Producción de anticuerpos específicos anti giroxina en conejos.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2003
Resumen: E-021
Producción de anticuerpos específicos
anti giroxina en conejos.
Rodríguez, Juan P.1 - Ruiz, Raquel2 - Leiva, Laura C.1 - Acosta, Ofelia2
1. Cátedra de Química Biológica I - Facultad de Cs. Exactas y Naturales y Agrimensura - UNNE.
Av. Libertad 5450 - (3400) Corrientes - Argentina.
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2. Cátedra de Patología Médica - Facultad de Cs. Veterinarias - UNNE.
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ANTECEDENTES
En la República Argentina los accidentes ofídicos causados por Crotalus durissus terrificus (cascabel) son
escasos, no obstante la gravedad de la intoxicación es tal, que más del 90% de las víctimas mueren, si el tratamiento
específico se administra más allá de las 8 horas posteriores al accidente, tiempo en que se fijan las toxinas y el suero no
las neutraliza.
La intoxicación se caracteriza por trastornos nerviosos con ptosis palpebral, oftalmoplejía, oliguria que puede
evolucionar a la anuria y muerte del paciente. Si bien los síntomas anteriormente citados son predominantes, el cuadro
se agrava cuando se presentan alteraciones de la hemostasia y rabdomiólisis, que generalmente complica el cuadro de
intoxicación, independientemente del tratamiento. (Vital Brasil, 1972)
En la intoxicación por veneno de Crotalus durissus terrificus de América del Sur se presentan efectos sobre el
sistema nervioso. El veneno constituye un paquete de sustancias tóxicas tales como: crotoxina, crotamina, convulsina y
giroxina. Tanto la crotamina como la crotoxina son las que causan alteraciones en la neurotransmisión periférica
(Habermann, E. and Breithaupt,1978). La convulsina produce una intoxicación fatal, al provocar convulsiones y
disturbios en el sistema nervioso autónomo y respiratorio (Prado-Franceschi et al, 1981). La giroxina es una enzima con
actividad trombínica (Alexander et al, 1988), capaz de convertir el fibrinógeno plasmático en una malla de fibrina, por
otro lado posee acción neurológica dado que su administración intravenosa en ratones provoca episodios temporarios de
opistótono y rotación. (Barrio, 1961).
Trabajos de Ruiz y col. (2001), han demostrado que la giroxina afecta los niveles de gangliósidos aislados de
cerebro de ratas neonatas, aunque no ha sido comprobada la presencia de la toxina en este tejido. Por ello es de interés
obtener anticuerpos anti giroxina, para ser empleados en técnicas inmunohistoquímicas para la detección de giroxina
en tejido nervioso.
MATERIALES Y METODOS
Obtención del antígeno
El antígeno, giroxina, enzima con actividad coagulante presente en el veneno de Crotalus durissus terrificus (Cdt), se
aisló y purificó mediante técnicas de cromatografía en columna (Alexander et al, 1988; Raw et al, 1986). La técnica
empleada constó de dos etapas. La primera se llevó a cabo en una columna de Sephadex  G75 (2 x 75cm) estabilizada
con buffer glicina 20 mM, pH=1.9, eluyendo con el mismo buffer la muestra (50mg veneno C.d.t./mL, 5 mL). El eluído
con la enzima de interés se sometió a cromatografía de afinidad, en una columna de 1 x 8 cm de BenzamidinaSepharosa 6 B, estabilizada con buffer Tris-HCl 50 mM, NaCl 0.4 M, pH 9, utilizándose el mismo buffer para la elusión
de las proteínas no fijadas. Para la elusión de la giroxina, se cambió el buffer por acetato de sodio 0.1 M , NaCl 0.3 M,
pH 5.0. La homogeneidad de la enzima obtenida se controló por SDS-PAGE.
Preparación de la vacuna
Un mg del antígeno (giroxina) se disolvió en 5 mL de buffer PBS. A esta solución se le agregaron 100 µL de Tween 20,
y luego gota a gota, sobre el vortex, se agregaron 5 mL de adyuvante INTA. Se agitó hasta formar una emulsión
evitando que se separe el aceite del adyuvante en una fase y, el PBS, en otra.
Obtención del antisuero (suero que contiene anticuerpos anti giroxina)
Animales: se trabajó con conejos mestizos machos en grupos de 5 (cinco), distribuidos en dos grupos.
Protocolo de inmunización: los conejos se inmunizaron mediante la inoculación de 0.6 mL intramuscular en cada pata
y 0,8 mL aplicados en 3 inyecciones subcutáneas en distintos lugares del lomo. A los 15 y 30 días se aplicaron dos
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refuerzos de igual volumen de vacuna. Alos 45 días se sangraron los conejos por vena yugular . Los sueros de los
respectivos conejos inmunizados se mezclaron en un pool, sometiendo el mismo a test de detección de anticuerpos.
Purificación de Anticuerpos:
Para separar las inmunoglobulinas del resto de las proteínas séricas, a 3 mL de suero inmune se agregó lentamente
SO4(NH4)2 hasta completar igual volumen al del suero, efectuando la mezcla en un agitador magnético. Se ajustó el pH
a 7.8 y se dejó en reposo en heladera dos horas. Se centrifugó a 5000 r.p.m. durante 30 minutos. Se eliminó el
sobrenadante y se resuspendió el precipitado en una solución de SO4(NH4)2 al 50% .Este procedimiento se repitió hasta
que el sobrenadante a descartar fue límpido. El precipitado final obtenido se reconstituyó en agua destilada, y luego se
desionizó en columna de Sephadex G-25. Igual procedimiento se llevó a cabo con pool de suero de conejos control.
Detección de anticuerpos producidos:
Electroforesis en acetato de celulosa. Se corrió un suero control, junto al suero hiperinmune. Se utilizo la técnica
semimicro. Tiempo de corrida: 45 minutos en Buffer Veronal sódico (8,24 g/l) pH: 8.6. Intensidad de corriente: 1.5 mA
por tira.
Precipitación en medios gelosados (Método de Ouchterlony). En caja de Petri estéril se depositaron 5 mL de agar
fundido (2%, en solución buffer de NaOH y H3 BO3, pH= 8.6) y una vez enfriado se agregaron 15 mL de agar fundido al
1% a 60 °C. Se dejó solidificar y se confeccionaron pares de orificios de 5 mm de diámetro, que se separaron 1 cm
entre sí. Se colocaron 4 pares por placa. En los distintos orificios enfrentados se sembraron 0,1 mL de antígeno y 0,1
mL del suero a testear. Las placas se mantuvieron en cámaras húmedas. Las lecturas de los resultados se efectuaron a
las 24-72 horas (Margni, 1995)
Neutralización de la actividad coagulante del veneno de C. d t con suero hiperinmune antigiroxina obtenida. Se
disolvió 2mg de veneno en 2 ml de PBS y se distribuyó 0.25 ml en 4 tubos:
Tubo control negativo: 0.25 ml de veneno + 0.25 ml de inmunoglobulinas de conejo control
Tubo control positivo: 0.25 ml de veneno + 0.25 ml de suero anticrotálico comercial
Tubo de muestra: 0.25 ml de veneno + 0.25 ml de de conejos inmunizados (Pool N°1)
Tubo de muestra: 0.25 ml de veneno + 0.25 ml de inmunoglobulinas de conejos inmunizados (Pool N°2)
Se incubaron todos los tubos 30 min a 37ºC. Se enfrentaron 2 gotas de cada tubo con 2 gotas de plasma citratado
previamente termostatizado a 37ºC, se registró el tiempo que demora el plasma en coagular.
DISCUSION DE RESULTADOS
Se aisló la proteína de interés (Giroxina) cuya homogeneidad se comprobó por SDS-PAGE (Figura 1), con un peso
molecular de 38 kDa, comparable con la obtenida por otros autores. (Alexander 1988), (Camillo, 2001)
El proteinograma del suero (Figura 2,) proveniente de conejos inmunizados con el antígeno (giroxina) mostró un
aumento en la fracción de las gammaproteína respecto al de los conejos control, indicando probable respuesta
inmunológica al antígeno inoculado (giroxina)
El ensayo de neutralización de la actividad coagulante del veneno de Cdt con suero hiperinmune obtenido en conejos
arrojó los valores que se muestran en la tabla. Los mismos ponen en evidencia la presencia de anticuerpos específicos
antigiroxina, capaces de disminuir la actividad trombínica de esta enzima, siendo un grupo de conejos más
respondedores que otros, aunque el nivel de anticuerpos obtenidos no llegó a ser tan alto como para lograr resultados
comparables a los del antiveneno comercial.
Por otro lado, el test para detección de anticuerpos específicos (método de Outcherlony) no dio positivo para los
anticuerpos obtenidos en este trabajo, sin embargo se obtuvo banda de precipitación cuando se enfrentó el antígeno con
el suero comercial antiveneno entero. (Figura 3). Probablemente, esto es debido a una baja concentración de
anticuerpos, no suficiente para dar positivo un test de interacción secundaria, tan poco sensible.
CONCLUSIONES
Se obtuvo un suero de conejo hiperinmune con anticuerpos antigiroxina de Cd t capaz de neutralizar la actividad
trombínica de la giroxina, aunque la concentración de inmunoglobulinas antigiroxina es inferior a la presente en el
antiveneno comercial. Este trabajo se continúa a fin de obtener una respuesta inmunológica cuantitativamente superior.
AGRADECIMIENTOS
A la Secretaría General de Ciencia y Técnica de la UNNE por el apoyo financiero a través del Proyecto PI 610 y de la
beca de Pre-Grado otorgada a J. P. Rodríguez.
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Figura 1. Electroforesis de giroxina y veneno de Crotaluss durissus
terrificus.
A- SDS-PAGE 12%: Veneno crudo de Crotaluss durissus terrificus
(Calle 2 ), Marcadores de Peso molecular (Calle 1). B- SDS-PAGE 12%
Veneno crudo de Crotaluss durissus terrificus (Calle l), antígeno
purificado (Giroxina) (Calle 2).
A
B
Figura 2. Proteinograma correspondiente a pool de sueros
de conejos inmunizados (B) y de conejos controles (A)
Figura 3. Test de Oucherlony.
Giroxina (1). Suero de pool 1 (2). Suero de
pool 2 (3). Antiveneno comercial (4)
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Tabla. Tiempos de coagulación en ensayo de neutralización
de la actividad coagulante de giroxina.
Tiempos
Control negativo
(plasma sin antiveneno)
30” + 2”
Control positivo
(plasma con antiveneno
comercial)
incoagulable durante
toda la experiencia
Pool 1
410 + 5 ”
Pool 2
150” + 5’’
BIBLIOGRAFIA
- Alexander, G., Grothusen, J., Zepeda, H. and Schwartzman, R.J.: Giroxin, a toxin from the venom of Crotalus
durissus terrificus, is a thrombin-like enzima. Toxicon 26 (10): 953-960, 1988.
- Barrio, A. Giroxin, a new neurotoxin of Crotalus durissus terrificus venom. Acta Physiol. Latinoamericana 11: 224,
1961.
- M. A. P. Camillo, P. C. Arruda Paes, L. R. P. Troncone, J. R. Rogero . “Gyroxin fails to modify in vitro release of
labelled dopamine and acetylcholine from rat and mouse striatal tissue”. Toxicon, 39: 843-853, 2001.
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Habermann, E. and Breithaupt, H.: Mini-review. The crotoxin complex-An example of biochemical and
pharmacological protein complementation. Toxicon 16: 19, 1978.
- Margni, R.A. Inmunología e Inmunoquímica. Quinta Edición. Editorial Panamericana. 1995.
- Prado-Franceschi, J., Tavares, D.Q., Hertel, R. and Lobo De Araujo, A.: Effects of convulxin, a toxin from rattlesnake
venom on platelets and leukocytes of anesthetized rabbits. Toxicon 19, 661, 1981.
- Raw, Y., Rocha, M.C., Esteves, M.I. and Kamiguti, A.S.: Isolation and Characterization of a Thrombin-like enzime
from the venom of Crotalus durissus terrificus. Brazilian J. Med. Biol. Res. 19: 333-338, 1986.
- Ruiz, R., Bongiovanni, B.; Duffard, R. O. Different rat brain areas exposed to Crotaluss durissus terrificus. XXXIII
Annual Meeting of the Argentine Society of Experimental Farmacology. Corrientes, 2001.
- Vital Brasil: Neurotoxins from the South American rattlesnake venom. J. Formosan Med. Assoc. 71, 395, 1972.