utilizacion de inhibidores de ikk-beta y procedimiento de

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 224 065
51 Int. Cl. : A61K 38/00
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A61P 9/10
ESPAÑA
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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 02730066 .4
86 Fecha de presentación: 26.03.2002
87 Número de publicación de la solicitud: 1372689
87 Fecha de publicación de la solicitud: 02.01.2004
54 Título: Utilización de inhibidores de IKK-β y procedimiento de localización de los indicados inhibidores.
30 Prioridad: 27.03.2001 DE 101 15 073
73 Titular/es: Procorde GmbH
Fraunhoferstrasse 9
82152 Martinsried, DE
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
01.03.2005
72 Inventor/es: Ungerer, Martin;
Brand, Korbinian y
Gawaz, Meinrad
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Ungría López, Javier
ES 2 224 065 T3
01.03.2005
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Utilización de inhibidores de IKK-β y procedimiento de localización de los indicados inhibidores.
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La presente invención se refiere a una nueva aplicación de inhibidores especiales para la preparación de medicamentos destinados a la prevención y al tratamiento de la arteriosclerosis, así como a un procedimiento de screening
(selección primaria) especial para la localización de nuevos inhibidores.
Es sabido que la arteriosclerosis es una consecuencia de lesiones del endotelio vascular, que se ve favorecida por
hipertonía, formación de nódulos locales o falta de oxigeno. Se supone que debido a las estructuras subendioteliales
de la pared vascular, que han quedado al descubierto debido a las lesiones, se adhieren a los puntos dañados del
endotelio plaquetas circulantes (adherencia de plaquetas) y que a continuación forman grumos entre si (agregación de
plaquetas).
Debido a la interacción de las plaquetas con las células endoteliales se forman multitud de procesos secundarios,
que dan lugar a una acumulación de lípidos en la pared vascular. Con la acumulación de lípidos en la pared vascular
comienza la formación de las llamadas placas ateroescleróticas. En las placas se enriquecen células esponjosas, que
se forman a partir de macrófagos que han inmigrado. Las células esponjosas absorben los lípidos acumulados y los
descomponen. Mientras que algunas lipoproteínas se pueden descomponer de forma sencilla, en cambio la colesterina
y el éster de colesterina se mantienen prácticamente sin descomponer. Por lo tanto las células esponjosas se sobrecargan
de colesterina y éster de colesterina.
Como consecuencia de las placas ateroescleróticas pueden llegar a producirse necrosis centrales, en cuyas proximidades se depositan sales calizas. En las fases avanzadas se pueden rasgar las placas de manera que se forman
lesiones ateroescleróticas, que a continuación son recubiertas por un trombo. El engrosamiento de la pared arterial y la
formación de trombos superficiales pueden estrechar el lumen vascular hasta llegar a cerrarlo por completo. Los trombos que se desprenden de las arterias grandes provocan la obstrucción de los vasos menores en la periferia del cuerpo.
Las alteraciones del riego sanguíneo arterial, que son debidas en la mayoría de los casos a procesos ateroescleróticos,
constituyen, en un porcentaje de aproximadamente un 50%, la causa de muerte más frecuente en los llamados países
industrializados.
Los mecanismos moleculares de la aterogénesis apenas se conocen, en particular los procesos que determinan
la quemotaxis de los monocitos y la transmigración de monocitos. Sin embargo, es sabido que en los procesos de
inflamación de la pared arterial aparece citoquina MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) y atrae monocitos
al lugar de la inflamación. También es sabido que la MCP-1 se puede exprimir en células endoteliales. La expresión
y secreción de la MCP-1 se controla por medio de cascadas de señales complejas. Los detalles de la expresión y
secreción de la MCP-1 en células endoteliales en fases tempranas de aterogénesis no se conocen por el estado de la
técnica. En particular no se conocen proteínas de destino relacionadas con la arteriosclerosis, influyendo sobre las
cuales se pudiera influir en la aparición y desarrollo precoz de la enfermedad.
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El impedimento o reducción de la atracción e inmigración de monocitos en la pared vascular dentro del marco de
los procesos ateroescleróticos puede ralentizar el enriquecimiento de células esponjosas en placas ateroescleróticas, y
por lo tanto sería adecuado para frenar o evitar los procesos ateroescleróticos.
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El objetivo de la invención es el de facilitar un nuevo procedimiento mediante el cual se pueda evitar o tratar la
ateroesclerosis.
También es un objetivo de la presente invención el de facilitar un procedimiento de screening (selección primaria)
para la localización de nuevas substancias activas mediante las cuales se pueda evitar o tratar la ateroesclerosis.
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Estos objetivos se resuelven de acuerdo con las reivindicaciones. La presente invención está basada en el conocimiento de que una expresión de la MCP-1 en células endoteliales no presupone una agregación de plaquetas sobre el
endotelio vascular. Más bien las plaquetas activadas inducen ya en una fase de aterogenesis una expresión de la MCP1 en células endoteliales, en la cual todavía no se puede demostrar ninguna agregación de plaquetas. Se ha observado
que las plaquetas activadas, que in vivo simplemente se adhieren de forma provisional pero firme sin llegar a aglomerarse, en una monocapa endotelial activada por isquemia, desgranulan y activan el factor de transcripción NF-κB en
las células endoteliales contiguas. Esta nueva forma de interacción entre las plaquetas y las células endoteliales activadas, que no presupone ninguna clase de lesiones reconocibles, se diferencia por una parte de las interacciones rolling,
conocidas según el estado de la técnica, en las que no se llega a producir una adherencia firme, y por otra parte de la
adherencia firme y formación de grumos en la agregación de plaquetas, que no es solo transitoria sino permanente. La
activación de NF-κB en las células endoteliales producida por las plaquetas activadas da lugar a una secreción de la
MCP-1 de las células endoteliales. Mediante la secreción de la MCP-1 se atraen monocitos en las fases tempranas de
aterogénesis, que pueden llegar a inmigrar en la pared vascular. Por lo tanto una adherencia simplemente transitoria
de plaquetas activadas conduce a una secreción de la MCP-1, que es condición para la formación de las placas en los
procesos ateroescleróticos.
La presente invención está basada además en el conocimiento de que durante la activación de NF-κB transmitida
por las plaquetas activadas se fosforilizan y con ello queda activada la proteína inhibidora IκB especial de la IKK2
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β-quinasa del complejo IKK. Debido a la activación especial de corta duración debida a las plaquetas activadas y
con la participación de IKK-β se produce una actividad de fosforilización intensa y persistente de IκB que dura hasta
una hora. Debido a la descomposición de la proteína inhibidora IκB que tiene lugar al mismo tiempo, se produce una
activación intensa y de larga duración de NF-κB y la correspondiente secreción de la MCP-1. Esto resulta sorprendente
con vistas al hecho de que la interacción con las plaquetas tiene lugar solo durante un tiempo relativamente corto.
El perfil de activación en el tiempo del complejo IKK durante la activación debida a las plaquetas activadas es
básicamente distinto de las de la activación debida a IL-1β o TNF, que ya son conocidos según el estado de la técnica
como activadores del complejo IKK. Las plaquetas activadas activan el complejo IKK durante unos 60 minutos,
alcanzándose el nivel máximo de fosforilización al cabo de unos 30 minutos, y apenas se observa una diferencia
entre la activación de IKK-α y IKK-β. El TNF da lugar a una activación extremadamente intensa que dura solo unos
pocos minutos, en particular del complejo IKK, pero que al cabo de 20 minutos ya no se puede demostrar. En cambio
IL-1β provoca una activación de muy larga duración, en particular de IKK-β, que persiste durante unas dos horas.
Sin embargo la activación de IKK-β es considerablemente menos intensa que la activación debida a las plaquetas
activadas.
Mediante la activación del complejo IKK con plaquetas activadas se activa por lo tanto la quinasa IKK-β de forma
intensa y de larga duración, lo que resulta decisivo para la activación de NF-κB en relación con la secreción de la MCP1, y por lo tanto para la formación de placas en los procesos ateroescleróticos. Este mecanismo no solamente afecta a
un paso decisivo en la regulación de procesos ateroescleróticos precoces, sino también en la formación, propagación
y desestabilización de las placas.
La invención propone por lo tanto el empleo de un inhibidor de IKK-β para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento de o a la prevención de la ateroesclerosis.
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La invención ofrece la ventaja de que durante la inhibición de IKK-β en una fase precoz de aterogénesis, la capa
endotelial todavía no está apantallada por la agregación de plaquetas o por la formación de trombos superficiales,
de manera que las células endoteliales pueden ser alcanzadas de forma sencilla y eficaz con inhibidores que influyen en una expresión de la MCP-1. Esta fase está caracterizada por unas lesiones endoteliales mínimas, a menudo
denominadas “fatty streaks”.
La invención ofrece además la ventaja de que con la inhibición del IKK-β en las células endoteliales que estén
contiguas a placas ateroescleróticas, se puede evitar el engrosamiento de las placas o se pueden estabilizar las placas
existentes.
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La invención ofrece además la ventaja de que se inhibe una proteína en la cascada de señales de la expresión de
MCP-1, la cual juega un papel principal en la activación mediante plaquetas activadas, aunque la proteína no es la
proteína NF-κB, cuya influencia directa daría lugar a efectos secundarios graves, ya que NF-κB también participa en
la expresión de otras proteínas, como por ejemplo en la expresión de citoquinas, quemocinas, factores de crecimiento,
por ejemplo TNF, IL-1β, IL-8, moléculas de adhesión, por ejemplo ICAM-1, VCAM-1 y ELAM-1, proteasas, como
por ejemplo MMP-9 y en la molécula protombógena TF. Mediante la inhibición IKK-β se inhibe más bien una proteína
que afecta a una vía de activación NF-κB eficaz, relacionada especialmente con procesos ateroescleróticos.
La invención ofrece además la ventaja de que al evitar una secreción de larga duración de la MCP-1 procedente
de células endoteliales, el efecto para evitar la inmigración de monocitos es incomparablemente superior que al evitar
una secreción de la MCP-1 de corta duración pero más intensa, tal como sucede en el caso de una inhibición de TNF.
La invención ofrece además la ventaja de que se puede regular el flujo de monocitos/macrófagos a la pared vascular,
a nivel de la capa endotelial y por lo tanto antes de que los monocitos/macrófagos hayan penetrado en la pared vascular.
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A diferencia de los tratamientos convencionales de ateroesclerosis, de acuerdo con la invención se puede elegir
una nueva clase de pacientes para una terapia, para quienes las terapias conocidas resultan ineficaces o para quienes
las terapias conocidas se consideran inaceptables debido a los efectos secundarios.
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Una primera subclase especial de pacientes incluye a aquellos que para evitar un episodio cardiovascular, tal como
apoplejía o infarto cardiaco, son tratados de acuerdo con la invención, como profilaxis primaria, con un inhibidor de
IKK-β, eligiéndose estos pacientes sobre la base de una evaluación de los factores de riesgo y/o basándose en un
diagnóstico de una fase precoz de ateroesclerosis, pudiendo asignarse a esta primera subclase especial.
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La elección y asignación de pacientes basándose en la evaluación de los factores de riesgo puede efectuarse sobre
la base de una evaluación de los factores de riesgo conocidos. La evaluación de los factores de riesgo que se hayan
determinado puede efectuarse de modo subjetivo, basándose en la experiencia general del médico que realiza el tratamiento, o de modo objetivo, basándose en procedimientos de evaluación normalizados. Se empleará preferentemente
el procedimiento de evaluación normalizado. En particular se empleará el sistema de evaluación propuesto por G.
Assmann y cols. (Circulation 2002; 105: 310-315), basado en el estudio PROCAM. En este sistema de evaluación se
asignan a los siguientes factores de riesgo particulares de un paciente unos coeficientes normalizados, de cuya suma
resulta un valor que está correlacionado con el riesgo de que aparezca un episodio cardiovascular agudo en los próximos diez años: edad, colesterina LDL, colesterina HDL, triglicéridos, fumador/no fumador, diabetes mellitus, casos
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de MI en la familia, así como la tensión arterial sistólica. Los pacientes que tengan un valor que sea superior o igual a
50 se pueden seleccionar y asignar a esta subclase.
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La elección y asignación de pacientes basándose en un diagnóstico de una fase precoz de ateroesclerosis puede
efectuarse tomando como base una evaluación de los síntomas conocidos de existencia de ateroesclerosis. En particular
se puede efectuar la selección basándose en una medición del espesor de pared intima-máxima de la arteria carotis
interna, donde un espesor superior a 1,2 mm es indicio de una alteración ateroesclerótica. La medición del espesor de
pared se efectúa mediante un aparato de ultrasonido que permita una resolución adecuada, tal como por ejemplo un
aparato de ultrasonido convencional con un cabezal sónico de 12 MHz.
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A esta subclase pueden pertenecer también pacientes en los que, hasta la fecha haya aparecido un episodio cardiovascular y que presenten placas ricas en lípidos o incluso placas con sedimentos de cal.
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De acuerdo con la invención, en esta subclase se puede impedir, mediante la administración de un inhibidor de
IKK-β, por profilaxis primaria, la progresión de las alteraciones ateroescleróticas de los vasos, de manera que se
reduce el riesgo de un episodio cardiovascular o el aumento del riesgo de un episodio cardiovascular.
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Una segunda subclase especial de pacientes se refiere a aquellos que, para evitar otros episodios cardiovasculares
como apoplejía o infarto, son tratados para profilaxis secundaria después de un episodio cardiovascular, de acuerdo
con la invención, con un inhibidor de IKK-β. En este caso, los pacientes se pueden seleccionar únicamente basándose
en el episodio primario y/o tal como se ha descrito anteriormente, basándose en una evaluación de los factores de
riesgo y/o basándose en un diagnostico de ateroesclerosis, asignándolos a esta segunda subclase especial.
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La presente invención se refiere también por tanto a procedimientos para la prevención o el tratamiento de la
ateroesclerosis, que están caracterizados porque a los pacientes se les administra un inhibidor de IKK-β. El inhibidor
se puede administrar de todas las formas conocidas. Por ejemplo, el inhibidor se puede administrar por vía enteral o
parenteral. El inhibidor también se puede administrar como fase previa, por ejemplo como vector, mediante una terapia
genética. La administración enteral se realizará preferentemente por vía oral. La administración parenteral puede
ser intravenosa, intraarterial, intramuscular o subcutánea, prefiriéndose la administración intravenosa o intraarterial.
También existe la posibilidad de combinar la administración del inhibidor por vía enteral, parenteral o mediante terapia
genética. Para el caso de que se tenga que administrar el inhibidor de forma repetida a lo largo de un periodo de tiempo
prolongado, se elegirá preferentemente un inhibidor que se pueda administrar por vía oral.
En una forma de realización preferida, se trata de pacientes pertenecientes a la primera subclase especial. En este
procedimiento para la prevención o el tratamiento de la ateroesclerosis antes de un episodio cardiovascular primario,
el inhibidor se administra preferentemente por vía oral.
En otra forma de realización preferida los pacientes son personas pertenecientes a la segunda subclase especial.
En este procedimiento para la prevención o el tratamiento de la ateroesclerosis antes de un episodio cardiovascular
primario, el inhibidor se administra preferentemente por vía oral.
En otra forma de realización preferida se trata de pacientes pertenecientes a la primera o a la segunda subclase
especial, administrándose el inhibidor como etapa previa a través de un vector en las células endoteliales de los vasos,
para tener dispuesto el inhibidor en las células endoteliales como producto de expresión de una o varias secuencias de
nucleótidos del vector. Este planteamiento ofrece la ventaja de que se evita la administración repetida al paciente de
un medicamento durante un período de tiempo prolongado.
A continuación se describe la invención con mayores detalles.
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La inhibición de IKK-β puede efectuarse a nivel de ADN por el hecho de que se impida la expresión de la proteína.
La inhibición puede iniciarse en todas las fases de la expresión genética, así por ejemplo en el propio gen o en los
productos de expresión tales como ARNs y proteínas. Por el estado de la técnica se conocen diversos procedimientos
para la alteración estructural de los genes. En particular, se remite al empleo de vectores especiales. En los ejemplos se
describe una utilización especial de un vector. La expresión de IKK-β se puede impedir además frenando la trascripción
o la traslación del gen IKK-β o del correspondiente ARNm. Como ejemplos de tales inhibidores se pueden citar los
ARN-antisense y las ribocimas.
La inhibición de IKK-β, sin embargo se puede efectuar también a nivel de proteína, inhibiendo para ello la función
de la proteína IKK-β expresada. La inhibición a nivel de proteína puede efectuarse mediante proteínas o no-proteínas.
Como ejemplos de proteínas inhibidoras pueden citarse anticuerpos que reaccionen con epitopos de IKK-β, o proteínas
que tengan una interacción con un punto activo de IKK-β impidiendo la actividad de fosforilización. Ejemplos de noproteínas son las substancias activas que tengan interacción con un punto activo de IKK-β e impidan la actividad de
fosforilización. Para ejemplos especiales de inhibidores moleculares de IKK-β se hace referencia expresa a la patente
US-A 5.939.302.
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El inhibidor es preferentemente selectivo para IKK-β.
En una forma de realización preferida de la presente invención, el inhibidor es un compuesto que frena la expresión
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del gen que codifica IKK-β, por ejemplo una ribocima o un ARN-antisense. En una forma de realización especialmente
preferida, el inhibidor es un ARN-antisense, que es complementario del ARNm transcrito por el gen codificado IKKβ o una parte de éste, preferentemente la zona codificada, y que se puede combinar específicamente con este ARNm,
con lo cual se reduce o frena la síntesis de IKK-β. En otra forma de realización especialmente preferida el inhibidor
es una ribocima, que es complementaria del ARNm transcrito por el gen codificado IKK-β o una parte de éste, y que
se puede combinar específicamente con este ARNm y disgregarse de éste, con lo cual se reduce o frena la síntesis de
IKK-β. Procedimientos adecuados para la preparación de ARN-antisense se describen en las patentes EB-B1 0 223
399 o EP-A1 0 458. Las ribocimas se componen de un único ramal de ARN y pueden fisionar intermolecularmente
otros ARNs, por ejemplo, los ARNm transcritos por las secuencias que codifican el IKK-β. Estas ribocimas han de
disponer principalmente de dos dominios, (1) un dominio catalítico γ (2) un dominio que sea complementario del
ARN de destino, y que se pueda combinar con éste, lo que constituye una condición previa para la fisión del ARN
de destino. Partiendo de las formas de proceder descritas en la bibliografía existe mientras tanto la posibilidad de
construir ribocimas específicas que seccionen un ARN deseado en un punto determinado preseleccionado (véase por
ejemplo: Tanner y cols., en: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993, 415-426).
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En otra forma de realización preferida, el inhibidor es un vector.
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En otra forma de realización preferida, el inhibidor es un anticuerpo que combina IKK-β o un fragmento de éste.
Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales o sintéticos, o fragmentos de éstos. A este respecto, el concepto de “fragmento” se refiere a todas las partes del anticuerpo monoclonal (por ejemplo fragmentos Fab,
Fv o “single chain Fv”), que tengan la misma epitopoespecificidad que el anticuerpo completo. Los anticuerpos objeto
de la invención son preferentemente anticuerpos monoclonales. El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo
procedente de un animal (por ejemplo ratón), un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico o un fragmento de
éstos. Los anticuerpos quiméricos, semejantes a los anticuerpos humanos o los anticuerpos humanizados, poseen un
carácter antígeno potencial reducido, pero en cambio no está reducida su afinidad con respecto al objetivo. La preparación de anticuerpos quiméricos y humanizados, o de anticuerpos semejantes a anticuerpos humanos ya ha sido descrita
detalladamente (véase por ejemplo Queen y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, y Verhoeyan y cols.,
Science 239 (1988), 1534). Las inmunoglobulinas humanizadas presentan unos sectores de estructura básica variable,
que proceden esencialmente de una inmunoglobulina humana (con la designación de inmonoglobulina-aceptador) y
la complementariedad de los sectores determinantes que proceden esencialmente de una inmunoglobulina no-humana
(por ejemplo de ratón) (con la designación de inmunoglobulina de donante). El sector o sectores constantes proceden,
en su caso, también esencialmente de una inmunoglobulina humana. En la administración a pacientes humanos, los
anticuerpos humanizados (así como los humanos) presentan una serie de ventajas frente a los anticuerpos procedentes
de ratones o de otras especies: (a) el sistema inmunitario humano no debería reconocer como extraña la estructura
básica o el sector constante del anticuerpo humanizado y por lo tanto, la respuesta inmune contra un anticuerpo de
esta clase que haya sido inyectado debería ser menor que frente a un anticuerpo de ratón totalmente extraño o un
anticuerpo quimérico parcialmente extraño; (b) dado que el campo efector del anticuerpo humanizado es humano,
interactúa mejor con otras partes del sistema inmunitario humano, y (c) los anticuerpos humanizados inyectados presentan un tiempo de semidesintegración que es esencialmente equivalente al de los anticuerpos humanos naturales, lo
que permite administrar dosis menores y con menor frecuencia en comparación con los anticuerpos de otras especies.
También se pueden utilizar ácidos nucleicos que combinen directamente con las proteínas, los llamados aptámeros. Estos se identifican y depuran a través de las proteínas depuradas de grandes bibliotecas de ARNs modificados
químicamente.
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Los inhibidores de aptámeros, de ribocima, de ARN anti-sense y de anticuerpos se pueden administrar como tales
o también preferentemente a través de la terapia genética, para lo cual se insertan preferentemente en un vector de
expresión unas secuencias de ADN codificadas adecuadas y se llevan al tejido de destino. De esta manera, la presente
invención comprende también vectores de expresión que contengan estas secuencias de ADN que codifiquen los inhibidores. La expresión “vector” se refiere a un virus o a otro vehículo adecuado. Las secuencias de ADN están enlazadas
funcionalmente en el vector con elementos reguladores, que permiten su expresión en células huésped eucarióticas.
Estos vectores contienen además de los elementos reguladores, por ejemplo un promotor, típicamente un origen de
replicación y genes específicos que permiten la selección fenotípica de una célula huésped transformada. Secuencias
reguladoras adecuadas se describen además en Goeddel: Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology, 185,
Academic Press, San Diego, CA (1990). Entre los vectores de expresión adecuados para células de mamíferos se cuentan por ejemplo los vectores procedentes de pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 y pCEV4 así como de pcDNA/amp,
pcDNAZ/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, psV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y de pHyg.
Las secuencias de ADN descritas anteriormente se insertan preferentemente en un vector adecuado para la terapia
genética, por ejemplo bajo el control de un promotor específico del tejido, y se transportan al interior de las células.
En una forma de realización preferida el vector que contiene las secuencias de ADN antes descritas es un virus, como
por ejemplo un adenovirus, un virus adeno-asociado, vaccinia-virus o retrovirus. Ejemplos de retrovirus adecuados
son MomuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV o GaLV. Se prefieren especialmente los adenovirus, en particular aquellos que
contienen mutaciones E1 y/o E3 (delecciones), que pueden presentar adicionalmente una mutación E4 (delección) o
los llamados adenovirus “glutless”. Los vectores adecuados para una terapia genética se describen además en las WO
93/04701, WO 92/22635 WO 92/20316, WO 92/19749 y WO 92/06180. Para los fines de terapia genética, las secuencias de ADN objeto de la invención también se pueden transportar a las células de destino en forma de dispersiones
coloidales. Esto incluye por ejemplo los liposomas o los lipoplexos (Mannino y cols., Biotechniques 8 (1988), 682).
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Para la construcción de los vectores de expresión que contengan estas secuencias de ADN y secuencias de control
adecuadas se pueden emplear procedimientos generales conocidos en el campo técnico. Estos conocimientos incluyen,
por ejemplo técnicas de recombinación in vitro, procedimientos sintéticos así como procedimientos de recombinación
in vivo, tal como se describen en los libros de texto corrientes.
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Los compuestos anteriores o que contengan estas secuencias de ADN codificadas o vectores se administran eventualmente con un soporte farmacéuticamente compatible.
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El técnico conoce soportes adecuados y la formulación de esta clase de medicamentos. Entre los soportes adecuados se encuentran, por ejemplo, soluciones de sal de cocina tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, por ejemplo
emulsiones de aceite/agua, humidificantes, soluciones estériles, etc. La dosis adecuada la determina el médico que
realiza el tratamiento, y depende de diversos factores, como por ejemplo, de la edad, del sexo, del peso del paciente,
de la clase y fase de la cardiopatía o de la forma de administración.
En otra forma de realización preferida, el inhibidor es una sustancia activa que se elije de entre el grupo siguiente:
Sulinda (véase Y. Yamamoto y cols., J. Biol. Chem. 1999; 274 (38): 27307-14); NEMO-binding domain peptide
(véase May Mj. y cols., Science 2000; 289: 1550-4); 3-[(4-metilfenil)-sulfonil]-2-propenonitrilo y 3-[(4-t-butilfenilsulfonil]-2-propenonitrilo (véase J. W. Pierce y cols., J. Biol. Chem. 1997; 272(34)).
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La presente invención presenta además un procedimiento de screening (selección primaria) para la localización
de inhibidores selectivos de IKK-β, en elcual se utilizan células endoteliales activadas para ensayar la eficacia de las
sustancias activas potenciales, especialmente para evitar una secreción de la MCP-1.
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Una actividad enzimática o expresión genética reducida o totalmente frenada indica que el compuesto objeto del
ensayo es eficaz como inhibidor. El especialista conoce ensayos adecuados. Este procedimiento se lleva a cabo en
un ensayo celular, en el que se emplean células endoteliales. En cuanto a los compuestos objeto del ensayo se puede
tratar de compuestos muy diversos, tanto de compuestos de origen natural como también sintéticos, orgánicos e inorgánicos, así como de polímeros (como por ejemplo oligopéptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y polinucleótidos),
así como de pequeñas moléculas, anticuerpos, azúcar, ácidos grasos, nucleótidos y análogos a nucleótidos, análogos de estructuras de origen natural (por ejemplo “imitadores” de péptido, análogos de ácido nucleico, etc.) y otros
numerosos compuestos. Además de esto se pueden clasificar como material de partida gran número de compuestos
frenadores de IKK-β posiblemente útiles, en extractos de productos naturales. Estos extractos pueden proceder de una
gran diversidad de fuentes, por ejemplo de especies de hongos, actinomicetos, algas, insectos, protozoos, plantas y
bacterias. Los extractos que presenten actividad se pueden analizar entonces para aislar la molécula activa. Véase por
ejemplo Turner, J. Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 3943 y Suh, Anticancer Res. 15 (1995) 233-239. En la industria
biotecnológica y farmacéutica se conocen bien formatos de ensayo básicamente adecuados para la identificación de
compuestos de ensayo que influyan en la expresión o actividad de IKK-β y para el técnico resultan evidentes otros
ensayos adicionales y variaciones de estos ensayos. Las alteraciones en el nivel de expresión IKK-β se pueden investigar utilizando procedimientos bien conocidos para el especialista. Esto incluye la vigilancia de la concentración
de ARNm (por ejemplo utilizando sondas o cebadores adecuados), inmunoensayos en cuanto a la concentración de
proteínas, ensayos de protección de ARN, ensayos de amplificación y cualquier otro medio que sea adecuado para una
demostración y que sea conocido para el especialista.
La búsqueda de inhibidores también puede efectuarse a gran escala, por ejemplo clasificando en bibliotecas de
sustancias un número muy grande de compuestos candidatos, pudiendo contener las bibliotecas de sustancias molécula
sintéticas y/o naturales.
En cualquier caso, la preparación y clasificación simultánea de grandes bancos de moléculas sintéticas puede realizarse mediante procedimientos bien conocidos de la química combinatoria, véase por ejemplo van Breemen, Anal.
Chem. 69 (1997), 2159-2164 y Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167. El procedimiento objeto de la invención también se puede acelerar intensamente como screening (selección primaria) de alto caudal (“high throughput
screening”). Los ensayos aquí descritos se pueden modificar debidamente para utilizarlos en un procedimiento de esta
clase.
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La figura 1 muestra interacciones entre plaquetas y células endoteliales in vivo. Las interacciones de células endoteliales y plaquetas se investigaron mediante microscopía intravital en arteriolos de la microvascularización de un
intestino de ratones, que habían sido sometidos a condiciones isquémicas (ACTIVADO, activated). Unos animales experimentales sirvieron como control (en reposo, resting). Figura 1A: Las plaquetas se clasificaron de acuerdo con sus
interacciones con las células endoteliales, tal como se describe en el estado de la técnica (1, 2): las plaquetas rodantes
se indican como número de células por segundo y milímetro de diámetro de vaso (Rolling); las plaquetas adheridas
se indican como cantidad por mm2 de superficie vascular (Firm adhesion), valor medio +- SEM, n = 6 animales de
ensayo por grupo. *p < 0,01 con respecto a los experimentales (Método de Dunn’sche). Figura 1B: Plaquetas marcadas
con rodamina-6G se hicieron visibles en arteriolos empleando microscopía fluorescente intravital. Aunque sólo hay
pocas plaquetas adheridas en el endotelio en los animales experimentales, la adherencia de las plaquetas en las células
endoteliales aumenta de forma significativa en condiciones de isquemia. Ampliación de las tomas: 450 veces.
La figura 2 muestra una adherencia de plaquetas - endotelios hecha visible mediante microscopía electrónica, sobre
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una monocapa endotelial. Se empleó la miscroscopía electrónica para mostrar que las plaquetas se adhieren a una
monocapa endotelial postisquémica intacta. Figura 2A: Se muestra una plaqueta rodante con contacto suelto respecto
al endotelio. Obsérvese el aspecto normal y la distribución normal de los gránulos de plaquetas. La figura 2B muestra
una plaqueta firmemente adherida a la monocapa endotelial. En las zonas de separación y de firme adherencia la
plaqueta ha sufrido una desgranulación significativa, lo cual es indicio de una segregación de compuestos procedentes
de la plaqueta. Ampliación: 20.000 veces. Las barras significan 0,5 µm.
La figura 3 muestra que la adhesión de las plaquetas al endotelio está relacionada con una activación de NF-κB.
Unos cortes criostáticos de muestras de intestino se incubaron con un anticuerpo monoclonal (mAb) frente a p65 (=
NF-κB activado) emitido por IκB, seguido de un teñido sirviéndose de la técnica de peroxidasa - antiperoxidasa. La
inmunoreactividad p65 queda señalizada por el producto de reacción rojo (que en la figura aparece oscuro). Figura
3A: En los animales de control (Resting), en el endotelio vascular no había prácticamente ninguna inmunoreactividad
de p65. Figura 3B: En experimentos con adhesión endotélica de plaquetas intensificada (Activated) se encontró más
intensamente una coloración p65 en los arteriolos y en el tejido circundante. Figura 3C: En las zonas con acumulación
masiva de plaquetas, que se muestra en una ampliación de un detalle de la Figura 3B, el p65 emitido por IκB se
encontraba preferentemente en la monocapa endotelial (flechas). Ampliación: 40 veces en la figura 3A y 3B y 100
veces en la figura 3C. Las barras significan 10 µm.
La figura 4 muestra el efecto de una interacción transitoria de plaquetas activadas con HUVEC sobre la secreción
de la MCP-1. El HUVEC se trató, con o sin plaquetas activadas, con α-trombina (PLT; 2 × 108 /ml), IL-1β (100 pg/ml)
o TNF (1,67 ng/ml), durante 5 a 300 minutos. A continuación se eliminaron las plaquetas o citoquinas mediante lavado
y se añadió nuevo medio de cultivo. Las células se incubaron durante un total de 5 horas. A continuación se aspiró el
exceso y se empleó un ELISA para medir la MCP-1. Las curvas muestran el valor medio +/- la desviación estándar de
cuatro experimentos independientes, cada uno de los cuales se realizó tres veces.
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La figura 5 muestra la activación de NF-κB dependiente de la simulación y la descomposición de IκB en HUVEC.
Figura 5A: Extractos de núcleo de HUVEC estimulado con plaquetas (PLT; 2 × 108 /ml) se investigaron mediante
EMSA en cuanto a NF-κB o combinación Sp-1, lo que está representado entre paréntesis. Figura 5B: Se analizaron
extractos de citosol procedentes de células estimuladas con plaquetas sirviéndose de Western-Blots. Las proteínas IκBα, IκB-ε, IKK-α e IKK-β están indicadas mediante puntas de flecha. Como control de carga sirvió α-actina. Figura 5C:
Se investigaron extractos de citosol procedentes de células estimuladas con IL-β (100 pg/ml) sirviéndose de WesternBlots. Figura 5D: Las células se incubaron con TNF (1,67 ng/ml) y los extractos de citosol se investigaron sirviéndose
de Western-Blots. La flecha superior muestra las formas fosforilizadas de IκB-α o -ε. Para todos los casos se muestra
un Blot representativo (n = 3).
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La figura 6 muestra la activación compleja diferencial IKK en células endoteliales. Las células se incubaron tal
como se ha indicado y se prepararon extractos de citosol. Después de una immunoprecipitación (IP) mediante anticuerpos de antiquinasa, tal como se ha indicado, se efectuó un ensayo de quinasa, empleando el sustrato GST.IκB-α
en presencia de 32 P-ATP. Se muestra una fosforilización del sustrato en función del tiempo, respectivamente después
de la estimulación de HUVEC con plaquetas (PLT; 2 × 108 /ml) (figura 6A), IL-1β (100 pg/ml) (figura 6B) o TNF
(1,67 ng/ml) (figura 6C). Para cada uno de los casos se muestra un experimento representativo (n = 3). Figura 6D: Los
ensayos de quinasa se escanearon y se analizaron por densitometría. El diagrama muestra los factores de inducción de
la actividad IKK frente a los controles, después de la estimulación.
La figura 7 muestra que la transcripción dependiente del Promotor κB- y MCP-1/VCAM-1 se inhibe por sobreexpresión de componentes del complejo IKK dominantes negativos. Figura 7A y figura 7B: Se cotransformaron células
ECV304 mediante 3kB.luci, pRLtk y plásmidos de hiperexpresión de quinasa (IKK-α, -β o NIK, tipo salvaje o mutado, o un vector vacío, CVM), en transformacionesindividuales o dobles, tal como se ha indicado. Después de una
incubación durante una noche se estimularon las células, bien con plaquetas activadas (PLT; 108/ml) (figura 7A) o IL1β (100 pg/ml) (figura 7B), durante 60 minutos. Al cabo de otras 15 horas se lisaron las células y se midió el RLU de
luciérnaga y de Renilla. Los resultados se muestran como múltiplos de la inducción respecto a aquellos que se habían
obtenido con células transformadas CMV sin estimular. Las barras de la izquierda muestran el efecto bien de NIK
salvaje (wt) o mutado así como de IKK-α y -β sobre la transcripción dependiente de κB inducida por el estímulo. Se
muestran ensayos representativos (n = 3). Con; células no estimuladas. Figura 7C: Unas células tal como las indicadas
se transformaron bien mediante un plásmido reporter de luciferasa dependiente de un promotor MCP-1 o VCAM1, junto con pRLtk e IKK, a través de plásmidos de expresión. Después de una estimulación con plaquetas o IL-1β
se midió el RLU de luciérnaga y de Renilla. Los resultados se muestran como porcentaje de inhibición obtenido en
relación con las células transformadas con el tipo salvaje (wt), que se indican en la línea de puntos en el 100%. Las
barras muestran el valor medio ± desviación estándar procedentes de tres experimentos independientes. α, IKK-α; β,
IKK-β: KA el punto activo de quinasa está mutado.
La figura 8 muestra que el transfer IKK-β dominante negativo transmitido mediante rAAV inhibe una secreción
endotelial de la MCP-1 inducida por plaquetas e IL-1β. Los subconfluentes HUVEC se dejaron sin tratar, o se transformaron mediante mutantes de control, rAAV-GFP, rAAV-IKK-β tipo salvaje o rAAV-IKK-βκA mutante dominante
negativo. 48 horas después de una transformación se dejaron las células sin tratar o se estimularon durante 60 minutos
con plaquetas activadas (PLT; 2 × 108 /ml) o IL-1β (100 pg/ml), se lavaron y se siguieron incubando tal como está
indicado. Figura 8A: Las células se investigaron en cuanto a expresión GFP mediante citometría de flujo, para determinar el rendimiento de transformación. La curva señalada como non infected muestra células no infectadas, y la curva
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marcada con rAAV-GFP-infected muestra células que fueron tratadas con rAAV-GFP. Aproximadamente el 50% de
los HUVEC se infectan con rAAV-GFP. Figura 8B: Una expresión de GFP se analizó mediante microscopía fluorescente. Imagen superior: Contraste de fases de la monocapa HUVEC; Imagen inferior: La correspondiente micrografía
de fluorescencia verde (puntos claros). Figura 8C: Se investigaron extractos de citosol de HUVEC transformados con
rAAV-IKK-β, rAAV-IKK-βκA o rAAV-GFP mediante Western-Blots en cuanto a proteína IKK-β endógena (GFP) y
sobreexprimida. Como control de carga se utilizó α-actina. Figura 8D: 4 horas después del lavado se determinó cuantitativamente la MCP-1 soluble en el remanente de las células, sirviéndose de ELISA. Los datos se muestran como
valor medio ± desviación estándar, procedente cada uno de tres experimentos realizados por duplicado.
La invención se describe a continuación con mayor detalle sirviéndose de algunos ejemplos especiales.
Ejemplos
Materiales y métodos
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Animales y microscopía de fluorescencia intravital
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Se emplearon ratones hembra Balb/c (Charles River, Sulzfeld) de 5 a 7 semanas de edad (10 animales de ensayo,
10 donantes de plaquetas). El procedimiento quirúrgico es parte del estado de la técnica (1, 2). En particular, se separó
hacia el exterior un segmento del yeyuno y se sometió a una isquemia normotérmica de 60 minutos. Las plaquetas
de los ratones se aislaron de plétora y se marcaron con rodamina-6G. Las interacciones entre plaquetas y células
endoteliales se investigaron en la microvascularización postisquémica en arteriolos submucosas mediante microscopía
intravital, 60 minutos antes y 60 después de la isquemia. Se eligieron al azar cinco zonas interesadas, que no se
solapaban y se llevó a cabo una determinación cuantitativa de las interacciones de plaquetas-células endotelicas. Estas
interacciones se clasificaron como adhesión de plaquetas rodante (“Rolling”) o firme.
Microscopio electrónico e investigaciones inmunohistoquímicas
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Se tomaron muestras de los segmentos del intestino 60 minutos antes y 60 minutos después de la isquemia. Para
fines de microscopía electrónica se fijó el tejido y se trató tal como se describe en el estado de la técnica (2). Se cortaron zonas ultradelgadas y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se investigaron bajo un microscopio
electrónico de transmisión Zeiss EM 900 (Zeiss, Oberkochen), que funciona a 80 kV. A efectos del teñido inmune las
biopsias se colocaron en un compuesto O.C.T. (Tissue-Tek; Miles Inc., Elkhart, IN, USA) y se congelaron inmediatamente con nitrógeno líquido. Para hacer visible el NF-κB activado se incubaron cortes crioestáticos fijados con acetona
(6 µm) con α-p65mAb ratón antihumano conjugado con biotina (Roche Diagnostics, Mannheim), que reacciona selectivamente con p65 sólo en ausencia de IκB, y que por lo tanto reconoce la forma activada de NF-κB, y que reacciona de
forma cruzada con los correspondientes antígenos de ratón (3). Después de una incubación con el anticuerpo primario
se tiñeron las secciones con kits de inmunoistoquimia de peroxidada (Vectastain, Camon, Wiesbaden). La actividad
endógena de peroxidada se bloqueó mediante metanol H2 O2 durante 10 minutos a temperatura ambiente.
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Cultivo de las células
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Se obtuvieron cultivos primarios de células endótelicas de vena de ombligo humano (HUVEC) mediante tratamiento con colagenasa de venas umbilicales, tal como se describe en (4). Se reunieron las células de 4 - 6 preparaciones
y se cultivaron sobre placas de cultivo con 24 depresiones en un medio de cultivo de células endótelicas completo
(PromoCell, Heidelberg), que contenía un 2% de FCS, 1 µg/ml de hidrocortisona, 0,1 ng/ml de hEGF, 1,0 ng/ml de
FGF, 50 µg/ml de gentamicina y 2,5 µg/ml de anfotericina B.
La línea de células endoteliales humanas ECV304 (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA) se
cultivó en M199, que estaba enriquecido con 10% de FCS, 1% de piruvato sódico, 1 mM de L-glutamina, 100 U/ml de
penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina (Biochrom, Berlín). Con el fin de eliminar la contaminación por endotoxinas
se sometieron todas las soluciones cristaloides a ultrafiltración (U 200, Gambro, Hechingen), y las soluciones madre
de proteínas se descontaminaron mediante columnas de polimixina (Pierce, Rockford, IL, USA). Para excluir la contaminación por endotoxinas se evaluaron todas las suspensiones de células en un ensayo de lisado con amoebocito con
limulus que formaba colorante (Schulz, Heidelberg), después de cada uno de los experimentos.
Determinación de la MCP-1
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Las concentraciones de proteína MCP-1 se determinaron en los remanentes de HUVEC mediante ELISA (Quantikine R&D, Wiesbaden-Nordenstadt).
Cultivo conjunto de monocapas de endotelios con plaquetas
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Las plaquetas se aislaron de plétora tratada con anticoagulante ácido-citrato-dextrosa, obtenido de personas sanas,
que no eran fumadoras, que no estuvieran bajo la influencia de ningún medicamento del que se sepa que influye en la
función de las plaquetas. Las plaquetas se lavaron y se resuspendieron en solución de Tyrode tampón/HEPES (HEPES
2,5 mM, 150 mM de NaCl, 12 mM de NaHCO3 , 2,5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 , 5,5 mM de
D-glucosa, 1mg/ml de BSA, pH 7,4), para obtener un número de plaquetas de 4 × 108 /ml tal como se describe en
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(5). Las plaquetas se preestimularon durante 20 minutos con 2 U/ml de α-trombina (Sigma, Deisenhofen), seguido
de una antagonización de la trombina mediante 5 U/ml de hirudina (Roche Diagnostics). Se verificó la activación de
las plaquetas mediante la determinación de la expresión superficial P-selectin y del receptor del fibrinógeno activado
(LIBS-1, Dr. Mark Ginsberg, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Se añadió 1 ml de la suspensión de
plaquetas a 1 ml de medio completo (cantidad final de plaquetas 108 /ml) y se pasó a depresiones con monocapas
confluentes HUVEC sobre placas con 6 rebajes. Las células se dejaron sin tratar o se incubaron a 37ºC con plaquetas
tal como se indica.
Por último se eliminaron las plaquetas mediante varias etapas de lavado cuidadosas y se añadió medio de cultivo
a las depresiones hasta que hubo trascurrido el tiempo total de incubación. Mediante investigaciones provisionales,
utilizando un anti-CD42b mAb específico para plaquetas se aseguró por vía microscópica y citometría de flujo que
mediante el lavado se habían eliminado todas las plaquetas de la monocapa de endotelio.
Electrophoretic mobility shift assay (EMSA = Ensayo de retardo con gel)
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Se prepararon y se analizaron extractos de núcleos de las células tal como se describe en el estado de la técnica
(6). El oligonucleótido prototípico de cadenas de κ inmunoglobulina se empleó como sonda y se marcó mediante el
fragmento Nenow de ADN polimerasa I (Roche Diagnostics). Las proteínas de núcleo se incubaron durante 30 minutos
a temperatura ambiente en un tampón de combinación (6), mediante sondas radiomarcadas con [α-32 P]dCTP (NEN
Life Science Products, Bruselas, Bélgica). Las muestras se dejaron correr en 0,25x TBE sobre geles de poliacrilamida
al cuatro por ciento no desnaturalizadas. La combinación del factor de transcripción Sp-1 se analizó utilizando un
oligonucleótido de consenso (Promega, Heidelberg), que estaba marcado con [γ-32 P]ATP (NEN Life Science Products)
y T4 quinasa de polinucleótido (Roche Diagnostics). Los geles se secaron y se analizaron por autoradiografía.
PAGE y análisis Western Blot
Se aislaron extractos de citosol y se llevó a cabo una electroforesis y un blotting tal como se describe en el estado
de la técnica (6, 7). Después de transferirlas las membranas se incubaron con anticuerpos contra IκB-α (Santa Cruz
Biotechnology, Heidelberg), IκB-ε (Profesor N. Rice, NIH, Frederick, MD), IKK-α, IKK-β (Santa Cruz Biotechnology) o α-actina (Sigma). Las proteínas se hicieron visibles sobre película de rayos X utilizando un reactivo químico
luminiscente Western Blot (NEN Life Science Products). Los tamaños de las proteínas se confirmaron por medio de
patrones de peso molecular (Amersham Pharmacia Biotech, Braunschweig, Bio-Rad, Munich).
Inmunoprecipitación y ensayo de quinasa
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Los extractos de citosol se sometieron a una inmunoprecipitación (IP) (7) en tampón TNT, que contenía 1 mM
de ditiotreitol, 0,5 µM 4-(2-aminoetil)-benzolsulfonilfluoruro (AEBSF) y 0,75 µg/ml respectivamente de leupeptina,
antipaina, aprotinina, pepstatina A, quimostatina (Sigma). Las combinaciones no específicas se bloquearon mediante
incubación con 1 µg de IgG de conejo normal (Santa Cruz Biotechnology) y 25 µl de 6% proteína A-Agarosa (RocheDiagnostics) durante 30 minutos a 4ºC, seguidos de una inumnoprecipitación durante 2 horas a 4ºC con 1 µg de un
anticuerpo antiquinasa adecuado (Santa Cruz Biotechnology). Después de lavar tres veces respectivamente con TNT
y tampón de quinasa (20 mM HEPES, pH 8,0; 10 mM de MgCl2 , 100 µM de Na3 VO4 ; 20 mM de β-glicerofosfato; 50
mM de NaCl; 2 mM de ditiotreitol; 0,5 µM AEBSF, 0,75 µg/ml respectivamente de leupeptina, antipaina, aprotinina,
pepstatina A, quimostatina), se analizaron las proteinas precipitadas mediante un ensayo de quinasa. La reacción se
llevó a cabo en un tampón de quinasa durante 30 minutos a 30ºC en presencia de 5 µCi [γ-32 P]ATP (NEN Life Science
Products) y GST-IκB-α (Santa Cruz Biotechnology).Las proteínas se analizaron mediante PAGE y se hicieron visibles
mediante autorradiografía.
Transfección de células endoteliales
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En las investigaciones sobre transfección se emplearon los siguientes plásmidos reporter:
- 3xκB-luci, un plásmido reportador de luciferasa de la luciérnaga, que contiene tres copias de un punto κB
prototípico (7);
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- VCAM-1.luci, comprendiendo 1811 pares de bases de la gama del promotor VCAM-1 (Dr. Nigel Mackmann, Scripps Research Instituite, La Jolla, CA); y
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- -MCT-1.luci, conteniendo las zonas proximales de promotor y distales de reforzador del gen MCP-1 humano (8, 9) (Dr. Teizo Yoshimura, NIH, Frederick, MD).
Se emplearon los siguientes plásmidos de hiperexpresión:
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- IKK-β
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(Tipo salvaje y mutado, formas inactivas de quinasa, Dr. Mike Rothe, Tularik Inc., South San Francisco, CA).
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Como control negativo se empleó ROCMV vacío (Invitrogen, Groningen, Holanda). Estos plásmidos se cotransformaron solos o en combinación, de forma transitoria, con un plásmido de control de luciferasa Renilla, constitutivamente activo, PRLtk (Promega), en células endoteliales, tal como se describe en el estado de la técnica (10). Al cabo de
24 horas se estimularon las células durante 60 minutos, bien con IL-1β o con plaquetas, seguido de un cultivo durante
otras 15 horas. Después de la estimulación se lisaron las células y se determinó la actividad de luciferasa, utilizando el
sistema de ensayo dual reportero de luciferasa (Promega). Los resultados se expresan como relación entre las unidades
luminosas relativas (RLU) de piróforos y luciferasa-renilla.
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Construcción y depuración de un virus recombinante adeno-asociado
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El plásmido pTR-UF5 fue facilitado por Dr. Muzyczka (Gene Therapy Center, Gainsville, Florida) (11, 12) y el
plásmido pDG fue facilitado por Dr. Kleinschmidt (Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Heidelberg, Alemania) (11, 13). Se construyó un virus recombinante, adeno-asociado deficiente de replicación (rAAV), que contiene la
proteína fluorescente verde (rAAV-GFP) del tipo humano IKK-β (rAAV-IKK-β) o IKK-βKA mutado(rAAV-IKK-βKA ),
en la forma siguiente: La secuencia de codificación de tipo salvaje o del IKK-β mutado se insertó en la secuencia
multienlace del vector pTR-UF5. Los plásmidos contenidos se cotransformaron a continuación con el plásmido pDG
en células subconfluentes HEK 293 empleando un método modificado de coprecipitación de fosfato cálcico, y la generación de rAAV se realizó tal como se describe en el estado de la técnica (13, 14). El título de las partículas virales
infecciosas (IVP) se evaluó mediante infección de células HeLa proliferantes.
Transducción de células endoteliales
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HUVEC se extendió sobre placas con 96 depresiones a razón de 104 células por depresión, en 200 µl de medio de
cultivo. Al producirse la subconfluencia, aproximadamente 16 a 24 horas más tarde, se añadieron a cada célula de 1 a 3
× 103 IVP de rAAV. Los medios se cambiaron 16 horas después de añadir rAAV, y las células transducidas se cultivaron
durante otras 48 horas. A continuación se estimularon las células durante 60 minutos con plaquetas activadas con IL1β o α-trombina, evaluándose 4 horas más tarde una secreción de MCP-1. El rendimiento de la transducción endotelial
rAAV-GFP se evaluó mediante citometría de flujo, microscopía fluorescente y Western Blot.
Resultados
Interacción de plaquetas en vivo
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El modelo de ratón de la isquemia aquí utilizado permite diferenciar distintas clases de adhesión de plaquetas, que
se hizo visible mediante microscopía intravital.
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En estado fisiológico in vivo, las plaquetas circulantes raras veces interactúan con el endotelio microvascular (figura
1A y B en reposo). Se observaron pocas plaquetas que rodaban a lo largo del revestimiento de células endoteliales de
los arteriolos (< 1/s/ml). Al mismo tiempo, por mm2 de superficie de células endoteliales se encontraron únicamente
38 ± 16 plaquetas firmemente adheridas.
En cambio, en el caso de realizar mediciones similares en arteriolos bajo condiciones de isquemia (isquemia de
60 minutos) se halló una adhesión de plaquetas en células endoteliales tremendamente incrementada (figura 1 A y B
activada). Se halló un incremento de aproximadamente 160 veces en la interacción rodante y un incremento de 13
veces de la adhesión firme de las plaquetas en endotelio isquémico (P <0,01).
Adhesión firme de plaquetas en el endotelio, que induce una secreción de gránulos
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Para investigar las alteraciones morfológicas que tienen lugar en las plaquetas cuando éstas se adhieren in vivo al
endotelio vascular se realizaron investigaciones con microscopio electrónico. Se halló que algunas plaquetas aisladas
se adhieren a las células del endotelio también en ausencia de agregados, sin que se pudieran reconocer defectos
en la capa de células del endotelio (figura 2). Estas plaquetas adheridas de manera suelta a las células del endotelio
(Rolling) mostraban el dibujo típico de gránulos completos que todavía no están desgranulados (figura 2a). En cambio
las plaquetas que están extendidas sobre la superficie de las células del endotelio (adhesión firme) están caracterizados
por una intensa secreción de sus gránulos, tal como está demostrado por los organelos vacíos que se hallan en estas
zonas (figura 2B).
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NF-κB se activa en la microvascularización en las zonas de adhesión de plaquetas
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Por las investigaciones in vitro se conoce que la interacción de las plaquetas activadas con células del endotelio
(co-cultivo permanente) dan lugar a una expresión de genes de quemoquinas y moléculas de adhesión, a través de
una activación de NF-κB. Para investigar la activación de este factor de transcripción en zonas de mayor adhesión de
plaquetas al endotelio en la microvascularización, se llevó a cabo una inmunohistoquimia sobre cortes criostáticos,
utilizando un mAb contra la subunidad NF-κB p65 liberada por IκB. En ratones experimentales falta casi totalmente la
activación de NF-κB (figura 3A, Resting). En condiciones de una interacción más intensa entre plaquetas y endotelio
se observó en la microvascularización una mayor inmunoreactividad de NF-κB activado, mostrado por marcación p65
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((figura 3B, activado) y principalmente en la monocapa del endotelio contigua a los agregados de plaquetas (figura
3C). Esto indica que una adhesión más intensa de plaquetas al endotelio da lugar a una activación de NF-κB in vivo.
La incubación transitoria de HUVEC con plaquetas activadas induce una secreción de MCP-1
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Dado que se observaron cantidades significativas de NF-κB activado en zonas que mostraron adhesión de plaquetas,
se investigaron los efectos de las plaquetas activadas sobre HUVEC activados. Primeramente se investigó in vitro el
desarrollo a lo largo del tiempo de la secreción de endotelios inducida por plaquetas en quemoquina MCP-1, que se
regula mediante NF-κB (8,9). Unas monocapas confluentes de HUVEC se dejaron sin tratar o se incubaron durante 5
a 300 minutos con plaquetas activadas con α-trombina, 100 pg/ml de IL-1β o 1,67 ng/ml de TNF. A continuación se
retiraron las plaquetas o las citoquinas de la monocapa endotelial y se determinó la cantidad de MCP-1 en el remanente
después de otras 4 horas de incubación (co-cultivo transitorio).
La incubación transitoria de HUVEC con plaquetas activadas durante 30 minutos dio lugar a un fuerte aumento
de la secreción de MCP-1, que es comparable con una estimulación IL-1β (figura 4), siendo algo más débil el efecto
TNF. La incubación de HUVEC con plaquetas en reposo no indujo ningún incremento significativo de la secreción de
MCP-1.
Activación endotelial de NF-κB y muestras de proteólisis IκB-α/ε, tras la incubación de plaquetas
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Con el fin de seguir aclarando el mecanismo mediante el cual las plaquetas inducen la expresión de productos
genéticos de destino NF-κB tales como MCP-1, se llevaron a cabo experimentos para la determinación del tiempo
con el fin de observar una activación de NF-κB que se determinó mediante EMSA. Las plaquetas activadas indujeron
una activación intensa y dependiente del tiempo de NF-κB en HUVEC, observándose los efectos máximos al cabo
de 60 minutos (figura 5A). En los mismos extractos de núcleos se investigó también la combinación de proteínas con
oligonucleótidos Sp-1, que actúan como Loading-Control (figura 5A).
A continuación se investigó el marco de tiempo y el volumen de proteólisis inducida por las plaquetas en la proteína
inhibidora IκB. La incubación de HUVEC con plaquetas activadas así como IL-1β dio lugar a una proteólisis importante de IκB-α e IκB-ε (figuras 5B y C). A pesar de que las muestras de proteólisis de la proteína IκB eran similares
a continuación de ambos estímulos se observaron algunas diferencias: el IκB-α se descompuso algo más rápidamente
después de la acción de IL-1β, comenzando al cabo de 15 minutos después de la incubación, en comparación con el
caso de una estimulación de plaquetas, donde se observó la descomposición después de unos 30 minutos. A la inversa,
las plaquetas inducen una proteólisis anterior de IκB-ε e IL-1β (efecto significativo: 30 minutos con respecto a 60).
En fuerte contraste con ésto, TNF indujo una descomposición mucho más rápida de ambas proteínas IκB en HUVEC
(figura 5D).
Activación diferencial del complejo IKK en células endoteliales después de la estimulación con plaquetas, IL-1β o
TNF
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Las proteínas IκB se fosforilizan antes de su descomposición, siendo provocado este proceso por el complejo IKK.
Para caracterizar el efecto de las plaquetas sobre este sistema de quinasa, se emplearon ensayos de quinasa in vitro.
HUVEC fueron estimulados con plaquetas activadas, IL-1β o TNF durante los periodos de tiempo indicados, antes
de preparar extractos de citosol. Se llevó a cabo una inmunoprecipitación, bien con anticuerpos IKK-α o IKK-β, y se
determinó la actividad de quinasa mediante la medición del estado de fosforilización de GST-IκB-α. La incubación
con plaquetas indujo una activación notable del complejo IKK con unos niveles de fosforilización máximos a los 30
minutos, que en un plazo de 60 minutos descendieron rápidamente a los valores de la línea base (figuras 6A y D).
Se obtuvieron resultados similares cuando se añadió IL-1β a HUVEC, a pesar de que se observaron diferencias en un
pico de activación a los 45 minutos, que se mantuvieron por lo menos durante 90 minutos (figuras 6B y D). Cuando
se utilizó TNF para estimular HUVEC, la activación de IKK se produjo rápidamente en un plazo de 2,5 minutos,
volviendo a valores más bajos al cabo de 20 minutos (figuras 6C y D). En estas condiciones, los niveles de IKK-α y
-β se mantuvieron constantes (figuras 5B y C). Se obtuvieron unos resultados similares empleando células ECV 304.
IKK-β y NIK participan en una activación de NF-κB inducida por plaquetas
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Con el fin de investigar el papel de las proteínas IKK y NIK en las cascadas de señales que afectan a NF-κB,
se transformó ECV 304 antes de la estimulación con plaquetas o IL-1β, con vectores de hiperexpresión para el tipo
salvaje o quinasas mutadas marcadas con flag, junto con un plásmido reporter de κB luciferasa. Un Western Blot, empleando un anticuerpo anti-flag, confirmó que la proteína respectiva había sido hiperexprimida en el sistema existente
y que el vector de control sin inserción no mostraba ninguna marca flag no específica. Unos experimentos complementarios mostraron que las proteínas precipitadas marcadas con flag eran activas para la quinasa, mientras que las
formas mutadas no mostraban actividad. Cuando se hiperexprimió NIK, se observó una inducción drástica de la señal
3xκB.luci, comparado con el control CMV, que se incrementó aún más incubando las células con plaquetas activadas
o IL-1β (figuras 7A y B, columnas de la izquierda). La transfección de NIK mutado provocó una disminución drástica
de este efecto tanto por la señal inducida por el tipo salvaje como también por el incremento adicional causado por la
ulterior estimulación. Una cotransformación de tipo salvaje IKK-α y -β juntas tuvo también un efecto directo sobre el
plásmido 3κB.luci, que se intensificó notablemente mediante la estimulación, bien con plaquetas o con IL-1β (figuras
7A y B, columna izquierda). Una hiperexpresión de las formas mutadas de IKK-α y -β juntas, inhibió no sólo los
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efectos directos sino también los inducidos por el estímulo, desapareciendo casi totalmente la señal inducida por las
plaquetas, observándose un efecto más débil para IL-1β. Cuando se exprimieron las quinasas individualmente, en lugar
de hacerlo en combinación, se halló una inhibición importante con IKK-βKA , como consecuencia de una incubación
con plaquetas o IL-1β (figuras 7A y B, columnas de la derecha). IKK-αKA sólo mostró efecto inhibidor para plaquetas,
pero no para células estimuladas con IL-1β.
Igualmente se investigó el efecto de una hiperexpresión de IKK-α y -β mutado sobre la transcripción dependiente
de plaquetas o dependiente del promotor inducida por IL-1β. ECV 304 se transformaron con vectores de hiperexpresión para tipo salvaje o quinasas mutadas, junto con plásmidos reporter de luciferasa, que contenían fragmentos
promotores que llevaban MCP-1 o VCAM-1 κB. En este caso solamente se obtuvo una reducción significativa de la
transcripción inducida por plaquetas o IL-1β mediante IKK-βKA , pero noIKK-αKA , bajo la regulación de estos promotores (figura 7C).
Una hiperexpresión de IKK-βKA inhibe la secreción inducida por plaquetas de MCP-1 en HUVEC transducido por
rAAV
Para mostrar el efecto de una hiperexpresión de IKK-βKA sobre el nivel de proteínas, se clonaron el tipo salvaje o
secuencias mutadas de IKK-β en un sistema de virus recombinante adeno-asociado (13, 14). Las investigaciones se
realizaron en un principio para comprobar si los rAAV podían transducir cultivos HUVEC primarios. Unas monocapas
endoteliales subconfluentes se incubaron durante 16 horas con rAAV-GFP y después de otras 48 horas en cultivo de
células se analizó la expresión de GFP en HUVEC infectados, mediante citometría de flujo y microscopía fluorescente
(figuras 8A y B). Se halló que en las condiciones aplicadas había una transducción importante de HUVEC con un
rendimiento de aproximadamente un 50%. Esto supone una diferencia ventajosa respecto a la tasa de transfección
de aproximadamente un 5 a un 10%, tal como se encuentra en HUVEC empleando los métodos de transfección
convencionales. La hiperexpresión de IKK-β mediante el sistema rAAV se confirmó mediante el empleo de un análisis
Western (figura 8C). Para investigar los efectos de hiperexpresión de IKK-β e IKK-βKA , se transdujeron HUVEC con
rAAV, que codifica estas proteínas, o mediante el control rAAV-GFP. Después de la incubación inicial, seguida de
otro cultivo durante 48 horas, se trataron las células transducidas durante 60 minutos con plaquetas activadas con IL1β, determinándose después de 4 horas una secreción de la MCP-1. Las células que habían sido transducidas con
rAAV-IKK-βKA , mostraron una disminución importante de la secreción de la MCP-1 inducida por plaquetas o IL1β, en comparación con las células tratadas con rAAV-GFP o rAAV-IKK-β (figura 8D). Estos resultados muestran
que el sistema rAAV, y el alto rendimiento de transfección conseguido con ello, permiten la demostración directa a
través de una determinación de la concentración de proteínas, de que el mutante negativo dominante IKK-βKA , inhibe
intensamente la expresión delgen endotelial de inflamación de MCP-1, que es inducido por la interacción transitoria
con plaquetas activadas o IL-1β.
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REIVINDICACIONES
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1. Procedimiento de screening (selección primaria) para localizar inhibidores de IKK-β en células endoteliales
comprendiendo el procedimiento la compactación de un inhibidor potencial con células endoteliales activadas y una
determinación de la secreción de la MCP-1 de las células endoteliales.
2. Procedimiento de screening (selección primaria) según la reivindicación 1, en el que se activan las células
endoteliales mediante plaquetas activadas.
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3. Utilización de un inhibidor de IKK-β, elegido entre Sulindac, NEMO-binding domain peptide, 3-[(4-metilfenil)-sulfonil]-2-propenonitrilo y 3-[(4-t-butilfenil)-sulfonil]-propenonitrilo, para la preparación de un medicamento
destinado a la
(a) profilaxis primaria de ateroesclerosis en pacientes cuyo valor PROCAM sea mayor o igual a 50, o para la
(b) profilaxis secundaria después de un episodio cardiovascular.
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