17 alpha OH Progesterone Microwell Serum ELISA For In Vitro

17 alpha OH Progesterone Microwell Serum ELISA
For In Vitro Diagnostic Use
Véase la etiqueta externa 2°C-8°C Σ= tests cat. #1292-6
INTRODUCCIÓN
El esteroide 17-α-Hydroxyprogesterona (17-α-OHP) es producido tanto por la corteza
suprarrenal como por las gónadas. Aun cuando el 17-α-OHP tiene relativamente poca
actividad de progesterona, es de intenso interés clínico debido a que es el precursor
inmediato del 11-desoxycortisol (Cpd-S). Debido a que el Cpd-S es producido por la
21-hidroxilación del 17-α-OHP, las medidas del 17-α-OHP es un indicador indirecto
útil de la actividad de la 21-hidroxilasa. En la deficiencia congénita de la 21-hidroxilasa,
en la variedad más común de hiperplasia adrenal congénita (CAH) la 17-α-OHP es
secretada en exceso. También es moderadamente elevada en la deficiencia de 11-ßhidroxilasa. La medición de la 17-α-OHP es en consecuencia valiosa en el diagnostico
inicial de CAH.
FISIOLOGÍA CLINICA
A. mujeres adultas no embarazadas: en mujeres adultas no embarazadas en el grupo
de mujeres con edad de tener hijos, las concentraciones de 17-α-OHP varían en el ciclo
menstrual, con la fase lútea las concentraciones son más altas que en la fase folicular.
Esto sucede porque el 17-α-OHP es secretado paralelamente con la progesterona de los
folículos maduros o del cuerpo lúteo. También hay una variación diurna de las
concentraciones de 17-α-OHP. Este ritmo esta en paralelo con la secreción de cortisona
adrenal de tal manera que las máximas concentraciones de 17-α-OHP son medidas
obtenidas en muestras entre la medianoche y las 8:00 am.
B. Hombres adultos: Hay poca información disponible en cuanto a la variabilidad
sistemática de las concentraciones de 17-α-OHP en hombres adultos.
C. Mujeres embarazadas y niños recién nacidos: El esteroide 17-α-OHP es
producido en grandes cantidades por el feto y las adrenales. Es secretado en abundancia
tanto en la circulación fetal como maternal. Las concentraciones maternas de 17-α-OHP
incrementan muy rápidamente luego de 32 semanas de gestación hasta cerca de 4 veces
por encima de las concentraciones basales a término.
APLICACIONES CLÍNICAS
A. Hiperplasia adrenal congénita:
La principal aplicación de la 17-α-OHP RIA está en el diagnostico de CAH en recién
nacidos con genitales ambiguos y en niñas adolescentes con rasgos viriles. Debido a que
la 17-α-OHP es el precursor inmediato del 11-dexosicortisol, concentraciones basales
de 17-α-OHP son elevadas en pacientes con deficiencia de 21-hydroxylase y en menor
grado en pacientes con exceso de la 11-hidroxilasa. Porque las concentraciones de 17-αOHP son marcadamente elevadas en recién nacidos y niñas adolecentes afectadas por
CAH, una sola medición basal es lo que normalmente se requiere para hacer el
diagnóstico.
B. Aparición tardía de hiperplasia suprarrenal:
Recientemente, las concentraciones de 17-α-OHP han sido utilizadas en la evaluación
de mujeres con rasgos andrógenos, donde se sospecha de la aparición tardía de la 21hidroxilasa. Esta condición es clínicamente muy sutil, debido a que se presenta igual al
clásico síndrome de ovarios poliquísticos, las concentraciones de la 17-α-OHP en el
plasma basal, a diferencia de la clásica hiperplasia adrenal congénita son normales. El
diagnostico es hecho por administración de un test estimulante de la ACTH.
C. Otras aplicaciones:
La medición de las concentraciones de 17-α-OHP es también usada en la evaluación de
hombres y mujeres con acné vulgaris, calvicie masculina y en algunas formas más
sutiles de infertilidad. Experiencias con estas aplicaciones son muy limitadas.
PRINCIPIO
El DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC. 17-α-OH Progesterone ELISA KIT está
basado en el principio de la competición y la separación de micro placas. Una cantidad
desconocida de 17-α-OHP presente en la muestra y una cantidad fija de 17-α-OHP
mezclado con peróxidos de rábano picante compiten por los sitios de unión de un
antisuero policlonal de 17-α-OHP que recubre los pozos. Luego de una hora de
incubación en la micro placa, esta es lavada para detener la reacción por competición.
Habiendo agregado la solución de sustrato, la concentración de 17-α-OHP es
inversamente proporcional a la medición de la densidad óptica.
REACTIVOS
1. Pocillos cubiertos con suero Anti-17-α-OH progesterona (96 pozos).
2. Enzima-Conjugada, 25 ml
17-α-OH Progesterona conjugada a los peróxidos de rábano picante.
3. Set de referencia Standard, 1 ml cada uno 0,15; 0,5; 1,5; 3; 7,5; 20 ng/ml.
4. Estándar Cero o Espécimen Diluente, 1 ml.
5. Solución de Substrato TMB, 25 ml.
6. Solución de Parada, 0.5M H2SO4, 14 ml.
7. Solución de Lavado, 40X, 30 ml.
MATERIALES REQUERIDOS PERO NO INCLUIDOS
1. Un lector de micro placas (450±10 nm) (Ej. the DIAGNOSTIC AUTOMATION,
INC. Instruments Microtiterplate Reader).
2. Micro pipetas de precisión con puntas desechables para 100 y 200 μl.
3. Refrigerador estándar.
4. Papel absorbente.
5. Agua desionizada.
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO
Cuando está almacenado de 2° a 8°C los reactivos intactos retendrán la reactividad hasta
la fecha de vencimiento.
La Enzima-Conjugada, Solución estándar, solución de substrato, solución de lavado y
Estándar Cero deben ser almacenados de 2° a 8°C.
Pocillos deben ser almacenados de 2° a 8°C. Una vez que el empaque ha sido abierto,
hay que estar atento de que se cierre correctamente de nuevo. La inmuno-reactividad de
los pocillos recubiertos, es estable por aproximadamente por 6 semanas en la bolsa
abierta que contiene el desecante, pero fuertemente cerrada.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES PARA LOS USUARIOS
1. PRECAUCIÓN: No hay métodos disponibles, que puedan ofrecer garantía completa
de que el virus de la Hepatitis B, el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH/HTLVIII/LAV), u otros agentes infecciosos estén ausentes de los reactivos en este kit. Por lo
tanto, todos los productos de sangre humana, incluyendo muestras del paciente, deben
ser considerados potencialmente infecciosos. El manejo y desecho debe estar en
concordancia con los procedimientos definidos por las directrices nacionales de
seguridad apropiadas o regulaciones de riesgo biológico, donde existen (Ejemplo, e.g.,
EE.UU. Centro para el Control de Enfermedades/Manual del Instituto Nacional de
Salud, “Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos”, 1984).
2. Evitar el contacto con la solución de parada, 0,5M H2SO4. Puede causar irritación en
la piel y quemaduras.
3. Coloque inmediatamente las tapas de nuevo en los reactivos. No cambie las tapas.
4. Las soluciones que contengan aditivos o preservativos, tales como azida de sodio, no
debería ser usado en la reacción enzimática.
5. No pipetee los reactivos con la boca.
6. Sólo para diagnósticos in vitro.
7. No mezclar o usar con componentes de kits con diferente número de lote.
RECOLECCIÓN DE ESPECIMENES Y PREPARACIÓN
1. Recolectar la sangre por venopunción, permita que la sangre se coagule, y separe el
suero por centrifugación a temperatura ambiente. No se necesita ningún tratamiento
especial de la muestra. El espécimen debe ser almacenado a 2-8° C por hasta 24 horas, y
debe ser congelado a -10° C o menos para periodos más largos. No utilice especímenes
muy hemolizados o muy lipémicos.
2. Muestras de las que se sospeche tienen altos contenidos de 17-α-OH Progesterona
mayores de 20 ng/ml deben ser diluidas con el Estándar Cero.
Tenga en cuenta: Muestras que contengan azida de sodio no deberían ser usadas en el
análisis.
EJECUCIÓN DEL ANÁLISIS
CONSIDERACIONES GENERALES:
1. Todos los especímenes y reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente antes
de ser usados. Todos los reactivos deben ser mezclados sin que se forme espuma.
2. Una vez que se ha comenzado con el test, todos los pasos deben ser completados sin
interrupción.
3. Use para las pipetas puntas de plástico nuevas desechables para cada reactivo,
estándar o espécimen para evitar contaminación cruzada. Para dispensar la Solución de
Substrato y la Solución de Parada evite usar pipetas con partes de metal.
4. Dispense los estándares y las muestras sobre el fondo del pocillo. Para pipetear el
conjugado enzimático y la Solución de parada, se recomienda sostener la pipeta de
forma vertical sobre el recipiente y dispensar la solución correspondiente en el centro
del pocillo, de manera que se consiga una mezcla completa del conjugado enzimático
con las muestras ó los estándares y de la solución de parada con la solución de
substrato.
5. Antes de comenzar el análisis, se recomienda que todos los reactivos estén listos,
tapas removidas, todos los recipientes necesarios asegurados en los soportes, etc. Esto
asegurará un tiempo similar para cada paso de pipeteo sin interrupción.
6. Como regla general la reacción enzimática es linealmente proporcional al tiempo y a
la temperatura. Esto hace posible la interpolación de condiciones físico-químicas fijas.
Si en la corrida del test la absorbancia del estándar cero es menor de 1,0 ó por encima
del límite superior de su microtiterplate spectrophotomter en consecuencia usted
puede extender o reducir el tiempo de incubación final de la reacción enzimática de
color a los 45 o 15 minutos.
7. La Solución de Substrato no debe tener color o ser ligeramente azul o verde. Si la
solución es azul oscuro el reactivo es inutilizable y debe ser descartado.
8. Durante la incubación con Solución de Substrato evite la luz solar directa en la micro
placa.
PREPARACIÓN DEL REACTIVO
Solución de Lavado: agregue agua desionizada a la Solución de Lavado concentrado
40x (contiene: 30 ml) a un volumen final de 1200 ml. La Solución de Lavado diluida es
estable por 2 semanas a temperatura ambiente.
PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS
1. Asegurar el número deseado de tiras recubiertas en el soporte.
2. Dispense 25 μl de Estándares de 17-α-OH Progesterona en cada pocillo.
3. Dispense 25 μl de cada muestra en los pozos seleccionados. El tiempo entre la
distribución del primer Estándar y la última muestra puede ser de hasta 10 minutos sin
afectar los resultados.
4. Incube la placa por 5 minutos a temperatura ambiente.
5. Dispense 200 μl del Conjugado Enzimático en cada recipiente.
6. Mezclar bien la placa por 10 segundos. Es importante obtener una mezcla completa
en este paso.
7. Incube por 60 minutos a temperatura ambiente.
8. Sacudir enérgicamente el contenido de los pozos.
9. Lave los pozos bien 3 veces con la Solución de Lavado diluida (400 μl por pozo).
Pase fuertemente los contenedores por papel absorvente para remover los residuos.
10. Agregue 200 μl de Solución de Substrato en cada pozo, a intervalos de tiempo.
11. Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente.
12. Detener la reacción enzimática agregando 100μl de Solución de parada en cada
pozo en los mismos intervalos de tiempo como en el paso 10 y determine la absorbancia
de cada contenedor a 450±10 nm.
Estabilidad de la Reacción Final
Se recomienda que los contenedores sean leídos en 10 minutos luego del paso 12.
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Cualquier lector de micro pozos capaz de determinar el nivel de absorbancia a
450±10nm puede ser usado. El valor de 17-α-OH Progesterona de cada muestra de
suero se obtiene de la siguiente manera:
1. Usando un papel de registro grafico lineal ó semi lineal, construir una curva de
calibración, trazando el promedio de las absorbancias (Y) de cada estándar de
referencia contra las concentraciones correspondientes (X) en ng/ml. Para la
construcción de la curva de calibración, recomendamos cuatro parámetros logísticos
de función.
2. Use el promedio de la absorbancia de cada muestra de suero para determinar el valor
correspondiente de la 17-α-OH Progesterona en la muestra, por interpolación de este
valor en la curva de calibración, multiplique por la dilución inicial de la muestra si
es necesario.
La AUTOMATIZACIÓN DE DIAGNÓSTICO, INC. Un programa de regresión
permite la lectura e interpretación asistida por computadora usando una función
logística de cuatro parámetros.
RESULTADOS NORMALES ESPERADOS
Recién nacido 5 - 30 días < 0,7 - 2,5 ng/ml
31 – 60días M. 0,8 - 5,0 ng/ml
F. 0,5 - 2,3 ng/ml
Niños 3 - 14 años 0,07- 1,7 ng/ml
Mujeres en Edad Reproductiva
Fase folicular: 0,1 - 0,8 ng/ml
Fase luteal: 0,6 - 2,3 ng/ml
Ovulación: 0,3 - 1,4 ng/ml
Post ACTH: < 3,2 ng/ml
Tercer trimestre: 2,0 - 12 ng/ml
Mujeres post menopausicas 0,13 - 0.51 ng/ml
Hombres Normales 0,5 - 2,1 ng/ml
EJEMPLO DE TÍPICA CURVA ESTÁNDAR
Los siguientes datos son sólo de demostración, y no pueden ser usados para generar
datos al momento de una prueba.
Estándar
Estándar 0 (0 ng/ml)
Estándar 1 (0,15 ng/ml)
Estándar 2 (0,5 ng/ml)
Estándar 3 (1,5 ng/ml)
Estándar 4 (3,0 ng/ml)
Estándar 5 (7,5 ng/ml)
Estándar 6 (20 ng/ml)
Unidades Ópticas
1,92
1,53
1,17
0,85
0,60
0,35
0,17
Opción II: Determinación de 17-α-OH Progesterona en Saliva
Preparación de muestras
Recomendamos congelar las muestras de saliva a -20° C inmediatamente después de su
recolección.
Previamente a la prueba, descongelar las muestras, mezclar en el vortex y centrifugar
las muestras de saliva. El sobrenadante es usado para análisis hormonal.
Extracción para la determinación de 17-α-OH Progesterona en Saliva:
Las muestras de saliva deben ser extraídas. Aunque los estándares han sido preparados
en Estándar Cero, los extractos de saliva de las muestras de saliva también son
reconstituidas con Estándar Cero, para evitar errores de extracción. Se recomienda el
siguiente método de extracción:
1. Pipeta 50 μl Control-/ Suero estándar (kit de prueba) o 250 μl de muestras de saliva
en tubos de vidrio bien cerrados. (Volumen aprox. 3 ml).
2. Agregue 1 ml de éter anestésico (Hoechst AG, Alemania) en cada tubo.
3. Mezcle en el Vortex 1 h, luego congele 1 h (o más) a -20° C o menos.
4. Decante la fase de éter en un tubo de vidrio nuevo y evapore (esto toma aprox. 2
horas en un exsikkator). Luego de la evaporación los tubos deberían verse vacios.
5. Reconstituya el extracto con 250 μl de Estándar Cero del kit de prueba
6. Mezcle en el vortex por 15 min.
7. Continúe como esta descrito en el manual de instrucción (vea Procedimiento de
Prueba, p.4).
Tenga en cuenta: Cuando se usan muestras de saliva los resultados del paciente tienen
que ser divididos entre 5 (debido a que usted ha usado 5 veces el volumen).
CARACTERÍSTICAS DEL DESEMPEÑO
Sensibilidad
El nivel más bajo de 17-α-OH Progesterona detectable que se puede distinguir del
Estándar Cero es 0,05 ng/ml al 95 % del límite de confianza.
Especificidad
Los siguientes materiales han sido revisados para reactividad cruzada. El porcentaje
indica una reactividad cruzada de 50% comparando el desplazamiento de la 17-OH
Progesterona.
Esteroide
% Reacción Cruzada.
17-α-OH Progesterona
100,0
Estriol
< 0,01
Estradiol 17ß
< 0,01
Testosterona
< 0,01
Dihydrotestosterona
< 0,01
DOC
0,05
11-Desoxicortisol
1,4
Progesterona
1,2
DHEA
< 0,01
DHEAS
< 0,001
Cortisol
< 0,01
Corticosterona
< 0,05
Aldosterona
< 0,01
Androstendiona
< 0,01
Dehydroepiandrosten de sulfato
< 0,01
Prednisona
< 0,01
Precisión
Intraensayo
Suero
n
1
2
3
10
10
10
<X> ± SD
ng/ml
0,99 ± 0,08
2,34 ± 0,10
6,75 ± 0,34
CV
%
n
8,1
4,3
5,0
10
10
10
Interensayo
<X> ± SD
ng/ml
0,95 ± 0,09
2,24 ± 0,18
6,52 ± 0,49
CV
%
9,5
8,0
7,5
Exactitud
La exactitud de la prueba fue evaluada por recuperación y dilución del test.
Test de Recuperación
Suero 17-α-OHP ng/ml Endógenos
1
3,1
2
1,9
Test de Dilución
Factor de Dilución
Suero
No diluido
1
1:2
1:4
1:8
2
No diluido
3
No diluido
17-α-OHP ng/ml Agregado
5
2
1
5
2
1
0,3
CV
%
105
103
97
102
105
99
101
Conc. ng/ml medido
1,23
0,62
0,29
0,15
% de recuperación
101
94
98
6,21
2,93
1,62
0,76
0,37
0,17
7,35
3,72
1,91
0,93
0,44
0,24
94
104
98
95
88
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
101
104
101
96
104
CONTROL DE CALIDAD
Las buenas prácticas de laboratorio, requieren que los controles se ejecuten con cada
curva de calibración. Un número estadísticamente significativo de controles deben ser
analizados, para establecer los valores promedios y rangos aceptables para garantizar un
rendimiento adecuado.
Recomendamos usar BIO RAD Lyphochek Inmunoensayo sueros de control que
también están disponibles por DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC.
LIMITACIÓN DEL PROCEDIMIENTO
1. Los resultados fiables y reproducibles se obtendrán cuando el procedimiento de la
prueba se lleve a cabo con una comprensión completa de las instrucciones del inserto, y
con el cumplimiento de correctas prácticas de laboratorio.
2. El procedimiento de lavado es crítico. De un lavado insuficiente resultara una
precisión pobre y altos niveles de absorbancia.
3. La mezcla complete del Conjugado con el estándar o la muestra (paso 5) y la
Solución de parada con la solución de substrato (paso 12) es crítica. Una mezcla
insuficiente, originara resultados de precisión pobre.
DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC.
23961 Craftsman Road, Suite E/F, Calabasas, CA 91302
Tel: (818) 591-3030 Fax: (818) 591-8383
ISO 13485-2003
PROCEDIMIENTO DEL TEST DE ELISA 17-α-OH PROGESTERONA DE
DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC
Descripción
Enzima
conjuga
da
μl
200
Estándar 0
Muest
ra
Están
dar μl
25
Estándar 1
25
Estándar 2
25
Estándar 3
25
Estándar 4
25
Estándar 5
25
Estándar 6
25
Muestra 1
25
200
Muestra 2
25
200
Muestra 3
25
200
Muestra 4
25
200
Incub
ado
por 5
minut
os a
tempe
ratura
ambie
nte
200
200
200
200
200
200
Mezcle
por 10
segundes.
Incube a
temperatu
ra
ambiente
por 60
minutos.
Lave los
contenedo
res 3
veces con
Solución
de Lavado
diluida
400μl por
contenedo
r.
Solució
n de
Substra
to μl
200
200
200
200
200
Incubar
por 30
minutos a
temperat
ura
ambiente
Solució
n de
Detenci
ón μl
100
100
100
100
100
Resultad
os
ng/ml
Lea el OD
a 430 nm
Con un
lector de
microplac
as.
0
0,15
0,5
1,5
3
200
100
7,5
200
100
20
200
100
200
100
200
100
200
100