Evaluación in vitro de actividad antitumoral de compuestos de

Parra Forero D.
Evaluación in vitro de actividad antitumoral de compuestos de origen natural y sintético
sobre líneas celulares neoplásicas humanas.
Diana Alejandra Parra1, Fabio Ancízar Aristizabal2
1
Grupo de investigación de Farmacogenética del cáncer. Departamento de Farmacia. Facultad
de ciencias. Universidad Nacional de Colombia.
[email protected]
2
Doctor en Ciencias Biológicas. Grupo de investigación de Farmacogenética del cáncer.
Departamento de Farmacia. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia.
[email protected]
RESUMEN
El cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo, razón por lo que se siguen
buscando nuevas opciones para su tratamiento. La evaluación de actividad citotóxica in vitro en
células tumorales humanas, se emplea como tamizaje de productos de diferente origen con miras
a detectar moléculas con potencial actividad antitumoral, siendo un componente importante de
estudios de fase preclínica para la selección y desarrollo de nuevos fármacos antitumorales. En
este estudio se evaluaron 48 productos de origen sintético (37) y natural (11), ensayados en tres
concentraciones distintas dependiendo de su origen: 1, 5 y 10µM para compuestos sintéticos y 6,
18 y 54µg/ml para productos de origen natural. Adicionalmente a un grupo de compuestos se les
evaluó a seis concentraciones: 0.1, 1, 5, 10, 50 y 100 µM para observar actividad citotóxica
diferencial. Los productos se ensayaron sobre cinco líneas tumorales humanas: PC-3, MDAMB231, HT-29, A549 y Hep G2 empleando una metodología fluorométrica fundamentada en la
reducción del colorante Resazurina para la valoración de la citotoxicidad; además se evaluó la
recuperación celular, con el fin de hacer una aproximación real al efecto de los tratamientos:
1
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
citotóxico o citostático. Se encontraron compuestos con actividad citotóxica promisoria, que
sugieren su potencial uso quimioterapéutico.
Palabras Claves: Actividad citotóxica in vitro – Antitumorales – Resazurina - Recuperación
celular
ABSTRACT
Cancer is a leading cause of death in the world, why are still looking for new options for
treatment. The in vitro cytotoxic activity evaluation in human tumor cell lines, used as screening
products from different origin with antitumor activity, remains an important component of
preclinical studies for the selection and development of new antitumor drugs. In this study, we
evaluated 48 products of synthetic origin (37) and natural (11), tested at three different
concentrations according their origin: 1, 5 and 10μM for synthetic compounds and 6, 18 and
54μg/ml for products of natural origin. In addition, a group of compounds were evaluated at six
concentrations: 0.1, 1, 5, 10, 50 and 100μM to observe differential cytotoxic activity. The
products were tested on five human tumor cell lines: PC-3, MDA-MB231, HT-29, A549 and
Hep-G2 using a fluorometric method based on the reduction of resazurin dye for the assessment
of cytotoxicity, also evaluated cellular recovery in order to make an approach to the treatment
effect: cytotoxic or cytostatic. We found promising compounds with cytotoxic activity,
suggesting its potential chemotherapeutic use.
Keywords: In vitro cytotoxic activity - Antitumor - Resazurin - Recovery cell
Parra Forero D.
INTRODUCCIÓN
El cáncer es una de las primeras causas de muertes en el mundo, 10.9 millones de personas son
diagnosticadas de cáncer cada año y se estima que hay 24.6 millones de personas que han
recibido el diagnóstico de cáncer en los últimos cinco años (1). Los tumores más comunes a nivel
mundial son el de pulmón (1.35 millones), mama (1.15 millones) y el colorrectal (1 millón); sin
embargo los que generan más mortalidad en orden de mayor a menor son el cáncer de pulmón, el
de estómago y el de hígado (2), datos que no difieren mucho de los reportados en Colombia,
donde también el cáncer de próstata ocupa un lugar relevante (3,4).
Después de años de constante descubrimiento y desarrollo, en la actualidad se cuenta con una
gran variedad de fármacos quimioterapéuticos, que han sido ampliamente utilizados. Sin
embargo, estas terapias se caracterizan por ser costosas, tener efectos secundarios no deseados (5)
y en casos reales generan tumores resistentes en los pacientes, donde estos tratamientos tienen
una efectividad limitada; es por todo esto, que se genera la necesidad de seguir buscando nuevas
opciones para el tratamiento del cáncer, dentro del quehacer investigativo farmacéutico.
En esa exhaustiva búsqueda de nuevas moléculas prototipo o cabezas de serie, se han sintetizado
nuevos compuestos y también se han aislado productos de origen natural. Los compuestos
semisintético y sintéticos con actividad antitumoral se han generado de modificaciones químicas
o síntesis química completa de compuestos de origen natural que se han logrado aislar, purificar y
han demostrado ser citotóxicos (6). La química medicinal inorgánica se ha convertido en un
campo creciente de investigación con numerosas aplicaciones en muchas ramas de la medicina
(7) y desde tiempos remotos ha permitido obtener compuestos sintéticos con un papel esencial en
el tratamiento del cáncer, como por ejemplo los derivados de platino (cisplatino) y así mismo ha
3
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
permitido la investigación y el desarrollo de nuevos compuestos sintéticos, es el caso de los
compuestos de coordinación, de los cuales algunos poseen promisoria actividad antitumoral (8).
En cuanto a los compuestos de origen natural, es importante resaltar que la medicina tradicional
ha sido una fuente reveladora de nuevas moléculas en el descubrimiento moderno de fármacos
antitumorales (9), es así como para el tratamiento de cáncer se utilizan derivados del taxol,
algunos derivados semisintéticos de los alcaloides de la vinca, derivados de la podofilotoxina,
entre otros (10). Se conoce, que las terapias que incluyen el uso de productos naturales, pueden
reducir efectos colaterales que se observan con los actuales antitumorales (11). Por todo lo
anterior es importante promover en Colombia la bioprospección para el descubrimiento de
nuevos fármacos antitumorales, aprovechando la gran diversidad biológica que posee y que es
considerada como fuente potencial de productos farmacológicamente activos, y conociendo que
a pesar de los esfuerzos de encontrar moléculas activas que minimicen los efectos secundarios, la
tasa de éxito se ha mantenido muy baja.
Los ensayos de evaluación de la actividad citotóxica in vitro, empleando líneas celulares
derivadas de neoplasias humanas, se han convertido en una de las principales herramientas de
apoyo para realizar esos procesos de bioprospección, y al ser un modelo experimental in vitro, es
una alternativa al empleo de animales de laboratorio que ha permitido en los últimos años la
búsqueda de nuevos principios activos, siendo una técnica sensible y sencilla, que genera
resultados reproducibles y validos, adaptable a un alto número de muestras de distinto origen
(12,13), que permite reducir tiempo, costos de investigación y costos éticos relacionados con el
uso de animales de laboratorio, por otra parte son útiles para diferentes tipos de estudios
relacionados con mecanismos celulares y moleculares (14,15). En este tipo de ensayos las líneas
celulares tumorales son expuestas a la sustancia por un periodo determinado de tiempo, se evalúa
Parra Forero D.
la viabilidad celular y la capacidad citotóxica de los agentes estudiados y esa capacidad es
interpretada como un indicativo de potencial anticáncer in vivo (10). La citotoxicidad indica el
potencial que un agente tiene para causar el daño celular, este dependerá de la concentración y
del tiempo de exposición en las células. La intensidad de este efecto compromete la viabilidad
celular por perturbación metabólica o integridad estructural, causando muerte celular, ó por
integridad reproductiva, inhibiendo división celular (16).
Este estudio realizó la evaluación de la actividad citotóxica de compuestos de origen natural y
sintético, con núcleos químicos distintos, empleando un panel de líneas celulares tumorales
humanas, seleccionado con el fin de que representara los tumores más comunes y que permitiera
de acuerdo a esto, realizar un adecuado tamizaje de los posibles agentes antitumorales. El panel
de líneas celulares estaba constituido por A549, MDA-MB231, HT-29, Hep-G2 y PC-3 que
fueron proporcionadas por el grupo de Farmacogenética del Cáncer de la Universidad Nacional
de Colombia provenientes de la American Type Culture Collection (ATCC) (17). La valoración
de la viabilidad celular se realizó empleando el método fluorométrico de la reducción de la
resazurina o alamarBlue, que se caracteriza por ser un método simple, rápido, eficiente, seguro,
sensible y costo-efectivo (18), características que no poseían los métodos que anteriormente se
utilizaban para tal fin, como el método de la tinción con sulforodamida B (SRB), el método de la
reducción del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio (MTT) o el método que
emplea 51Cr radioactivo (19). El fundamento del método de reducción de la resazurina, es que al
ser la resazurina metabolizada por células viables, genera un metabolito altamente fluorescente
conocido
como
―resorufina‖ permitiendo la detección
del
crecimiento celular por
espectrofotometría o fluorometría (20). Una de las ventajas de utilizar resazurina es que las
células que son usadas con este colorante pueden ser utilizadas para otros experimentos, puesto
5
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
que el colorante no es toxico para las células (18), aprovechando esta característica, en este
estudio fue posible evaluar la recuperación de la viabilidad celular luego de las 48 horas después
de los tratamientos, con el fin de realizar una aproximación del efecto del compuesto: citostático
o citotóxico, y en algunos casos ayudo a observar el efecto antiproliferativo que poseen algunos
compuestos.
Los productos de origen natural evaluados fueron extractos y fracciones de tomate de árbol y
extractos crudos de diferentes fuentes y especies naturales: mora, uva, motilon, gulupa madura y
coral. De acuerdo a la naturaleza química de los compuestos sintéticos evaluados, se dividieron
en cuatro subgrupos: compuestos de coordinación, derivados quinoidales, derivados de
benzamidas y análogos de purinas. En este estudio se encontró que la mayoría de compuestos de
origen natural evaluados no poseían actividad citotóxica en las concentraciones evaluadas, por el
contrario algunos de los compuestos sintéticos poseían un perfil de citotoxicidad promisorio. Los
resultados de este estudio sugieren que los compuestos sintéticos como derivados quinónicos y
compuestos de coordinación con ion plata, núcleos químicos de fenantrolina y salicilato, se sigan
evaluando puesto que poseen una actividad citotóxica interesante y pueden
llegar a ser
moléculas prototipo o cabezas de serie de nuevos fármacos antitumorales, abriendo nuevas
perspectivas de tratamiento para esta patología de alto impacto social y económico.
METODOLOGÍA.
Cultivos Celulares: Se emplearon cinco líneas de diferente origen tumoral humano, de
crecimiento adherente en monocapa: carcinoma de pulmón (A549), adenocarcinoma de mama
(MDA—MB231), adenocarcinoma colorrectal (HT-29), carcinoma hepatocelular (Hep-G2) y
Parra Forero D.
carcinoma de próstata (PC-3), todas obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC).
Las cinco líneas se mantuvieron en Dulbecco’s Modified Eagle’s médium/ Ham’s Nutrient
Mixture F-12 (DMEM) (Sigma), suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino (FBS)
(Microgen), gentamicina 50 µg/mL (Genfar) en frascos de cultivo celular de 75 y 150cm2 de área,
a 37°C, en atmósfera con 5% de CO2 y 100% de humedad relativa. Se cambiaba el medio a las
células al menos tres veces a la semana.
Valoraciones de actividad citotóxica: Las células en crecimiento exponencial, con un 90% de
confluencia, se lavaron con solución de fosfatos (PBS) y posteriormente se trataron con una
solución de tripsina 0,025%-EDTA 0,03% durante 5 minutos a 37°C, para obtener una
suspensión celular que se contó en cámara de Neubauer, empleando el método de exclusión del
colorante azul de trypan. Las células fueron inoculadas en placas de 96 pozos con fondo plano en
las densidades celulares previamente establecidas por el Grupo Farmacogenética del Cancer de la
Universidad Nacional de Colombia (21, 22, 23, 24, 25, 26): MDA—MB231, PC-3 y Hep-G2:
1,0x104; HT-29: 2x104; y A549: 5x103 células por pozo. Las placas se preincubaron por 24 h para
permitir adherencia de las células en los pozos, luego se adicionaron los tratamiento (DMEM mas
compuestos) en las concentraciones establecidas, con sus respectivas replicas, incubando por un
periodo de 48 h. Además, se dejaron pozos con células mas medio de cultivo, como controles de
crecimiento, y pozos sin células, pero con tratamiento como blancos.
Para evaluar el efecto citotóxico del compuesto, se empleó el método fluorométrico indirecto de
reducción de Resazurina (18,19,20). El tratamiento fue retirado y se reemplazó por 100µL/pozo
de una solución de resazurina en una concentración final de 10% v/v a partir de una solución
inicial de 44 µM y se incubó por 4 horas a 37ºC. Posteriormente se leyó por fluorometría la
7
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
formación de resorufina (producto de la reducción de la resazurina por las células viables),
empleando un filtro de excitación de longitud de onda de 530nm y un filtro de emisión de 590 nm
en un lector de placas TECAN GENios. Se calcularon los porcentajes de supervivencia relativa a
las células control de crecimiento y se construyeron curvas de porcentaje de supervivencia en
función del logaritmo de la concentración.
Valoración de la Recuperación celular: Cuando los tratamientos mostraron alguna reducción
de la supervivencia, dado que la rezasurina no tiene efectos tóxicos importante sobre las células
su uso permite monitorear la recuperación de las líneas celulares luego de 48 horas de la
exposición al tratamiento, para observar si se trata de una acción citostática o citotóxica. Después
de la Lectura de la valoración de la citotoxicidad en el lector de placas, se retiró el medio con la
rezasurina y se reemplazó por 100µL/pozo de DMEM suplementado únicamente con gentamicina
50µg/mL, incubando por un periodo de 48 h. Posteriormente se siguió el procedimiento
anteriormente descrito para evaluar el efecto citotóxico, leyendo en el lector de placas TECAN
GENios y obtener las curvas de porcentaje de supervivencia en función del logaritmo de la
concentración.
Tratamientos: Como molécula patrón se empleó la Doxorubicina HCl (Ebewe Pharma), debido
a su actividad citotóxica y que ha sido empleado en trabajos previos del grupo de investigación
de Farmacogenética del Cáncer, del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de
Colombia como control positivo en los estudios de valoración citotóxica (21,22). Se preparó una
solución stock de los 48 compuestos usando dimetilsulfóxido (DMSO) cuya concentración final
fue de 10.000µM para los compuestos sintéticos y 5400µg/ml para compuestos de origen natural.
Al momento de ser adicionadas a las células se prepararon diluciones en medio de cultivo
Parra Forero D.
(DMEM). Cada uno de los tratamientos se evaluó en 3 diluciones seriadas, 10, 5 y 1µM para
compuestos sinteticos y 54, 18 y 6 μg/mL para productos de origen natural. Los compuestos de
coordinación evaluados se ensayaron en 6 concentraciones seriadas 100, 50,10,5, 1, y 0.1 µM.
La concentración final de DMSO no fue mayor a 0,1% v/v, para evitar la interferencia de este
solvente en los resultados. Se evaluó el efecto del DMSO en MEM, como control negativo.
Análisis estadísticos: Las diferencias significativas fueron determinadas usando un análisis de
varianza (ANOVA), Se consideró un p<0,05 como significativo. Los resultados se presentan
como % de supervivencia ± ESM (Error Estandar de la media). Los valores de IC50
(concentración de compuesto que causa el 50% de reducción de la viabilidad celular) en los casos
que podía ser calculada, fueron obtenidos de una regresión no linear usando GraphPad 5.0-Prism
software. Los controles y tratamientos se evaluaron por triplicado para cada concentración y se
realizó al menos una repetición del ensayo. Los valores de IC50 se expresaron en µM ± ESM
(Error estándar de la media).
RESULTADOS
Los resultados muestran los porcentajes de supervivencia de los compuestos que fueron activos
en cada línea celular utilizando una matriz que relaciona las líneas celulares con los subgrupos
químicos, especificando también el origen de los subgrupos: sintético o de origen natural
Adicionalmente se presenta una tabla con los datos de la Concentración Inhibitoria 50 (CI50)
9
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
Tabla I. Porcentajes de Supervivencia y resultados de la Recuperación Celular de los compuestos evaluados que
RC2
RC3
RC4
Quinonas (Sintéticas)
RC5
RC6
RC7
RC8
RC10
RC12
RC13
RC15
RC16
Ensayo
Código
Naturaleza
química
presentaron actividad citotóxica sobre las líneas celulares MDA-MB231 y Hep-G2
Líneas celulares tumorales humanas
10 µM
MDA-MB231
5 µM
Hep-G2
1 µM
10 µM
44,50%
Ct
39,39%
Ct
38,47%
Ct
16,66%
Ct
58,64%
0,96%
65,08%
8,39%
±
4,59%
65,24%
±
±
43,91%
±
-2,36%
±
1,75%
98,43%
0,64%
45,91%
71,93%
±
70,08%
±
±
5,58%
98,65%
±
±
9,99%
94,13%
4,72%
67,04%
±
1,85%
100,57%
±
2,18%
108,57%
1,88%
84,33%
±
1,88%
38,77%
48,97%
11,22%
43,18%
71,37%
±
±
2,64%
54,89%
2,08%
68,05%
24,93%
±
10,54%
±
1,04%
NR
NR
1,51%
±
NR
NR
±
2,16%
NR
0,54%
40,56%
NR
±
2,22%
49,63%
±
2,56%
32,08%
3,50%
102,74%
±
2,51%
101,65%
±
2,12%
37,72%
±
2,83%
4,22%
±
3,61%
NR
103,50%
±
1,75%
105,11%
-
±
±
±
±
6,56%
63,01%
1,06%
47,08%
1,98%
±
1,93%
-
15,39%
±
NR
0,27%
98,66%
±
±
2,58%
72,28%
2,06%
86,29%
45,18%
0,17%
14,42%
±
0,55%
92,37%
1,27%
45,36%
26,09%
±
NR
1,13%
±
4,42%
±
2,13%
-
NR
0,37%
±
-
NR
±
4,52%
NR
NR
0,80%
±
-
NR
NR
±
±
NR
NR
2,46%
59,66%
NR
-
±
2,53%
NR
-
±
±
NR
-
NR
94,72%
2,80%
-
-
4,56%
±
6,08%
-
NR
NR
Rc
95,89%
-
NR
Rc
5,34%
NR
NR
Rc
±
NR
NR
Rc
Ct
84,22%
NR
Rc
Ct
4,59%
NR
Rc
Ct
±
NR
Rc
Ct
2,47%
NR
Rc
Ct
±
±
NR
NR
Rc
Ct
50,12%
NR
Rc
Ct
1,82%
NR
Rc
Ct
±
1 µM
5 µM
±
2,58%
NR
1,37%
48,22%
±
NR
1,15%
Parra Forero D.
RC17
RC18
RC19
RC20
RI1
RI2
Purinas
(sinteticas)
P5*
Ct
83,35%
7,90%
14,97%
±
±
18,10%
±
0,67%
77,70%
1,73%
102,93%
0,56%
±
77,89%
2,99%
98,56%
±
64,60%
1,35%
±
2,84%
±
39,95%
2,18%
95,23%
NR
2,22%
±
-
NR
NR
Rc
±
-
-
3,66%
±
108,31%
2,32%
9,67%
±
1,86%
6,68%
-
52,50%
±
±
37,23%
±
0,92%
18,02%
38,19%
±
0,27%
27,61%
77,78%
±
5,37%
ND
89,13%
±
2,46%
-
111,06%
±
89,89%
±
±
1,42%
59,68%
±
0,38%
58,69%
48,83%
±
6,05%
±
0,84%
NR
1,29%
42,21%
±
1,53%
NR
2,84%
64,91%
NR
2,22%
±
-
NR
NR
Rc
2,32%
NR
NR
Ct
±
NR
NR
Rc
Rc
0,81%
NR
Ct
Ct
±
NR
-
NR
±
1,97%
NR
3,68%
64,72%
NR
±
9,84%
NR
3,83%
36,66%
Ct
±
4,02%
41,63%
±
3,48%
64,29%
±
8,09%
MH4a
R
R
R
54µg/mL
18µg/mL
6 µg/mL
Rc
54µg/mL
Extractos y
Fracciones
101,72%
NR
Rc
Ct
2,41%
NR
Rc
Ct
±
NR
Rc
Ct
NR
NR
Rc
Ta1
Tr 1
Ct
18µg/mL
6 µg/mL
24,82%
Rc
1,53%
39,38%
NR
Rc
Ct
±
59,76%
±
NR
±
8,37%
57,97%
R
5,69%
76,07%
±
R
±
4,51%
R
0,31%
123,25%
±
12,55%
-
Porcentaje de supervivencia promedio de por lo menos 6 determinaciones ± ESM. Los valores negativos se aproximan a porcentajes de
supervivencia iguales a cero. CONVENCIONES: Ct- Ensayo de Citotoxicidad; Rc-Ensayo de Recuperación; R: Presenta recuperación 48 horas
después del tratamiento; NR: No presenta recuperación 48 horas después del tratamiento; ND: Recuperación no determinada (-) No aplica
recuperación. (*) No presento Actividad citotóxica, Presento efecto hormético
11
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
Tabla II. Porcentajes de Supervivencia y resultados de la Recuperación Celular de los compuestos evaluados que
RC5
Quinonas (Sintéticas)
RC7
RC10
RC13
RC15
RC18
RC19
RC20
Ensayo
Líneas celulares tumorales humanas
Código
Naturaleza
química
presentaron actividad citotóxica sobre las líneas celulares HT-29 y PC-3
Ct
10 µM
63,09%
Rc
Ct
67,36%
65,59%
64,95%
Rc
104,59%
±
4,81%
99,40%
±
±
±
13,35%
±
±
NR
101,28%
7,85%
101,04%
±
2,66%
102,20%
±
2,05%
108,14%
99,72%
1,72%
97,13%
±
2,19%
100,86%
±
5,60%
111,85%
±
3,90%
94,94%
71,09%
1,90%
74,63%
±
4,84%
27,86%
1 µM
±
9,13%
95,32%
3,02%
99,66%
NR
±
2,26%
14,94%
±
2,52%
±
2,11%
94,32%
±
0,82%
98,00%
4,20%
70,47%
±
±
1,07%
-
-
NR
±
1,39%
-
NR
±
±
±
0,82%
1,35%
106,33%
NR
±
1,64%
-
68,48%
±
8,69%
106,10%
NR
0,49%
±
-
24,84%
2,03%
-
-
4,82%
±
-
3,46%
5 µM
10 µM
-
-
NR
23,50%
0,38%
1 µM
-
NR
Rc
Ct
0,29%
NR
74,99%
Rc
Ct
±
±
PC-3
-
NR
Rc
Ct
90,23
NR
Rc
Ct
2,01%
NR
53,13%
Rc
Ct
±
NR
Rc
Ct
HT-29
5 µM
±
NR
±
119,46%
96,02%
2,55%
-1,46%
±
3,40%
12,21%
±
NR
±
5,15%
100,15%
0,60%
0,13%
NR
±
-
9,05%
NR
1,41%
±
±
131,62%
±
NR
6,18%
0,55%
39,43%
NR
3,49%
±
±
1,21%
NR
14,
38%
234,12%
±
36,81%
-
Porcentaje de supervivencia promedio de por lo menos 6 determinaciones ± ESM. Los valores negativos se aproximan a porcentajes de
supervivencia iguales a cero. CONVENCIONES: Ct- Ensayo de Citotoxicidad; Rc-Ensayo de Recuperación; R: Presenta recuperación 48 horas
después del tratamiento; NR: No presenta recuperación 48 horas después del tratamiento; ND: Recuperación no determinada. (-) No aplica
recuperación
Parra Forero D.
Tabla III. Porcentajes de Supervivencia y resultados de la Recuperación Celular de los compuestos evaluados que
RC2
RC3
Quinonas (Sinteticas)
RC4
RC5
RC6
RC7
RC10
RC12
RC13
RC15
RC16
Línea celular tumoral humana
Ensayo
Código
Naturaleza
química
presentaron actividad citotóxica sobre la línea celular A-549
Ct
10 µM
47,85%
Rc
Ct
39,76%
80,69%
39,99%
69,60%
11,27%
-3,72%
57,76%
13,08%
±
±
±
±
±
±
60,03%
±
1,15%
96,79%
±
92,34%
72,89%
3,76%
±
104,41%
70,85%
1,84%
±
112,57%
62,46%
3,86%
±
93,75%
53,34%
10,15%
±
98,38%
99,64%
19,74%
±
104,10%
27,00%
3,86%
±
104,29%
93,73%
3,00%
±
93,90%
79,50%
±
±
1,77%
±
4,81%
±
5,87%
±
6,96%
±
7,43%
3,74%
109,91%
5,81%
2,02%
-
NR
2,24%
±
-
NR
1,52%
2,79%
-
NR
2,05%
±
-
NR
0,52%
2,59%
-
NR
1,55%
±
-
NR
0,03%
7,23%
-
NR
4,64%
±
-
2,72%
±
NR
74,04%
96,30%
NR
NR
Rc
Ct
±
4,93%
±
NR
Rc
Ct
65,47%
NR
Rc
Ct
5,23%
NR
Rc
Ct
±
1 µM
NR
NR
Rc
Ct
±
NR
Rc
Ct
75,51%
NR
Rc
Ct
3,90%
NR
Rc
Ct
±
NR
Rc
Ct
A-549
5 µM
±
7,51%
1,36%
97,91%
±
2,94%
13
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
NR
Rc
RC17
RC18
RC19
RC20
RI2
P2*
P4*
P5*
Ct
7,14%
Rc
Ct
24,85%
-2,13%
-3,36%
79,17%
0,27%
69,17%
±
±
±
70,65%
±
±
0,35%
10,29%
Rc
83,57%
±
NR
77,90%
40,77%
2,36%
±
2,06%
±
0,75%
22,92%
NR
0,11%
±
-
3,86%
±
±
2,50%
NR
1,49%
108,22%
±
6,84%
1,06%
102,84%
±
1,83%
NR
0,93%
81,30%
±
NR
7,24%
94,52%
±
5,34%
105,37%
NR
2,60%
95,70%
±
NR
Ct
99,98%
NR
NR
77,05%
4,98%
±
NR
Rc
Rc
±
-
NR
NR
Rc
Ct
±
NR
Rc
Ct
59,69%
NR
Rc
Ct
1,63%
NR
Rc
Ct
±
NR
6,64%
94,36%
NR
1,26%
88,67%
±
11,70%
±
6,74%
2,53%
NR
±
-
113,63%
±
5,03%
-
Porcentaje de supervivencia promedio de por lo menos 6 determinaciones ± ESM. Los valores negativos se aproximan a porcentajes de
supervivencia iguales a cero. CONVENCIONES: Ct- Ensayo de Citotoxicidad; Rc-Ensayo de Recuperación; R: Presenta recuperación 48 horas
después del tratamiento; NR: No presenta recuperación 48 horas después del tratamiento; ND: Recuperación no determinada. (-) No aplica
recuperación. (*) No presento Actividad citotóxica, Presento efecto hormetico
Parra Forero D.
Tabla VI. Porcentajes de Supervivencia y resultados de la Recuperación Celular de los compuestos de coordinación y
D
MDA-MB231
D-1
D-2
D-3
D-4
Hep-G2
D-5
D-2
HT-29
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Concentraciones Evaluadas- Compuestos de Coordinación
100 µM
50 µM
10 µM
5 µM
1 µM
0,1 µM
(-)2,17%± 0,95%
NR
28,49%± 0,51%
R
28,65%± 1,73%
(-)1,82%± 0,57%
NR
74,73%± 12,00%
R
35,7%± 4,83%
43,53%± 0,86%
NR
85,21%± 7,68%
R
90,77%± 3,56%
76,2%± 6,71%
107,6%± 5,55%
88,13%± 6,17%
93,36%± 4,93%
101,04%± 1,59%
104,65%± 4,52%
97,66%± 5,07%
104,26%± 4,71%
123,85%± 4,65%
Rc
R
R
R
-
-
-
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
27,15%± 3,12%
R
20,05%± 2,16%
R
(-)0,66%± 0,02%
NR
38,68%± 9,88%
R
72,88%± 3,89%
R
(-)0,53%± 0,04%
NR
48,39%± 6,85%
R
71,35%± 7,56%
R
88,86%± 2,51%
-
77,78%± 4,93%
77,55%± 8,44%
101,95%± 0,90%
-
87,82%± 0,96%
79,56%± 3,92%
103,54%± 1,31%
-
89,93%± 2,80%
92,69%± 3,32%
120,37%± 1,88%
-
Ct
(-)0,28%± 0,15%
(-)0,67%± 0,04%
(-)0,21%± 0,10%
7,71%± 0,56%
109,73%± 3,31%
107,63%± 1,61%
Rc
NR
NR
NR
NR
NR
-
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
(-)1,24%± 0,13%
NR
27,71%± 1,52%
R
76,87%± 3,09%
NR
17,16%± 2,76%
R
(-)0,67%± 0,04%
NR
(-)1,12%± 0,12%
NR
(-)1,01%± 0,17%
NR
58,84%± 4,90%
R
82,65%± 6,59%
R
83,92%± 10,66%
R
(-)0,60%± 0,06%
NR
(-)0,62%± 0,24%
NR
89,11%± 2,83%
NR
108,74%± 1,08%
96,75%± 6,00%
119,57%± 3,75%
112,72%± 0,65%
17,6%± 5,59%
NR
107,51%± 3,03%
109,53%± 2,18%
98,64%± 3,28%
118,36%± 4,10%
111,02%± 0,98%
99,13%± 5,49%
-
105,76%± 2,50%
109,29%± 2,24%
102,02%± 3,17%
115,16%± 3,54%
111,73%± 0,23%
104,04%± 3,45%
-
103,13%± 2,20%
126,37%± 2,60%
105,71%± 3,52%
136,3%± 4,66%
128,55%± 0,94%
102,52%± 3,44%
-
D
D
D-3
D-4
D-5
PC-3
Ensayo
Código
Línea
Celular
el control positivo Doxorrubicina en las cinco líneas tumorales humanas.
D
15
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
D-4
D-5
D
A-549
D-2
D-3
D-4
D-5
Linea
Celular
MDA-MB231
HT-29
PC-3
A-549
Hep-G2
Ct
0,36%± 0,16%
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
Ct
Rc
R
(-) 0,090%± 0,06%
R
(-)0,570%± 0,02%
NR
2,18%± 2,36%
NR
18,08%± 1,29%
R
88,19%± 0,94%
NR
43,5%± 1,68%
NR
(-)0,62%± 0,03%
NR
30,67%± 4,18%
R
46,31%± 1,28%
R
106,07%± 2,47%
5,94%± 4,26%
NR
67,02%± 2,44%
R
95,28%± 0,75%
NR
65,04%± 1,76%
NR
(-)0,05%± 0,05%
NR
121,14%± 8,19%
112,32%± 1,20%
104,37%± 1,06%
7,11%± 4,54%
NR
87,97%± 4,15%
102,69%± 0,88%
86,75%± 1,13%
NR
101,15%± 0,80%
-
122,28%± 8,29%
112,91%± 1,14%
101,37%± 0,92%
72,49%± 7,21%
NR
83,06%± 3,43%
101,16%± 0,61%
83,81%± 0,65%
99,89%± 0,61%
-
128,72%± 10,81%
113%± 1,12%
102%± 0,91%
85,63%± 8,78%
94,26%± 3,23%
103,82%± 0,54%
92,94%± 0,38%
101,79%± 0,64%
-
140,36%± 11,08%
123,11%± 1,36%
116,41%± 2,93%
100,49%± 6,95%
111,64%± 4,15%
101,47%± 0,16%
106,83%± 1,82%
118,34%± 1,14%
-
Ensayo
D-2
100 µM
Ct
3,53%± 0,170%
7,91%± 0,53%
6,79%± 1,03%
12,16%± 0,56%
31,42%± 1,98%
89,06%± 5,26%
Rc
Ct
NR
0%± 0,33%
NR
0,83%± 0,18%
NR
4,66%± 1,09%
NR
19,02%± 0,38%
NR
83,42%± 1,20%
94,98%± 1,36%
Rc
NR
NR
NR
NR
-
-
Concentraciones Evaluadas- Doxorrubicina (Control positivo)
50 µM
10 µM
5 µM
1 µM
0,1 µM
Ct
20,83%± 0,77%
35,22%± 1,48%
55,64%± 1,22%
54,33%± 3,29%
86,44%± 1,93%
100,02%± 1,65%
Rc
NR
NR
NR
NR
-
-
Ct
28,16%± 0,91%
37,7%± 1,57%
44,69%± 1,91%
38,06%± 1,07%
80,62%± 1,35%
101,59%± 1,72%
Rc
NR
NR
NR
NR
-
-
Ct
0%± 0,11%
20,73%± 3,13%
34,43%± 3,67%
42,46%± 3,36%
94,13%± 4,21%
107,28%± 3,12%
Rc
NR
NR
NR
NR
-
-
Porcentaje de supervivencia promedio de por lo menos 6 determinaciones ± ESM. Los valores negativos se aproximan a porcentajes de
supervivencia iguales a cero. CONVENCIONES: Ct- Ensayo de Citotoxicidad; Rc-Ensayo de Recuperación; R: Presenta recuperación 48 horas
después del tratamiento; NR: No presenta recuperación 48 horas después del tratamiento; ND: Recuperación no determinada (-) No aplica
recuperación
Parra Forero D.
Tabla V. Resultados de citotoxicidad expresados en valores de Concentración
Inhibitoria 50 (IC50)
Código Nat .
química
CI 50 (µM)
Línea celular
MDAMB231
Hep-G2
HT-29
PC-3
A-549
RC2 - Q
4,21 ± 0,06
9,64 ± 0,02
RC3- Q
4,03 ± 0,02
8,06 ± 1,19
RC4- Q
3,8 ± 0,05
RC5- Q
<1
5,93 ± 0,27
6,85 ± 0,02
8,82 ± 0,76
RC7- Q
5,52 ± 0,94
7,11 ± 0,03
RC8- Q
4,64 ± 0,36
4,44 ± 0,03
RC12- Q
10,1 ± 0,26
3,73 ± 0,01
RC13- Q
5,93 ± 0,27
<1
RC10- Q
10,51 ± 0,41
8,44 ± 0,32
4,62 ± 2,78
7,16 ± 0,08
2,48 ± 0,54
RC11- Q
5,8 ± 0,29
RC17- Q
RC18- Q
4,43 ± 0,60
5,57 ± 0,03
RC19- Q
6,7 ± 0,10
1,31 ± 0,05
2,89 ± 0,93
<1
<1
RC20- Q
6,43 ± 0,28
<1
7,07 ± 0,08
9,04 ± 0,08
9,32 ± 0,11
22,28 ± 1,58
6,84 ± 0,05
4,94 ± 1,02
63,35 ± 2,49
41 ± 0,81
62,33 ± 3,61
RI1- Q
6,59 ± 0,02
RI2- Q
6,13 ± 0,05
MH4 a - AP
8,05 ± 0,11
D-C
9,28 ± 1,07
3,03 ± 0,58
16,76a ±
0,05a
2,57 ± 0,02
D1 - C
74,68 ± 2,26
ND
D2- C
33,27 ± 8,56
ND
D3- C
18,57 ± 8,41
ND
D4- C
60,67 ± 0,89
ND
69,84 ± 5,56
49,58 ± 1,92
80,76 ± 1,97
D5 - C
22,08 ± 0,52
ND
28,34 ± 0,18
65,37 ± 1,93
24,98 ± 0,17
Doxorrubicinab
0,48 ± 0,06
4,88 ± 0,04
2,12 ± 0,02
8,44 ± 0,05
4,2 ± 0,03
Tr1-E
CI50 ± ESM (Error Estándar de la media), n=6, determinados empleando el método de
resazurina para las cinco líneas celulares. a) µg/mL. b) Control Positivo. El signo (<) indica que
el valor de CI50 no es alcanzado en el rango de concentraciones de la valoración. Convenciones:
Q- Quinona; AP-Análogo de Purina; E- Extracto; C- Compuesto de Coordinación.
17
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
Tabla VI. Compuestos que presentaron hórmesis en el panel de
líneas celulares evaluadas
Código
MDA-MB231
Línea Celular
HEP-G2
HT-29
PC3
a
RC5
RC10a
RC13 a
RC15 a
RC16 a
RC19 a
RC20 a
P2 a
P5 a
TR1b
Dc
D2c
D3c
D4c
D5c
DOXOc
X
A549
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
ND
ND
ND
ND
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Se considero efecto hormético cuando % supervivencia ≥ 105,00% en la menor concentración
evaluada: a). 1µM. b) 6 µg/mL. c) 0,1 µM. ND: No determinada
DISCUSIÓN
Sobre las cinco líneas celulares se utilizó el agente antineoplasico Doxorrubicina HCl como
control positivo de citotoxicidad, encontrando un descenso en el porcentaje de supervivencia
proporcional al aumento de la concentración (Tabla IV), todas las líneas celulares mostraron ser
sensibles al compuesto antitumoral con valores de CI50 dentro del intervalo de 0,48 a 8,44µM
(Tabla V), indicando la adecuada sensibilidad de las líneas celulares a productos xenobióticos, y
por tanto ser un adecuado control positivo para este tipo de valoraciones. A pesar de que se ha
reportado resistencia en líneas celulares tumorales de mama por parte de doxorrubicina (27) la
línea más sensible en este estudio fue MDA-MB231 con una CI50 de 0,48 µM (480 nM), dato
que no difiere de lo reportado por otros autores (28) con CI50 dentro del orden de 343.3nM.
Parra Forero D.
Como control negativo de actividad citotóxica se empleó el control de crecimiento celular
(células con medio DMEM F-12) en todos los ensayos. Además del control Positivo y negativo,
se utilizó el DMSO como control interno de viabilidad celular, ya que fue el vehículo para
preparar las soluciones Stock de los compuestos evaluados en este estudio; se aseguró que la
concentración en el ensayo no sobrepasara el 0,01% en ninguna de las concentraciones evaluadas,
puesto que ha concentraciones mayores puede resultar citotóxico. Se encontró en este estudio que
a esa concentración, el DMSO no interfería en la actividad observada para los compuestos
ensayados.
Los resultados muestran, bajo las condiciones de ensayo que los derivados de compuestos de
coordinación presentaron actividad citotóxica dosis dependiente. Se evaluaron en total seis
compuestos de coordinación y se conoce la estructura de únicamente cuatro: D, D3, D4 y D5
(Figura I), se sospecha que los otros dos, D1 y D2, son el mismo compuesto D4, que posee una
ruta sintética y forma cristalina diferente (D1) y un patrón de hidratación distinto, que al parecer
es la forma deshidratada (D2) (29). Se observa que la línea celular más sensible a este tipo de
compuestos, es la línea celular MDA-MB231 (Tabla V), donde todos los compuestos presentaron
actividad.
Los eventos responsables de la reducción de la viabilidad celular de esta clase de compuestos aun
no han sido establecidos por completo, al parecer perturban el funcionamiento de una amplia
variedad de sistemas biológicos (30), inhiben la síntesis de ADN en una relación dosis
dependiente, que no parece estar mediada a través de Intercalación (31) al contrario de lo que
ocurre con el control positivo. Estos complejos además alteran la función mitocondrial al inducir
el stress oxidativo incluyendo la retracción del citoplasma, la fragmentación nuclear (32).
19
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
Figura I. Estructura química de los compuestos de coordinación de plata y
de cobre evaluados.
El compuesto D: [Ag(phen)2]SalH, (Figura I) es un nuevo complejo de plata con ligandos
salicilato y 1,10-fenantrolina ambos de actividades biológicas comprobadas, tanto analgésica
como antifúngica, respectivamente (33, 34), diseñado con el objeto de obtener un compuesto de
mayor biodisponibilidad conociendo que los principales inconvenientes de los complejos de
plata, son su baja solubilidad en medio acuoso y el efecto de cargas eléctricas sobre los ligandos.
Los resultados para este compuesto (D) indican una promisoria actividad antitumoral, como lo
reflejan los valores de IC50 (Tabla V) que en la mayoría de líneas celulares fue de una magnitud
similar al control positivo doxorrubicina. Todo el panel de células tumorales humanas fue
sensible a este compuesto, siendo las líneas más sensibles: Hep G2, A549 y PC-3; y la más
resistente HT-29, lo que sugiere una relativa selectividad de citotoxicidad en el panel de células
evaluado. En comparación con los otros compuestos de coordinación, se aprecia una actividad
citotóxica diferencial (Figura 2) entre los compuestos con ion acomplejante de plata y de cobre.
Parra Forero D.
Se observa que los compuestos más activos en todas las líneas, son los que poseen plata en su
estructura D y D5, [Ag(Phen)2]SalH y [Ag2(SalH)2] respectivamente, siendo más potente el
compuesto nuevo [Ag(Phen)2]SalH, por tener valores de CI50 de magnitud similar al control
positivo doxorrubicina, que puede ser indicativo de la importancia de la presencia del núcleo
fenantrolina (Phen) para la actividad citotóxica. Esta hipótesis pudo corroborarse haciendo la
comparación entre D3 y D4, [Cu(sal)(Phen)] y [Cu(SalH)2(H2O)2] respectivamente, en donde se
observa mayor actividad citotóxica en el complejo de cobre que contiene fenantrolina. Además,
es posible que exista una relación molar del núcleo de fenantrolina en la actividad, puesto que la
relación molar del fenantrolina de D respecto a D3 es 2 a 1. En cuanto a la influencia del ion
complejante sobre la actividad, en primer lugar se compararon los compuestos que no poseían el
anillo de fenantrolina D4 y D5, cada uno complejado con iones diferentes encontrando que el
compuesto que contiene el ion plata D5 genera mayor actividad citotóxica respecto al que posee
cobre D4. De igual manera se realizó la comparación entre los compuestos que poseían el núcleo
fenantrolina D y D3, llegando a la misma conclusión. Lo anterior sugiere que la promisoria
actividad del nuevo compuesto [Ag(Phen)2]SalH es debida tanto a la presencia del ion Plata,
como del núcleo químico fenantrolina en la estructura. El incremento de la actividad por la
presencia del ion plata puede deberse a la carga neta del complejo, conllevando a un aumento en
la biodisponibilidad del núcleo [Ag(phen)2]+ que le permite interaccionar de una manera efectiva
con la membrana para ingresar más fácilmente a la célula. Por otro lado la adición de fenantrolina
podría generar una mayor interacción tipo hidrofobica entre el policiclo y las bases del ácido
nucleíco del DNA, partiendo del supuesto de que el mecanismo de acción sea por una interacción
con el ADN.
21
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
Figura II. Porcentaje de viabilidad celular de los compuestos de coordinación, para las cinco líneas celulares tumorales. Valores
expresados como Promedio ± ESM, de dos experimentos independientes por triplicado. (*) Significativamente diferente respecto al
control de viabilidad DMSO (P<0,05)
Parra Forero D.
La evaluación de la recuperación celular para el compuesto D, luego de las 48 horas de retirar el
tratamiento se refleja una disminución de supervivencia celular para las líneas celulares. Esto nos
sugiere que la acción del compuesto evaluado es citotóxica y no citostática, porque las células no
pudieron recuperarse en el tiempo posterior al tratamiento.
Se observó un efecto proliferativo significativo (% de supervivencia superiores al 105%) a
concentraciones bajas para el compuesto D3- [Cu(sal)(Phen)] en las líneas celulares PC-3 y HT29, y para el compuesto D5 [Ag2(SalH)2] en todas las líneas evaluadas (Tabla VI). Este fenómeno
es posible explicarlo a través del efecto hormético o hormesis descrito por varios autores (35, 36)
como un patrón de dosis-respuesta a algunos productos químicos tóxicos observado en distintos
tipos celulares, caracterizado por una estimulación de la proliferación a dosis bajas y una
inhibición a dosis altas, su mecanismo molecular aún no está claro y aún no se ha establecido si
es un fenómeno universal que afecta a todos los tipos de células(37), este efecto ha sido
relacionado con proliferación celular y por lo tanto está implicado en la carcinogénesis (38).
Los derivados quinoidales fueron otro grupo de compuestos evaluados que presentaron una
promisoria actividad citotóxica, representaban la mitad de los compuestos evaluados en este
trabajo. La información sobre las estructuras de los compuestos evaluados fue limitada por la
entidad que los suministró, por lo que se realizó un análisis general con la información otorgada.
Existen muchas clases de quinonas dependiendo de la complejidad de la estructura básica, siendo
de menor a mayor complejidad: benzoquinonas, naftoquinonas y antraquinonas, en esta
investigación se evaluaron naftoquinonas y derivados (Figura III). Desde hace ya más de tres
décadas se conoce el potencial antitumoral de este tipo de compuestos es así como varios agentes
quimioterapéuticos contra el cáncer utilizados en la actualidad poseen ese núcleo, entre ellos la
23
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
doxorrubicina (39), el control positivo de este estudio. A pesar de su amplia investigación aun no
se ha encontrado el mecanismo de toxicidad, pero existen dos propuestas una está relacionada
con la habilidad de la porción quinónica de la molécula de aceptar electrones para formar un
anión radical o una especie dianionica, que estimulan intracelularmente la producción de
radicales libres y especies reactivas de oxigeno y como resultado del estrés oxidativo se dañan
membranas proteínas, y también el ADN, de esta manera puede conllevar a la apoptosis; la
segunda propuesta se basa en la capacidad de interactuar con el ADN y alquilarlo (40,41). Las
Naftoquinonas y sus derivados se siguen estudiando por todas las actividades biológicas que se
han descubierto: actividad antibacteriana, antifúngica, antitumoral, actividad antimalarica y
antioxidante (42, 43, 44, 45).
Figura III. Estructura química de naftoquinonas y derivados evaluados. A). Naftoquinonas
sustituidas. B). Furano naftoquinonas. C). Pirrol naftoquinonas
En este estudio se evaluaron 24 derivados de naftoquinonas, 10 naftoquinonas sustituidas, 11
furano naftoquinonas, y 3 pirrol naftoquinonas. Luego de la valoración citotóxica bajo las
condiciones experimentales se encontraron 16 compuestos con actividad promisoria, con CI50
dentro de un rango de 1,31 µM a 10 µM, la mayoría menores a 5 µM (Tabla V), y en algunos
Parra Forero D.
casos se reporta menor a 1 µM, siendo las líneas celulares más sensibles: Hep-G2, A549 y MDAMB231 resultados que confirman lo reportado por otros autores (40, 45, 46, 47) sugiriendo una
relativa selectividad de estos compuestos. Por otro lado, las líneas tumorales más resistentes del
panel fueron PC-3 y HT-29.
El grupo de las pirrol naftoquinonas (Figura III. C.) solo presentaron actividad en la línea celular
carcinoma hepatocelular (Hep-G2) donde fue sensible a dos de los tres derivados, siendo
compuestos promisorios por su alta selectividad, que in vivo posiblemente pueda disminuir la
incidencia de efectos secundarios observados en compuestos que no son tan selectivos y aún se
utilizan en terapéutica. El grupo responsable de la actividad es el núcleo naftoquinonico (48), se
reporta que tanto 1,2- y 1,4-naftoquinonas fusionadas con un anillo furano o pirano incrementan
en muchos casos la citotoxicidad en células tumorales (49). Una de las líneas celulares más
utilizadas en estudios de biotransformación es Hep G2, porque expresa enzimas activas como
CYP1A, CYP3A4 y UGT involucradas en el metabolismo de varios xenobióticos (50); no se
descarta el hecho de que las pirrol naftoquinonas sean bioactivadas por las enzimas de HepG2
para ejercer su actividad antitumoral, hipótesis que se basa en que estos compuestos no fueron
activos en el resto del panel celular y se reporta que varias quinonas necesitan de bioactivación
para ejercer su actividad (51,52)
Los resultados obtenidos bajo las condiciones experimentales para el grupo de naftoquinonas
sustituidas (Figura IV) muestran que las líneas más sensibles fueron Hep G2 y A549. El
compuesto RC8 presentó actividad en Hep G2 únicamente, por lo que probablemente también
requiera bioactivación. Se observa una actividad citotóxica diferencial para las naftoquinonas
sustituidas en las posiciones 2 y 3 (RC3, RC8 y RC10) y que contienen en su estructura un éter
25
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
ciclico o epóxido fusionado (RC2 y RC5) (Figura V). Estos compuestos sugieren la importancia
en actividad citotóxica de los compuestos di o mono sustituidos en posiciones 2 y 3, como se ha
reportado para el lapachol (40), que pueden actuar como liberadores de electrones y como
consecuencia, la capacidad de enlace de hidrógeno es mayor y permite que el compuesto se una
con más fuerza a su lugar de acción. (53). El orden de actividad fue RC10>RC3>RC8, lleva a
pensar que la presencia de átomos de carbono en los sustituyentes puede dar lugar a perdida de la
actividad, recordando que debe haber un balance hidrofilico-hidrofobico para una adecuada
actividad, es así como se ha reportado que el exceso sustituyentes alquilo, diez o más átomos de
carbono da lugar a la pérdida de actividad en estos compuestos (54). RC5 y RC2 fueron más
activos que los anteriores, por lo tanto el epóxido puede influir en un aumento de la actividad.
Figura IV. Estructura química de naftoquinonas sustituidas evaluadas.
Parra Forero D.
Los derivados naftoquinonicos 5 y/o 8 sustituidos (P1, P3, P4 y P5) y sin sustituir (P2), en
general no presentaron actividad en el panel de líneas evaluadas, por lo que se sugiere que la
actividad de la naftoquinonas, se suprime cuando son sustituidas en esta posiciones sin importar
los grupos químicos que hagan la sustitución. Se ha reportado que para análogos del compuesto
sin sustituir P2, del 8 hidroxilado P3, y del 3 alquilado P4, no presentan actividad citotóxica
sobre carcinoma Walter 256, (48) sin embargo, se ha reportado actividad antitumoral para 5-8
Viabilidad Celular (Porcentaje)
dihidroxisustituidos (53)
100
**
RC3
***
RC8
***
***
***
***
50
RC10
***
***
***
RC2
***
***
***
***
RC5
***
***
0
DMSO
10
5
1
10
5
1
Concentration (M)
Figura V. Porcentaje de viabilidad celular de naftoquinonas que presentaron actividad en la línea
celular Hep G2. Valores expresados como Promedio ± ESM, de dos experimentos independientes
por triplicado. (*) Significativamente diferente respecto al control (P<0,05)
El grupo más potente de las naftoquinas, fue el de las furanonaftoquinonas (Figura VI), al
obtener valores más bajos aproximados de CI50 que los anteriores grupos, en algunos casos
menores a 1 µM como en los compuestos RC18 y RC19. En general todas las líneas fueron
sensibles a este grupo de compuestos, se ha reportado actividad para análogos de
furanonaftoquinonas en A549 y PC3 (44). Los compuestos de este grupo que presentaron menor
actividad fueron RC12, RC15 y RC16 donde a la concentración más alta el % de supervivencia
27
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
Figura VI. Estructura química de Furano naftoquinonas sustituidas evaluadas.
estaba alrededor del 60%. Esto sugiere que las 1, 4 Furanonaftoquinonas mono sustituidas con
anillos aromático, o con grupos esteres pierden actividad (Figura VII). Se observó que RC15 fue
activa para un mayor número de líneas celulares respecto a RC16 y RC12, por lo que se deduce
que el anillo aromático presente en estos últimos compuestos puede darle una actividad selectiva,
que se ha reportado también para otros análogos (55) Sin embargo pasa lo contrario con las 1,2
furanonaftoquinonas, en donde no se observa tanta selectividad con la presencia del anillo
aromático (RC13), y si se observa con la sustitución alquílica (RC18). En cuanto a los
compuestos di sustituidos RC4, RC6 y RC17, el compuesto con menor actividad fue RC6 quizás
por un inadecuado balance hidrófilo-hidrófobo como se había descrito anteriormente, ya que los
dos sustituyentes son alquenos y alcanos. No es posible establecer una comparación diferencial
Parra Forero D.
entre RC4 y RC17 porque fueron activos en líneas celulares distintas, sin embargo es evidente
que los compuestos mono sustituidos o sin sustituir son más activos que los di sustituidos, es el
caso de RC19 y RC20 que presentaron una actividad citotóxica promisoria, RC19 fue más
potente que RC20, inclusive en algunas líneas más potente que el control positivo de
doxorrubicina, sugiriendo que un grupo polar en esta posición en el anillo furano puede aumentar
considerablemente la actividad, así como se ha reportado para otros derivados (54). Sin embargo
estos compuestos (así como varias quinonas evaluadas en este estudio) presentan en varias líneas
el efecto de hormesis en la concentración de 1µM, por lo que posiblemente sean carcinogénicas
Viabilidad Celular (Porcentaje)
(Tabla VI) algunas ya han sido reportadas mutagénicas (56)
100
***
***
***
***
50
RC12
RC19
RC20
RC13
RC18
***
***
***
***
***
0
Concentración (M)
Figura V. Porcentaje de viabilidad celular de furanonaftoquinonas que presentaron actividad en
la línea celular MDA-MB231. Valores expresados como Promedio ± ESM, de dos experimentos
independientes por triplicado. (*) Significativamente diferente respecto al control (P<0,05)
Los resultados de recuperación celular para los tratamientos con quinonas, en general, muestran
que ninguna de las células (de las cinco líneas tumorales) se recuperó luego de un tiempo de
29
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
recuperación de 48 horas posterior al tratamiento, reafirmando lo reportado (39) sobre el
mecanismo citocida de las quinonas.
Para los productos naturales ensayados, en general, ninguno de los extractos o fracciones mostró
actividad citotóxica significativa para las líneas de células cancerosas. Los productos de tomate
de árbol Ta1 y Tr1 mostraron moderados efectos citotóxicos en Hep G2, mostrando selectividad
en esa línea, sin embargo pueden requerir bioactivación, en tanto que sus fracciones no fueron
activas. Se observó el efecto de hormesis En Tr1 en la concentración mas baja ensayada. (Tabla
V)
Figura VI. Estructura química de Furano naftoquinonas sustituidas evaluadas.
Parra Forero D.
Los resultados muestran, que bajo las condiciones de ensayo tanto los derivados de benzamidas,
como los análogos de purinas no presentaron actividad citotóxica en el panel de líneas tumorales
ensayadas
Esta investigación y sus resultados resaltan la importancia de continuar con este tipo de estudios
de tamizaje para encontrar nuevas moléculas con potencial actividad antitumoral, es necesario
que posteriormente se sigan con estudios que evalúen el mecanismo de acción para los productos
con actividad citotóxica promisoria, para darle continuidad a la búsqueda de nuevos principios
activos. Se logro asociar el tipo de valoraciones in vitro junto con análogos estructurales de un
mismo compuesto permiten hacer una aproximación al grupo farmacofórico responsable de la
actividad antitumoral, como el caso de los compuestos de coordinación de plata, fenantrolina y
salicilato.
A los compuestos que presentaron el efecto hormético, resultaría interesante realizar los estudios
para detectar productos con potencial carcinogenicidad, utilizando ensayos como el de
genotoxicidad in vitro utilizando células de linfoma de ratón, para comprobar si se tratan de
compuestos genotóxicos, de ser así, las valoraciones de citotoxicidad en concentraciones bajas
podrían ser una aproximación de genotoxicidad. Así mismo es importante realizar el ensayo de
genotoxicidad para los compuestos con actividad promisoria como un paso más hacia la
búsqueda de nuevos fármacos antitumorales, puesto que este tipo de ensayos hace parte de la
batería de ensayos pre-requisito para la aprobación de nuevos medicamentos.
Se recomienda ensayar los compuestos en líneas celulares normales como Fibroblastos, ensayo
que permitirá determinar la selectividad de los compuestos hacia las células tumorales y no hacia
tejidos normales, mediante el cálculo del índice de selectividad.
31
Evaluación in vitro de actividad antitumoral
Gracias a la nutrigenómica, en la actualidad se sabe que existen compuestos de origen natural que
han sido asociados a efectos citoprotectores y anticarcinogénicos. Se recomienda para los
productos naturales evaluados realizar estudios de citoprotección, puesto que no se observaron
efectos citotóxicos en este estudio y posiblemente posean efectos citoprotectores, que prevengan
un proceso carcinogénico. También son importantes realizar los estudios de los mecanismos
moleculares por los cuales estos componentes pueden ejercer sus efectos citoprotectores
AGRADECIMIENTOS
Al Profesor Fabio Aristizabal por haberme dado la oportunidad y la confianza de realizar esta
investigación. Al grupo de investigación de Farmacogenética del Cáncer del Departamento de
Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia y a Yanet Cecilia Ocampo por su constante
apoyo en el desarrollo de este trabajo. Al grupo de investigación de
Productos Naturales
Vegetales del Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia, al Grupo de
Ensayos Biológicos de la Universidad de Cartagena, a los químicos Daniel Moyano, Liz Murcia
y Martin Estrada por el suministro de los compuestos para la evaluación.
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