(Guion-Respiración mitocondrial)

Respiración mitocondrial (Nov-08)-1
RESPIRACIÓN MITOCONDRIAL
Una de las metodologías posibles para determinar la respiración celular o mitocondrial es cuantificar el
consumo de oxígeno en preparados de células o mitocondrias. Esta cuantificación se puede realizar mediante diferentes
técnicas; una de las más sencillas es el electrodo un oxígeno.
ELECTRODO DE OXÍGENO
El electrodo de oxígeno comprende un cátodo de platino central (B) unido a una resina y un ánodo de plata (C)
concéntrico unido por un puente electrolítico y conectados al módulo control.
La cámara del electrodo es preparada por aplicación de un espaciador de papel muy fino y una fina membrana
de poli-tetra-fluor-etileno (P.T.F.E.) que es cuidadosamente fijada a la placa base donde se encuentran los electrodos
por un anillo-O. En la presencia de oxígeno una pequeña corriente fluye a través de los electrodos que es proporcional a
la concentración de oxígeno en la muestra. Esta señal es digitalizada por la unidad de control y presentada directamente
en el PC.
Estos electrodos pueden ser acondicionados para medidas en fase líquida o en fase gaseosa; aquí vamos a
medir en fase líquida.
Todas las unidades del electrodo deben mantenerse a temperatura constante durante las determinaciones. Este
efecto se consigue por circulación de agua a la temperatura deseada alrededor de la cámara y controlando la temperatura
de los componentes de la muestra. Este control es importante por dos razones:
1º.- El electrodo es sensible a la temperatura
2º.- El contenido en oxígeno de las muestras acuosas saturadas de aire cambia con la temperatura.
Variación con la temperatura del contenido de oxígeno en una muestra de agua saturada con aire a presión estándar.
TEMPERATURA ºC
0
5
10
15
OXÍGENO (nmol/mL)
442
386
341
305
TEMPERATURA ºC
20
25
30
35
OXÍGENO (nmol/mL)
276
253
230
219
Durante la medida, el electrodo consume una pequeña proporción del oxígeno disponible. Para evitar registrar
un declive en la señal debido a este artefacto, las muestras deben estar continuamente en agitación de forma que la capa
de líquido, situada encima del disco del electrodo, sea constantemente repuesta en oxígeno.
CALIBRACIÓN DEL ELECTRODO
Se realiza en los siguientes pasos:
1º.- Nivel máximo de oxígeno: añadir agua destilada y mantenerla en constante agitación para que ajuste el 100% del
registro (253 nmoles de O2 /ml).
2º.- Nivel mínimo de oxígeno: añadir ditionito (Na2S2O4, una punta de espátula) para reducir el O2. Enroscar el émbolo
hasta enrasarlo con el líquido dentro de la célula, cuidando que quede sin burbujas y mantener la agitación
(ajustar el 0% del registro).
Lavar muy bien la cámara con H2O destilada antes de su uso con muestras.
Observaciones: El baño de agua debe estar a temperatura constante. La membrana debe mantenerse húmeda.
EXTRACCIÓN DE MITOCONDRIAS DE HÍGADO o de otros tejidos
REACTIVOS:
• Solución STE: 250 mM sacarosa
1 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
• Solución ST: 250 mM sacarosa
1 mM Tris-HCl
pH= 7.4
pH= 7.4
Respiración mitocondrial (Nov-07)-2
MÉTODO de extracción
-Pesar la muestra de tejido hepático, renal, corazóm, cerebro, etc..
-Trocear el tejido y homogeneizarlo en un potter con STE al 20 % (peso / volumen) (i.e., 1g / 5 ml)
-Poner el homogeneizado en tubos de centrífuga y equilibrar antes de centrifugar.
-Centrifugar a 600 g (2 000 rpm, aprox.) durante 10 mi. a 4º C. Recoger el sobrenadante en tubos eppendorf.
-Centrifugar a 12 000 g durante 5 min. a 4º C. Recoger el sedimento con las mitocondrias y someterlas a 3 lavados
consecutivos:
• 2 lavados con STE a 12 000 g, 5 min.
• 1 lavado con ST a 12 000 g, 5 min.
Al sedimento de mitocondrias añadirle 1 mL de ST, resuspenderlas y determinar la concentración de proteínas en la
suspensión mitocondrial, como referencia de la concentración de mitocondrias.
MEDIDA DE LA RESPIRACION MITOCONDRIAL
REACTIVOS:
• Solución de respiración
MgCl2
Na2HPO4
EGTA
MOPS
Manitol
1 mM
3 mM
2 mM
10 mM
240 mM
pH =7.5
EGTA = ácido etilenglicol-bis-(β-aminoetiléter)N, N, N’, N’-tetraacético
MOPS = ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico.
Rotenona, se usa en pequeñas cantidades, aprox. 4 µg.
Succinato sódico
500 mM
ADP
10 mM
PCBs, Aroclor-1248 a 33.33 mM
ESQUEMA DE LA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRÓNICO MITOCONDRIAL, con algunos inhibidores.
Rotenona
Amital
Antimicina A
Oligomicina
Azida sódica
CO, CN-
TABLA DE INHIBIDORES Y DESACOPLANTES DE LA RESPIRACIÓN Y LA FOSFORILACIÓN OX.
INHIBIDORES
DESACOPLANTES
Reactivos químicos
Cianuro,
CO,
azida,
anilinas, 2,4-dinitrofenol,
benzonitrilo,
malonato, 2-Br-hidroquinona
pentaclorofenol, benzoquinonas
Fármacos
Doxorrubicina, Menadiona, Amital, Dicumarol,
salicil-anilidas,
Antimicina A
Valinomicina, Gramicidina, halotano
Contaminantes
ambientales
PCBs, herbicidas difenil-eter
triazínicos, Rotenona, CO
y DDT, PCBs, Halofenoles, herbicidas
dinitrofenoles
Respiración mitocondrial (Nov-07)-3
PCBs
Nitro-fenol
Rotenona
MÉTODO de medida del oxígeno consumido:
Las determinaciones de los consumos de oxígeno (nmoles de O2 /ml/min) se efectuarán en las siguientes
condiciones:
1ª.- Respiración basal.- Se disponen en la cámara:
0.800 mL de la solución de respiración
0.200 mL de suspensión mitocondrial (correspondiente aprox. a 1 mg de proteínas)
Colocar el émbolo y registrar el consumo de oxígeno (nmoles de O2 /ml) a lo largo del tiempo, manteniendo la agitación
continua.
2ª.- Inhibición de la respiración por Rotenona (inhibidor entre el complejo I y la Ubiquinona).Añadir a la muestra en respiración basal una punta de espátula de Rotenona. Colocar el émbolo y
registrar el consumo de oxígeno (nmoles de O2 /ml) manteniendo la agitación continua.
3ª.- Respiración en presencia de succinato (sustrato respiratorio del complejo II, succinato-DH):
Añadir a la muestra anterior 100 µL de succinato sódico 0.5 M (aprox. 50 mM o 50 µmoles de
succinato en el medio). Colocar el émbolo y registrar el consumo de oxígeno (nmoles de O2 /ml) manteniendo la
agitación continua.
4ª.- Estimulación de la respiración por ADP:
Añadir a la muestra anterior 100 µL de ADP 10 mM (aprox. 1 mM o 1 µmol de ADP en el medio de
respiración). Colocar el émbolo y registrar el consumo de oxígeno (nmoles de O2 /ml) manteniendo la agitación
continua.
5ª.- Inhibición de la respiración por PCBs (actúan a nivel del complejo III):
Añadir a la muestra anterior 50 µL de soluciones de diferentes PCBs. Colocar el émbolo y registrar el
consumo de O2 (nmoles de O2 /ml) manteniendo la agitación continua.
TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS:
1ª.- Calcular la velocidad del consumo de oxígeno en nmoles de O2 / ml / min (pendiente de las rectas) experimentado
por la suspensión mitocondrial en las diferentes situaciones ensayadas.
2ª.- Calcular los porcentajes de activación y / o inhibición de cada uno de los tratamientos con respecto a la situación
anterior y / o control. Solo, en el caso de que haya inhibición por Rotenona es interesante hacer los cálculos con
ambas referencias, sin inhibidor y con inhibidor.
3ª.- Explicar el comportamiento de las mitocondrias en cada una de las situaciones estudiadas, indicando donde y cómo
actúa cada uno de los compuestos estudiados.
4ª.- Comparar el comportamiento de las mitocondrias procedentes de los diferentes tejidos, si ha lugar.
Respiración mitocondrial (Nov-07)-4
PREVIOS
El electrodo hay que conectarlo a la red, con un alargador
El electrodo hay que conectarlo al ordenador; es necesario un adaptador de conexión.
El electrodo es conveniente calibrarlo y ensayarlo unos dias antes, para evitar problemas en el entrenamiento.
Las mitocondrias deben obtenerse cuidadosamente y evitar los cambios de temperatura.
RECABAR OTROS POLINUCLEARES Y/O INHIBIDORES
PRODUCTOS DE JARDIN: herbicidas, insecticidas, acaricidas, etc.