5 Requerimientos de control de calidad en bioensayos

5 Requerimientos de control de calidad en
bioensayos
María del Carmen Cuevas Díaz, Guadalupe Pinette Medina,
Ángel Mario López Hidalgo, Jesús Samuel Cruz Sánchez,
María de Lourdes Nieto Peña
Es de primordial importancia considerar que en la realización de pruebas biológicas
se requiere del control de los aspectos que garantizan la confiabilidad de los resultados. La garantía de la credibilidad de los resultados implica que el laboratorio
mantenga estándares de calidad, los cuales se establecen en la Norma Mexicana
NMX-EC-17025-IMNC-2006 (DOF, 2006) “Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración”. Dicha norma considera
los siguientes aspectos: organización y administración del laboratorio, sistema de
calidad y auditoría, personal, distribución y medioambiente, instrumentos y equipos de medición, trazabilidad en las mediciones y métodos de medición y prueba.
A continuación se describen dichos aspectos agrupados en tres rubros generales:
aspectos del laboratorio, aspectos relativos a los organismos de prueba y aspectos
del desarrollo de los bioensayos.
Aspectos relacionados con el
funcionamiento del laboratorio
Dentro de los parámetros normativos que deben cumplir los laboratorios de ensayo
y calibración, es necesario considerar antes que nada su capacidad para implementar los métodos requeridos, de acuerdo con la capacidad de su personal y el equipo
con el que cuentan. El laboratorio debe garantizar el control adecuado de los ensayos, desde su inicio con la colecta o recepción de las muestras hasta la entrega final
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del reporte. Para ello debe demostrar que mantiene y actualiza regularmente sus
equipos, que su personal es confiable, que cuenta con una adecuada formación y
capacitación, que conoce las técnicas requeridas y que realiza revisiones periódicas
para detectar posibles desviaciones en los procedimientos.
Organización del laboratorio
Específicamente, en lo que corresponde a la organización y funcionamiento del
laboratorio, el primer punto a considerar es que todo el personal debe conocer y
respetar el organigrama del laboratorio, en el cual se deben establecer con claridad
las funciones y las responsabilidades de todos y cada uno de los integrantes.
Control de documentos
Debe establecerse un control de documentos que garantice el seguimiento adecuado de cualquier trámite a realizar. En estos documentos debe incluirse uno que
constate, antes de la realización de cada prueba, la competencia técnica y humana
del laboratorio para realizarla; en este es necesario indicar el tipo de prueba que se
realizará, si el ensayo ha sido implementado en el laboratorio previamente o no, las
necesidades materiales, técnicas y de personal capacitado para realizarlo, y la aceptación o cancelación de su realización de acuerdo con el análisis efectuado.
Cadena de custodia
Como se recomienda en el caso de las evaluaciones de sitios contaminados (DíazBaez et al., 2004), la validación de las técnicas de análisis de muestras requiere
que durante el muestreo se documente toda la secuencia de personas que hayan
estado en posesión de la totalidad o parte de la muestras. Es necesario establecer
una cadena de custodia, la cual debe constar en los registros internos del laboratorio y debe contener al menos los siguientes datos: tamaño de la muestra, lugar de
colecta, análisis efectuado y nombre del analista.
Evaluación del desempeño del personal
De manera verídica y de acuerdo con el periodo que determine el responsable del
laboratorio (tomando en cuenta el número de ensayos que se realizan y la solicitud
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de los clientes), debe llevarse a cabo una evaluación del desempeño del personal con base en la trazabilidad y la incertidumbre de las pruebas que realizan. De
acuerdo con la política de la Entidad Mexicana de Acreditación (EMA, 2011), el
cálculo de la incertidumbre constituye una parte indisoluble de los resultados de
las mediciones; es un elemento indispensable de la trazabilidad de las mismas. Sin
embargo, dicho cálculo no puede sustituir al pensamiento crítico, la honestidad
intelectual y la habilidad profesional. La evaluación de la incertidumbre no es una
tarea de rutina, ni puramente matemática; depende del conocimiento detallado de
la naturaleza de los mensurandos y de las mediciones. Por lo tanto, la calidad y la
utilidad de la incertidumbre indicada en los resultados de una medición dependen,
en última instancia, del entendimiento, el análisis crítico y la integridad de aquellos
que contribuyen a la asignación de ese valor; es decir, de la capacidad y preparación
del personal.
Aspectos relacionados con los organismos de prueba
Para controlar las variables que afectan a los organismos de prueba es muy importante tomar en cuenta los procedimientos establecidos para su cultivo y mantenimiento, y seguir estrictamente las indicaciones marcadas en ellos, con especial
énfasis en los siguientes puntos:
Condiciones ambientales
Debe darse un seguimiento adecuado de las condiciones en las que se cultivan o
mantienen los organismos y en las que se realizan los ensayos. Así, el organismo seleccionado debe someterse a una etapa de observación con la finalidad de garantizar
que no ha sido dañado durante el transporte ni por el cambio de condiciones ambientales. Cualquier cambio en estas puede producir resultados equívocos. En el caso de
las pruebas de actividad enzimática, por ejemplo, debe controlarse la temperatura, el
pH y el contenido de humedad del suelo de acuerdo con los requerimientos específicos para asegurar la actividad óptima de cada enzima (Moss, 1969).
Estado de salud de los organismos
Los organismos seleccionados para las pruebas deben ser observados con cuidado
para determinar su condición de salud. Si durante el tiempo de observación se
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registran signos de daño o una mortandad mayor al 1 %, se considera que dicho
lote de organismos no es adecuado y no debe ser usado en los ensayos (Serrano,
2010). De manera similar, durante las pruebas los organismos del control negativo
deben mostrar una mortalidad mínima (< 1 %) o nula, de lo contrario los resultados de esas pruebas deben ser desechados.
En el caso de pruebas crónicas y durante el mantenimiento de los organismos,
se debe comprobar la calidad nutricional y la ausencia de contaminantes en el alimento que se les proporciona.
Carta control
Para cada especie de organismos se debe contar con una carta control de la prueba,
en donde se lleve un registro histórico de su sensibilidad, de la estabilidad de su respuesta y de la repetibilidad de sus resultados. Las pruebas que muestren resultados
fuera de los límites superior o inferior de esta carta control deben ser descartados.
Aspectos relacionados con el desarrollo de los ensayos
Condiciones generales
La condición ideal es que los ensayos que se realicen sean pruebas estandarizadas,
es decir, que sus resultados demuestren estadísticamente que existe una relación
directa entre la concentración del compuesto tóxico al que se exponen y la respuesta biológica de los organismos. Esto implica que el ensayo se realiza mediante
un método normalizado o, en el caso en que el procedimiento empleado por el
laboratorio no cuente con esta característica, se requiere su validación mediante el
cálculo de los parámetros estadísticos clásicos de toda prueba experimental, como
la media y la desviación estándar, además del coeficiente de variación. Se deben
considerar además las cartas control que nos permiten tener presentes los rangos
de validez de las mediciones, tomando en cuenta el intervalo de confianza del 95
% recomendado por los estadísticos. De acuerdo con Díaz-Baez et al. (2004),
esta carta control es el medio de referencia para evidenciar el control de la sensibilidad de la especie empleada a un compuesto tóxico de referencia, de la estabilidad
de la respuesta biológica y de la repetibilidad (exactitud) de los resultados. Se recomienda que estas mediciones se realicen con un mínimo de 5 lecturas y se vayan
incorporando datos hasta llegar a 20.
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Colecta y preservación de muestras
Si se llevan a cabo, los protocolos de muestreo y manipulación o preservación de
las muestras deben ser incluidos como parte de procedimientos estandarizados.
Cualquier alteración de las muestras debido a su transporte, almacenamiento, tamizado, mezcla o toma de submuestras puede afectar los resultados de los ensayos
(USEPA, 2009). Por ello, deben seguirse estrictamente todos los pasos e indicaciones descritos en dichos procedimientos, además del ya indicado para llenar el
registro correspondiente a la cadena de custodia.
Mantenimiento, calibración y evaluación
del funcionamiento de los equipos
Todos los equipos deben recibir mantenimiento preventivo de manera regular y, en
caso necesario, mantenimiento correctivo. Dicho mantenimiento debe ser efectuado por empresas competentes para brindar este servicio.
El funcionamiento cotidiano de todos los equipos debe evaluarse periódicamente mediante técnicas de trazabilidad y cálculo de incertidumbre. Antes de realizar cualquier medición, los equipos, sin excepción, deben ser calibrados de acuerdo
con sus requerimientos específicos. Para esta calibración deben emplearse materiales y reactivos certificados.
Condiciones y limpieza del material
Ningún material que se use para el cultivo o el mantenimiento de los organismos o
para la realización de las pruebas debe afectar su desarrollo.
La cristalería empleada para las mediciones volumétricas debe ser de vidrio de
borosilicato resistente al calor. Los recipientes plásticos que se usan son generalmente de polímeros como PVC, polipropileno o poliestireno. Estos se seleccionan
según el uso que se les vaya a dar y las condiciones a las cuales se les vaya a exponer. De acuerdo con ello, se toma en cuenta que pueden ser afectados por el calor,
por compuestos corrosivos o por disolventes orgánicos.
Para el caso de las pipetas y las buretas, estas no deberán estar rotas de la
punta. Además, las llaves de las buretas deben cerrar fácil y herméticamente, y no
deben formar gota en la punta después de un periodo de 60 s.
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Todo el material, pero en especial la cristalería, debe sujetarse a un procedimiento de limpieza que garantice la ausencia de contaminación. Para el caso del
material de vidrio se recomienda seguir el siguiente procedimiento:
Si el material se expone a compuestos tóxicos orgánicos, dos días antes de la
prueba se lava el material con detergente no iónico adecuado para muestras biológicas, se enjuaga con abundante agua, y se deja en solución de mezcla crómica
(mezcla de 100 g de dicromato de potasio en un litro de ácido sulfúrico técnico
diluido en una proporción 1:4) cuando menos una hora (la mezcla crómica puede
ser sustituida por algún producto sin cromo, como el Sulfoclean o también se puede
emplear ácido muriático comercial). Posteriormente se enjuaga con agua destilada
o desionizada, se escurre y se seca en la estufa a 110 °C. Si la forma del material
dificulta su secado espontáneo, como en el caso de las pipetas, se le adiciona acetona, la cual es eliminada mediante el secado en la estufa. Si el material se expone
a compuestos inorgánicos, se sumerge en ácido muriático comercial (contiene del
30 al 32 % de cloruro de hidrógeno) cuando menos una hora, se enjuaga con agua
destilada o desionizada y se seca en la estufa a 110° C.
Una vez que el material ha sido lavado, debe protegerse del polvo, ya sea tapándolo con papel aluminio o guardándolo en estantes adecuados.
Reactivos
Salvo que otra cosa se especifique, todos los reactivos que se emplean deben ser
grado analítico ACS. Asimismo, los compuestos tóxicos de referencia que se usen
para evaluar la sensibilidad de los organismos de prueba o como controles positivos
en los ensayos deben ser certificados, presentar una pureza del 99 % y ser solubles
en agua. Estos últimos deben usarse exclusivamente para los bioensayos. En cuanto a las concentraciones de los compuestos tóxicos de referencia, se debe emplear
un intervalo adecuado para evaluar la respuesta de los organismos.
El agua con la que se preparen las soluciones y diluciones, con la que se enjuague todo el material y con la que se mantengan o cultiven los organismos de
prueba debe ser de alta calidad, como el agua tipo I, en donde los compuestos o
elementos no son detectables prácticamente; así por ejemplo, la concentración de
carbono orgánico total es menor de 100 µgl-1, el contenido de bacterias menor de
10 UFC/mL, la conductividad eléctrica de 0.056 µScm-1 y el contenido de sílice
menor de 3 µgl-1 (ASTM, 1991).
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Soluciones
Debe garantizarse que las soluciones se encuentren correctamente preparadas e
indicar en su etiqueta el nombre de la solución, su concentración, fecha de preparación y vencimiento, y nombre del laboratorista. Para el caso de soluciones para
volumetría, como por ejemplo ácidos o bases, se deberán valorar cuando sean utilizadas para corroborar su normalidad o molaridad.
Las soluciones deben almacenarse en recipientes de vidrio o plástico según el
tipo de producto. Por ejemplo, se recomienda colocar las soluciones de hidróxido
de sodio (NaOH) en recipiente de plástico, para evitar efectos sobre el vidrio, o
almacenar las soluciones sensibles a la luz en frascos ámbar. También se deben
preservar en condiciones que impidan su degradación, ya sea en refrigeración, ausencia de luz, etc.
Para la preparación exacta de una solución deben utilizarse pipetas y matraces
volumétricos. Cuando sea posible, se pueden preparar soluciones madre o stock,
que posteriormente se diluyen en la proporción adecuada para obtener las soluciones de trabajo (Harvey, 2002).
Para el caso de los compuestos tóxicos de referencia, sus soluciones patrón
deben ser valoradas con reactivos certificados antes de la realización de los ensayos
(Díaz-Baez et al., 2004).
Réplicas y controles
En todos los ensayos debe garantizarse, como mínimo, la preparación por triplicado
de todos los tratamientos. Esto permite obtener un adecuado número de datos
para el manejo estadístico de los resultados y para el cálculo de los parámetros de
toxicidad, como la CL50 o la CE50. En cuanto al número de individuos por tratamiento, éste depende de las características del organismo en estudio; sin embargo,
debe seleccionarse considerando el nivel de significancia y el tipo de análisis estadístico que se aplicarán.
En cada prueba se debe incluir un control positivo, a una concentración cercana
a la CE50 o la CL50, y un control negativo, para conocer el porcentaje del efecto
máximo. En caso necesario, se debe incluir además un control del vehículo empleado para disolver el contaminantes de interés. También se debe incluir un blanco de
procedimiento, cuya respuesta de toxicidad no debe ser mayor al 10 %.
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Suelo usado como control negativo
En las pruebas que se realizan directamente en suelo, un factor importante que
puede ocasionar errores es la selección del suelo que se usa como control negativo,
también conocido como suelo de referencia. Con frecuencia es difícil conseguir
un suelo igual al suelo problema y que pueda usarse como referencia. Para ello se
recomienda buscar uno que presente características fisicoquímicas lo más similar
posible al suelo problema. Por lo tanto, debe llevarse a cabo una caracterización
general de las propiedades tanto del suelo problema como del que se vaya a usar
como control negativo.
De manera similar al control negativo, el uso de suelo artificial contaminado
como control positivo puede producir resultados distintos con respecto al suelo
problema debido a las diferencias en su composición y en la interacción de los
contaminante con sus componentes (Eijsackers, 1997). La adición de arcilla al
suelo puede cambiar sus propiedades y hacerlo más o menos incompatible con el
crecimiento o el desarrollo de los organismos de prueba, por lo que la composición
del suelo debe seleccionarse en función del bioensayo que se vaya a realizar (ISO,
2003).
Determinación de la respuesta
En la mayoría de la pruebas la respuesta que se mide es la mortalidad o ciertos efectos subletales. La muerte de los organismos es fácil de reconocer en casi todas las
especies; sin embargo, en ocasiones la observación a simple vista no es suficiente,
por lo que se debe recurrir a estímulos mecánicos para determinar esta respuesta.
En lo que respecta a los efectos subletales, se debe tener en cuenta el comportamiento de los organismos, como por ejemplo la velocidad y la frecuencia de desplazamiento, la respuesta a estímulos mecánicos, o cualquier otra característica propia
de la especie en estudio (Serrano, 2010).
Es importante mencionar que todos los aspectos anteriormente descritos se
encuentran relacionados y, por ello, debe darse un seguimiento puntual de todos,
de manera que se controle integralmente el desarrollo de las pruebas y se garantice
la obtención de resultados confiables.
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Referencias
American Society for Testing and Materials (ASTM). 1991. Estándares de calidad de agua.
Wasserlab. D1193-91. http://www.wasserlab.es/castellano/PDF/estandares_calidad_agua.pdf. Consultado en agosto de 2011.
Díaz-Baez, .M.C., Sobrero, C., Pica Granados, Y. 2004. Aseguramiento y control de calidad
de bioensayos. En: Castillo, G. (editora). Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas. Estandarización, Intercalibración, Resultados y Aplicaciones. Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo, Instituto Mexicano de
Tecnología del Agua. México.
Eijsackers, H. 1997. Soil ecotoxicology: Still new ways to explore or just paving the road.
En: Van Straalen, N.M., Lokke, H. (editores). Ecological Risk Assessment of Contaminants in Soil. Chapman and Hall. Londres. Inglaterra.
Entidad Mexicana de Acreditación (EMA). 2011. Política de Incertidumbre en mediciones. http://www.ema.org.mx/descargas/ensayos_aptitud/politicas/politica_intertidumbre_mediciones.pdf. Consultado en febrero de 2011.
Harvey, D. 2002. Química Analítica Moderna. Mc Graw Hill. España.
International Organization for Standardizations (ISO). 2003. Soil Quality. Guidance on the
ecotoxicological characterization of soils and soil materials. ISO 15799:2003. Suiza.
Moss, A. D. 1969. Accuracy, precision and quality control of enzyme assays. Journal of
Clinical Pathology. 24, 22-30.
Diario Oficial de la Federación (DOF). 2006. Norma Mexicana NMX-EC-17025IMNC-2006, evaluación de la conformidad. Requisitos generales para la competencia
de los laboratorios de ensayo y calibración. Publicado el 24 de julio.
Serrano, G.R. 2010. Introducción al análisis de datos experimentales. Tratamiento de datos en bioensayos. Universitat Jaume I. España.
United States Environmental Protection Agency (USEPA). 2009. Soil Toxicity and Bioassessment. Test Method for Ecological Risk Assessment. Office of Environmental
Health Hazard Assessment. EUA.
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