EFECTO DE LA EPIGALOCATEQUINA-3-GALATO

EFECTO
DE
LA
EPIGALOCATEQUINA-3-GALATO
NEOVASCULARIZACIÓN CORNEAL
SOBRE
LA
Introducción
La neovascularización es un factor fisiopatogénico importante en patologías crónicodegenerativas como diabetes, cáncer, aterosclerosis, enfermedades cardiovasculares y a nivel
ocular la retinopatía diabética y la neovascularización corneal. Esta última es considerada
como un importante problema de salud; en Estados Unidos se estima que 1.4 millones de
pacientes, presentan neovascularización corneal secundaria a enfermedades inflamatorias,
degenerativas o por trauma1,2. Cuando existe daño corneal se induce la activación e
infiltración de células inflamatorias que producen especies reactivas de oxigeno, factores proinflamatorios y angiogénicos como un mecanismo de respuesta celular; siendo la respuesta
inflamatoria y el estrés oxidativo los principales desencadenantes de la neovascularización1-3.
Por otro lado la neovascularización y cicatrización no solo puede disminuir la agudeza visual
sino también son factores de riesgo para el rechazo inmunológico del trasplante de córnea4-5.
Las terapias antiinflamatorias para disminuir la neovascularización tradicionalmente con
corticosteroides y actualmente las nuevas terapias antiangiogénicas son motivo de debate
debido a los efectos adversos presentados así como a los pobres resultados5-7. Actualmente, se
han usado nuevos tratamientos antiangiogénicos como la terapia fotodinámica, anticuerpos
monoclonales antiangiogénicos y terapia génica8,9. Por otro lado los antioxoidantes naturales
han mostrado tener un efecto benéfico en modelos in vitro e in vivo en cáncer así como en
procesos inflamatorios debido en parte a la imhibición de la angiogenesis. Dentro de estos la
Epigalocatequina-3-galato (EGCG) principal flavonoide derivado de la “Camellia sinensis” o
té verde, ha sido estudiada por sus propiedades antioxidantes10,11. En estudios experimentales
en animales y modelos in vitro, EGCG presenta excelentes propiedades antitumorales y
antiinflamatorias, al inhibir la producción de oxido nítrico (NO) en el tejido afectado, además
de suprimir factores proinflamatorios como IL-1, NF-kB e iNOS y angiogénicos como
VEGF y MMP-2 y 911-14. Sin embargo existen pocos reportes de los efectos de los flavinoides
en la neovascularización corneal. Joussen y colb. reportan los efectos antiangiogenicos de
tres flavinoides (Genisteina, Fisetina y Luteolina) como tratamiento tópico en microemulsión,
en un modelo de neovascularización por herida quirúrgica15. Por otro lado Cao y cao han
demostraron que el consumo oral de EGCG inhibe la angiogenesis corneal16. En otros
estudios a nivel ocular EGCG ha presentado un efecto protector en las células ganglionares y
células del epitelio pigmentado de la retina de ratas con reperfusión isquémica al regular las
vías apoptóticas e inhibir la producción oxido nítrico mostrando la potencialidad de EGCG
como antioxidante sin efecto citotoxico secundario17,18. En base a estos reportes podemos
sugerir que la aplicación directa de EGCG sobre la superficie ocular puede disminuir la
neovascularización corneal al inhibir diversos factores inflamatorios y angiogénicos como
NF-kB, IL-1B, MMPS así como productos del estrés oxidativo como NOS2. El presente
estudio demuestra el efecto anti-inflamatorio y anti-angiogénico de EGCG en modelo animal
con inflamación corneal inducida por alcali.
Objetivo
Determinar el efecto de EGCG en la neovascularización corneal en ratas quemadas con álcali.
Material y métodos
Con un diseño prospectivo, longitudinal y experimental el presente estudio, aprobado por el
comité de ética, determinó si la aplicación de EGCG disminuye o no la formación de
neovasos cornéales en ratas quemadas por álcali. Se utilizaron 20 ratas machos de la cepa
wistar, con un peso de 180 a 220 gr. El cuidado y manejo de los animales se realizó de
acuerdo a la norma oficial mexicana y a los estatutos de ARVO (American Research For
Vision and Ophthalmology)19. Las ratas se dividieron en 4 grupos: el grupo 1 fueron ratas no
quemadas a las cuales se les aplicó solución salina balanceada transconjuntival mientras que
el grupo 2 fueron ratas no quemadas a las cuales se les aplicó 400 µm de EGCG. Los grupos
3 y 4 fueron ratas quemadas con álcali con aplicación de solución salina balanceada
transconjuntival y 400 µm de EGCG respectivamente.
Para la inducción de la neovascularización corneal a las ratas de los grupos 3 y 4, bajo
anestesia general con pentobarbital sódico; se les aplicó por 20 segundos, NaOH al 1.0 %,
impregnado en un disco de papel filtro de 3 mm de diámetro en la superficie de la córnea
central del ojo derecho, Se realizó un lavado corneal posterior a la aplicación del álcali.
72 horas después de la quemadura, bajo anestesia general se administró la suspensión de
EGCG vía subconjuntival en las ratas de los grupos 3 y 4 y solución salina balanceada a los
grupos 1 y 2. Se utilizó una jeringa tipo insulina con aguja calibre 30G. Ocho días después los
globos oculares fueron enucleados, fijados y preparados con hematoxilina-eosina para el
estudio histopatológico de las corneas. Para evaluar la neovascularización así como los
cambios morfológicos en los tejidos estudiados, con microscopio de luz se realizó un análisis
histopatólogico doble ciego por parte de 2 patólogos expertos en oftalmología. Se registró la
descripción específica para cada preparación. Por otro lado para el análisis cuantitativo se
realizó el conteo del número de vasos presentes por campo a una magnificación de 40X. Las
piezas de patología macroscópicas así como las preparaciones histológicas fueron
fotografiadas con una cámara digital adaptada a los microscopios.
Para el análisis inmunohistoquímico del tejido corneal; secciones de tejido fueron montadas
sobre laminillas cubiertas con poli-L- lisina (marca). La laminilla fue calentada en un horno
de microondas durante 10 minutos y luego el tejido fue incubado con suero normal de conejo
(Dako, Kyoto, Japón; 1: 75 diluido) e incubado con anticuerpos NF-kB, IL-1B, MMP2 e
NOS2, seguido por la incubación del anticuerpo secundario anti- IgG de ratón de conejo
marcado con biotina (Dako, Kyoto, Japón). La Peroxidasa endógena fue bloqueada con
peróxido de hidrógeno al 3 % de en metanol durante 30 minutos. Posteriormente la laminilla
lavó con solución amortiguadora TRIS-HCl 50 mM (pH 8.0), el complejo antígeno anticuerpo
en el tejido fue visualizado mediante un sistema de detección de peroxidasa streptavidin–
horseradish (Dako, Kyoto, Japón) con diaminobenzidine como cromógeno.
Para el estudios de toxicidad por estrés oxidativo las preparaciones fueron incubadas con el
anticuerpo monoclonal N45.1 anti-8-OH-dG (Japan Institute for the Control of Aging,
Fukuroi, Japan), seguido por la adición del anticuerpo secundario anti- IgG de ratón de conejo
marcado con biotina (Dako, Kyoto, Japón). Peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido
de hidrógeno al 3 % de en metanol durante 30 minutos. Posteriormente la laminilla se lavó
con solición amortiguadora TRIS-HCl 50 mM (pH 8.0), el complejo antígeno anticuerpo se
visualizará mediante un sistema ABC (ABC Staining System, Santa Cruz Biotechnology
Laboratory, Inc.) usando el anticuerpos secundarios anti IgG de cabra. Los procedimientos se
realizaron de acuerdo a lo descrito por las casas comerciales.
Resultados
En el análisis macroscópico (fotos 1 a 4) de las piezas de patología encontramos que las
corneas de las ratas de los grupos 1 y 2 presentaron un aspecto normal, sin alteraciones o
datos patológicos. Las ratas quemadas con aplicación de solución salina balanceada (grupo 3)
presentaron corneas con leve edema, quemadura central y se apreciaron formaciones
neovasculares que van de la periferia al centro. En comparación las ratas a las que se les
aplicó 400 µm EGCG, presentaron cornea transparentes, leve edema, quemadura central, pero
no se aprecian formaciones neovasculares macroscópicas. En el análisis con microscópico
(fotos 5 a 8) de luz las ratas de los grupos 1 y 2 no presentaron neovasos, inflamación o
apoptosis, ni alguna alteración estructural. El grupo 3 mostró con un aumento 10X afección
de todo el espesor estromal con presencia de neoformaciones vasculares e infiltrado
inflamatorio abundante. A 40X las corneas mostraron afección de todo el espesor estromal a
expensas de múltiples neoformaciones neovasculares caracterizadas por células endoteliales
organizadas, con espacios luminales de tamaño variable. Se encontró infiltrado inflamatorio
con numerosas células de fase aguda (segmentados) y subaguda (linfocitos), se encontraron
múltiples células con cambios compatibles con apoptosis. El grupo cuatro, con aplicación de
400 µm EGCG con un aumento 10X mostró escasas formaciones neovasculares con escasos
infiltrados inflamatorios. A 40X se apreciaron escasas células endoteliales, aisladas.
Celularidad inflamatoria escasa con segmentados y linfocitos con predominio de células
linfoides, también se apreciaron células con cambios compatibles con apoptosis como
picnocitosis y cariorexis. El análisis estadístico se muestra en la tabla 1 y grafica 1, en la cual
observamos como las medianas difieren entre los grupos 3 y 4 siendo menor el número de
neovasos por campo para el grupo tratado con EGCG. La reacción inflamatoria general se
valoro como ausente o presente, esta ultima dividida en leve, moderada y severa; la tabla 1 y
grafica 2 describen estos hallazgos, encontrando una menor reacción inflamatoria en el grupo
4. Los resultados de inmunohistoquimica se encuentran pendientes.
Discusión
Hasta la fecha no esta descrito el uso de EGCG subconjuntival en un modelo animal
experimental de neovascularización corneal. Existe un solo reporte del uso de este flavinoide
en neovascularización corneal. Cao y Cao describen un modelo de neovascularización en ratas
aplicando VEGF directo en cornea, y administraron EGCG vía oral; demostraron una
disminución en la neovascularización corneal respecto al grupo control, medida por la
longitud de los vasos, los meridianos afectados y la proporción de cornea afectada16. En
nuestro estudio, el modelo de neovascularización fue por quemadura con álcali, lo cual es
más homogéneo ya que no hay receptores ni mediadores intermediarios que puedan variar
entre los diferentes sujetos. Además la aplicación subconjuntival es un método que provee
una biodisponibilidad local, ya que en la administración sistémica la farmacodinamia depende
de múltiples sistemas bioquímicos; a pesar de que Cao y Cao demostraron niveles sanguíneos
similares en las diferentes ratas, esto no garantiza su biodisponibilidad constante a nivel
corneal. Por último en nuestros análisis fue doble ciego tanto macroscópico como
microscópico
e
inmunohistoquímico
demostramos
también
la
disminución
de
neovascularizacion en las corneas tratadas con EGCG en comparación con el grupo tratado
con solución fisiológica. Estos resultados son prometedores para continuar el estudio de esta
nueva molécula en la neovascularización corneal.
Conclusiones
La aplicación de EGCG subconjuntival disminuye la formación de neovasos en las corneas
sometidas a quemadura con álcali, en comparación con la aplicación de SS, por otro lado la
inyección de EGCG subconjuntival no es tóxica a nivel histológico. Por lo tanto los efectos
anti-inflamatorio y antioxidantes de EGCG, que disminuyen la neovascularización corneal,
podrían ser utilizados como un tratamiento alternativo para disminuir o inhibir el crecimiento
de neovasos corneales, disminuyendo la cicatrización corneal así como el alto riesgo de
rechazo del botón corneal transplantado.
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