Ecología Microbiana

ECOLOGIA MICROBIANA
- Estudio de los microorganismos en su ambiente natural
-Ambiente es todo aquello que rodea a un organismo vivo.
- Por ejemplo los factores químicos, físicos y biológicos.
- Los microorganismos (MOs) son parte de comunidades
organizadas llamadas ecosistemas.
- Los MOs interactúan con el entorno y pueden cambiar en
forma marcada las características del mismo.
Desempeñan papeles importantes en la síntesis y
degradación de distintos compuestos.
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MOs autotróficos: generan materia orgánica a partir de CO2
MOs organotróficos: participan en la biodegradación y
reciclado de materia orgánica.
Se puede definir un ciclo biogeoquímico para los elementos
clave (C, N, S, Fe) en el cual los mismos sufren distintos
estados de óxido reducción a medida que se mueven a través
de un ecosistema.
Los MOs participan en las reacciones biogeoquímicas. Para
muchos elementos son los únicos capaces de generar los
compuestos clave capaces de ser utilizados por otros
organismos.
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Biodiversidad de los MOs
Ecólogo microbiológico
Actividades metabólicas y como interaccionan
Conocer aspectos cuali y
cuantitativos de la
microbiología de un
ecosistema
Da una idea del potencial
biogeoquímico en un ecosistema
Conocer las actividades
de los MOs en su
ambiente natural
- La existencia de MOs no implica que los mismos sean activos
-Solo los MOs activos tienen impacto ecológico.
-Medir la existencia de una determinada transformación bioquímica
específica implica que un grupo específico de bacterias existe y que
es metabólicamente activo.
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Células individuales
poblaciones
gremios
comunidades
Distintas poblaciones relacionadas metabólicamente forman
agrupaciones llamadas “guilds” o gremios.
La interacción de los gremios que llevan a cabo procesos fisiológicos
complementarios da lugar a la formación de una comunidad bacteriana
Las comunidades microbianas interactúan con comunidades de
macroorganismos para definir el ecosistema entero.
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Luz
Compuestos orgánicos
Energía
Ecosistema
Sustancias inorgánicas
Luz
organismos fototróficos, síntesis de materia
orgánica que contiene C, N, S, P, Fe
Muerte de los MOs y liberación de energía
de sus constituyentes químicos orgánicos
Materia orgánica
organismos quimioorganotróficos
(usan compuestos orgánicos como fuente de energía)
Sustancias inorgánicas
reducidas
organismos quimiolitotróficos
(organismos que obtienen energía de la oxidación de
compuestos inorgánicos)
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Comunidad microbiana en un ecosistema lacustre
6
En el lago tenemos tres
organismos fototróficos
comunidades microbianas
organismos quimioorganotróficos
(aerobios y aerobios facultativos)
organismos anaerobios
La ciencia de la microbiología ecológica tiene 2 objetivos:
1ro) el estudio de la biodiversidad de los MOs en la naturaleza y de
cómo los diferentes gremios interactúan en las comunidades
microbianas.
2do) medir las actividades de los MOs en la naturaleza y monitorear
sus efectos sobre los ecosistemas.
Hay muchos MOs que no se han descubierto aún. La medición de las
actividades microbianas en la naturaleza permite conocer el
funcionamiento metabólico de las comunidades microbianas aún si
conocemos poco acerca de los organismos que las componen
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LOS MICROORGANISMOS EN LA NATURALEZA
- Cualquier hábitat adecuado para el crecimiento de organismos
superiores puede también soportar el crecimiento de MOs. La
inversa no es válida.
-Los MOs pueden habitar la superficie de animales superiores y
en algunos casos pueden vivir dentro de plantas y animales. En
tales hábitat alcanzan grandes números y pueden ser
beneficiosos para las plantas o animales o ser patógenos de sus
respectivos hospedadores.
LOS MICROORGANISMOS Y EL MEDIO AMBIENTE
El crecimiento de los MOs
Los recursos nutricionales
en la naturaleza depende de
Las condiciones de crecimiento
- El nicho de un organismo en particular está definido por los recursos
nutricionales, la cantidad de los mismos, el pH, la temperatura, la
disponibilidad de agua, luz y oxígeno de su hábitat.
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-Cada organismo tiene un nicho primario o principal en el cual dicho
organismo es el mas exitoso.
- En la tierra existe un número innumerable de nichos microbianos
siendo éstos en parte los responsables de la gran diversidad metabólica
y de la biodiversidad de los MOs que tenemos en la actualidad.
- El hábitat de un MO es pequeño (está en relación al tamaño de los
MOs), pero pueden existir gradientes químicos y físicos en dicho hábitat
que afecten a los MOs.
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MICROAMBIENTE
Es donde el MO vive y metaboliza dentro de un hábitat.
Perfil de las concentraciones de
O2 en una partícula de suelo
En una partícula de suelo de 6 mm pueden
existir varios microambientes diferentes, tanto
físicos como químicos y pueden coexistir
distintos tipos fisiológicos de MOs. Los MOs
anaerobios podrían ser activos en el centro de
la partícula de tierra, los microaerófilos podrían
ser activos mas afuera y los aerobios obligados
podrían metabolizar en los 0,2 a 0,3 mm
externos de la partícula
Las condiciones fisicoquímicas en el microambiente pueden cambiar rápidamente en
función del tiempo y del espacio. La
respiración de los MOs o el incremento de
agua en el suelo pueden cambiar
drásticamente el gradiente de O2 a través del
micro medioambiente.
Conclusiones: Los microambientes son
heterogéneos. Las condiciones pueden cambiar
drásticamente. Una gran diversidad microbiana
puede existir en un área física relativamente
pequeña.
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NIVELES DE NUTRICIÓN Y VELOCIDAD DE CRECIMIENTO
- Los nutrientes entran al ecosistema en forma intermitente. A períodos de
gran abundancia le siguen períodos de escasez.
- Los MOs han diseñado mecanismos de defensa que les permiten acumular y
almacenar materiales de reserva en forma de polímeros. Por ej. Poli-betahidroxibutirato, alcanoatos, polisacáridos (glucógeno), polifosfatos, azufre
elemental, etc.
- La velocidad de crecimiento de los MOs en la naturaleza no es la óptima o la
velocidad máxima que se da en el laboratorio. Las bacterias del suelo
tienen una velocidad de crecimiento de aproximadamente 1% de la
velocidad máxima de crecimiento obtenida en el laboratorio.
Hábitat
Escherichia coli
en el intestino
en el laboratorio
Tiempo de duplicación
12 horas
20 minutos
La disminución de la velocidad de crecimiento en la naturaleza se debe a:
a) Baja disponibilidad de nutrientes
b) Distribución no uniforme de los nutrientes en el hábitat
c) Efectos competitivos con otros MOs.
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SUSTANCIAS DE RESERVA
(a) Estructura química del poli-β-hidroxibutirato
(PHB); (b) Microfotografía electrónica del bacilo
fototrófico Rhodospirillum sodomense.
Microfotografía de campo claro del
bacilo púrpura del azufre Chromatium
buderi.
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COMPETENCIA Y COOPERACIÓN MICROBIANA
La competencia por los recursos disponibles en la naturaleza es muy
intensa y el resultado depende de:
a) La tasa de incorporación de los nutrientes
b) Las tasas metabólicas inherentes a cada MO
c) La velocidad de crecimiento
- En algunos casos de competencia microbiana, un MO puede inhibir el
crecimiento de otros, por ej. con la producción de antibióticos o de
productos tóxicos (Ej. el ácido producido por la fermentación de
azúcares).
- En algunos casos los MOs colaboran para llevar a cabo una
transformación determinada que ninguno de ellos puede llevar a cabo
por si solos. Esto se llama sintrofía. Los organismos que participan
deben convivir en un mismo microambiente ya que el producto del
metabolismo de uno de ellos debe ser de fácil acceso para el otro.
Estas interacciones son cruciales para el éxito competitivo de algunas
bacterias anaeróbicas.
Otro ejemplo de relaciones cooperativas son por ej. el metabolismo
complementario entre las bacterias nitrosificantes y las nitrificantes
para oxidar el amoníaco a nitrato. Otro ej. son las bacterias reductoras
de sulfato y oxidantes de sulfuro.
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Sintrofía: proceso por el cual dos o mas MOs cooperan
en la degradación de una sustancia que no pueden
degradar por sí solos.
En la mayoría de los casos, en la reacción sintrófica
interviene el H2, que es producido por un miembro de la
relación sintrófica y consumido por el otro. Por este
motivo la sintrofía es conocida también como
transferencia interespecífica de H2. El organismo que
consume el H2 puede ser por ej. bacterias sulfato
reductoras, homoacetógenos, metanógenos, bacterias
desnitrificantes, etc. Las reacciones sintróficas son
características de transformaciones anaeróbicas y se dan
en hábitat anóxicos.
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Fermentación de etanol a metano y acetato por la acción
sintrófica de una bacteria que oxida el etanol y una
bacteria que consume el H2 producido por la primera.
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SUPERFICIES Y BIOFILMS
-Las superficies absorben nutrientes
-Son hábitats microbianos importantes
-La concentración de los nutrientes es muy superior en las superficies
respecto a la del medio que la rodea
-La tasa metabólica y de crecimiento de los MOs aumenta mucho en las
superficies
-La concentración de MOs que crecen en las superficies suelen ser mucho
mayores que las que se encuentran en el medio líquido
Existen técnicas sencillas de tinción de poblaciones microbianas adheridas
a una superficie sólida para medir la velocidad de crecimiento de MOs, por
ej. La tinción con naranja de acridina y posterior observación por
microfotografía fluorescente
La superficie de adherencia puede ser también un nutriente o materia
orgánica o inorgánica que los MOs adheridos catabolizan directamente de
la superficie de la partícula
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SUPERFICIES Y BIOFILMS MOSTRANDO MICROCOLONIAS
BACTERIANAS
Microfotografía fluorescente de una
comunidad microbiana natural
colonizando raíces de plantas en el
suelo. Obsérvese el desarrollo de la
microcolonia. La preparación se ha
teñido con naranja de acridina
Microcolonias bacterianas desarrollándose
sobre un portaobjetos inmerso en agua de
un arroyo. Las partículas brillantes son
materia mineral. Las células cortas de
forma bacilar miden unos 3 µm de largo.
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COLONIZACIÓN
-La mayor parte de los MOs crecen sobre superficies adheridos
por medio de polisacáridos bacterianos, secretados por las
mismas bacterias.
-Los biofilms atrapan nutrientes y en medios fluidos impiden que
los MOs se desprendan
-Los biofilms tienen importancia en medicina y en las industrias
-Las bacterias contenidas en biofilms pueden escapar al ataque
del sistema inmunitario de los organismos
-Los implantes médicos pueden convertirse en el lugar de
desarrollo de biofilms que pueden contener MOs patógenos
-La placa dental es un biofilm típico que contiene bacterias
productoras de ácido láctico que es el causante de las caries
dentales
-En las industrias los biofilms pueden causar el entorpecimiento
del flujo de agua o de petróleo en los oleoductos
-Los biofilms pueden contribuir a la degradación de objetos
sumergidos, plataformas petroleras, barcos, instalaciones en la
costa, etc.
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LOS DIENTES Y LA PLACA DENTAL
-El diente está compuesto por una matriz de cristales de
fosfato de calcio (esmalte) y tejido vivo del diente
(dentina y pulpa)
-El diente influye en la naturaleza de la flora microbiana
(microbiota)
-En el 1er año de vida predominan en la boca las
bacterias anaeróbicas aerotolerantes así como
estreptococos y lactobacilos.
-Al aparecer los dientes hay un cambio marcado de la
microflora hacia los MOs anaeróbicos. Aparecen bacterias
adaptadas específicamente al crecimiento sobre las
superficies y hendiduras de los dientes
Colonización bacteriana
1-Formación de una película fina de glicoproteínas ácidas de la saliva sobre el
diente
2-Anclaje firme de células bacterianas. La colonización de ésta película por
crecimiento en forma de microcolonias es muy específica y se llama placa dental.
Caries dentales
Es el resultado del aumento de la placa dental y de la formación de productos
ácidos, como el ácido láctico producido por la fermentación de los azúcares, que
provoca la descalcificación del diente.
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Una vez que ha comenzado la rotura del tejido duro, tiene lugar la proteólisis de
la matriz del esmalte dentario bajo la acción de las enzimas proteolíticas liberadas
por las bacterias.
El flúor en la matriz del cristal de fosfato de calcio hace que la matriz sea mas
resistente a la descalcificación por el ácido.
Se han implicado dos MOs en las caries dentales. Streptococus sobrinus y
Streptococus mutants. Ambas bacteria son productoras de ácido láctico.
S. sobrinus tiene una gran afinidad específica por las glicoproteínas de la saliva y
se adhiere firmemente a las superficies lisas del diente colonizándolo.
S. mutants se encuentra principalmente en la hendiduras y fisuras pequeñas y su
capacidad para fijarse a ambas superficies es el resultado de la producción de un
polisacárido de dextrano que es extraordinariamente adhesivo. S mutants
produce dextrano únicamente cuando existe sacarosa, mediante la enzima
dextransacaridasa.
n sacarosa
(glucosa)n + n fructosa
dextrano
Distribución de la placa dentaria utilizando un agente
de revelado en un diente cepillado (arriba) y sin
cepillar (abajo). Los números expresan el área total de
la placa dentaria al día 1 (1436 mm2) y al día 10
(22522 mm2).
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Microcolonias bacterianas que crecen sobre una superficie dentaria artificial insertada
en una boca durante (a) 6 hs ; (b) a mayor aumento la misma preparación que se
muestra en (a).
Obsérvese la diferencia morfológica
de los organismos presentes y el
material viscoso, indicado con flechas,
que “sujetan” a los microorganismos.
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22
METODOS EN ECOLOGIA MICROBIANA
Interesan dos aspectos en la ecología microbiana
1) La biodiversidad, es decir qué MOs y en qué número
se encuentran en un determinado hábitat.
2) La actividad microbiológica, o sea como afecta la
presencia de un determinado MO al ecosistema.
Esto se puede llevar a cabo realizando las siguientes
actividades:
•Análisis de las comunidades microbianas
dependientes de cultivos.
•Análisis molecular de las comunidades microbianas.
•Medición de las actividades microbianas en la
naturaleza.
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Análisis dependientes de cultivos:
enriquecimiento y aislamiento.
- En la naturaleza los microbios existen en
cultivos mezclados llamados comunidades
microbianas.
- Para aislar y estudiar un organismo
particular los microbiólogos utilizan técnicas
de enriquecimiento.
- Se usan medios y condiciones de incubación
que seleccionan a un organismo particular y
contra-seleccionan a los organismos no
deseados.
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Ejemplo: el método de Beijerinck Martinus
(microbiólogo holandés) a quien se deben las
primeras técnicas de cultivo de enriquecimiento
para aislar la bacteria fijadora de nitrógeno
Azotobacter.
Azotobacter puede crecer rápidamente fijando N2 del
aire, los medios de enriquecimiento carentes de
amoníaco u otras formas de nitrógeno fijado son muy
selectivos para este organismo; las bacterias no
fijadoras de nitrógeno o las bacterias fijadoras de
nitrógeno anaeróbicas son contra-seleccionadas con este
método.
25
Aislamiento de Azotobacter
26
ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO.
La columna de Winogradsky:
. Se usa para aislar y enriquecer en bacterias fototróficas
púrpuras y verdes, bacterias reductoras de sulfato, y
muchos otros anaeróbios.
. Es un sistema anóxico en miniatura.
. Se prepara llenando aproximadamente por la mitad un
cilindro de vidrio grande con un lodo rico en materia
orgánica.
. El lodo es cubierto con agua de un lago, embalse o
acequia y se tapa.
. Se coloca cerca de una ventana donde recibe luz solar
atenuada y se deja varias semanas.
27
Columna de Winogradsky
Agua de pozo
o lago
Lodo
suplementado
con nutrientes
orgánicos y
sulfato de
calcio y
carbonato de
calcio
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Se desarrolla una mezcla de organismos
- Cianobacterias y algas en el tope (zona oxigénica).
- Proceso de descomposición en el lodo o sedimento
produce productos adecuados como ácidos orgánicos,
alcoholes y H2, sustratos adecuados para las bacterias
reductoras de sulfato.
- El sulfuro producido a partir del sulfato gatilla el
desarrollo de las bacterias verdes o púrpuras del azufre.
Se toman muestras de la columna a profundidad para
obtener muestras de cultivos anaeróbicos.
- La columna de Winogradsky se ha usado para enriquecer
diversos procariotas, tanto aerobios como anaerobios. Una
vez que se ha establecido un enriquecimiento, se puede
intentar obtener cultivos axénicos.
29
SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO
En el laboratorio, el organismo que está mejor adaptado
a las condiciones in vivo podría crecer mas rápido y
convertirse en el organismo dominante.
Típicamente, el organismo más apto in vivo es solo un
componente minoritario del ecosistema.
La solución es la dilución del inóculo. Se cree que la
dilución elimina aquellas poblaciones minoritarias, pero
de crecimiento rápido dando de este modo la
oportunidad de desarrollarse a otros miembros de la
comunidad que tienen tiempos de duplicación mayores.
La dilución del inóculo es una práctica común en el
cultivo de enriquecimiento en la microbiología actual.
30
AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS O AXÉNICOS.
Los cultivos axénicos se pueden obtener a partir de cultivos de
enriquecimiento de varias maneras; los métodos más frecuentes son:
a) la siembra por estría en superficie (caja de Petri),
b) la siembra en profundidad (agar shake) y
c) la dilución en líquido.
-Siembra por estría en superficie.
Para aquellos MOs que crecen bien en medio sólido, este es el método
de elección. A partir de una población mixta se obtienen al estriarla
en superficie de agar colonias aisladas. Repitiendo con cada una de las
colonias aisladas este procedimiento se consigue un cultivo axénico que
puede ser transferido a un medio líquido.
-Siembra en profundidad o agar-shake
La dilución de un cultivo mixto en agar fundido da lugar a colonias
embebidas en el agar. Este método es útil para purificar anaeróbios.
Se hacen diluciones sucesivas seriadas para obtener cultivos puros.
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Métodos de cultivo axénico
Jarra anóxica. Una reacción química producida por
el contenido del sobre en el interior de la jarra
genera H2 + CO2. El H2 reacciona con el O2
presente en la jarra sobre la superficie de un
catalizador de paladio para formar H2O2. La
atmósfera final contiene N2, H2 y CO2.
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AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS.
El número más probable.
- Dilución serial de un inóculo en medio líquido hasta
que el tubo final en la serie no muestre crecimiento.
- Conocida como la técnica del número más probable
(NMP).
-Se usa para estimar el número de microorganismos en
alimentos, aguas residuales y otro tipo de muestras
donde el número necesita ser asignado en forma
rutinaria.
Utilizando diluciones seriadas de 10 en 10, el último tubo que muestre
crecimiento tiene que haberse originado a partir de 10 células o menos. Si
se repite este proceso varias veces se obtiene cultivos puros. Se pueden
usan medios altamente selectivos y condiciones de incubación dirigidos a
uno o a un pequeño grupo de organismos, como por ej. un determinado
patógeno, o medios complejos para obtener una estimación del número
total de células.
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Procedimiento de enriquecimiento por dilución de
extinción o análisis del número mas probable NMP
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- El último tubo que muestra crecimiento (en el ej. Es la
dilución 10-5) debe haberse desarrollado a partir de 10
células o menos.
- Para obtener cultivos axénicos se utiliza como inóculo la
mayor dilución que muestra crecimiento y se repite el
procedimiento.
- Para una estimación del número
de un tipo
determinado de bacteria en una muestra, el NMP se
define como la dilución más elevada que muestra
crecimiento. Si el medio utilizado fuera muy selectivo, por
ejemplo para bacterias reductoras de sulfato, se podría
concluir que para el caso mostrado en la figura hay entre
105 y 106 células recuperables de ese organismo por
gramo de muestra. Se hacen réplicas para mayor
exactitud y un blanco de dilución.
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CULTIVOS AXÉNICOS DE ALTA TECNOLOGÍA:
Las pinzas láser
- Las pinzas de láser consisten de un microscopio óptico
invertido equipado con un láser infrarrojo enfocado con
precisión y un instrumento de micromanipulación.
- Una célula individual del campo de visión es atrapada
por el haz de rayos láser y separada del resto de los
microorganismos contaminantes.
- Es un método útil para aislar bacterias de crecimiento
lento que pueden ser superadas por el crecimiento
rápido de otras poblaciones en los cultivos de
enriquecimiento típicos o para organismos presentes en
bajo número.
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Pinzas de láser para el aislamiento de bacterias.
(a) Principio de las pinzas ópticas.
Un haz de rayos láser fuertemente
enfocado sobre un objeto tan
pequeño
como
una
célula
bacteriana,
crea
fuerzas
de
radiación descendentes (Fa, Fb)
sobre la célula, que permiten su
desplazamiento
en
cualquier
dirección mientras esté sometida a la
fuerza del haz de rayos láser.
(b) Aislamiento. El haz de rayos
láser puede enfocarse sobre una
célula individual presente en la
mezcla de un tubo capilar, atraparla
óptimamente y separarla. Una vez
separada lo suficiente de las otras, el
capilar se corta, se desconecta el
láser y la célula se coloca en un
medio de cultivo estéril.
37
ANÁLISIS MOLECULAR DE LAS
COMUNIDADES MICROBIANAS.
Viabilidad y cuantificación mediante técnicas de
tinción.
- El colorante fluorescente DAPI (4´,6-diamido-2fenilindol) se usa con frecuencia para teñir
microorganismos en hábitat opacos.
- Células teñidas con DAPI presentan fluorescencia
azul brillante y son muy fáciles de ver y contar.
- Tinción con DAPI es ampliamente usada para la
enumeración de microorganismos en el ambiente, en
alimentos y en muestras clínicas.
- Para muestras acuáticas las células pueden ser
teñidas sobre la superficie de un filtro, después que la
muestra líquida ha sido pasada a través del mismo.
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Células de Escherichia coli después de haber sido teñidas con DAPI
(4´,6-diamido-2-fenilindol)
DAPI es un colorante fluorescente inespecífico que tiñe ácidos nucleicos y no
suele reaccionar con la materia inerte. DAPI es una forma razonable de estimar
el número de células presentes en una muestra.
Ventaja: es una técnica sencilla, no es específica (tiñe todos los MOs de una
muestra.
Desventaja: No diferencia entre células vivas y muertas, ni permite el rastreo de
organismos específicos en el ambiente.
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TINCIÓN DE VIABLES
- Hay métodos de tinción fluorescentes que permiten
distinguir entre células vivas y muertas.
- Basadas sobre la integridad de la membrana
citoplasmática (MC). A la muestra se añaden dos
colorantes (verde y rojo).
- El colorante verde penetra todas las células.
- El colorante rojo penetra en las células donde la MC no
está intacta (por ejemplo células muertas).
- Método no adecuado para examinar microscópicamente
muestras naturales debido al teñido inespecífico de los
materiales inertes. Se utiliza con cultivos bacterianos de
laboratorio (muestras clínicas, del ambiente y de
alimentos).
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Tinción de células viables
Células vivas (verdes) y células muertas (rojas) de Micrococcus luteus
(cocos) y Bacillus cereus (bacilos) teñidas por el método de tinción
Live/Dead (vivas/muertas) Bac Light TM de viabilidad bacteriana. El
colorante verde penetra en todas las células, viables o no, mientras que el
rojo, penetra solo en aquellas células cuya membrana esté dañada (células
muertas). Este método da una evaluación instantánea de la viabilidad. Se
utiliza en cultivos bacterianos de laboratorio, pero no es adecuado para el
examen de muestras naturales debido a problemas de tinción inespecífica con
los materiales inertes
41
ANTICUERPOS FLUORESCENTES
- Explota la especificidad de anticuerpos contra los
constituyentes de superficie de un organismo particular.
- Se usa para la identificación o seguimiento de organismos
en hábitat complejos con muchos microorganismos, tales
como suelos o muestras clínicas que contengan una mezcla
de muchos organismos.
- Requiere de la preparación de anticuerpos específicos
contra el microorganismo de interés lo cual es largo y
laborioso.
- Anticuerpos relevantes clínicamente son disponibles
comercialmente.
42
Anticuerpos fluorescentes.
Mediante la técnica de
anticuerpos fluorescentes
se observan microcolonias
bacterianas (las células
aparecen como puntos
verde-amarillentos) y la
arquea hipertermófila
Sulfolobus acidocaldarius
en la superficie de
partículas del suelo de una
solfatara. Las células
miden alrededor de 1µm
de diámetro.
43
Métodos de utilización de anticuerpos florescentes para
detectar antígenos de la superficie microbiana
(a) Preparación de anticuerpo fluorescente
por acoplamiento del colorante
fluorescente, el isotiocianato de
fluoresceína, con una molécula de
anticuerpo (Ac).
(b) Reacciones con anticuerpos
fluorescentes. Células de Clostridium
septicum con un Ac conjugado con
isotiocianato de fluoresceína que da
fluorescencia amarilla verdosa y células
de Clostridium chauvei teñidas con Ac
conjugado con rodamina B, que da
fluorescencia roja.
© Parte superior del panel: Método de
tinción directa
Parte inferior del panel: Método de tinción
indirecta
44
Proteína fluorescente verde para el etiquetado celular
Las células bacterianas pueden ser alteradas mediante técnicas de
ingeniería genética para volverlas fluorescentes. Se puede insertar en su
genoma el gen que codifica por la proteína verde fluorescente (GFP,
green fluorescent protein). Al expresarse, las células que contienen la
GFP aparecen color verde cuando se observan con un microscopio de luz
ultravioleta. Las células etiquetadas con GFP se pueden introducir en un
medio, como las raíces de las plantas, y seguir con el microscopio la
célula etiquetada. Aunque éste método no resulta útil para medir
poblaciones naturales, las células etiquetadas con GFP se pueden
introducir en un medio, como las raíces de las plantas. Con éste método,
los ecólogos microbianos pueden estudiar in situ la competencia
microbiana entre la microbiota nativa y la cepa con GFP introducida, o
evaluar el efecto de la perturbación en el ambiente. La GFP también se
puede utilizar como un gen indicador “reporter” fusionado a un operón
para estudiar la regulación de la transcripción de distintos promotores
por medición de la fluorescencia.
45
Células modificadas por ingeniería genética que expresan
la GFP (green fluorescent protein).
Células de Pseudomonas fluorescens
modificadas por ingeniería genética con la
GFP observadas por microscopía láser
confocal. Las células están adheridas a
raíces de cebada y presentan fluorescencia
de color verde. Las células teñidas de azul
son parte de la biota normal de las raíces de
cebada y se han teñido con el colorante
inespecífico DAPI.
El uso de GFP permite rastrear las
células introducidas en el ambiente.
Este método no es un método de tinción sino que es un método de etiquetado molecular.
46
Limitaciones de la microscopía
•
•
•
•
•
•
La microscopía es una técnica importante para la enumeración e
identificación de MOs en muestras naturales pero no es suficiente para el
estudio de los mismos.
Procariotas pequeños pasan inadvertidos si la muestra natural contiene
mucha materia orgánica o elevados números de células grandes.
Es difícil diferenciar entre células vivas y muertas y la materia inerte.
Imposibilidad de evaluar la diversidad genética de los MOs en un hábitat
natural.
Células muy similares morfológicamente pueden ser genéticamente muy
distintas y por lo tanto desempeñar funciones diferentes en un ecosistema.
Los estudios de microscopía en el área de la ecología microbiana deben
complementarse con métodos de cultivo o moleculares, preferiblemente de
ambos si se quiere entender bien la ecologia de un ecosistema microbiano.
47
Morfología y diversidad genética
Dos fotos de un mismo campo de células. a)
microscopía de contraste de fases. b) tinción
filogenética. Aunque las células ovaladas grandes
tienen una morfología y tamaño poco corrientes en
procariotas (2,25 um de diámetro), y parecen similares
por microscopía de contraste de fases, la tinción
filogética revela que son dos tipos distintos
genéticamente.
48
TINCIONES GENÉTICAS
- La sonda de ácido nucleico es un oligonucleótido de DNA
o RNA complementario a un gen diana.
-Las sondas de ácidos nucleicos son un instrumento
poderoso para identificar y cuantificar microorganismos en
la naturaleza.
-La técnica de hibridización florescente in situ (FISH,
fluorescent in situ hybridization) usa sondas de DNA o
RNA fluorescentes para identificar organismos que
contienen una secuencia de ácido nucleico que es
complementaria a la sonda.
- La técnica de FISH es una herramienta muy común en
ecología microbiana y permite la identificación rápida de
organismos patógenos específicos en la industria
alimenticia y en el diagnóstico clínico.
49
Tinción filogenética con FISH
- Los colorantes filogenéticos son oligonucleótidos
fluorescentes complementarios en la secuencia de bases a las
secuencias “signatura” en el rRNA 16S (en procariotas) o
18S (en eucariotas).
-Los colorantes filogenéticos penetran en la célula, donde
hibridan con el RNA ribosómico directamente en los
ribosomas.
-Se han identificado sondas filogenéticas signatura para
especies microbianas individuales, así como para dominios
enteros de organismos.
-El grado de especificidad de un colorante filogenético puede
controlarse mediante la secuencia de la sonda fusionada al
colorante. FISH permite identificar o rastrear un organismo
particular , o un grupo de organismos relacionados,
dependiendo de la especificidad de la sonda.
50
Identificación de microorganismos en ambientes naturales por métodos de sonda
de ácidos nucleicos
(a)
Microfotografías de células hibridizadas con
sondas complementarias a secuencias
específicas en el 16S rRNA de Bacteria
(izquierda) y de el 18S rRNA de Eukarya
(derecha)
(b)
Sondas de RNA ribosomal marcadas
fluorescentemente. Izquierda: microfotografía
de contraste de fases de B. megaterium y la
levadura Saccharomyces cerevisiae (no hay
probes presentes. Centro: el mismo campo,
células teñidas con la probe de rRNA universal.
Derecha: el mismo campo, células teñidas con
la sonda para eukarya (sólo las células de S.
cereviciae reaccionan).
(c)
Diferenciación de bacterias Gram-negativas
estrechamente relacionadas. Izquierda:
microfotografía de una mezcla de Proteus
vulgaris y de una bacteria relacionada aislada
de avispas. Centro: el mismo campo con una
sonda bacterial. Derecha: probe específica para
las bacterias aisladas de avispa.
51
Estudio de muestras naturales mediante sondas
filogenéticas multiples por FISH
a) Bacterias nitrificantes en muestra de aguas residuales. En rojo bacterias
oxidadoras de amoníaco, en verde bacterias oxidadoras de nitritos. b) Micrografía
laser confocal de rastreo de una muestra de fango de aguas residuales. La muestra
fue tratada con tres sondas filogenéticas distintas.
52
TINCIONES GENÉTICAS
Técnicas de FISH:
a) Tinción de cromosomas:
- Comienza con el marcado fluorescente de una sonda de
oligonucleótidos o del gen completo, de un conjunto de
genes, o incluso de un genoma completo digerido, para
obtener sondas pequeñas.
- Las sondas se utilizan para averiguar qué organismo(s)
de una muestra contiene(n) el gen o los genes presentes en
la sonda(s).
- La tinción de cromosomas es útil para identificar
bacterias que contienen genes específicos, como los que
codifican para la nitrogenasa, responsable de la fijación
de N2, los componentes del centro de reacción
fotosintético, o vías autotróficas específicas.
- Los números de células fluorescentes en cada caso darán
una estimación de las bacterias fijadoras de N2, fotótrofas
o autótrofas, respectivamente, en una muestra natural.
53
b) Transcripción inversa in situ (in situ reverse
transcription, FISH-ISRT).
- Usada para determinar si un organismo está expresando
un gen o genes particulares en la naturaleza, a un tiempo
dado.
- Involucra el uso de una sonda que hibridiza con un mRNA.
- Permite a los científicos explorar los factores que controlan
la expresión del gen en poblaciones naturales.
54
Técnicas de fluorescencia que
emplean tinción de
cromosomas bacterianos y
transcripción inversa in situ.
55
PCR: relacionando genes específicos con organismos
específicos.
Muchos estudios en ecología no necesitan aislar los
organismos, ni siquiera identificarlos por microscopía con
tinciones específicas. A menudo el objetivo del estudio es
evaluar la biodiversidad de un hábitat sin emplear técnicas de
cultivo, ni observar células. Con este objetivo se han aislado y
caracterizado genes específicos como medida de la
biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los genes
específicos están ligados frecuentemente a organismos
específicos, la detección del gen implica la presencia del
organismo. Las principales técnicas en este tipo de análisis de
comunidades microbianas son la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), la electroforesis en gel desnaturalizante en
gradiente (DGGE), la clonación molecular y la secuenciación y
el análisis del DNA.
56
PCR. La reacción en cadena de la polimerasa llamada
“PCR” puede multiplicar moléculas de DNA hasta miles de
millones de veces proporcionando grandes cantidades de
genes para su clonación, secuenciación o mutagénesis. La
técnica de PCR hace uso de la DNA polimerasa. Se
requiere que se conozca la secuencia nucleotídica de una
región del gen deseado para poder diseñar oligonucleótidos
iniciadores cortos o primers, complementarios de
secuencias presentes en el gen o genes de interés. Las
etapas de amplificación son las siguientes: 1- En un
sintetizador de nucleótidos se fabrican los dos
oligonucleótidos iniciadores que flanquean al gen diana, y
se añaden en un gran exceso al gen diana desnaturalizado
por calor. 2- Cuando se ha enfriado la mezcla, el exceso de
iniciadores relativos al DNA diana asegura que la mayor
parte de las cadenas diana hibriden con iniciadores y no
entre sí. 3- La DNA polimerasa alarga los iniciadores
usando las bandas diana como moldes. 4- Después de un
período de incubación adecuado, se calienta de nuevo la
mezcla para separar las cadenas. Luego se enfría la
mezcla para permitir que los iniciadores se hibriden con las
regiones complementarias del DNA recién sintetizado, y se
repite el proceso.
57
Análisis de la comunidad microbiana.
Para el análisis de comunidades microbianas un gen diana que se amplifica
frecuentemente es el que codifica el RNA ribosómico 16S (rRNA 16S). De
esta manera, el análisis de la secuencia de genes de rRNA 16S amplificados
a partir de una comunidad microbiana puede ofrecer una imagen
filogenética de esa comunidad. Alternativamente también se pueden usar
como dianas los genes metabólicos que codifican proteínas particulares del
metabolismo de un organismo específico (o de un grupo de organismos
relacionados). El imprescindible que el diseño de los cebadores tenga una
especificidad elevada. Si la fuente de DNA es una muestra natural , el
diseño de los cebadores es crítico para que los resultados no sean ambiguos
y difíciles de interpretar. Se dispone de reactivos comerciales (kits) para
obtener el DNA puro, sin restos de sustancias que pueden interferir con la
PCR. El DNA obtenido es una mezcla del DNA genómico de todos los
microorganismos presentes originalmente en el hábitat. La tarea de la PCR
es “capturar” el o los genes diana que interesan en la mezcla y hacer las
copias suficientes para análisis posteriores. El producto de la PCR es
corrido en un gel donde se obtienen bandas de los genes diana amplificados
58
Pasos en el análisis de una comunidad microbiana mediante
sondas filogenéticas.
(a) Se utiliza el DNA total de la comunidad
para amplificar los genes del rRNA 16S
utilizando cebadores (primers)
universales conservados para los
microorganismos del dominio Bacteria.
Las bandas producidas por la PCR se
cortan y los diferentes genes rRNA 16S se
separan o por clonación o por DGGE
(electroforesis en gel desnaturalizante en
gradiente) y se secuencian. A partir de las
secuencias obtenidas se construye un
árbol filogenético.
59
Análisis por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y DGGE
(electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente) coordinados.
Por la divergencia evolutiva del gen diana
elegido en las diferentes especies, la banda
obtenida en el gel (a) puede estar compuesta
de varios genes diana, los cuales difieren en
la secuencia de nucleótidos entre los lugares
de unión de los cebadores escogidos. Para el
análisis filogenético de las secuencias de los
genes amplificados , se necesita un paso
extra para distinguir las diferentes formas
del gen antes de iniciar la secuenciación. Un
método es mediante la clonación molecular y
la otra posibilidad es la electroforesis en gel
desnaturalizante en gradiente (b). La DGGE
es un método de electroforesis que separa los
genes del mismo tamaño que difieren en la
secuencia de bases. La técnica utiliza un
gradiente de urea y formamida que
desnaturaliza el DNA. Un fragmento de
DNA bicatenario se desplaza por el gel y
cuando
llega
a
una
determinada
concentración
“desnaturalizante”
las
cadenas de DNA se separan y el
desplazamiento se interrumpe.
60
Las bandas individuales obtenidas por DGGE se pueden cortar y secuenciar.
Usando como gen diana el rRNA 16S, el análisis por DGGE proporciona una
visión detallada del número de filotipos (genes rRNA 16S distintivos) presentes
en el hábitat. Secuenciando estas bandas , es posible determinar las especies
presentes en la comunidad por comparación con las secuencias de las especies
conocidas disponibles a partir de bases de datos apropiadas. Con otros genes
(por ejemplo, genes metabólicos) se obtiene información acerca del número de
tipos diferentes de organismos presentes en la comunidad que contiene el gen
específico. El análisis por DGGE revela la biocomplejidad de un hábitat con
respecto a un gen especifico.
El análisis filogenético por PCR de las comunidades microbianas ha dado
resultados sorprendentes. Con el rRNA 16S como diana, se ha comprobado que
la mayoría de las comunidades microbianas contienen varios organismos
filogenéticamente distintos, cuyas secuencias de RNA ribosómico no se
emparejan con ninguno de los cultivos de laboratorio. Hay que señalar que en
muchos casos los miembros más abundantes de las comunidades microbianas
son especies que hasta ahora no han podido ser cultivadas en el laboratorio. Este
problema indica que nuestro conocimiento de la diversidad microbiana a partir
de los cultivos de enriquecimiento es todavía muy incompleto y que el
enriquecimiento presenta sesgos, lo cual supone un serio problema para los
estudios de biodiversidad.
61
Medición de la actividad microbiana en la naturaleza
La actividad microbiana in situ se puede medir mediante la
utilización de:
(1) Radioisótopos
(2) Microelectrodos
(3) Isótopos estables
Los análisis usando radioisótopos son:
-
Muy sensibles y muy específicos para medir procesos químicos
-
Usan tiempos cortos de incubación
-
Las mediciones obtenidas son mas representativas de las
muestras como existen en la naturaleza
-
Hay que hacer control con células muertas para verificar que
ocurre un proceso bioquímico y no una transformación química
62
Medida de la actividad microbiana en la naturaleza
a) Análisis químico para
lactato y H2S
durante la reducción
de sulfato.
b) Uso de radioisótopos:
fotosíntesis medida
en un ambiente
natural de agua de
mar con 14CO2
c) Reducción de sulfato
en un lodo medido
con 35SO42d) Producción de 14CO2
de 14C-glucosa.
63
Esquema de un microelectrodo de oxígeno
MICROELECTRODOS
- Electrodos de vidrio muy finos que miden
pH, oxígeno, N2O, CO2, H2 o H2S.
- Usado para el estudio de transformaciones
químicas y fotosíntesis en tapetes microbianos.
- Los tapetes microbianos son comunidades
microbianas estratificadas conteniendo
usualmente cianobacteria en las capas
superiores, bacterias fototróficas anoxigénicas
en las capas subsiguientes y bacterias
quemoorganotrofas en las capas inferiores.
- Los tapetes microbianos son encontrados a
menudo en las zonas intermareales y junto a
fuentes termales.
64
Tapetes microbianos y el
uso de microelectrodos
para su estudio.
b) microperfiles de pH,
sulfhídrico y oxígeno en
un tapete microbiano de
una fuente termal.
65
ISÓTOPOS ESTABLES
Muchos elementos químicos tienen diferentes isótopos, que
difieren en el número de neutrones. Algunos son inestables y se
degradan liberando radioactividad y otros son estables.
- Los isótopos estables no son radioactivos y se utilizan para el
estudio de diversas transformaciones microbianas en la
naturaleza.
- Los elementos mas comúnmente usados para estudios con
isótopos estables en la ecología microbiana son el carbono y el
azufre.
- En la naturaleza, el carbono se encuentra principalmente
como 12C, y en pequeña cantidad (alrededor del 5%) como 13C.
Lo mismo sucede con el azufre, cuya forma principal es el 32S,
pero que también se encuentra en menor cantidad como 34S.
- Las reacciones bioquímicas tienden a favorecer el isótopo más
liviano, los mas pesados son discriminados negativamente.
66
ISÓTOPOS ESTABLES
-Fraccionamiento isotópico: las molécula producidas
bioquímicamente son mas livianas que los compuestos
producidos geoquímicamente.
- Cuando el CO2 es atrapado por un organismo fototrófico, el
carbono celular se enriquece en 12C y se empobrece en 13C.
-El sulfuro producido por la reducción bacteriana del sulfato
es mas “ligero” que el de origen geoquímico.
-Este fenómeno se conoce como fraccionamiento isotópico.
-El fraccionamiento es el resultado de la actividad de algunas
enzimas que discriminan la forma más pesada de un
elemento cuando se unen a sus sustratos.
67
Medición de la actividad microbiana por el uso de isótopos estables
Los isótopos estables pesados 13C, 18O, 34S tienen un número distinto de neutrones
que la forma isotópica principal.
Los geoquímicos y los microbiólogos forman equipos para el estudio de las
transferencias biogeoquímicas usando isótopos estables.
La mayoría de los procesos bioquímicos favorecen el isótopo mas liviano
discriminando el más pesado. Esto es particularmente cierto para las enzimas que
fijan CO2 o que metabolizan SO4=.
Los organismos fototróficos utilizan el CO2 de
composición isotópica conocida como alimento y
las enzimas fijadoras de CO2 lo hacen
preferentemente con el isótopo mas ligero (12C).
De esta manera , el carbono fijado como carbono
celular aumenta la cantidad de 12C y disminuye la
de 13C en relación con el sustrato inicial. El grado
de disminución de 13C se acumula como un
fraccionamiento isotópico. El tamaño de las
flechas indican la abundancia relativa de cada
isótopo del carbono.
68
Fraccionamiento isotópico en ecología microbiana
La composición isotópica de una muestra contiene un registro de su actividad
biológica pasada. El análisis isotópico del carbono permite distinguir entre la
materia orgánica biogénica de la abiogénica. Se pueden hacer registros evolutivos
a) Composición isotópica de carbono de varias
sustancias. Los valores están dados en partes
por mil y fueron calculados usando la fórmula
(13C/12C muestra)-(13C/12C estándar) x 1000
13C/12C estándar
El estándar del C es el belemnite de la
formación rocosa PeeDee. Nótese que el C
fijado por los organismos autotróficos está
enriquecido en 12C.
b) Resumen de la geoquímica isotópica del
azufre con indicación del margen de valores
para 34S y 32S en varias sustancias que
contienen azufre. Los valores se dan en partes
por mil y se calculan mediante la fórmula
(34S/32S muestra)-(34S/32S estándar) x 1000
34S/32S estándar
El estándar del S es el SFe procedente del
meteorito Canyon Diablo. El sulfuro y azufre
de origen biogénico tienden a tener menos 34S.
69
EL USO DEL FRACCIONAMIENTO ISOTÓPICO EN
ECOLOGÍA MICROBIANA.
- La composición isotópica de una muestra contiene un
record de su actividad biológica pasada.
-El análisis del isótopo de carbono en las rocas tiene prevista
la existencia de vida sobre la tierra 3.500 millones de años
atrás.
-El análisis del oxígeno (18O/16O) de rocas se usa para
determinar la transición de la Tierra de un ambiente
anóxico a un ambiente óxico (fotosíntes oxigénica de las
cianobacterias).
-El análisis del isótopo de azufre también ha sido usado
como evidencia de la carencia de vida sobre la luna.
-La composición isotópica de un organismo animal superior
tiende a aproximarse a la composición isotópica de su
principal alimento. Esto permite rastrear el flujo de C a
través de un ecosistema.
70
FIN
71
ECOSISTEMAS MICROBIANOS
72
HÁBITAT MICROBIANOS TERRESTRES Y DE AGUA DULCE
Los suelos y las aguas varían en su estructura física, composición de
nutrientes, temperatura y potencial de agua. Todos estos factores se
combinan para influir en los tipos y número de microorganismos
presentes en cada caso.
Ambientes terrestres
material original
Interacción
(roca, arena, sedimentos)
compleja
topología del terreno
formación del suelo
clima
seres vivos
La interacción involucra procesos físicos, químicos y biológicos.
73
Formación del suelo. Los suelos pueden clasificarse en dos grandes grupos: suelos
minerales y suelos orgánicos según procedan inicialmente de la fragmentación de rocas
y otros materiales inorgánicos , o de la sedimentación de turberas y marismas.
roca expuesta a la intemperie
humedad
algas
Se desarrollan
MOs fototróficos
líquenes musgo
Producen materia
orgánica que permite el
crecimiento de
bacterias
quimioorganotróficas y
hongos
El número de bacterias quimioorganotróficas aumenta en forma proporcional a la
extensión de la cubierta vegetal de la roca. El CO2 que producen los organotrofos
durante la respiración se convierte en ácido carbónico, que es un agente importante en
la disolución de rocas, especialmente en las que son calizas. Muchos
quimioorganotrofos secretan además ácidos orgánicos que disuelven la roca en
partículas de menor tamaño.
Heladas y deshielos
grietas en las rocas
formación del suelo primitivo
74
Hendidura de roca formación de suelo primitivo desarrollo de plantas superiores
Las raíces de las plantas van penetrando por las hendiduras y aumentan la
fragmentación de la roca y sus excreciones causan el desarrollo de una rizosfera.
Planta muere
suelo
nutriente para un desarrollo microbiano mas extenso
Los minerales se solubilizan aún más y el agua al filtrarse arrastra los mismos hacia
capas mas profundas. A medida que avanza el proceso de meteorización del suelo,
éste se hace mas profundo y permite el desarrollo de plantas y árboles de mayor
tamaño. Los animales se estabilizan y desempeñan un papel importante en el
mantenimiento de la aireación y mezcla de las capas superiores del suelo.
Finalmente, el movimiento de materiales hacia el interior origina la formación de
distintas capas y aparece un perfil de suelo típico, cuya velocidad de formación
depende del clima, de otros factores. Es un proceso lento que puede llevar cientos
de años.
Horizonte O : capa de materia vegetal sin descomponer
Horizonte A: suelo superficial (rico en materia orgánica), alta actividad microbiana.
Horizonte B: subsuelo (se acumulan minerales, humus, etc), pobre en materia
orgánica, actividad microbiológica pobre.
Horizonte C: suelo base, actividad microbiana muy baja.
Roca sólida
75
Ambiente terrestre: formación del suelo
Agregado de suelo
Microscopía electrónica de barrido
Microorganismos sobre una partícula de suelo
76
EL SUELO COMO HÁBITAT MICROBIANO
-El crecimiento mas importante se da en la rizosfera (suelo que rodea las raíces).
-Un pequeño agregado de suelo contiene microambientes muy diferentes y diferentes
tipos de MOs.
Partícula de suelo
tinción fluorescente
naranja de acridina
observación de distintos MOs
microscopio
tinción con anticuerpos
fluorescentes
MOs específicos
microscopio
de fluorescencia
microscopio electrónico de barrido
MOs sobre superficies opacas (suelos)
(morfología, recuento de viables)
-La actividad microbiana depende de la disponibilidad del agua, que es variable y
depende de: (a) la composición del suelo, (b) la lluvia, (c) el drenaje, (d) la cubierta
vegetal.
- El agua permanece en el suelo : (a) adsorvida sobre superficies, (b) libre formando
láminas o películas entre las partículas del suelo.
77
Solución del suelo: es el agua del suelo con diversos materiales disueltos
En terrenos bien drenados el aire penetra con facilidad y la concentración
de O2 es alta. En suelos encharcados, el O2 disponible es el disuelto en el
agua y es pronto consumido por los MOs. Este tipo de suelo se vuelve
pronto anóxico, por lo que experimenta profundos cambios en sus
actividades biológicas.
El estado nutricional ( los recursos) es otro factor importante que afecta
a la actividad microbiana, la mayor parte de la cual se lleva a cabo en las
capas superiores ricas en materia orgánica (rizosfera).
El número de MOs del suelo y su actividad dependen del equilibrio
entre los nutrientes presentes (orgánicos e inorgánicos).
La disponibilidad de agua es lo que más influye en la actividad
microbiológica que tiene lugar en la superficie del suelo, mientras que en
el interior del suelo la disponibilidad de nutrientes es el factor principal.
78
79
MICROBIOLOGÍA DE LA SUBSUPERFICIE PROFUNDA
metanógenos
Suelos profundos
MOs anaerobicos estricto
homoacetógenos
MOs aerobios facultativos
bacterias SO4= reductoras
MOs anaerobios facultativos
En muestras tomadas a 300 m se han aislado una gran variedad de microorganismos.
Tienen actividades metabólicas bajas, inferiores a las que tienen en sus hábitat naturales
Comparado con los MOs de las capas superiores del suelo, la importancia
biogeoquímica de los MOs de ambientes profundos puede ser mínima. No obstante
pueden causar la mineralización de compuestos orgánicos y liberar productos a las
aguas subterráneas.
El potencial que representan estas bacterias para la Biorremediación in situ de las
sustancias tóxicas que alcanzan las aguas subterráneas por lixiviación (por ej. bencenos
y productos químicos utilizados en agricultura) tiene un gran interés en la actualidad.
80
Vida microbiana en las profundidades de la Tierra
Los microbiólogos han hallado procariotas viables a varios metros de profundidad bajo la superficie
En algunas formaciones de basalto de hasta 1500 m de profundidad se han encontrado una gran
cantidad de bacterias anaeróbicas quemolitotróficas que son sulfato reductores, metanógenos y
homoacetógenos. Estos anaerobios estrictos comparten una gran apetencia por el H2. El análisis del
isótopo estable del carbono del CH4 presente en las rocas y aguas circundantes indica una gran
abundancia del isótopo más ligero (12C), lo que es típico de la metanogénesis biológica
demostrando que estos organismos son metabólicamente activos. El H2 del basalto parece originarse
de la interacción , estrictamente química, del agua con los minerales de hierro de las rocas y es el
que permitiría el crecimiento de las poblaciones de procariotas anaeróbicos encontrados en las
profundidades. Estos quimiolitótrofos subterráneos son independientes de la producción primaria
fotosintética la cual genera O2 y/o materia orgánica sugiriendo que pueden ser agentes
biogeoquímicos importantes en estos ambientes.
81
Ambientes de agua dulce
Lagos
Distintos hábitat acuáticos. Difieren en sus propiedades
Estanques
fisicoquímicas y consecuentemente en la composición
Ríos
de las especies microbianas que viven en ellos, que
Manantiales
predominantemente son los organismos fototróficos.
Zona óxica
Cianobacterias
algas
que flotan (fitoplancton)
que se adhieren al fondo o a los lados (bénticas)
Zona anóxica
bacterias fototróficas anoxigénicas
E
Luz
materia orgánica
organismo fototrófico
productor primario
82
Los organismos fotótrofos oxigénicos producen nuevo material orgánico
y O2. Cuando la actividad quimioorganotrófica es muy elevada, la
materia orgánica lleva al agotamiento de O2 y a condiciones anóxicas.
-La actividad biológica de un ecosistema acuático depende de la tasa de
producción primaria que llevan a cabo los organismos fototróficos.
-Los recursos y las condiciones ambientales afectan la actividad de los
productores primarios. Hay mayores tasas en los ríos y manantiales.
-En los mares abiertos hay baja concentración de nutrientes para el
fitoplancton y por lo tanto baja productividad.
-Las zonas mas fértiles son las cercanas a la costa por los aportes de
nutrientes de los ríos y de las aguas continentales contaminadas.
-Las zonas costeras tienen alta producción primaria y son los mejores
lugares para el crecimiento y recolección de pescados y mariscos.
83
Relaciones con el oxígeno en lagos y ríos
-Concentración de O2 en el aire 21%, su solubilidad en el agua es
limitada
-El intercambio entre el O2 disuelto y el O2 atmosférico en las grandes
masas de agua es lento.
-La producción fotosintética significativa de O2 en mares y lagos se lleva
a cabo sólo en las capas superficiales, donde hay luz disponible.
-La materia orgánica que no se consume en estos estratos superiores va a
parar al fondo, donde se descompone por la acción de MOs facultativos,
que utilizan el O2 disuelto en el agua.
-En los lagos, cuando se ha consumido el O2 disuelto, las capas mas
profundas se vuelven anóxicas donde sólo pueden crecer bacterias
anaeróbicas y organismos microaerofílicos. Se produce un cambio del
metabolismo respiratorio al fermentativo y al metanogénico.
Metanogénesis 4H2 +CO2
CH4 + 2H2O
84
Mar
capas mas
Lago superficiales
O2
consumida
luz organismos materia
quimioorganotrofos
biosintéticos orgánica
no consumida
excedente al fondo
organismos facultativos
que utilizan el O2 disuelto
En lagos
Cambio del metabolismo
capas mas profundas anóxicas
del respiratorio al fermentativo
bacterias anaeróbicas y organismos
y al metanogénico
microaerofílicos
no plantas superiores ni animales
85
Que una masa de agua quede o no desprovista de O2 depende de muchos
factores.
Hay O2 en la masa de agua:
(a) si la materia orgánica es escasa (lagos poco productivos o mar abierto)
(b) si no hay suficiente materia orgánica disponible para que los organismo
quimioorganotróficos consuman todo el O2,
(c) si la velocidad de intercambio del agua entre las capas profundas y la superficie es
alta (corrientes, turbulencias, etc) que mezclan bien y el O2 puede alcanzar las capas
profundas.
En muchos lagos de climas templados la masa de agua permanece estratificada
durante el verano con capas superficiales menos densas y mayores temperaturas
llamadas epilimnion y separadas de capas inferiores mas pesadas y frías llamadas
hipolimnion. Cuando se produce la estratificación, normalmente a principios del
verano, las capas inferiores se vuelven anóxicas. Al final del otoño o al principio del
invierno, las capas superiores se enfrían y se vuelven mas densas que las capas
inferiores, produciéndose un intercambio que causa la aireación del fondo. Por ello
la mayoría de los lagos de zonas templadas muestran un ciclo anual en el que las
capas inferiores pasan de óxicas a anóxicas y de nuevo a óxicas. Estos cambios y
especialmente también la temperatura afectan la actividad microbiana.
86
Interrrelaciones del oxígeno en lagos y ríos
O2
temperatura
Epilimnion
Termoclina
Hipolimnion
SH2
Desarrollo de condiciones anóxicas en las profundidades de un lago de clima
templado, como resultado de la estratificación estival. Las aguas mas frías del
fondo son mas densas y contienen SH2 procedente de la reducción del sulfato. La
zona que presenta un cambio brusco de la temperatura se denomina termoclina. A
medida que las aguas superficiales se enfrían en otoño y en invierno, la densidad
de las mismas aumenta y, al hundirse, desplazan a las del fondo, dando lugar a la
“mezcla del lago”.
87
Ríos
El O2 es un factor importante, especialmente en los ríos que reciben mucha materia
orgánica procedente de aguas residuales y de contaminación industrial. Si hay mucha
materia orgánica, se produce un déficit de O2 debido a la respiración bacteriana. A
medida que el agua se aleja del lugar donde se produce la descarga de residuos, la
materia orgánica es consumida gradualmente y la concentración de O2 se acerca a la
normalidad. En condiciones de anoxia, aunque sean temporales, los animales se
mueren y además empiezan a crecer bacterias anaeróbicas que producen compuestos
con olor fuerte (SH2, mercaptanos, ac. grasos)
Efecto de la incorporación de aguas residuales o de materia orgánica a los ríos
O2
bacterias, C orgánico y DBO (demanda biológica de O2)
algas y cianobacterias
O2
Aporte de aguas
NO3-
NH4+ y PO43-
residuales Distancia corriente abajo
88
Demanda biológica de O2 (DBO)
Es la capacidad de consumir O2 que tienen los MOs en una masa de agua determinada.
Muestra de agua se airea bien
se coloca en
botella precintada
incubación 5 días
a 20oC
se mide el O2
residual
La DBO es una medida indirecta de la cantidad de materia orgánica del agua que puede
ser oxidada por los MOs. Cuando un río se recupera de la contaminación producida por
compuestos orgánicos, hay una disminución de la DBO que se acompaña con un
aumento de la concentración de O2 disuelta en el agua.
En una masa de agua, los ciclos de C y O se encuentran interrelacionados y la
concentración de cada uno de los elementos suele ser inversamente proporcional a la
del otro. Esto se hace especialmente evidente en los ambientes anóxicos, donde hay
abundancia de C.
89
Microbiología de las profundidades marinas
-Los océanos ocupan ¾ partes de la superficie terrestre de allí la importancia de la
microbiología marina.
-Las zonas alejadas a las costas son pobres en nutrientes y la actividad microbiana no es
intensa.
-Los MOs marinos son interesantes porque: crecen a concentraciones de nutrientes
Mar
300 m
Animales y
luz solar
MOs quimio-
intensa actividad biológica
crecen a
temperaturas
crecen a
presiones
zona fótica
organotróficos
1000 m
mas abajo zona biológicamente inactiva
profundidades marinas 75% del volumen del agua de mar
La presión atmosférica 1 atm cada 10m de profundidad. A 5000 m tenemos 500 atm.
90
Distribución de Archaea/Bacteria en mar abierto
El número de procariotas en mar abierto
disminuye con la profundidad. En la superficie
el promedio es de 105-106 células/ml. Por debajo
de los 1000 metros el número desciende a 103105 células/ml. Las tinciones filogenéticas han
revelado que en general las especies de Bacteria
predominan en las aguas superiores (<1000
metros), mientras que los números son iguales o
muestran un ligero predominio de Archeae en
las aguas profundas. Extrapolando los datos de
la figura se ha estimado que en el conjunto de
los océanos de todo el mundo existen 1,3 x 1028
y 3,1 x 1028 células de Archeae y Bacteria,
respectivamente. Esto indica que los océanos
contienen la mayor cantidad de biomasa
microbiana que existe en toda la superficie de la
Tierra.
91
Bacterias barotolerantes y barofílicas
Bacterias barotolerantes son aquellas que toleran altas presiones.
Bacterias barofílicas son aquellas que necesitan altas presiones para crecer.
La distribución de ambos tipos de bacterias dependen básicamente de la profundidad.
Las bacterias barotolerantes no crecen a presiones superiores a las 500 atm (pero
pueden crecer también a 1 atm).
Los organismos aislados a mas de 500 atm son barofílicos, con un crecimiento óptimo a
400 atm. A más de 10.000 m de profundidad se obtienen los barófilos extremos o
estrictos (necesitan mas de 400 atm para crecer). En general la temperatura óptima es de
aproximadamente 2oC. Por enzima de 10 oC disminuye su viabilidad.
La presión puede afectar la expresión de genes en las bacterias barofílicas. Las
proteínas de la pared celular y las estructuras relacionadas con la pared celular, así
como los transportadores parecen ser los componentes con mayor variabilidad. La
presión actúa de manera selectiva para regular la transcripción de genes específicos que
codifican las proteínas necesarias para el crecimiento a alta presión.
92
Crecimiento de bacterias barotolerantes, barofílicas y barofílicas extremas
93
FIN
94