CiLV-C - Nappo

Etiología, historia, situación mundial y
manejo de la leprosis de los cítricos y
sus vectores
Maria Andréia Nunes
Centro APTA Citros Sylvio Moreira
Instituto Agronômico de Campinas
Primer reporte
1907
“scaly bark”
“nail head rust”
Florida-EUA
Fawcett
1920
1931
“lepra explosiva” “leprose dos citros”
São Paulo – Brasil
Paraguay
Spegazzini
Bitancourt
1932
Argentina
Zeman
http://idtools.org/id/mites/flatmites/index.php
Asociación con Brevipalpus
(toxina del ácaro?)
1945
B. obovatus
Argentina
Frezzi; Vergani
1963
B. phoenicis
Brasil
Musumecci & Rosseti
1968
B. californicus
EUA
Knorr
Gomphrena globosa
Chenopodium amaranticolor
C. quinoa
1972; 1974
1995
2000
Observación de partículas
Microscopía electrónica de
transmisión
Transmisión mecánica
hospedantes no cítricos
América Central
Panamá y Costa Rica
Colariccio et al.
Araya González et al.
Kitajima et al.
2003
Diagnóstico por RT-PCR
Locali et al.
2004
Leprosis de los cítricos
en América del Norte
México
Senasica
2006
Genoma
Citrus leprosis virus C
Cilevirus
Locali-Fabris et al. y Pascon et al.
Swinglea glutinosa
CiLV-C en ácaros
Persistente/Circulativo
2007
Nicolini et al.
Kitajima & Alberti, 2010
Commelina benghalensis
2008
2010
Plantas no cítricas
ICTV (International
naturalmente
Committee on Taxonomy
infectadas con CiLV-C
of Viruses)
Léon; Nunes et al. (2012)
Cartens
2013
2013
2013
CiLV-C
Más de 40 hospederas
experimentales
Citrus leprosis virus
cytoplasmic
type 2
Citrus leprosis virus
nuclear
Genoma
Garita
Roy et al. (a)
Roy et al. (b)
Situación actual
Américas:
EUA no existe desde 1968:
- probablemente fue Leprosis del tipo nuclear
- extinguido debido a heladas e intensas pulverizaciones
Dispersión reciente
2011
2004
2007
2002
2000
2000
Distribuición en Brasil
Fonte: Bastianel et al., 2010
Distribución en México
Primer reporte en 2004
1. Chiapas -2004
(30 municipios)
2. Tabasco -2007
(dos municipios – Huimanguillo
y Cunduacán)
4
5
32
1
3. Veracruz - 2010
(un municipio – Las Choapas)
4. Querétaro *- 2011
(un municipio -Tolimán)
5. Jalisco* - 2012
(un municipio –Guadalajara)
Fuentes: Mora Aguilera et al. 2013 ; Rojas-Martínez et al., 2013
*Nuclear
La Leprosis típica y prevalente
99% de todos los reportes
Citrus leprosis virus C (CiLV-C)
Genoma de CiLV-C
Miembro tipo del género Cilevirus
(Locali-Fabris et al., 2006)
Genoma bipartito ssRNA (+) 8.745 y 4.986 nucleótidos
RNA 1
5’ Cap
MTR
C-Prot
HEL
3’ Poly A
RdRp
p29
RNA 2
p15
5’ Cap
p24
p61
MP
3’ Poly A
Importancia en Brasil
Disminuye el valor cosmético y la producción
La Leprosis es la principal enfermedad viral de los cítricos en Brasil
US$ 80-100 millones/año para el control del vector
Importancia en Brasil
Costos únicamente
de los insumos
Fukuda et al., 2012. Balanço fitossanitário de citros. O que mais pesa?
virus X planta X vector
Adquisición
Replicación
del virus en
la planta
Transmisión
4 horas
1 hora
Replicación
del virus en
la planta
virus en ácaro
Circulativo
síntomas
± 15 días
En la planta
-Replicación del virus
- Lesiones localizadas
En el ácaro
-Vírus circulativo
-No hay transmisión vertical
Fotos de MET: E.W. Kitajima
Órganos afectados
No hay infección sistémica
hojas
frutos
ramas
frutos
•
Diagnóstico
Síntomas en los frutos
Lesiones localizadas
circulares
Cloróticas/Necróticas
Ø =5-12 mm
caída
• Lesiones deprimidas en el centro
• Halo clorótico
• Presencia ocasionales de rajaduras o goma en el
centro de la lesión
Síntomas en híbridos
•
Diagnóstico
Síntomas en las hojas
Lesiones localizadas
Ø = 2-3 mm
Círculos concéntricos
cloróticos o necróticos
Defoliación
•
Diagnóstico
Síntomas en las ramas
Manchas circulares
localizadas
cloróticas/necróticas
Descamación
Muerte de las ramas
Extremadamente importante como fuente de inóculo en el campo
Diagnóstico
b. Microscopía electrónica de transmisión – MET
Localización subcelular
Lumen del retículo endoplasmático
Morfología
Partículas baciliformes y cortas
Tamaño de la partícula
50-60 x 100-120nm
Viroplasmas densos y vacuolados 3-5 µm
foto: E.W. Kitajima
Diagnóstico
c. RT-PCR
CiLV-C
A. Proteína de movimiento - MP
B. RpRd
Locali et al. (2003)
CiLV-C+ CTV (Citrus tristeza virus)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
557 bp 339 bp -
Freitas-Astúa et al. (2005)
Diagnóstico
d. Inmunoensayo (ELISA)
Diagnóstico
e. Inmunoflorescencia
anti CP
Control no infectado
Lesión clorótica
P29
Lesión necrótica
P29
Calegario et al., 2013
Calegario, 2009
Otros agentes causales de síntomas similares a la Leprosis de los cítricos
1. CiLV-N
2. CiLV-C2
3. HGSV
Kitajima et al., 1972
Roy et al., 2013
Melzer et al., 2011
Leprosis causada por Citrus leprosis virus N (CiLV-N)
•Brasil (1972), Panamá (2001) y México (2012)
•Supuestamente fue la Leprosis en los E.U.A.
•En Brasil se presenta en zonas de clima frío y no comerciales
Citrus leprosis virus N (CiLV-N)
Morfología
Partículas baciliformes y desnudas
Estructura en forma de rueda de carreta
Viroplasmas densos en el núcleo
Foto: E. W. Kitajima
Tamaño de la partícula
40-50 x 100-110 nm
Localización subcelular
Núcleo
Síntomas
Locales (cloróticos/necróticos )
Informes
Pocos
Transmisión
Brevipalpus spp.
Genoma de CiLV-N
familia Rhabdoviridae
género Dichorhabdovirus (Roy et al., 2013a)
familia género Dichorhavirus (miembro tipo) (Dietzgen et al., in press)
Genoma bipartito ssRNA (-) 6.268 y 5.847nucleótidos
Identidad con Orchid fleck virus (*OFV): RNA1 90% y RNA2 91%
*OFV es transmitido por B. californicus
Genoma de CiLV-C Tipo 2
CiLV-C type 2, reportado en Colombia
probablemente una especie diferente (Roy et al., 2013b)
Genoma bipartito ssRNA (+) 8,717 y 4,989 nucleótidos
RNA 1
8717 bp
RNA 2 p15 p7
4989 bp
RdRp
p61
CP
MP
p24
Identidad con CiLV-C: RNA1 58% y RNA2 49%.
Los viriones son semejantes.
Síntomas en hojas de naranja Valencia (A, B), frutos (C) y ramas
(D) de planta infectada por Citrus leprosis virus cytoplasmic type 2
(CiLV-C2). Roy et al., 2013b
Hibiscus green spot virus (HGSV)
Higrevirus
Hawaii
Melzer et al., 2011
C. volkameriana
Hibiscus arnottianus
El tetraedro de la enfermedad
El tetraedro de la enfermedad
La Leprosis típica y prevalente
Citrus leprosis virus C (CiLV-C)
Hospederas: Citrus spp.
+
-
Naranjas dulces= Natal> Pera> Valencia> Hamlin
Mandarinas (pocos síntomas en frutos)
Naranjas ácidas o ágrias
Pomelos
Tangor Murcott
Limones y limas ácidas
Los ácaros colonizan todas las plantas cítricas
En naranja, el orden de preferencia
hojas
ramas frutos lisos
frutos irregulares
Hospedantes naturales no cítricos
Limoncillo -Swinglea glutinosa
- Rutaceae
-Cerca-viva
-Colombia
Léon et al., 2008
Yuquilla, Siempre viva (Tropical spiderwort)
Commelina benghalensis
Brasil/SP
-Commelinaceae – Monocotiledónea
-Semi-perenne
-Hospedera de B. phoenicis
-Maleza común en plantaciones de los cítricos
-Ácaros de C. benghalensis sintomática transmiten CiLV-C para cítricos
Nunes et al., 2012
Hospederas experimentales no cítricos
Foto: E.W. Kitajima
Phaseolus vulgaris - frijol
Presenta síntomas 3-5 días después de
infestados con los ácaros virulíferos
Garita et al., 2013
Arabidopsis thaliana
Planta modelo para estudios genéticos
Arena et al., 2013
Hospederas experimentales no cítricos
Más de 40 plantas hospederas
Inoculación mecánica
Inoculación con ácaros
Colariccio et al. 1995
Garita, 2013
Lovisolo et al. 2000
Nunes et al., 2012
El tetraedro de la enfermedad
Fluctuación poblacional
Ácaros están en el campo todo el año
en Brasil
30
de infestación
Nivel de
infestação
Nível
25
20
15
sequía
10
5
0
J
F
M
A
M
J
J
A
S
O
N
D
Meses
do año
ano
Meses del
de Oliveira et al. 1986
Sequía
Baja capacidad de campo favorece el aumento
de la población de ácaros.
Andrade et al., 2012
Población del ácaro
colecta
Población X Desarollo del fruto
frutos
Hojas y ramas
Fuente: Renato Bassanezi
Tiempo
El tetraedro de la enfermedad
Ordem Acari
Família Tenuipalpidae
Genero Brevipalpus
Complexo de especies crípticas: B. phoenicis, B. californicus, B. obovatus
Centenas de hospederas
928 sp., 513 gen., 139 fam.
B. phoenicis
Cosmopolita
Fonte: http://www.cabi.org
Haploide
Partenogénesis telítoca
(Candidatus Cardinium)
Brevipalpus phoenicis
Welbourn et al., 2003
Especies crípticas
Filogenia utilizando secuencias del gen citocromo oxidasa I (COI)
Tipo 2
Grupo B
Tipo 1
Grupo C
http://idtools.org/id/mites/flatmites/index.php
Beard et al., 2012
Navia et al., 2013
Ciclo Biológico
B. phoenicis
Depende de factores abióticos y bióticos
false spider mite
*ácaro de la Leprosis
0,10 x 0,06 mm
1 huevo/día
7 días
17 días
35 días
25ºC 70% U
Teodoro & Reis, 2006
0,29 mm
*Transmisión de CiLV-C por todas las fases activas
Adquisición del virus
A. Inyección de saliva en el tejido
vegetal;
B. Ingestión de contenido celular y
virus
Tiempo de
aquisición (horas)
Hojas
Sintomáticas/total
% de folhas
sintomáticas
1
0/30
0
4
1/30
3,3
24
6/30
20,0
48
6/30
20,0
Inoculación del vírus
Tiempo de
aquisición (horas)
Hojas
sintomáticas/total
% de folhas
sintomáticas
0,08
0/30
0
0,25
0/30
0
0,5
0/30
0
0,75
0/30
0
1
2/30
6,6
4
4/30
13,3
24
8/30
26,6
48
11/30
36,6
A. Inyección de saliva y virus en
tejido vegetal;
B. Ingestión del contenido celular
(Adaptado de Nuzzaci & Lilli, 1989; Rodrigues, 1995)
Biología de la interacción CiLV-C-Bp
Transmisión transovárica?
Si para B. obovatus y B. californicus en Florida (Knorr, 1968)
No para B. phoenicis (Boaretto et al., 1993; Novelli et al., 2005)
M = Marcador 1 Kb; 1, 10 e 11= ovos; 2, 4, 7, 9 = adultos; 3, 5, 8 = larvas; 6 = ninfas; 12 = ácaros avirulíferos
Tipo de interacción CiLV-C-Bp
Tipo de
transmisión
Tiempo de
adquisición
Tiempo de
retención
Persistencia
transestadial
Periodo de
latencia
Multiplicación
en el vector
Transmisión
transovárica
no
persistente
segundos a
minutos
Minutos
no
no
no
no
semi
persistente
minutos a
horas
horas
no
no
no
no
persistente
circulativa
horas a
días
días a
semanas
si
horas a
días
no
no
persistente
circulativa
horas a
días
semanas a
meses
si
semanas
si
frecuente
Adaptado de Hull (2002)
Dinámica espacial del ácaro y de plantas con síntomas de Leprosis en
campos sin controle del ácaro vector
Bassanezi et al. 2007
Plantas con ácaros
• La agregación entre
las
plantas
con
síntomas > que la
agregación entre las
plantas
infestadas
con ácaros
Ciclo 2003
Plantas con síntomas
Ciclo 2004
• Ausencia
de
relación entre la
presencia del ácaro
y la presencia de los
síntomas
Renato Bassanezi - Fundecitrus
Frecuencia de ácaros positivos para CiLV-C (RT-PCR) en función de la
distancia mínima hasta una planta con síntomas de Leprosis
de las muestras de los ácaros con CiLV-C (%)
Frecuencia
Frequência de amostras de ácaros com o CiLV-C (%)
Modelo da lei exponecial negativa: v3=b1*exp(-b2*v1)
y=(71.0621)*exp(-0.426379*x)
100
90
80
71% de los ácaros PCR+
En las plantas con síntomas
70
60
50
95% de los ácaros RT-PCR+
hasta 7 m de las plantas sintomáticas
40
30
100% de los ácaros RT-PCR+
hasta 23,5 m de las plantas sintomáticas
20
10
0
0.0
3.5
7.0
10.5
14.0
17.5
21.0
24.5
28.0
DistanciaDistância
mínimamínima
hastaaté
una
planta
leprosis
uma
planta con
com síntomas
sintomas dede
leprose
(m) (m)
Bassanezi et al. 2012
Manejo de la Leprosis en Brasil
Variedades resistentes
220 accesos
Banco Activo de Germoplasma (EECB y CCSM)
Naranjas dulces: todas susceptibles
común, navel, baja acidez, sanguíneas
Programa de mejoramiento de cítricos
300 híbridos (seis repeticiones)
10 potenciales
Prevención de ácaros
1. Cortina rompe vientos
Disminuye la dispersión de los ácaros
2.Cercas vivas
Evita la dispersión por personas o animales
(Syzygium cumini)
3. Plántulas sanas
Evita la contaminación de nuevas plantaciones
Colecta
1.Limpieza del material
3. Retirada de todos los frutos
2.Colecta escalonada
Poda
disminución del inóculo
Fotos: Fernando Pataro
Eliminar plantas hospederas
de ácaros y vírus
Disminución del inóculo
Monitoreo de ácaros
dónde, cómo y cuándo?
Tamaño de la muestra:
En general 1% de la parcela
Nivel de control de 3 -15% dependiendo de la historia
Unidad de muestra:
Frutos>ramas> hojas
Obs. Sarna de los cítricos
Frecuencia de monitoreo:
De 7 a 15 días
Toma de muestras:
Mayoría tomadas al azar
Fonte: Fundecitrus
Acaricidas en el cultivo de los cítricos en Brasil
(por principio activo)
Outros
13 %
Organoestânico
41%
Propargite
14%
Hexythiazox
15%
Dicofol
17%
1998
Dicofol Flufenoxuron
2%
4%
Hexythiazox
5%
Spirodiclofeno
58 %
Propargite
12%
Organoestânico
17 %
2010
Fuente:Celso Omoto
Enemigos naturales de B. phoenicis
comunes en plantaciones de citrus
en Brasil
Phytoseiidae
Euseius citrifolius
E. concordis
Iphiseiodes zuluagai
Stigmaeidae
Agistimus brasiliensis
Consideraciones generales
• La Leprosis típica es causada por CiLV-C, pero hay nuevos patógenos
reportados como agentes causales de síntomas similares;
• Existe una tendencia de la expansión de la epidemia hacia el norte del
continente americano;
• La principal medida de manejo es la prevención de fuente de inóculo.
Dra. Maria Andréia Nunes
Dra. Juliana Freitas-Astúa
Dra. Marines Bastianel
Dra. Valdenice M. Noveli
Dr. Pedro L. Ramos-Gonzalez
Dr. Marcos A. Machado
Alex Junior Soares
Gabriella Arena
Gabriela Barco
Marcela P. Bergamini
Thamiris Sipriano
Thais Sinico
[email protected]
Análise
de centenas de ácaros supostamente virulíferos
CiLV-C
Pocas partículas virais
Presumíveis vírions entre membranas de las células adjacentes nas
proximidades de la ramificación de lo intestino médio (ceco) y tejido adjacente
Ausencia de viroplasmas
CiLV-C
Quantificação de partículas virais no vetor
Ácaros virulíferos mantidos em fonte de inóculo por 48h e
transferidos para:
A) Fonte de inóculo por até 30 dias, com coletas a cada dois dias;
B) Limão Cravo (hospedeiro do vetor e não do vírus) e coletados a cada
dois dias por até 30 dias;
Nota: Amostras em duplicata na placa de RT-qPCR, com três repetições biológicas
Sem diferença estatística entre tratamentos;
sem aumento no número de ácaros
Andrade et al., 2013