HAV IgM S

S
HAV IgM
punto inferior — anticuerpos de conejo anti-IgM humano.
La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila
contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa
del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de
una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa.
Al comienzo de la prueba, las muestras de suero o plasma se
prediluyen a 1:50 y se agregan al diluyente en los pocillos de la fila
A de la Bandeja de Desarrollo. El Peine luego es insertado en los
pocillos de la fila A. El IgM humano es capturado por los anticuerpos
anti-IgM en los puntos inferiores de los dientes del Peine (Figura 1).
Los componentes no unidos son lavados en la fila B. En la fila C,
anticuerpos IgM anti-HAV capturados en los dientes reaccionan con
el antígeno de HAV. Simultáneamente, el antígeno HAV también se
une al anticuerpo anti-HAV en el punto superior (Control Interno). En
la fila D, el antígeno HAV unido reacciona con el anticuerpo antiHAV monoclonal marcado con fosfatasa alcalina (FA). En la fila E
los componentes no unidos son eliminados mediante un lavado. En
la fila F, la fosfatasa alcalina unida reacciona con componentes
cromogénicos. Los resultados pueden observarse como puntos azul
grisáceo en la superficie del diente del Peine.
Captura de anticuerpos;
2 horas/37ºC
α− IgM
humano
anticuerpos
humanos IgM
Reacción HAV — anti-HAV;
30 min/37ºC
HAV
FA
FA
Unión del conjugado
anti-HAV; 20 min/37ºC
conjugado
α-HAV
Reacción enzimática de
color; 10 min/37ºC
FA
Formato: 3 x 12 pruebas
Código: 60457002
Para uso diagnóstico in vitro solamente
Uso Previsto
®
El kit ImmunoComb II HAV IgM es una prueba rápida para la
detección cualitativa de anticuerpos IgM contra el virus de hepatitis
A (HAV, según sus siglas en inglés) en el suero o plasma humano.
Treinta y seis pruebas pueden ser realizadas con un kit.
Introducción
La Hepatitis A es una enfermedad frecuente en la población
humana, causada por el virus de la hepatitis A (HAV). Luego de un
período de incubación de 14 a 40 días, la infección de HAV se
manifiesta más comunmente por ictericia debido a una inflamación
aguda del hígado y el subsecuente incremento de la concentración
de bilirrubina en la sangre. No se han registrado casos de infección
crónica.
La hepatitis A es endémica en todas partes del mundo. Su
epidemiología está marcadamente influenciada por el nivel local de
sanidad e higiene. La trasmisión se produce por vía fecal-oral. Una
alta cantidad de virus (hasta 108 unidades infecciosas por gramo)
son excretadas en las heces unos cuantos días antes de que
aparezcan los síntomas clínicos o la ictericia. La diseminación del
virus se realiza a través del contacto directo o el consumo de
alimentos o aguas contaminados.
La profilaxis de la hepatitis A se logra actualmente por medio de la
inmunización pasiva con inmunoglobulinas anti-HAV humanas.
Además, recientemente han sido desarrolladas vacunas de HAV.
Varias causas de origen viral (por ejemplo, virus de hepatitis B y
hepatitis C) o no-viral pueden inducir hepatitis. Por consiguiente, es
muy difícil diagnosticar la infección de HAV en base a los síntomas
clínicos y la evaluación bioquímica de las funciones hepáticas
únicamente. El inmunodiagnóstico, sin embargo, permite la
identificación del agente etiológico.
Los anticuerpos de IgM al HAV son producidos en la etapa
temprana de infección de HAV y persisten durante la fase aguda de
la enfermedad. La detección de IgM anti-HAV usando el kit
ImmunoComb® II HAV IgM permite el diagnóstico seguro de la
infección aguda de HAV.
Principio de la Prueba
La prueba ImmunoComb® II HAV IgM es un ensayo
inmuno-enzimático de fase sólida (EIA) basado en el principio de la
inmunocaptura. La fase sólida es un Peine con 12 proyecciones
("dientes"). Cada diente está sensibilizado en dos áreas activas:
punto superior — anticuerpo monoclonal contra virus de hepatitis A
(Control Interno)
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sustrato
cromogénico
Figura 1. Principio de la Prueba
El kit incluye un Control Positivo (IgM anti-HAV) y un Control
Negativo, que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba.
Al término de ésta, el diente usado con el Control Positivo debe
mostrar 2 puntos de color azul grisáceo. El diente usado con el
Control Negativo debe mostrar el punto superior y un punto inferior
muy ténue o la ausencia del mismo. El punto superior debe también
aparecer en todos los demás dientes, a fin de confirmar que el kit
funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada de manera
correcta.
Contenido del Kit
Peines
El kit contiene 3 Peines de plástico. Cada Peine tiene 12 dientes, un
diente para cada prueba (Figura 2). Cada diente está sensibilizado
en dos áreas reactivas:
punto superior — anticuerpo monoclonal contra el virus
hepatitis A (Control Interno)
punto inferior — anticuerpos de conejo anti-IgM humano
®
ImmunoComb II
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Control Interno
Anti-IgM humano
Figura 2. Peine
Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que
contienen una bolsa desecante.
Bandejas de Desarrollo
El kit contiene 3 bandejas de desarrollo cubiertas con papel de
aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los
reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrollo
consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una.
Los contenidos de cada fila son los siguientes:
Fila A diluyente de la muestra
Fila B solución de lavado
Fila C antígeno HAV
1
Fila D
Fila E
Fila F
anticuerpo anti-HAV monoclonal marcado con fostatasa
alcalina
solución de lavado
solución de sustrato cromogénico conteniendo
5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul
tetrazolio (NBT)
Figura 3. Bandeja de Desarrollo
Control Positivo — 1 frasco (tapa roja) de 0,2 ml de plasma humano
inactivado con calor, conteniendo anticuerpos IgM anti-HAV.
Control Negativo — 1 frasco (tapa verde) de 0,2 ml de plasma humano
inactivado con calor, negativo para anticuerpos anti-HAV.
Diluyente de la muestra — 1 frasco de 20 ml de diluyente.
Perforador — para perforar el papel de aluminio que cubre los
pocillos de la Bandeja de Desarrollo.
Seguridad y Precauciones
•
•
•
•
•
•
Todos los materiales de origen humano usados en la
preparación del kit pasaron pruebas que demostraron que no
son reactivos al antígeno de superficie de la hepatitis B, así
como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C. Ya que
ningún método puede garantizar por completo la ausencia de
contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todas
las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran
potencialmente infecciosas.
Use guantes quirúrgicos y ropas de laboratorio. Siga los
procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con
suero o plasma humano.
No use la pipeta aspirando con la boca.
Deseche todas las muestras, Peines usados*, Bandejas de
Desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos
biocontaminantes.
No mezcle reactivos de lotes diferentes.
No use el kit después de la fecha de caducidad.
Conservación y estabilidad del kit
•
•
•
•
•
•
El kit es enviado a 2-8º C. Durante el transporte el kit puede ser
conservado a menos de 30º C durante cortos períodos de
tiempo que no excedan de 48 horas. Los controles internos
indican que el kit no ha sido dañado durante el transporte.
Conservar el kit en su caja original a 2-8º C.
No congelar el kit.
Después de abrir el kit inicialmente, los componentes deben
ser conservados a 2-8º C.
El funcionamiento del kit después de su apertura inicial, es
estable hasta la fecha de caducidad del mismo si se conserva
a 2-8º C.
Después del uso inicial, el peine y la bandeja de reactivos no
pueden ser utilizados más de tres veces.
Manejo de las Muestras
• Es posible usar suero o plasma en la prueba.
• Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a temperaturas
de 2° a 8°C antes de la prueba. Para almacenar las muestras por
más de 7 días, congélelas a -20°C o a temperaturas más bajas.
• Todas las muestras congeladas deben centrifugarse a 10.000 rpm,
por 5 minutos a temperatura ambiente. Remover cuidadosamente
el líquido sobrenadante. Si se forma una capa de lípidos en la
superficie, asegurese de tomar la muestra del líquido claro debajo
de la capa. Evite congelar y descongelar repetidamente.
• Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no han
mostrado tener efecto sobre los resultados del test.
Procedimiento de la Prueba
Equipo Necesario
•
•
•
•
Pipetas de precisión ajustables con puntas desechables con
capacidad de 10 µl, 25 µl y 490 µl
Tijeras
Cronómetro de laboratorio o reloj
Microtubos
* A menos que sea archivado para consulta posterior
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Preparación de la Prueba
Ponga todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente y
realice la prueba a temperatura ambiente(22°-26°C).
Preparación de la Bandeja de Desarrollo
1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37°C por
45 minutos.
2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, para ser
desechado como desecho biocontaminante al concluir la
prueba.
3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo.
Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo;
rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador,
cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen.
Preparación del Peine
Precaución: Para asegurar el funcionamiento apropiado de la
prueba, no toque los dientes del Peine.
1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el
Peine.
2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o
una parte. Para utilizar parte del Peine:
a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las
muestras y los controles. Se necesita un diente para cada
prueba. Cada diente tiene impreso el número del código del kit,
"57", para permitir la identificación de los dientes sueltos.
b. Doble y rompa verticalmente el Peinte, o córtelo con tijeras
(ver Figura 4) para separar el número requerido para las
pruebas (Nro. de pruebas mas dos controles).
c. Vuelva a meter la porción no utilizada del Peine en el
empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien
el empaque (con un clip, por ejemplo) para mantenerlo
seco. Almacene el Peine en la caja original del kit a
temperaturas de 2°a 8°C para su uso posterior.
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ImmunoComb II
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Figura 4. Fraccionamiento del Peine
Instrucciones de la Prueba
Predilución de Muestras y Controles
1. Para cada muestra y control, vierta 490 µl de diluyente de la
muestra en un microtubo.
2. A cada microtubo agregue 10 µl de una muestra o del Control
Positivo o del Control Negativo suministrados con el kit. Mezcle
vaciando y rellenando repetidamente la solución.
Captura de anticuerpo (FIla A de la Bandeja de Desarrollo)
Nota: Incube a 37°C. Las etapas de lavado deben llevarse a cabo a
temperatura ambiente (22°–26°C)
3. Pipetee 25 µl de una muestra prediluída. Perfore la cubierta de
aluminio de un pocillo de la fila A con la punta de la pipeta o el
perforador y vacíe la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle la
solución rellenando y vaciando el pocillo.
Deseche la punta de la pipeta.
4. Repita el paso 3 para las otras muestras prediluídas y los dos
controles prediluídos. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie
la punta de la pipeta para cada muestra o control.
5. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los pocillos
de la fila A que contienen las muestras y los controles.
Mezcle: Retire e inserte el Peine en los pocillos varias
veces.
b. Deje el Peine en la fila A e incube por 2 horas a 37°C. Programe
el reloj. Antes de dos horas, perfore la cubierta de la fila B,
utilizando el perforador. No abra más pozos de los necesarios.
c. Al cumplirse las 2 horas, saque el Peine de la fila A.
Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes
apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la
superficie frontal del diente.
Primer Lavado (FIla B)
6. Inserte el Peine en los pocillos en la fila B. Agite: retire e inserte
vigorosamente el Peine en los pocillos por al menos
10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado
varias veces agitando en el transcurso de 2 minutos; mientras
tanto, perfore el papel aluminio de la fila C. Después de dos
minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido como en
el paso 5c.
2
Reacción Antígeno-Anticuerpo (Fila C)
7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle como en el paso
5a. Incube la Bandeja de Desarrollo por 30 minutos (programe el
reloj) a 37°C. Perfore el papel aluminio de la fila D. Después de
30 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido.
Unión del Conjugado (Fila D)
8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Mezcle. Incube la
Bandeja de Desarrollo con el Peine por 20 minutos (programe el
reloj) a 37°C. Perfore el papel aluminio de la fila E. Después de
20 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido.
Segundo Lavado (Fila E)
9. Inserte el Peine en los pocillos de la Fila E. Agite repetidamente
durante dos minutos, como en el paso 6. Perfore el papel
aluminio de la fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y
absorba el líquido adherido.
Reacción de Color (Fila F)
10. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Incube la Bandeja
de Desarrollo con el Peine por exáctamente 10 minutos (programe el
reloj) a 37°C. Después de 10 minutos, retire el Peine.
Detención de la Reacción (Fila E)
11. Inserte el Peine de nuevo en la fila E. Después de un minuto,
retire el Peine y déjelo secar al aire.
Almacenamiento de las Partes No Usadas
del Kit
Bandeja de Desarrollo
Si no usó todos los pocillos de la Bandeja de Desarrollo, puede
almacenarla para ser utilizada posteriormente:
• Selle los pocillos usados con una cinta adhesiva ancha a fin de
que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de
que la Bandeja de Desarrollo sea volcada.
Otros Materiales del Kit
• Vuelva a colocar la(s) Bandeja(s) de Desarrollo, Peine(s),
perforador, controles e instrucciones en la caja original del kit y
almacene a temperatura de 2° a 8°C.
Validación
A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y
demostrar que los resultados son válidos, deben cumplirse las
siguientes cuatro condiciones (ver Figura 5):
1. El Control Positivo debe producir dos puntos en el diente del
Peine.
2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control
Interno). El punto inferior puede no aparecer o aparecer
ténuemente, sin afectar la interpretación de los resultados.
3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior
(Control Interno).
Si cualquiera de las cuatro condiciones no se cumplen, los
resultados no son válidos y las muestras y controles deben ser
reexaminados.
Control
Negativo
Resultados
Inválidos
Figura 5. Validación de la Prueba
Interpretación Cualitativa de los
Resultados
Interpretación Visual
Compare la intensidad del punto inferior de cada diente de la muestra con
la del punto inferior del diente del Control Positivo (Figura 6).
• Un punto con una intensidad major que o igual a la del Control
Positivo indica la presencia de anticuerpos IgM anti-HAV.
• La ausencia del punto o su presencia con menor intensidad que la
del Control Positivo debe ser considerada como un resultado
negativo.
≤
Resultado Negativo
®
El kit ImmunoComb II HAV IgM es una prueba de tamizaje.
Los resultados indican que una muestra es reactiva a los
anticuerpos IgM contra el HAV, mas no debe considerarse como
diagnóstico de infección de hepatitis A. Evalúe los resultados de la
prueba en relación a la sintomatología, historia clínica y otros
parámetros de laboratorio del paciente.
Características del Ensayo*
A. Panel de Desempeño
®
La sensibilidad y la especificidad del Kit ImmunoComb II HAV IgM
fueron evaluados en 627 muestras de suero.
Los resultados son resumidos en la Tabla 1.
Tabla 1. Resultados de la Prueba
®
Ensayo de Referencia
ImmunoComb II HAV IgM
Positivo
Negativo
Positivo
204
3
Negativo
3
417
Se calcularon las características del ensayo, encontrándose los
siguientes reultados:
Sensibilidad – 98.5 %
Especificidad – 99.3 %
B. Seroconversión
®
La capacidad del kit de ImmunoComb II HAV IgM para detectar
tempranamente HAV IgM fue evaluada en un panel de seroconversión de
5 miembros obtenido de Boston Biomedica, Inc. (Bridgewater, MA USA)
de un solo individuo con un anti-HAV IgM RIA como prueba de referencia.
Ambas pruebas detectaron anti-HAV IgM en los sueros números 3 y 4,
pero no en el suero número 5. Anti-HAV IgG fueron detectados en las
muestras 3 a 5. Los resultados muestran 100% de correlación con RIA.
Repetibilidad
Diez peines fueron escogidos al azar de varias partes de un lote de
producción. Un suero positivo fue analizado 12 veces en estos
10 peines. Todas las veces el suero resultó positivo para HAV IgM.
Resultados de la Prueba
Control
Positivo
Limitaciones
Control
Muestra
Positivo
Presencia de anticuerpos IgM anti-HAV
Figura 6. Resultados de las Pruebas
Documentación de los Resultados
Debido a que el color que aparece en el Peine es estable, los
Peines pueden ser archivados para consulta posterior.
60457002/S13/OR/CE
Reproducibilidad
Tres muestras positivas para HAV fueron analizadas en peines
tomados de tres diferentes lotes de producción. En todos los casos,
todas las muestras positivas fueron detectadas.
Reacción Cruzada
Reacción Cruzada con muestras positivas de hepatitis causada por
agentes tales como Antígeno de Superficie del virus de la hepatitis
B, virus de la hepatitis C, VIH-1, VIH-2, HAV Ab y HTLV no fue
importante.
Interferencia
No se observó interferencia con muestras hemolisadas
(hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipémicas (Colesterol hasta
281.6 mg/dL; Triglicéridos hasta 381.0 mg/dL) y bilirrubina alta
(hasta 20 mg/dl).
Bibliografίa
Blaine H. 1991. Hepatitis A virus. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB,
Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds. Raven Press,
New York. pp 1-37.
Decker R, Ling CM, Overby L, Frösner GG, Boggs J. 1976.
Serology of transmission of hepatitis A in humans. J Infect Dis
139:74-82
Dienstag JL, Krugman S, Wong DC, Purcell RH. 1976.
Comparison of serological tests for antibody to hepatitis A antigen
using coded specimens from individuals infected with MS-1 strain of
hepatitis A virus. Infect Immun 14:1000-1003.
Duermeyer W, Van der Veen J, Koster B. 1978. ELISA in hepatitis
A. Lancet 1:823-824.
Frösner GG, Papaevangelou G, Butler R, Iwarson S, Lindholm A,
Courource-Pauty AM. 1979. Antibody against hepatitis A in seven
european countries. I. Comparison of prevalence data in different
age groups. Am J Epidemiol 110:63-69.
Herrera JL. 1994. Serological diagnosis of viral hepatitis. S Med J
87:677-684.
Kiyasu PK, Caldwell SH. 1993. Diagnosis and treatment of the
major hepatotropic viruses. Am J Med Sci 306:248-261
* Datos detallados disponibles
3
Szmuness W, Dienstag JL, Purcell RH, Harley EJ, Stevens CE,
Wong DC. 1976. Distribution of antibody to hepatitis A antigen in
urban adult populations. N Engl J Med 295: 755-759.
Zaaijer HL, Leentvaart-Kuijpers A, Rotman H and Lelie PN. 1993.
Hepatitis A antibody titres after infection and immunization:
Implications for passive and active immunization. J Med Virol
40:22-27.
Leyenda de los símbolos
CARD
®
ImmunoComb tarjeta
PLATE
Bandejas de Desarrollo
CONTROL +
CONTROL
-
PERFORATOR
Control positivo
Control negativo
Perforador
Consulte las instrucciones de uso
Atención,ver instrucciones de uso
IVD
Producto sanitario para diagnóstico in
vitro
Limite de temperatura
Σ
n
Contenido suficiente para n ensayos
Fabricante
Representante autorizado en la
Comunidad Europea
REF
Número de catálogo
DIL
Diluyente de la muestra
LOT
Codigo de lote
Fecha de caducidad
Número de serie
Version: 60457002/S13/OR/CE
(03/2009)
60457002/S13/OR/CE
4
Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba
2
1
Preincubación de la Bandeja de
Desarrollo: 45 minutos a 37°C
3
Tomar y prediluir las
muestras y controles
5
6
Insertar el Peine y mezclar en
la fila A. Incubar a 37°C
Perforación de la fila B
4
Agregar las muestras y
controles prediluídos a
la fila A. Mezclar
Sacar el Peine del
empaque
8
7
Absorber el líquido
adherido a los dientes
Insertar el Peine y agitar
en la fila B. Incubar
Luego de mezclar/agitar e
incubar en filas C, D y E…
10
9
Reacción de color en la
fila F
Resultados
Resumen del Procedimiento de la Prueba
Las instrucciones abreviadas abajo son para los usuarios experimentados en el uso del kit
®
ImmunoComb II HAV IgM.
(Para instrucciones detalladas, favor referirse al texto completo)
1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37ºC por 45 minutos.
2 Prediluya 10 µl de cada muestra y control mezclando con 490 µl de diluyente de la muestra.
3. Vierta 25 µl de cada muestra y control prediluídos en los pocillos de la fila A de la Bandeja de
Desarrollo y mezcle.
4. Inserte el Peine en la fila A, mezcle y continúe como se describe en la Tabla 1.
Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba
Paso
Fila
Proceda como sigue
Captura de anticuerpos
A
Mezcle; incube 2 horas a 37ºC; absorba.
Lavado
B
Agite; incube 2 minutos; absorba.
Reacción Antígeno-anticuerpo
C
Mezcle; incube 30 minutos a 37ºC; absorba.
Unión del conjugado
D
Mezcle; incube 20 minutos a 37ºC; absorba.
Lavado
E
Agite; incube 2 minutos; absorba.
Cromógeno
F
Mezcle; incube 10 minutos a 37ºC.
Detención de la reacción
E
Incube 1 minuto; seque al aire.
1
2
Manera de romper el Peine
60457002/S13/OR/CE
5