguja para vacutainer
Torundas, ligadura y adaptador
Tubo vacutainer con gel.
3.2 REACTIVOS
 Kit para determinación de Urea (BUN) en suero.
 Kit para determinación de Creatinina en suero.
 Kit para la determinación de Ácido úrico en suero.
53
Laboratorio de Bioquímica Clínica
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.
4.1 Obtener aproximadamente 5 mL de sangre periférica en un tubo vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
B. DATOS DEL PACIENTE
4.4 Anotar los datos generales del paciente en la tabla 5.1
B. DETERMINACIÓN DE UREA (BUN), CREATININA Y ÁCIDO ÚRICO EN SUERO.
Dependiendo de la marca del Kit que se tenga en la práctica, las concentraciones, cantidades y
condiciones de las reacciones pueden variar.
4.5 En los kits, los reactivos y/o enzimas usados se encuentran liofilizados y deben ser
reconstituidos, es decir solubilizados, para su uso. Esto lo llevará a cabo el profesor previo a la
práctica.
4.6 Seguir las indicaciones del profesor, así como las instrucciones que indique el inserto de cada
uno de los kits que serán proporcionadas por el profesor, y revisar en ellos:
4.6.1
como se prepara el blanco de reactivos
4.6.2
como se procesará la muestra de suero obtenida, el tiempo y la temperatura del
ensayo
4.6.3
a que longitud de onda (λ) de realiza la determinación
4.6.4
como se realizarán los cálculos para determinar la concentración del metabolito
4.6.5
De que tipo son las reacciones que se llevan a cabo en la determinación de estos
metabolitos
4.6.6
las interferencias, precisión y exactitud del método
4.6.7
la estabilidad del color desarrollado
4.7 Calibrar el espectrofotómetro con agua destilada.
4.8 Tomar las lecturas según las instrucciones del inserto y las indicaciones del profesor.
4.9 Anotar los resultados en la tabla 5.2.
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.
A. DATOS DEL PACIENTE
5.1 Anotar los datos del paciente en la tabla 5.1
Tabla 5.1
Sexo
Edad
Condición de salud o fisiológica
Ayuno
Toma medicamento (cuál)
B. DETERMINACIÓN DE UREA (BUN).
5.2 Anotar los resultados de las lecturas de As en la tabla 5.2.
54
Laboratorio de Bioquímica Clínica
Tabla 5.2
As 340 nm a
As 340 nm a
30 seg
60 seg
Tubo
ΔAs
Patrón
Muestra
suero
5.3
5.4
5.5
5.6
de
Anotar la fórmula que indica el inserto para calcular la concentración de Urea
Calcular la concentración de urea en la muestra empleando esa fórmula.
Anotar los resultados de la concentración de urea (BUN) en la tabla 5.5
Anotar los valores de referencia de Urea en la tabla 5.5
C. DETERMINACIÓN DE CREATINA.
5.7 Anotar los resultados de las lecturas de As en la tabla 5.3.
Tabla 5.3
Tubo
As 492 nm a
As 492 nm a
30 seg
90 seg
Patrón
Muestra
suero
ΔAs
de
5.8 Anotar la fórmula que indica el inserto para calcular la concentración de Creatinina
5.9 Calcular la concentración de creatinina en la muestra empleando esa fórmula
5.10
Anotar los resultados de la concentración de creatinina en la tabla 5.5
5.11
Anotar los valores de referencia de Creatinina en la tabla 5.5
D. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO
5.12
Anotar los resultados de las lecturas de As en la tabla 5.4.
Tabla 5.4
Tubo
As 520 nm a 30 seg
Patrón
Muestra de suero
5.13
5.14
5.15
5.16
Anotar la fórmula que indica el inserto para calcular la concentración de Ácido Úrico
Calcular la concentración de Ácido Úrico en la muestra empleando esa fórmula
Anotar los resultados de la concentración de Ácido Úrico en la tabla 5.5
Anotar los valores de referencia de Ácido Úrico en la tabla 5.5
Tabla 5.5
Metabolito
Valores obtenidos en
suero mg/dL
Valores de referencia
Urea
Creatinina
Ácido Úrico
55
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5.17
Comparando con los valores de referencia, que puedes decir de los valores obtenidos. ¿Qué
relación hay con su sexo y su estado de salud o fisiológico?
5.18 Explica de donde provienen (metabolismo) la Urea, el Ácido Úrico y la Creatinina que aquí se
determinaron.
5.19 ¿Cuál es el fundamento de cada una de las técnicas empleadas? Anota las reacciones que
ocurren en la determinación.
5.20
Anota dos causas no patológicas y dos causas patológicas que originan un aumento en la
excreción de ácido úrico.
5.21 Describe las posibles interferencias en las técnicas empleadas con la presencia de:
Bilirrubinas, hemoglobina, amonio y ácido ascórbico.
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia de estas determinaciones en el diagnóstico clínico y en que patologías se alteran los
valores de estos metabolitos.
Discutir si existe correlación entre los valores de las determinaciones.
Como se producen estos compuestos en el metabolismo.
7. CONCLUSIONES
7.1
Con los resultados obtenidos, análisis y discusión y en base a los objetivos de la práctica y la
investigación bibliográfica, elaborar las conclusiones.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1. Davidson I., Henry J. B.Todd-Sanford. 1979. Diagnóstico clínico por el laboratorio. 6ª. edición.
Salvat editores. Barcelona.
8.2. Devlin. T. M. 1997. Bioquímica con aplicaciones clínicas. Tomo I y II. 3ª. Ed- Reverté S.A.,
España.
8.3. Sampson, E.J., Baird, M.A., Burtis, C.A., et al.: A coupled equilibrium method for measuring urea
in serum: Optimization and evaluation of AACC Study Group on urea candidate reference
method. Clin. Chem., 26, 816-826, 1980.
8.4. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioquímica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. México.
56
Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA No. 8
DETERMINACIÓN DE HORMONA GONADOTROPINA
CORIÓNICA.
UNIDAD V: Compuestos nitrogenados y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Determina la presencia de la hormona gonadotropina coriónica (hGC) en orina humanas.
1.2 Objetivos específicos
El alumno:
1.2.1 Conoce el uso de anticuerpos como una herramienta para identificar sustancias.
1.2.2. Realiza la determinación cualitativa y semicuantitativa de la hormona hGC en orina a través de
una prueba rápida y sensible basada en un inmunoensayo.
1.2.3. Evalúa el uso de la determinación de hormonas para el diagnóstico clínico.
2. INTRODUCCIÓN
Las hormonas son moléculas producidas por las glándulas y que tienen como función la regulación
del metabolismo corporal. Desde el punto de vista de su naturaleza química, las hormonas pueden
ser lípidos esteroides, derivados de aminoácidos, péptidos o proteínas. Son muchas las glándulas
que las producen, como las suprarrenales, las gónadas (ovarios y testículos), hipófisis, páncreas,
tiroides, etc. En general estas glándulas se encuentran reguladas por el hipotálamo en el encéfalo.
Dado el papel de regulación del metabolismo que juegan las hormonas, la alteración en sus
niveles trae consecuencias patológicas. Por ello en el laboratorio clínico se realiza la determinación
de los niveles hormonales en el diagnóstico de patologías o ciertos estados fisiológicos.
La Gonadotropina coriónica humana hGC es una hormona proteica producida por la hipófisis y por
las células trofoblásticas de la placenta durante el embarazo. La hGC es un dímero de peso
molecular aproximadamente de 28.000, compuesto de subunidades, α y β. En varones su función
consiste en estimular la producción de espermatozoides en los testículos. En las mujeres tiene como
función favorecer la ovulación y la implantación del embrión al interior de la matriz. Durante el
embarazo, la hormona es producida por la placenta y tiene como función evitar la destrucción del
cuerpo lúteo y mantener los niveles de progesterona para mantener el embrión implantado y asegurar
su nutrición y aporte de oxígeno.
Los niveles normales de hGC en hombres son de 8 -10 mIU/mL y en mujeres no embarazadas
son de 10 15 mIU/mL. Sin embargo, durante el embarazo los niveles pueden aumentar de 20 mIU/mL
en la primera semana de embarazo, hasta 250 000mIU/mL en la 13ava. Es por esto que la hormona
se emplea para el diagnostico de embarazo. Como la hormona se excreta en orina, se acostumbra
realizar la determinación en esa muestra y así evitar sangrar a la paciente.
Además de esta condición, la hGC es secretada por varios tumores cancerosos, como teratomas,
cáncer de testículo, en coriocarcinomas y en la mola hidatiforme, de manera que en estos casos la
detección se realiza en orina y en sangre, lo cual además es un indicador de la eficiencia del
tratamiento de quimioterapia, pues la concentración de la hGC disminuye cuando el tumor
desaparece. En los últimos años, y bajo la sospecha o antecedentes de defectos en el nacimiento, se
realiza una prueba a las 15 – 20 semanas de embarazo conocida como triple test, donde se miden los
57
Laboratorio de Bioquímica Clínica
niveles de alfa-fetoproteina (AFP), de hGC, y de un estrógeno (estriol no conjugado uE3) y que
permite al clínico estimar la probabilidad de defectos en el recién nacido. Esta prueba ya se realiza en
México.
Los niveles de hGC en orina y en suero correlacionan, como se ve en la fig. 1 y los niveles pueden
observarse en la tabla 1, donde también se observa que las variaciones de la hormona son muy
amplias, por lo que no puede emplearse para calcular el tiempo de embarazo.
Fig. 1
Tabla 1
Semana de la última Niveles de hGC en mU/mL
menstruación
3
5 – 50
4
5 – 426
5
18 – 7,340
6
1.080 – 56 500
7-8
7 650 – 229 000
9-12
25 700 – 288 000
13-16
13 300 – 254 000
17 – 24
4 060 – 165 400
25 – 40
3 640 – 117 000

No embarazadas: <5.0 mIU/ml

Postmenopausicas: <9.5 mIU/ml
En cerca del 85% de los embarazos normales, los niveles de hGC se duplican cada 48-72 h en las
primeras semanas. Después, lo hacen cada 96 h. Alcanza su máximo a las 8-11 semanas, declina un
poco y después se mantiene constante el resto del embarazo.
El método más usado actualmente para detectar la hormona es el de inmunoensayo. En esta
prueba se usa una tira de papel (fase sólida) cubierta de látex y que ha sido tratada con anticuerpos,
en tres zonas diferentes de la tira. Para hacer el ensayo, un extremo de la tira se sumerge en la orina
o se le gotea la orina, y entonces el líquido recorre la tira por capilaridad y llega a la primera banda La
primera banda contiene anticuerpos anti hGC (cadena a) y que van a unir a las moléculas de hCG
58
Laboratorio de Bioquímica Clínica
presentes en la orina. Este Ac anti hCG se encuentra unido a un colorante. Esta banda también
contiene IgG como control para asegurar que la tira trabaje correctamente. Después el líquido
conteniendo los Ac unidos a la hCG de la orina continua ascendiendo por capilaridad y llegan a la
segunda banda. En ella se encuentra otro anticuerpo anti hCG (cadena b) que también se une a la
hCG formando un “sándwich”, y entonces el colorante cambia de color, dando como respuesta una
banda colorida. Luego la IgG continua ascendiendo y llega a la tercera banda donde se encuentra
una Ac anti IgG, y en donde también aparecerá una banda colorida en la ventana de control.
Si en la tira se observan dos bandas coloridas (una de la banda de prueba y otra de la banda de
control) la prueba es positiva, y si la tira se emplea para la detección de embarazo, significa que la
paciente esta embarazada. Si solo aparece una banda (en la banda control) la prueba de embarazo
es negativa. Si no aparece ninguna banda en la zona de control, la prueba no se realizó
correctamente y deberá repetirse.
La sensibilidad de la prueba es de 25 mUI de hGC/mL ó más. Con esta prueba es posible detectar
los niveles de HGC que se encuentran normalmente en las mujeres embarazadas a partir del 8º día
de la menstruación esperada en adelante. También detecta la presencia de los tumores de los que se
hablo antes, y se usa de manera cualitativa para seguimiento de la quimioterapia.
Otro sistema de inmunoensayo para la determinación de hGC es el de aglutinación en placa, esta
prueba de embarazo se basa en la aglutinación rápida de partículas de látex sensibilizadas por
anticuerpos monoclonales específicos con la hGC presente en la muestra.
La presencia de hGC en las muestras urinarias conduce a una aglutinación que se diferencia
visualmente de la no aglutinación del control negativo.
Este método requiere de valores superiores a 200 mUI/ml para obtener un resultado positivo, es
decir un resultado positivo asegura que en la muestra hay al menos 200 mUI/ml de hGC. Este
sistema nos permite la realización de un procedimiento semicuantitativo en la determinación de hGC
mediante dilución de la muestra de orina, lo que permite a la vez hacer una estimación del momento
de la gestación en que se encuentra la embarazada.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL









Centrífuga clínica
1 pipeta automática de 10 a 100 L
cronómetro
gradilla
5 tubos de 13 x 100
Aplicadores de madera
1 pipeta de 1 ml
1 pipeta pasteur
Orina de mujer embarazada
3.2 REACTIVOS
 Prueba en tira, la cuál contiene una membrana impregnada con anticuerpo anti-HGC y un cojín
de absorción con Anticuerpo monoclonal anti-hGC conjugado y 0.05% Azida de Sodio como
preservativo.
 Kit para la determinación de hGC por aglutinación en placa.
59
Laboratorio de Bioquímica Clínica
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIÓN DE LA ORINA.
4.1 Utilizar un contenedor limpio y seco para recolectar la orina. Se puede utilizar orina recolectada
hasta con 24 horas de anticipación. Las muestras de orina pueden ser refrigeradas (2 – 8 °C) y
almacenadas hasta por 72 horas antes de ser evaluadas. Se requiere un volumen pequeño de la
misma.
4.2 Anotar las semanas de embarazo de la paciente de quién se obtuvo la muestra.
B. REALIZACIÓN DE LA PRUEBA EN TIRA.
4.3 Tanto la Tira como la muestra recolectada o cualquier otro material deberán estar a temperatura
ambiente (20-30 °C) antes de llevar a cabo la prueba.
4.4 Saque la Tira de su sobre metalizado. Lleve a cabo cualquiera de los métodos descritos a
continuación:
Método 1
4.4.1 Sumerja la Tira en la muestra de orina ó suero, hasta el nivel que marque el fabricante.
4.4.2 Coloque la Tira en una superficie plana tan pronto la muestra absorbida empiece a correr en la
membrana (usualmente toma de 4 a 8 segundos).
4.4.3 Espere para llevar a cabo la interpretación de resultados.
Método 2
4.4.4 Coloque la tira en una superficie plana y limpia, con la flecha apuntando hacia la persona que
lleva a cabo la prueba.
4.4.5 Coloque 3 ó 4 gotas de muestra de orina ó suero en el cojín de absorción por debajo de la
línea que marque el fabricante.
4.4.6 Espere para llevar a cabo la interpretación de resultados.
B. REALIZACIÓN DE LA PRUEBA EN PLACA.
4.5 Los componentes del sistema como la muestra o cualquier otro material deberán estar a
temperatura ambiente (20-30 °C) antes de llevar a cabo la prueba.
Método 3 Prueba directa.
4.5.1 Coloque una gota de la orina sobre el circulo de la placa.
4.5.2 Depositar una gota de la suspensión del reactivo de látex al lado de la gota de la muestra.
4.5.3 Mezclar las gotas con ayuda de una punta de pipeta o con un aplicador de madera mediante
movimientos circulares y distribuyendo dentro del circulo de la placa.
4.5.4 Balancear la placa suavemente durante 2 minutos y observa la aglutinación dentro del circulo.
No prolongar la incubación mas allá de 2 minutos para evitar errores de interpretación (falsos
positivos).
4.5.5 Correr simultáneamente un control negativo y un control positivo.
Método 4 Prueba Semicuantitativa.
4.5
Si la prueba en placa resultó positiva, prepare las siguientes diluciones de la muestra en agua
destilada, en tubos limpios y secos: 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 y 1:100
4.5.6 De manera secuencial, con cada dilución repita el procedimiento en placa, hasta llegar a la
dilución donde la prueba resulte negativa.
4.5.7 Al terminar la prueba enjuague la placa con agua corriente y agua destilada y secar al aire
libre.
4.5.8 Coloque 3 ó 4 gotas de muestra de orina ó suero en el cojín de absorción por debajo de la
línea que marque el fabricante.
4.5.9 Espere para llevar a cabo la interpretación de resultados.
60
Laboratorio de Bioquímica Clínica
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
5.1 Anotar las semanas de gestación de la paciente _________________________________
5.2 Anotar el resultado de la prueba de hGC en orina (positivo o negativo)
5.3 Haga un esquema de la prueba en placa.
5.4 Anote en el cuadro siguiente el resultado de las pruebas en placa.
DILUCIÓN
1:1
CONC. MINIMA (mUI/ml)
de hGC
200
RESULTADO
1:5
1:10
1:20
1:50
1:100
5.5 Determine entre que límites se encuentra la concentración de hGC en la muestra analizada e
indica si corresponde con las semanas de embarazo de la paciente.
5.6 Describir un resultado falso positivo y dé un ejemplo
5.7 Describir un resultado falso negativo y dé un ejemplo.
5.8 Qué otras pruebas se recomendarían para corroborar el diagnóstico de embarazo?
5.9 ¿Qué otras pruebas de laboratorio existen en el mercado para el diagnóstico de embarazo?
6. DISCUSIÓN
6.1 Discuta las diferencias entre los métodos para cuantificar o identificar biomoléculas empleados en
esta práctica con los empleados en las practicas previas.
6.2 Discutir la importancia de las pruebas inmunológicas en el laboratorio clínico.
6.3 Discutir si esta prueba tiene solo uso en el diagnóstico del embarazo.
6.4 Revisar los fundamentos de la prueba y analízalos.
7. CONCLUSIONES
7.1
En función de los resultados y la discusión que se realizó, elaborar las conclusiones y verificar
si se cumplieron los objetivos planteados.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1. Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Víctor W. Rodwell. 2001. Bioquímica de
Harper. 15a. edición. Editorial El Manual Moderno.
8.2. Guyton Arthur C. 2002. Fisiología Médica. 5a. edición. Editorial Interamericana. México.
8.3. Amstrong, G. Ehrlich, P.H., Birken, S., Schlatterer, J.P., Siris, E. Hembree, C., and Canfield, R.E.
1984. Use of a Highly Sensitive and Specific Immunoradiometric Assay for Detection of Human
Chorionic Gonadotropin in Urine of Normal, Nonpregnaiit, and Pregnant Individuals. J.Clin.
Endocrinol. Metab. 59, 867-874.
8.4. Iles, R.K. Purkins, E. Ehitehead, P.C., Oliver, R.T.D., Leigh, I., and Chard, T., 1990. Expression of
beta human chorionic gonadotrophin by non-trophoblastic non-endocrine 'normal' and malignant
epithelial cells. Br. J. Cancer 61, 663-666.
61
Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA No. 9
POTENCIOMETRÍA
UNIDAD VII: Equipos empleados en la clínica para el estudio del metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Emplea el potenciómetro como modelos de sensor para valorar el poder amortiguador del
suero sanguíneo.
1.2 Objetivos específicos
El alumno:
1.2.1. Realiza la calibración de un potenciómetro.
1.2.2. Compara el poder amortiguador del suero sanguíneo con respecto a otros amortiguadores
químicos.
2. INTRODUCCIÓN
La potenciometría es una técnica analítica que se emplea para determinar la concentración de una
especie electroactiva, generalmente iones, de una solución casi siempre líquida. Con los equipos
empleados, es decir los potenciómetros, lo que se determina es la actividad de esa especie iónica,
que se encuentra relacionada directamente con su concentración.
Cuando un metal se encuentra inmerso en una solución electrolítica, se tiene un potencial, o mejor
dicho aún, una fem (fuerza electromotriz) que depende de la concentración de los iones ahí
presentes. Se puede meter un electrodo dentro de la solución y uno fuera de la solución, el cuál
funcionaría como una referencia, con lo cuál mediríamos el potencial de la solución con respecto a un
medio diferente, es decir tendríamos una medida de la diferencia de potencial. Es posible calcular la
concentración de los iones de la solución electrolítica, como una medida de la actividad de dichos
iones. Con el fin de evitar problemas con estas determinaciones, ya que lo que se mide realmente es
la actividad del ión, y no su concentración, se realizan titulaciones potenciométricas. Como el nombre
indica, en este caso lo que se hace es realizar una titulación con un potenciómetro a fin de llegar a un
punto final de equilibrio o neutralización. Por esto, cuando se realizan las mediciones, se debe
permitir alcanzar el equilibrio para tomar la medición.
Para obtener mediciones analíticas válidas, el electrodo externo, es decir el electrodo de
referencia, deberá tener un potencial constante. Los cambios se deberán a cambios registrados en el
otro electrodo, o electrodo de trabajo. El electrodo de referencia tiene un potencial, o más bien una
fem constante, es decir que el potencial depende de una especie cuya concentración permanece
inalterada durante toda la determinación.
Un electrodo de referencia está constituido por una hemicelda interna de referencia, un puente
salino o electrolito y un pequeño canal en la punta del electrodo a través del cuál fluye lentamente el
electrolito del puente salino y establece el contacto entre los componentes de la celda electroquímica,
es decir una solución electrolítica de sal, para que se pueda medir la fem de la celda. Los puentes
salinos pueden ser un tubo esmerilado, un puente de agar, una mecha de asbesto u otros. Los
empalmes líquidos, es decir estas soluciones de electrolitos que conectaran a los dos electrodos, son
de sales de alta fuerza iónica, y la más común es la de KCl saturado, pero pueden ser mezclas de
sales de K, Na, Cl. La fem de la celda es la diferencia algebraica de los potenciales de los dos
62
Laboratorio de Bioquímica Clínica
electrodos (el de referencia y el indicador). El electrodo de referencia en la mayoría de los
potenciómetros se comporta como un ánodo.
Los electrodos de referencia generalmente son de Calomel (Cloruro de mercurio) o de Plata
(Cloruro de plata/Plata). Las características de este tipo de electrodos son:
 Invariabilidad del potencial durante la medición
 Ajuste rápido y exacto
 No debe alterarse con la temperatura
Existen electrodos de trabajo de distinto tipo útiles para distintos cationes o aniones. Cada vez son
más usados los electrodos selectivos de iones (ESI) o electrodos de membrana. Uno de los más
empleados, que se comenzó a utilizar a principios del siglo XX, es el electrodo de pH (un electrodo de
vidrio). Los electrodos de primera clase contienen un metal sumergido en una solución con iones de
la misma especie. Son generalmente electrodo de plata sumergido en nitrato de plata y mercurio. Los
electrodos de segunda clase son electrodos de metal recubiertos de una sal poco soluble o un
complejo de este metal inmerso en una solución con un ión de la misma especie. El potencial del
electrodo indicador está en función de la actividad de ión activo, esto es el ión para el cuál el
electrodo es activo. Este valor se requiere para conocer la concentración de la especie en estudio. Un
electrodo de trabajo debe tener las siguientes características:
 Alta sensibilidad a la especie que va a ser determinada.
 Alto grado de reporducibilidad.
 Respuesta rápida a las variaciones de concentración de la especie que se va a
determinar.
Los factores principales que determinan el potencial de electrodo con respecto a otro son: la
capacidad de ionización de la sal, la concentración de la sal y la temperatura.. Los potenciales de
electrodo se consideran como la fem de las celdas constituidas por un electrodo patrón de hidrógeno,
el cual se considera una referencia para calcular los potenciales de otros electrodos de referencia.
El potencial
de cualquier electrodo está dado por la ecuación de Nerst:
Є = Є° −
𝐑𝐓 𝐚𝐫𝐞𝐝
𝐥𝐧
𝐧𝑭 𝐚𝐨𝐱
en donde R es la constante de los gases (8.31 V/°K), T es la temperatura en grados Kelvin, n es el
número de electrones transferidos en la reacción del electrodo, F es la constante de Faraday (96,
485.33 coloumbs/mol) y ared y aox son las actividades de las formas reducidas y oxidadas. Si en la
ecuación las actividades se sustituyen por la concentración en moles, y se insertan valores numéricos
en lugar de constantes, usando además logaritmo decimal, a una temperatura de 25 °C la ecuación
se transforma en
Є = Є° −
𝟎. 𝟎𝟓𝟗𝟏𝟓 𝐚𝐫𝐞𝐝
𝐥𝐧
𝐧𝑭
𝐚𝐨𝐱
Eletrodos de pH
Los electrodos de pH son electrodos de membrana sólida, en este caso vidrio de silicatos con
modificadores iónicos, sensibles a iones hidrógeno. Estas membranas de vidrio pueden ser de dos
tipos:
 Membrana T: Na2O - CaO - SiO2 (22:6:72)%

Membrana U: Li2O - Cs2O2 - BaO - La2O3 - SiO2 (28:2:4:3:63)%
Cuando el electrodo se pone el contacto con la solución que se va a medir, se presenta un
proceso de intercambio iónico entre los iones H+ de la solución y el Na+ o Li+ de la membrana. Es muy
importante mantener el electrodo sumergido en agua, regulador diluido o KCl, de modo que se forme
una capa de cohesión entre el vidrio y la solución que se va a determinar, y evitar retrasos en la
63
Laboratorio de Bioquímica Clínica
determinación por el transporte de iones, o una caída del voltaje por la resistencia del medio. El
electrodo de pH tiene un electrodo de referencia interna de plata (Ag/AgCl) sumergido en un
regulador de sales de Cl- (pH = 7.0) con una membrana de vidrio (Fig. 1).
Fig. 1
La determinación de pH en clínica tiene relevancia para el diagnóstico de ciertos estados
patológicos. El pH de la sangre tiene un muy estrecho margen de variación, entre 7.3 y 7.45 lo que
indica que existen controles muy rigurosos de este parámetro. El control tiene que ver con permitir el
funcionamiento de las enzimas del metabolismo y con su regulación. Como consecuencia de los
procesos metabólicos, se producen constantemente sustancias ácidas: ácido carbónico (el que se
produce en mayor cantidad), ácido láctico, y muchos cetoácidos como metabolitos intermediarios.
La regulación del pH puede darse por 4 procesos: amortiguación extracelular, amortiguación
intracelular, amortiguación respiratoria y la excreción renal de la carga de H+. En la amortiguación
extracelular, es decir de la sangre, el HC03- juega el papel más importante, ya que posee una gran
capacidad para evitar cambios bruscos en el pH de la sangre arterial. En la amortiguación respiratoria
se incrementa la ventilación alveolar, y como resultado, la PC02 descenderá para volver el pH a la
normalidad. El riñón desempeña un papel crítico en el equilibrio ácido-básico a través de la regulación
del HCO3- plasmático a través de la reabsorción de este ión.
La acidosis metabólica es un trastorno clínico caracterizado por un descenso en el pH arterial y en
la concentración de HCO3- esta acidosis metabólica se produce de dos maneras: por la adición de
ácido o por la pérdida de HCO3-. Las causas son insuficiencia renal o cetoacidosis metabólica.
También la ingesta de anticongelantes provoca un tipo de acidosis.
La alcalosis metabólica es un trastorno en el cuál el pH sanguíneo aumenta. Puede deberse a
retención de HCO3- o pérdida gastrointestinal o renal de H+, por ejemplo en vómito y succión gástrica.
También por el uso de diuréticos, la ingestión excesiva de alcalinos y se encuentra asociada al
hipercorticismo.
Como se mencionó anteriormente, la sangre tiene una gran capacidad amortiguadora, sobre todo
por la presencia de iones bicarbonato, pero también porque muchas proteínas actúan amortiguando
los cambios de pH. En esta práctica se realizará la titulación de suero humano para probar esta
capacidad de amortiguación del pH. Esto se observará en la gráfica correspondiente, donde se podrá
observar la zona donde no se modifica el pH de la solución, aún cuando se adicione álcali.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL




Potenciómetro con electrodo
Centrífuga clínica.
Aguja para vacutainer
Torundas, ligadura y adaptador.
64
Laboratorio de Bioquímica Clínica





Tubos vacutainer con gel.
Vaso de precipitados de 15 mL
Pipeta Pasteur.
Bureta de 50 mL
Pizeta.
3.2 REACTIVOS






Solución calibradora de pH 4.0
Solución calibradora de pH 7.0
NaOH 0.01N
HCl 0.01 N
Regulador de fosfatos (Na2 HPO4 – NaH2PO4) 0.0025N pH 7.35
Solución salina fisiológica (SSF)
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.
4.1 Obtener aproximadamente 5 mL de sangre periférica en un tubo vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
4.4 Con ayuda de una pipeta Pasteur recuperar el suero y realizar una dilución 1:20 del suero, con
SSF, para obtener 20 mL de la dilución.
4.5 . Colocarlo en un vaso de precipitados de 30 mL.
B. CALIBRACIÓN DEL POTENCIOMETRO.
4.6 Tomar el potenciómetro y lavar el electrodo con agua destilada, para eliminar la solución de KCl
que contiene. Con ayuda de un paño suave secar el exceso de agua de la punta del electrodo, sin
frotarlo.
4.7 Realizar la calibración del equipo con dos reguladores (2 puntos) acorde al instructivo según el
modelo de potenciómetro que sea asignado.
4.8 Lavar nuevamente el electrodo con agua destilada y secar. El equipo está ahora listo para las
determinaciones de pH.
C. TITULACIÓN POTENCIOMÉTRICA DEL SUERO HUMANO.
4.9 Introducir el electrodo en 20 mL de la dilución del suero y registrar el pH marcado.
4.10 Con una bureta, adicionar gota a gota, una solución de NaOH 0.01 N, mientras el vaso se
mantiene con agitación a baja velocidad.
4.11 Registrar el pH del suero cada 0.2 mL de gasto de sosa. Anotar estos datos en la tabla 5.1.
Detener la titulación cuando el pH sea de 10.0
4.12 Otro equipo realizará la misma titulación pero empleando HCl 0.01N como titulante. Detener la
titulación cuando el pH sea de 2.0
4.13 Repetir el procedimiento pero empleando ahora 20 mL de agua destilada, para compararla
con la curva obtenida con el suero. Titular igualmente con NaOH 0.01N, y con HCl 0.01N. Anotar
los datos en la tabla 5.2
4.14
Finalmente, realizar la titulación con 20 mL de una solución de reguladora de fosfatos
0.0025N, pH 7.35. Titular con NaOH 0.01N, y con HCl 0.01N. Anotar los datos en la tabla 5.3
65
Laboratorio de Bioquímica Clínica
CUIDADOS DEL POTENCIOMETRO DE pH.
Almacenamiento.
 Los electrodos de pH se deberán guardar siempre en un medio líquido, nunca secos.
 En el caso de los electrodos de pH combinados en un electrolito de referencia o solución
saturada de sales.
Limpieza del electrodo.
 Si se realizan mediciones sistemáticas de disoluciones de HCl u otros con Cl en baja
concentración, puede precipitarse el AgCl. Debe entonces introducirse el electrodo en NH3
concentrado toda una noche y se lava con agua destilada.
 Después de cada lectura puede hacerse una lectura rápida con agua destilada.
 Pueden emplearse soluciones limpiadoras comerciales.
 Si se ha empleado agar, puede enjuagarse inmediatamente con agua destilada caliente.
5. RESULTADOS
5.1 Anotar el valor de pH inicial del suero __________________
5.2 Anotar el pH inicial del regulador de fosfatos ____________
5.3 Anotar el pH inicial del agua destilada __________________
5.4 Anotar los resultados de la titulación de suero en la tabla 5.1. En las tablas 5.2 y 5.3 anotar los
datos de agua y de regulador de fosfatos.
mL de NaOH
gastados
Tabla 5.1 SUERO
pH
mL de HCl
gastados
pH
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
mL de NaOH
gastados
mL de NaOH
gastados
Tabla 5.2 AGUA
pH
mL de HCl
gastados
Tabla 5.3 REGULADOR FOSFATOS
pH
mL de HCl
gastados
pH
pH
5.5 Realizar una gráfica de pH (en las ordenadas) contra los mL de NaOH o HCl gastados (en las
abscisas).
5.6 En esta gráfica marcar con rojo la zona donde el suero amortigua el pH, y que es donde se dice
que funciona como amortiguador o regulador. ¿En qué intervalo de pH se encuentra esta zona?
5.7 Qué determina el valor de pH del suero sanguíneo?
5.8 ¿A qué se debe la capacidad amortiguadora del suero sanguíneo?
5.9 ¿En qué casos se debe determinar el valor de pH del suero de un individuo?
5.10
¿Cuál es la importancia metabólica y fisiológica de regular el pH de la sangre?
5.11
¿Cuáles son los cuidados del potenciómetro de pH?
5.12
¿Con que otros equipos se determina en clínica el pH sanguíneo y en que condiciones?
5.13
¿Cómo se puede automatizar la determinación de pH de sangre?
67
Laboratorio de Bioquímica Clínica
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia y uso de la determinación de pH de la sangre. Funcionamiento y cuidados del
potenciómetro de pH.
7. CONCLUSIONES
7.1 En función de los resultados y la discusión que se realizó, elaborar las conclusiones y verificar si
se cumplieron los objetivos planteados.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1 Skoog, D., Holler, J. y Crouch, S. 2006. Principios de análisis instrumental. 6a. edición. Ed. Mc
Graw-Hill Co. México.
8.2 Willard, H., Merritt, L., Dean, J. y Settle, F. 1988. Métodos Instrumentales de Análisis. 7a.
edición. Ed. Iberoamericana. México.
8.3 Devlin, T. 2004. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. edición. Ed.
Reverté. Barcelona, España.
8.5. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioquímica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. México.
68
Laboratorio de Bioquímica Clínica
APENDICE A
USO DE LAS PIPETAS AUTOMÁTICAS
Las pipetas automáticas son instrumentos delicados y costosos, que deben cuidarse dado que de ellos
depende gran parte de nuestro trabajo. Dichas pipetas son muy precisas si se las utiliza correctamente. Existen
varios tipos de pipetas y cada marca provee un juego para diferentes rangos de volúmenes. Cada pipeta está
rotulada en el émbolo y posee un color distintivo, para su funcionamiento la mayoría tiene características
análogas. A continuación se ejemplifican dos tipos de pipetas.
Ante la menor duda, consulte antes de usar. Es preferible
preguntar lo mismo veinte veces antes que romper una
pipeta.
Juego de pipetas tipo A
Una pipeta rotulada P-20 mide entre 2 l y 20 l.
Una pipeta rotulada P-200 mide entre 20 l y 200 l.
Una pipeta rotulada P-1000 mide entre 200 l y 1.000 l ó 0,2 y 1,0 ml.
Para poder tomar líquido con estas pipetas, deben tener en su extremos las puntas plásticas descartables (tips),
amarillas para P-20 y P-200, y azules para P-1000.
Antes de utilizar la pipeta asegúrese conocer cómo fijar el volumen. La P-20 mide hasta la décima de
microlitro. En la P-20 los dos números superiores indican el volumen en microlitros, en tanto que el número
inferior es la cantidad fraccional La P-200 y P-1000 miden hasta el microlitro por lo tanto, el número superior
de la P-200 nunca debe superar el 2.
Por ejemplo:
En una p20 equivalen
a 3,8l
En una p200
equivalen a 38l
En una p1000
equivalen a 380l
Recuerde que las micropipetas tienen dos topes, antes de tomar un volumen solamente debe bajar hasta el
primero, y cuando baje el volumen hágalo hasta el primer tope, en caso de que aun quede solución en el tips
puede bajar hasta el segundo tope.
“NUNCA”
1- Nunca forzar la pipeta por encima del volumen indicado por su nombre. No mide más de lo establecido y
descalibrará o romperá la pipeta.
2- Nunca utilice la pipeta para medir un volumen menor a la décima parte de su nombre. No es precisa.
3- Nunca utilice una pipeta sin su punta (tips) amarilla o azul.
4- Nunca utilice la pipeta con soluciones ácidas concentradas. Los vapores pueden oxidar las partes metálicas
interiores de la pipeta.
69
Laboratorio de Bioquímica Clínica
APENDICE B
¿CÓMO ESCRIBIR EL REPORTE?
“Si un hombre puede organizar sus ideas, entonces él puede escribir"
Robert Louis Stevenson (1850-1894)
Son varios los elementos de los cuales se conforma un reporte, y en el caso de los laboratorios de la
academia de BIOQUÏMICA se incluyen los siguientes:
PRÁCTICA No. #
Título de la Práctica
UNIDAD: Unidad de aprendizaje a la cual pertenece la práctica
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo general
1.1.1. El principal objetivo que se busca al realizar la práctica
1.2 Objetivos específicos
1.2.1 Son los objetivos parciales que nos llevan a concluir el objetivo general
1.2.2
1.2.3
EN EL REPORTE QUE SE SOLICITA EN EL LABORATORIO
INTRODUCCIÓN, LA CUÁL YA ESTÁ INCLUIDA EN CADA PRÁCTICA.
NO
SE
INCLUYE
LA
A continuación se describe más detalladamente cada una de las secciones.
Objetivo:
En el campo de la educación, podemos decir, que un objetivo es el resultado que se espera logre el
alumno al finalizar un determinado proceso de aprendizaje, es decir, que un objetivo es el resultado que se
espera logre el alumno al finalizar un determinado proceso de aprendizaje.
Los objetivos se dividen en Objetivo General y Objetivo Específicos. El Objetivo General es el resultado
final que se quiere llegar. El Objetivo General, para ser llevado a cabo, usualmente puede y tiene que ser
desglosado en una serie de acciones o actividades particulares menores, sustancialmente diferentes unas de
otras. Estos son los Objetivos Específicos. Son como las dos, tres o cuatro partes básicas en que se divide la
investigación. Aunque este ya se encuentra impreso en la práctica, debes considerar que debe tener
congruencia con el título, y que verdaderamente se estén cumpliendo con el trabajo experimental.
Introducción:
Esta sección le indica al lector cuál es el problema, así como por qué y cómo se ha planeado la
práctica. Te proporciona el marco teórico necesario para que puedas enriquecer los experimentos a realizar, y
poder lograr los objetivos.
Como se trabaja este laboratorio, la introducción ya está realizada, debes leerla antes de cada práctica,
y es por eso que NO es necesario incluirla en tu reporte.
Material y métodos
En esta sección se responde a la pregunta de "cómo se ha hecho el estudio". La sección de material y
métodos debe ser lo suficientemente detallada como para que puedas realizar los experimentos de forma
independiente. Una vez más esta se encuentra ya escrita dentro de tu práctica, por lo que NO es necesario que
lo copies, pero debes tenerla muy presente a la hora de elaborar tu reporte, incluyendo las modificaciones que
se hayan realizado durante la realización de la práctica, porque van a ser muy importantes durante los
resultados, discusión y las conclusiones.
Resultados
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
Los resultados deben cumplir dos funciones:
1. Expresar los resultados de los experimentos descritos en Material y Métodos.
2. Presentar las pruebas que apoyan tales resultados, sea en forma de figuras, tablas, gráficas o en el mismo
texto.
Los resultados deben poder ser vistos y entendidos de forma rápida y clara. Es por ello por lo que la
construcción de esta sección debe comenzar por la elaboración de esquemas, las tablas y figuras, así como
gráficas, las que, por sí solas, deben poder expresar claramente los resultados de todos los experimentos
realizados en la práctica. Recuerda que en el manual ya se encuentran tablas para poder organizar tus
resultados, utilízalas en el reporte.
Las graficas deben de llevar titulo, unidades y la escala debe ser congruente, las figuras y esquemas
deben de llevar un pie de figura indicando de lo que se trata, los esquemas deben ser de tipo biológico
También se incluye en esta sección un Cuestionario, el cual debes de contestar apoyándote en
bibliografía, que además de irte guiando en todos los resultados que debes presentar, estas preguntas te
servirán para centrar tus resultados dentro del marco teórico.
Análisis de Resultados y Discusión
Esta sección incluye lo más importante del reporte, por lo que es la sección más compleja de elaborar y
organizar. Aquí es donde se interpretan los resultados, se califican, y se les pone dentro del contexto del
trabajo. Guía al lector de forma que siga el proceso mental que se siguió para llegar a las conclusiones. Algunos
puntos específicos que se deben resaltar son:
1. Cualquier experimento realizado debe ser discutido. Básate en como expresaste los resultados, analiza los
esquemas, tablas y gráficas. ¿Cómo se relacionan los datos dentro de una tabla? ¿En qué se diferencian?
¿Cómo debería interpretarse en una gráfica? ¿Cuál es el significado biológico de la forma de la gráfica,
pendiente, puntos de inflexión, máximos, mínimos o donde se interceptan las líneas?
2. ¿Cómo se ajustan los resultados a las expectativas? Por ejemplo, ¿las mediciones concuerdan con las
predicciones teóricas o con las mediciones de otros experimentos? ¿Cuál es la explicación para estas
diferencias?
3. Si una variable fue medida en varias formas, ¿cómo se comparan las medidas y qué significa esta
comparación?
4. ¿Cuáles son las fuentes de error para el análisis o para la recolección de datos? ¿Los resultados están
dentro del intervalo aceptable de error ya establecido? No debe decirse que los resultados están dentro del
error esperado, a menos que se haya efectuado un análisis de error. Si algo salio mal no se trata que digas
que “salió mal” sino que debes analizar todo el proceso y encontrar cuales son todas las fuentes probables
de ese error, y como podrías identificar cual es la que verdaderamente falló y como corregirla.
5. No olvides siempre tratar de contextualizar esta discusión dentro de tu carrera, y las aplicaciones que le
podrás dar al conocimiento adquirido en tu área.
Algunas sugerencias pueden ayudar
 Comienza la Discusión con la respuesta a la pregunta de tus objetivos, seguida inmediatamente con las
pruebas expuestas en los resultados que la corroboran.
 Escribe esta sección en presente ("estos datos indican que"), porque los hallazgos del trabajo se
consideran ya evidencia.
 Saca a la luz y comente claramente, en lugar de ocultar resultados anómalos, dales una explicación lo
más coherente posible o simplemente diciendo que esto es lo que ha encontrado, aunque por el
momento no se vea explicación.
 Especule y teorice con imaginación y lógica. Debes aprender a exponer ideas novedosas de forma
clara.
 Incluye las recomendaciones que creas oportunas.
 Y, por encima de todo, evita sacar más conclusiones de las que sus resultados permitan, por mucho
que esas conclusiones sean menos espectaculares que las esperadas o deseadas.
En cuanto a la redacción ten siempre en mente a un lector específico, real o imaginario, cuando escriba
el reporte; y siempre asume que dicho lector es inteligente pero que no está informado de la situación en
particular que se está reportando. Antes de empezar a escribir, entienda que la discusión tiene un objetivo, y
todas las partes en el deben contribuir a ese objetivo. El reporte deberá reflejar un sólido entendimiento de lo
que en el se presenta, y debería ser objetivo, por lo que nunca deben de expresarse opiniones personales.
Use lenguaje simple, preciso y familiar. El uso incorrecto del vocabulario y de los términos
técnicos únicamente evidencia que no tienes un buen conocimiento de los conceptos. Trata de ligar los
71
Laboratorio de Bioquímica Clínica
párrafos para que no se lean de manera inconexa, cada uno se debe de ir ligando y finalmente te deben
llevar a las conclusiones.
Use la tercera persona en voz pasiva. Los pronombres personales "yo", "a mí", "tú", "Ud.", "a nosotros",
no deben aparecer. La voz pasiva es utilizada debido a que los informes generalmente hablan de cosas que se
han hecho en el pasado; por ejemplo: "el potenciómetro fue calibrado", en vez de "nosotros calibramos el
potenciómetro".
Si se tienen problemas con una oración, esto se debe probablemente a que se quieren unir dos ideas
que no están relacionadas entre sí. Deténgase a pensar un momento en lo que está tratando de decir.
Encontrará que dos o más oraciones más cortas representarán la información con mayor claridad y harán que
este pasaje sea más fácil de leer.
Conclusiones:
La sección de conclusiones es la culminación de tu reporte, tus objetivos señalan adonde deberías
llegar, los resultados son la forma en que puedes llegar, la discusión te permite, junto con tus resultados, el
proceso para que cumplas con los objetivos, en esta parte del reporte debes de expresar a que llegaste de
manera concisa.
Las conclusiones se inician con una o dos oraciones que recuerden los objetivos. Dado que se pueden
sacar varias conclusiones de un estudio, una lista numerada es útil frecuentemente. Cada conclusión debería
constar de una oración breve y clara. Las conclusiones deben estar relacionadas con los objetivos.
Las conclusiones solo pueden ser de aquello que experimentaste, discutiste y que por lo tanto
ya deben estar claras en la persona que lee el informe, solo las debes de puntualizar. No pueden ser
apreciativas, ni repetir el enunciado de los objetivos en diferente verbo, sino que deben ser lo más objetivas, de
acuerdo a lo que te indicaba el objetivo, por ejemplo si el objetivo es “determinar la tasa de crecimiento del
microorganismo” no puedes concluir “aprendimos a determinar la tasas de crecimiento” o “se determinó la tasa
de crecimiento”, sino “la tasa de crecimiento del microorganismo fue de X”.
Bibliografía
La Bibliografía hace referencia a todo el material que consultaste para la realización de la práctica, para
contestar el cuestionario, para buscar datos específicos, o para buscar los datos teóricos, no debes copiar
aquella que presenta el manual, y que fue la usada para la elaboración de la introducción, a menos que incluyas
datos nuevos. Esta puede incluir más la de libros aunque su nombre así lo indique, pude incluir artículos de
revista, normas, leyes, e inclusive sitios electrónicos, siempre y en cuando estos sean una fuente fidedigna y
confiable, y no páginas de Internet cuestionables, esto se puede corroborar por el respaldo que tiene una
publicación electrónica por una institución de prestigio, esto es universidades, institutos de investigación,
órganos gubernamentales ú organizaciones internacionales. Tampoco es válido la inclusión de enciclopedias
como Encarta, o sitios de recopilación de datos como lo es Wikipedia, ya que todos sus datos no son generados
por esos sitios, y siempre se debe buscar la fuente original para poder certificar su veracidad. En el apéndice
puedes revisar las diferentes fuentes y como deben citarse.
A continuación se presenta las diferentes fuentes que puedes usar en la bibliografía y la forma correcta
de citarlas de acuerdo a normas internacionales como son la norma ISO 690-1987 y su equivalente UNE 50104-94 para citar literatura convencional, y la norma ISO 690-2 especifica los elementos que hay que incluir en
las citas bibliográficas de los documentos electrónicos.
* Los elementos señalados con un asterisco son opcionales.
** Los elementos señalados con dos asteriscos son obligatorios para los documentos en línea.
LIBROS
APELLIDO(S), Nombre. Título del libro. Mención de responsabilidad secundaria (traductor; prologuista;
ilustrador; coordinador; etc.)*. Nº de edición. Lugar de edición: editorial, año de edición. Nº de páginas*.
Serie*. Notas*. ISBN
Ejemplo:
BOBBIO, Norberto. Autobiografía. Papuzzi, Alberto (ed. lit.); Peces-Barba, Gregorio (prol.); Benitez, Esther
(trad.). Madrid: Taurus, 1988. 299 p. ISBN: 84-306-0267-4 .
PARTES DE LIBROS
APELLIDO(S), Nombre. "Título de la parte". En: Responsabilidad de la obra completa. Título de la obra. Edición.
Lugar de edición: editorial, año de edición. Situación de la parte en la obra.
72
Laboratorio de Bioquímica Clínica
Ejemplo:
SNAVELY, B.B. "Continuous-Wave Dye lasers I". En: SCHÄFER, F.P. (ed). Dye lasers. Berlin: Springer, 1990.
p. 91-120.
ARTÍCULOS DE REVISTAS
APELLIDO(S), Nombre. "Título del artículo". Responsabilidad secundaria. Título de la publicación seriada.
Edición. Localización en el documento fuente: año, número, páginas.
Ejemplo:
HARUTA S., Nakayama T., Nakamura K., Hemmi H., Ishii M., Igarashi Y., Nishino T. “Microbial diversity in
biodegradation and reutilization processes of garbage”. J. Biosci. Bioeng. 2005 99(1):1-11.
LEGISLACIÓN
País. Título. Publicación, fecha de publicación, número, páginas.
Ejemplo:
México. Ley Orgánica del Instituto Politécnico Nacional. Diario Oficial de la Federación. 29 de diciembre de
1981. 13p
NORMAS
ENTIDAD RESPONSABLE DE LA NORMA. Título. Nº ó código de la norma. Edición. Lugar de publicación:
editorial, año de publicación.
Ejemplo:
MÉXICO. SECRETARÍA DE SALUD. Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, que establece las
especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades. NOM-065-SSA1-1993. Diario Oficial de la
Federación. 27 de febrero de 1995.
CONGRESOS
APELLIDO(S), Nombre. Título. Responsabilidades secundarias*. Nº de edición. Lugar: editorial, año de
publicación. Nª de páginas o volúmenes*. ISBN
Ejemplo:
Actas del I Congreso de Historia de la Lengua Española en América y España: noviembre de 1994-febrero de
1995. M. Teresa Echenique, Milagros Aleza y M. José Martínez (eds.).València: Universitat, Departamento de
Filología Española, 1995. 564 p. ISBN: 8480022698.
PONENCIAS DE CONGRESOS
APELLIDO(S), Nombre. "Título de la parte". En: APELLIDO(S), Nombre. Título de la obra completa.
Responsabilidades secundarias*. Nº de edición. Lugar: editorial, año de publicación. Serie*. ISBN
Ejemplo:
CEREZO GALÁN, Pedro. "La antropología del espíritu en Juan de la Cruz". En: Actas del Congreso
Internacional Sanjuanista, (Ávila 23-28 de septiembre de 1991), v. III. [S.l.]: [s.n.], 1991. P. 128-154
TESIS NO PUBLICADAS
APELLIDO(S), Nombre. "Título de la tesis". Dirección. Clase de tesis. [Tipo de documento]. Institución
académica en la que se presenta, lugar, año.
Ejemplo:
LASCURAIN SÁNCHEZ, María Luisa. "Análisis de la actividad científica y del consumo de información de los
psicólogos españoles del ámbito universitario durante el período 1986-1995". Director: Elías Sanz Casado.
Universidad Carlos III de Madrid, Departamento de Biblioteconomía y Documentación, 2001.
DOCUMENTOS ELECTRÓNICOS
TEXTOS ELECTRÓNICOS, BASES DE DATOS Y PROGRAMAS INFORMÁTICOS
Responsable principal. Título [tipo de soporte]. Responsables secundarios*. Edición. Lugar de publicación:
editor, fecha de publicación, fecha de actualización o revisión, [fecha de consulta]**. Descripción física*.
(Colección)*. Notas*. Disponibilidad y acceso**. Número normalizado*
Ejemplo (en norma ISO 690-2):
CARROLL, Lewis. Alice's Adventures in Wonderland [en línea]. Texinfo ed. 2.1. [Dortmund, Alemania]:
WindSpiel, November 1994 [ref. de 10 de febrero de 1995]. Disponible en Web:
<http://www.germany.eu.net/books/carroll/alice.html>. Igualmente disponible en versiones PostScrip y ASCII
en Internet: <ftp://ftp.Germany.EU.net/pub/books/carroll/>
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
PARTES DE TEXTOS ELECTRÓNICOS, BASES DE DATOS Y PROGRAMAS INFORMÁTICOS
Responsable principal (del documento principal). Título [tipo de soporte]. Responsable(s) secundario(s) (del
documento principal*). Edición. Lugar de publicación: editor, fecha de publicación, fecha de actualización o
revisión [fecha de consulta]**. "Designación del capítulo o parte, Título de la parte", numeración y/o
localización de la parte dentro del documento principal*. Notas*. Disponibilidad y acceso**. Número
normalizado*
Ejemplos (en norma ISO 690-2):
CARROLL, Lewis. Alice's Adventures in Wonderland [en línea]. Texinfo. ed. 2.2. [Dortmund, Alemania]:
WindSpiel, November 1994 [ref. de 30 marzo 1995]. Chapter VII. A Mad Tea-Party. Disponible en World Wide
Web: <http://www.germany.eu.net/books/carroll/alice_10.html#SEC13>.
CONTRIBUCIONES EN TEXTOS ELECTRÓNICOS, BASES DE DATOS Y PROGRAMAS INFORMÁTICOS
Responsable principal (de la contribución). "Título" [tipo de soporte]. En: Responsable principal (del documento
principal). Título. Edición. Lugar de publicación: editor, fecha de publicación, fecha de actualización o revisión
[fecha de consulta]**. Numeración y/o localización de la contribución dentro del documento fuente. Notas*.
Disponibilidad y acceso**. Número normalizado*
Ejemplos (en norma ISO 690-2):
MCCONNELL, WH. Constitutional History. The Canadian Encyclopedia [CD-ROM]. Macintosh version 1.1.
Toronto: McClelland & Stewart, c1993. ISBN 0-7710-1932-7.
PUBLICACIONES ELECTRÓNICAS SERIADAS COMPLETAS
Responsable principal. Título [tipo de soporte]. Edición. Designación de los números (fecha y/o número)*. Lugar
de publicación: editor, fecha de publicación [fecha de consulta]**. Descripción física*. (Colección)*. Notas*.
Disponibilidad y acceso**. Número normalizado
Ejemplo (en norma ISO 690-2):
Journal of Technology Education [en línea]. Blacksburg (Virginie): Virginia Polytechnic Institute and State
University,
1989[ref.
de
15
marzo
1995].
Semestral.
Disponible
en
Internet:
<gopher://borg.lib.vt.edu:70/1/jte>. ISSN 1045-1064.
ARTÍCULOS Y CONTRIBUCIONES EN PUBLICACIONES ELECTRÓNICAS SERIADAS
Responsable principal (del artículo). "Título (del artículo)". Título (de la publicación principal) [tipo de soporte].
Edición. Designación del número de la parte. Fecha de actualización o revisión [fecha de consulta]**.
Localización de la parte dentro del documento principal. Notas*. Disponibilidad y acceso**. Número
normalizado
Ejemplo (en norma ISO 690-2):
STONE, Nan. The Globalization of Europe. Harvard Business Review [en línea]. May-June 1989 [ref. de 3
septembre 1990]. Disponible en BRS Information Technologies, McLean (Virginie).
BOLETINES DE NOTICIAS, LISTAS DE DISCUSIÓN
Título [tipo de soporte]. Responsable(s) secundario(s). Lugar de publicación: editor, fecha de publicación
[Fecha de consulta]**. Notas*. Disponibilidad y acceso**
Ejemplo (en norma ISO 690-2):
PACS-L (Public Access Computer Systems Forum) [en línea]. Houston (Tex.): University of Houston Libraries,
Junio 1989- [ref. de 17 mayo 1995]. Disponible en Internet: <[email protected]>.
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
APENDICE C
Preparación de Reactivos.
Nota: Elaborar las cantidades necesarias de reactantes en base al número de equipos de trabajo total por 1.5.
PRÁCTICA 1. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
No se emplean soluciones o reactivos.
PRÁCTICA 2. DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE BIOMOLÉCULAS.
1.1 Reactivo BCP Stock 40 mM
0.54 g de Púrpura de bromocresol grado reactivo en 15 mL de etanol absoluto. Disolver y aforar a 25 mL
Almacenar en frasco ámbar. El reactivo es estable 3 meses en la obscuridad y en refrigeración.
1.2 Stock de ácido acético
150 mL de ácido acético glacial en un L de agua destilada.
1.3 Reactivo de trabajo de BCP 40 μM
10 g de acetato de sodio 3H2O en 800 mL de agua, disolver Adicionar 10 mL de la sol. Stock de ácido
acético y 1 mL de la solución stock de BCP. Ajustar el pH a 5.2 (con acético o con NaOH). Aforar a 1 L con
agua destilada. El reactivo debe ser de color amarillo verdoso. Esta solución de trabajo es estable una
semana en obscuridad y refrigeración.
1.4 Soluciones de Albúmina Humana
200 mg/mL. Pesar 100 mg de albúmina humana y disolver en 0.5 mL de ssf, con agitación muy suave para
evitar la formación de espuma. Puede usarse ssf ligeramente caliente (50-60°C) para facilitar la disolución.
160 mg/mL: Tomar 0.5 mL de solución de albúmina humana de 200 mg/mL y adicionar 0.125 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formación de espuma.
100 mg/mL: Tomar 0.5 mL de solución de albúmina humana de 200 mg/mL y adicionar 0.5 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formación de espuma.
60 mg/mL: Pesar 60 mg de albúmina humana y disolver en 1 mL de ssf ligeramente caliente (50-60°C)
agitando muy suavemente para evitar la formación de espuma.
40 mg/mL: Tomar 0.5 mL de solución de albúmina humana de 60 mg/mL y adicionar 0.25 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formación de espuma.
20 mg/mL: Tomar 0.25 mL de solución de albúmina humana de 40 mg/mL y adicionar 0.25 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formación de espuma.
10 mg/mL: Tomar 0.25 mL de solución de albúmina humana de 20 mg/mL y adicionar 0.25 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formación de espuma.
6 mg/mL: Tomar 0.1 mL de solución de albúmina humana de 60 mg/mL y adicionar 0.9 mL de ssf. Disolver
agitando suavemente para evitar la formación de espuma.
4 mg/mL: Tomar 0.1 mL de solución de albúmina humana de 40 mg/mL y adicionar 0.9 mL de ssf. Disolver
agitando suavemente para evitar la formación de espuma.
1.5 1 mg/mL en solución salina fisiológica.
Solución salina fisiológica (ssf)
0.85 g de NaCl en 100 mL de agua destilada
1.6 Colágeno (gelatina) 60 mg/mL en ssf.
60 mg de gelatina disolverlos en 1 mL de ssf..
1.7 Glicina 60 mg/mL en ssf.
60 mg de glicina disolverlos en 1 mL de ssf.
1.8 Solución de albúmina 60 mg/mL emulsionada con aceite de oliva.
Mezclar 1 mL de la solución de albúmina de 60 mg/ mL adicionarle 1 mL de aceite de oliva. Mezclar en
vortex 15 segundos antes de usarse.
1.9 Solución de albúmina 60 mg/mL con detergente comercial 60 mg/mL (1:1 albúmina: detergente).
Mezclar 1 mL de solución de albúmina con 1 mL de la solución de detergente comercial de 60 mg/mL y
mezclar sin hacer espuma.
1.10 Solución de albúmina 60 mg/mL con hemoglobina.
A 1 mL de sangre obtenida con anticoagulante, agregar un 1 mL de agua destilada, para lisar los eritrocitos.
A esta solución adicionar 1 mL de la solución de albúmina de 60 mg/mL.
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Laboratorio de Bioquímica Clínica
PRÁCTICA 3. ELECTROFORESIS DE SUERO
3.1 Amortiguador 4X a pH 8.8 (Tris HCl 1.5 M)
Pesar 18.16g de de Tris-base, agregar 80 mL de agua bidestilada y ajustar el pH a 8.8 con HCl
concentrado (aproximadamente 1 mL) aforar a 100 mL con agua bidestilada.
3.2 Amortiguador 4X a Ph 6.8 (Tris HCl 0.5 M)
Pesar 0.075g de Tris- base, 3.85 g de Tris-HCl y disolverlo en 50 mL de agua bidestilada.
3.3 Acrilamida –Bisacrilamida 29:1 %
Pesar 29g de acrilamida y 1 g de bisacrilamida, disolver en 100 mL de agua destilada.
3.4 Persulfato de amonio 10 %
Pesar 100 mg de persulfato de amonio y disolverlo en 1 mL de agua bidestilada. Prepararlo siempre
fresco a la hora de preparar el gel.
3.5 Amortiguador de Laemmli 2x
Componentes
Volumen (mL)
Concentración final
Tris- HCl 1M pH 6.8
1.2
120 mM
Glicerol
2
20 %
SDS 10 %
2
2%
Azul de bromofenol
0.2
0.02%
(1%)
Ditiotritol 1M
2
0.2 M
EDTA 0.5 M
0.04
2mM
Agua bidestilada
2.56
3.6 Fibrinógeno sérico
Pesar 1 mg de fibrinógeno y disolverlo en 1 mL de solución salina fisiológica.
Nota: En el gel no cargar más de 100 µg totales de fibrinógeno
3.7 Solución de azul de Coomasie para teñir
Solución madre: Pesar 2 g de azul de Coomasie R-250 y disolverlo en 200 mL de agua bidestilada
caliente. Filtrar con papel Wathman No.1 y conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.
Solución de trabajo: Agregar 31.3 mL de la solución madre de azul de Coomasie, 125 mL de metanol,
25 mL de ácido acético glacial y 68.7 mL de agua bidestilada. Mezclar bien, llevar a un volumen final de
250 mL, filtrar con papel Wathman No.1 y conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.
3.8 Solución desteñidora
Mezclar 500 mL de metanol, 100 mL de ácido acético glacial y 400 mL de agua bidestilada.
3.9 Buffer de corrimiento 1x
Componentes
Pesar (g)
Concentración final
Tris- base
3
25 mM
Glicina
14.4
192mM
SDS
1
0.1%
Aforar a 1 L con agua bidestilada, cuidando no hacer espuma
PRÁCTICA 4. USO DE ENZIMAS EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO: PERFIL HEPÁTICO Y PERFIL CARDIACO.
No se requiere de preparar soluciones y reactivos ya que se emplean kits de diagnóstico.
PRÁCTICA 5. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SUERO HUMANO
5.1.
Solución patrón de glucosa de 100 mg/ mL
Emplear la solución del kit de determinación de glucosa
5.2.
Estándares de referencia de glucosa
150 mg/dL: Pesar 150 mg de glucosa grado reactivo y disolver en 50 mL de agua destilada. Aforar a
100 mL con agua destilada.
120 mg/dL: Tomar 50 mL de la solución de glucosa de 150 mg/dL y adicionar 12.5 mL de agua
destilada.
90 mg/dL: Pesar 90 mg de glucosa grado reactivo y disolver en 50 mL de agua destilada. Aforar a 100
mL con agua destilada.
60 mg/dL: Tomar 50 mL de la solución de glucosa de 120 mg/dL y aforar 50 mL de agua destilada.
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30 mg/dL: Tomar 50 mL de la solución de glucosa de 60 mg/dL y aforar 50 mL de agua destilada.
PRÁCTICA 6. OBTENCIÓN DE VALORES DE REFERENCIA DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN
SUERO HUMANO.
No se requiere de preparar soluciones y reactivos ya que se emplean kits de diagnóstico.
PRÁCTICA 7. DETERMINACIÓN DE UREA, CREATININA Y ÁCIDO ÚRICO.
No se requiere de preparar soluciones y reactivos ya que se emplean kits de diagnóstico.
PRÁCTICA 8. DETERMINACIÓN DE HORMONA GONADOTROPINA CORIÓNICA
Solución salina fisiológica: ver práctica 2
PRÁCTICA 9. POTENCIOMETRÍA
9.1. Solución calibradora de pH 4.0 y solución calibradora de pH 7.0: Se emplean lsa comerciales.
9.2. NaOH 0.01N. Pesar 0.4 g de NaOh grado reactivo y disolver en 500 mL de agua destilada. Aforar a 1 L
con agua destilada.
9.3. HCl 0.001 N. Medir 0.83 mL de HCl (37% pureza, grado reactivo) y disolver en 500 mL de agua
destilada. Aforar a 1 L con agua destilada.
9.4. Regulador de fosfatos 0.0025 N, pH 7.35:
9.5. Pesar 0.355 g de Na2HPO4 y aforar 1 L con agua destilada. Pesar 0.3 g de NaH2PO4 y aforar a 1 L
con agua destilada. Colocar el dibásico en un vaso de precipitados de 2 L, y determinar el pH con el
electrodo del potenciómetro (debe ser de 8.9-9.2). Ahí mismo adicionar lentamente y con agitación el
monobásico hasta obtener el pH deseado.
9.6. Ssf: ver práctica 2
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