Diseño de un medio de cultivo a base de peptona de colageno y

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DIVISION DE POSTGRADO
DIBEÑO DE UN MEDIO DE CULTIVO A BASE DE
PEPTONA DE COLAGENO Y EXTRACTO DE LEVADURA
PARA LA PROPAGACION DE TRES LINEAS
CELULARES DE MAMIFEROS
Por
GLORIA ELENA ESPINOSA AVALA
Como requisito parcial para obtener ef grado de:
DOCTORADO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD
EN BIOTECNOLOGIA
Ciudad Universitaria
Septiembre 2007
1020160696
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DIVISION DE POSTGRADO
DISEÑO DE UN MEDIO DE CULTIVO A BASE DE PEPTONA DE COLAGENO Y
EXTRACTO DE LEVADURA PARA LA PROPAGACION DE TRES LINEAS
CELULARES DE MAMIFEROS.
Por:
GLORIA ELENA ESPINOSA AYALA
Como requisito parcial para obtener el grado de:
DOCTORADO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGIA
Ciudad Universitaria
Septiembre, 2007.
Jb
FC o
9
FONDO
TESIS
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DISEÑO DE UN MEDIO DE CULTIVO A BASE DE PEPTONA DE COLAGENO Y
EXTRACTO DE LEVADURA PARA LA PROPAGACIÓN DE TRES LINEAS
CELULARES DE MAMIFEROS.
El comité de tesis que revisó y aprobó el trabajo:
Dra. Katius
Direct
Niño
Dra. Catalina Rivas Morales
Co-Direc/ora
Dra. Maria del Pilar Carranza Rosales
Directora Externa
Dra. Delia/Elva Cruz Vega
'Vocal
Dra. Azucena Orandaf-Cárdenas
Secretaria
AGRADECIMIENTO
Este trabajo se llevó a cabo gracias al apoyo financiero del CONACYT (beca de
doctorado No. 170412), del CONACYT-SECTORIAL-SALUD 33B y de la UANL
(PAYCIT-CA-83-04).
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Investigación Biomédica del Noreste del Instituto Mexicano del
Seguro Social.
A la Dra. Catalina Rivas Morales, por la confianza que siempre ha tenido en mí,
aun en los tiempos críticos. Por el apoyo, consejos y la buena disposición que mostró
durante todo el proyecto. Por todas las enseñanzas que me dio durante mis etapas de
estudiante.
A la Dra. Pilar Carranza Rosales, por enseñarme acerca del cultivo celular. Por
sus consejos y sugerencias dados durante toda la etapa experimental y también en la
revisión de la tesis.
A la Dra. Katiuska Arévalo Niño, por la dirección de tesis y por su apoyo para
mi titulación.
A la Dra. Delia Elva Cruz Vega, por toda la ayuda y conocimientos brindados
durante la realización del trabajo experimental y sus enseñanzas sobre el uso de Excel.
Al Dr. Jorge E. Castro Garza, por sus acertadas sugerencias durante el proyecto
y por la revisión del artículo.
A la Dra. Azucena Oranday Cárdenas, por ser parte de mi comité de tesis y por
sus consejos.
A la Dra. Nancy Elena Guzmán Delgado, por su ayuda para tomar las
fotografías de las líneas celulares en estudio.
A la MC. Carmen Molina, por las fotografías tomadas de los geles de
electroforesis.
Al personal del CIBIN-IMSS por las facilidades brindadas para realizar mi
trabajo experimental en sus distintos departamentos.
Al Sr. Abel Navarro de la Biblioteca del CIBIN-IMSS, por la recuperación del
material bibliográfico.
A la Dra. Sonia Yesenia Silva, por escucharme y apoyarme en cualquier
momento.
Al MC. Jaime Treviño Narvaez por su ayuda y enseñanza con los procesos
estadísticos de esta tesis.
A mis amigos, que estuvieron conmigo durante la realización del proyecto.
DEDICATORIA
A mis dos grandes amores María Fernanda y Dalia Marijose Rivas Espinosa, por
iluminar y dar sentido a mi vida.. .las amo.
A mi esposo Clemente Rivas, por su apoyo, ayuda y comprensión durante todo el
doctorado.. ..gracias.
A mi Mamá por siempre estar
la quiero.
A Juany y Toño, mis hermanos.
TABLA DE CONTENIDO
PAGINA
RESUMEN Y ABSTRACT
1
INTRODUCCION
3
HIPOTESIS
5
OBJETIVOS
6
Objetivo general
6
Objetivos particulares
6
ANTECEDENTES
7
Antecedentes generales
7
Medio de cultivo
7
Desarrollo de nuevos medios de cultivo
11
Antecedentes directos
Líneas celulares
15
21
METODOS
23
Material biológico
23
a) Líneas celulares
23
b) Suero fetal de bovino
23
c) Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM).
23
Preparación del medio de cultivo MD.
24
a) Medio de cultivo diseñado MD.
24
Cultivo de las líneas celulares OK, CHANG Y LLC-PIC,.
25
a) Resiembra y mantenimiento.
25
Adaptación de las líneas celulares al medio MD
25
Morfología de las células cultivadas en MEM y MD
26
Criopreservación de las células en MEM y MD
26
Cuantificación de elementos esenciales y no esenciales
27
Preparación del medio de cultivo diseñado (MCR)
28
Cinéticas de crecimiento de las líneas celulares cultivadas en MEM y MCR
29
Morfología de las células cultivadas en MEM y MCR
30
Ensayo de citotoxicidad con HgCL
30
Determinación de proteínas totales de las células cultivadas en MEM y MCR
31
Electroforesis en geles de poliacrilamida SDS.
33
a) Preparación preliminar de las células
33
b) Lisis Celular
33
c) Determinación de proteínas por el método de Hartree
33
d) Preparación de equipo para electroforesis
34
Criopreservación de las células en MEM y MCR.
35
RESULTADOS (Primera parte)
37
Morfología de las líneas celulares en el medio de cultivo con ingredientes
industriales (MD)
37
Criopreservación de las células en MEM y MD
40
Cuantifícación de elementos esenciales y no esenciales
41
Adaptación de las líneas celulares al medio MCR
42
Cinéticas de crecimiento de las líneas celulares
42
Morfología de las células cultivadas en MEM y MCR
46
Ensayo de citotoxicidad con H g C b
48
Determinación de proteínas totales de las células en MEM y MCR
52
Electroforesis en geles de poliacrilamida SDS
55
Criopreservación de las células en MEM y MCR
55
DISCUSION
57
CONCLUSIONES
64
LITERATURA CITADA
67
APENDICE
80
ABREVIATURAS Y SIMBOLOS UTILIZADOS
American Type Culture Collection
ATCC
Amortiguador Salino de Fosfatos
PBS
Bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio
MTT
Cloruro Mercúrico
HgCfe
Desviación Estándar
DE
Dimetilsulfóxido
DMSO
Grados centígrados
°C
Gramos
g
Horas
h
Kilodaltones
kDa
Litro
L
Medio Esencial Mínimo de Eagle
MEM
Medio C Rivas
MCR
Medio Diseñado
MD
Microgramos
jxg
Microlitro
jj.1
Mililitro
mi
Milimolar
Mm
Minutos
min
Nanogramos
ng
Nanomoles
nmol
Ohms
Q
Porcentaje
%
Potencial de Hidrógeno
pH
Revoluciones por minuto
rpm
Solución Salina Balanceada de Hanks
SSBH
LISTA DE TABLAS
PAGINA
Tabla 1
Curva estándar de proteinas por el micro-método de Azul de Coomassie
Tabla 2
Porcentaje de viabilidad en las líneas celulares en las diferentes
Proporciones d e M E M : M D
Tabla 3
40
Comparación de las concentraciones de metales en la peptona de colágeno y
extracto de levadura utilizados en la formulación del MD y del MCR
Tabla 4
32
41
Porcentaje de viabilidad de las líneas celulares en MCR y MEM después de
un proceso de descongelación
55
LISTA DE FIGURAS
PAGINA
Fig. 1
Morfología de las células OK cultivadas en MEM y
Mezclas MEM:MD
Fig. 2
Morfología de las célulasCHANG cultivadas en MEM y
Mezclas MEM:MD
Fig.3
46
Morfología de las células CHANG propagadas en a) MEM y
b) en MCR ( 40 X)
Fig. 9
45
Morfología de las células OK propagadas en a) MEM y
b) en MCR ( 40 X)
Fig. 8
44
Curva de crecimiento de la línea celular LLC-PK| propagada
en MEM y MCR
Fig. 7
43
Curva de crecimiento de la línea celular CHANG propagada
en MEM y MCR
Fig. 6
39
Curva de crecimiento de la línea celular OK propagada en
MEM y MCR
Fig. 5
38
Morfología de las células LLC-PK| cultivadas en MEM y
Mezclas MEM:MD
Fig. 4
38
46
Morfología de las células LLC-PK] propagadas en a) MEM y
b) en MCR ( 40 X)
47
Fig. 10
Efecto del cloruro mercúrico sobre la viabilidad de las células OK.
49
Fig. 11
Efecto del cloruro mercúrico sobre la viabilidad de las células
CHANG.
50
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En los últimos años, el enfoque al diseño de nuevos medios de cultivo utilizando
ingredientes altemos económicos y accesibles, para la propagación de distintos tipos de
células, ha sido de interés en el campo de la investigación biomédica. En el presente
trabajo se diseñó un medio de cultivo a base de peptona y extracto de levadura de grado
industrial para adaptar las líneas celulares OK (riñon de zarigüeya), CHANG (hígado
humano) y LLC-PKi (riñon de cerdo), las cuales se lograron cultivar hasta la mezcla
5:95 de MEM:MD (MEM = Medio esencial mínimo de Eagle, medio control; MD =
medio diseñado). Sin embargo, en esta mezcla las células presentaron alteraciones
morfológicas del núcleo, en la relación núcleo-citoplasma, así como mayor
susceptibilidad frente al tóxico cloruro mercúrico (HgCh). Debido a esto, se consideró
que el cultivo fue exitoso hasta la proporción 25:75 (MEM:MD). Las alteraciones
observadas en células creciendo en la mezcla 5:95 posiblemente fueron debidas a la
presencia de altas concentraciones de elementos tóxicos en la peptona y extracto de
levadura utilizada. Por lo anterior, se continuo con el diseño del medio MCR para
cultivo in vitro de líneas celulares de mamífero, pero utilizando esta vez peptona y
extracto de levadura de mayor pureza. Al igual que para el MD, se utilizó el medio
MEM para la adaptación en el MCR y como medio de referencia para evaluar los
parámetros de crecimiento de las líneas celulares OK, CHANG y LLC-PK|. Se
realizaron cinéticas de crecimiento, análisis morfológico en microscopía de luz, y
análisis de citotoxicidad con HgCh sobre las líneas celulares cultivadas en MCR y en
MEM. También se determinó la concentración total de proteínas, así como el patrón de
proteínas en geles de poliacrilamida; por último se llevó a cabo la criopreservación de
las células en estudio y se midió su viabilidad con azul tripano. De acuerdo con los
resultados obtenidos, se logró adaptar las tres líneas celulares en MCR al 100%. La
cinética de crecimiento de las células propagadas tanto en MEM como en MCR tuvo un
patrón de crecimiento similar y no se encontraron diferencias significativas (p < 0,05).
En cuanto a la morfología realizada en el microscopio de luz, no se observaron
diferencias en los tres tipos celulares empleados que se cultivaron en MCR con respecto
a las células cultivadas en MEM. Los ensayos de sensibilidad frente al HgCl2 mostraron
que las tres líneas celulares cultivadas en MCR no presentan diferencias significativas
comparadas con los cultivos crecidos en MEM (p<0,05). Con respecto a la
concentración de proteínas totales, para las células en M C R y en MEM no se
encontraron diferencias significativas entre las tres líneas celulares estudiadas (p< 0,05).
Los patrones electroforéticos de proteínas entre todas las líneas celulares cultivadas en
los dos medios, también frieron similares, con excepción del patrón observado en las
células LLC-PKi en el medio MCR, la cual presentó una banda más ancha comparada
con la misma banda de las células crecidas en MEM. Finalmente, después de 30 días se
descongelaron las células OK y CHANG (pasaje 50) y LLC-PK| (pasaje 30)
provenientes del medio MCR y se determinó su viabilidad, la cual fue del 98, 94 y 92 %
respectivamente. Nuestros resultados muestran que las células cultivadas en MCR
conservan características fisiológicas similares a las cultivadas en el medio MEM, por
lo que el medio MCR puede representar una buena alternativa económica para el cultivo
de células de mamífero.
ABSTRACT
In the last years, the approach to the design of cell culture media using economic and
accessible ingredients for growth and propagation of different cell types, have been of
interest in biomedical research. In the present work we designed a cell culture media by
using casein peptone and yeast extract of industrial degree to adapt the cell lines OK
(opossum kidney), CHANG (human liver) and LLC-PKI (pig kidney), which were
cultivated in a mixture 5:95 of MEM:MD (MEM = Eagle's minimum essential
medium; control medium; MD = designed medium). However, in this mixture the cells
presented morphologic alterations of the nucleus, in the nucleus-cytoplasm relationship,
as well as greater susceptibility to mercuric chloride (HgCh). Due to this, it was
considered that the culture was successful until proportion 25:75 (MEM:MD). The
alterations observed in cells growing in the mixture 5:95 were possibly due to high
concentrations of toxic elements in the peptone and yeast extract. For this reason,
peptone and yeast extract were substituted by compounds with greater purity (cell
culture grade). Like for the MD, MEM medium was used as reference and for the
adaptation in MCR (medium with new ingredients) in order to evaluate parameters of
growth of the cell lines OK, CHANG and LLC-PKI. Growth kinetics, morphologic
analysis by light microscopy, and cytotoxicity analysis with HgCfe of the cells
cultivated in MCR and MEM were done. Also the total protein concentration, the
protein pattern in polyacrylamide gels and criopreservation of the cells was performed.
Cell viability was measured by trypan blue exclusion. According to the results, the three
cell lines were successfully adapted to growth in 100% MCR. The kinetic of growth of
the cells propagated both in MEM and MCR was similar and there were not significant
differences (p <0,05). With regard to the cellular morphology, there were not
differences in the cell lines cultivated in MCR compared to those cultivated in MEM.
The H g C ^ toxicity assays showed that the cells cultivated in MCR do not present
significant differences compared with cells grown in MEM (p <0,05). With regard to
the concentration of total proteins content, the cells cultivated in MCR and in MEM do
not exhibited significant differences (p <0,05). The electrophoretic pattern of proteins
between the cells cultivated in both cell culture media were also similar, except for one
band in LLCPK1 cells grown in MCR, which was broader compared with the same
band of the cells grown in MEM. Finally, after 30 days frozen in liquid nitrogen, the
cells OK and CHANG (passage 50) and LLC-PKI (passage) 30) in MCR medium were
defrosted and their viability was 98, 94 and 92 % respectively. Our results show that the
cells cultivated in MCR maintain physiological characteristics similar to the cells
cultivated MEM. It is concluded that the MCR medium can be a good and economic
alternative for the culture of mammalian cell lines.
2. INTRODUCCIÓN
El cultivo celular es un fenómeno sumamente complejo, e implica diversos
factores que pueden influir en la fisiología y respuesta de las células.
El cultivo de células tuvo su origen en el siglo XIX, se inició con las
observaciones de Roux en cultivos de células de embrión de pollo; posteriormente,
Carrel en 1912 utilizó plasma de pollo para el estudio en animales de sangre caliente.
Los
cultivos
celulares
han
permitido
un
incremento
en
aplicaciones
experimentales. Esto ha contribuido en el desarrollo de la virología, la investigación del
cáncer, la inmunología, la ingeniería de proteínas, los estudios de interacción y
señalización celular, la diferenciación y desarrollo, asi como en aplicaciones médicas,
industriales y agronómicas.
Una serie de innovaciones tales como el desarrollo de
medios de cultivo, el uso de antibióticos, las técnicas de separación celular para el
pasaje de células y la suplementación del medio con suero fetal bovino, permitieron
mayores aplicaciones de los cultivos de células.
Los medios para cultivo celular contienen una gran variedad de nutrientes, tales
como aminoácidos, vitaminas, suplementos orgánicos de bajo peso molecular, además
de hormonas y factores de crecimiento, estos últimos provenientes del suero empleado
en el cultivo y que en conjunto hacen que en ocasiones el cultivo in vitro resulte
oneroso. El costo de producción de 1 g de tejido en cultivo es más de 10 veces superior
al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitación de producción, que es del
orden de 10 g de células en un laboratorio normal, y que para ser superior a 100 g
requiere instalaciones de tipo industrial. Por lo anterior, para nosotros es de interés
contar con un medio de cultivo para propagar células de mamífero a bajo costo y en
base a eso se propuso como objetivo principal de este trabajo.
3. HIPÓTESIS
Él medio de cultivo diseñado a base de
levadura
(MCR)
favorecerá el crecimiento
conservando sus propiedades morfológicas y
peptona de colágeno y extracto de
de
líneas celulares de
fisiológicas.
mamíferos,
4. OBJETIVOS
4.1 General
Diseñar un medio de cultivo a base de
peptona de colágeno y extracto de
levadura (MCR), para la propagación in vitro de líneas celulares de mamífero, en
comparación con un medio de cultivo tradicional (MEM).
4.2 Particulares
1. Probar
las mejores formulaciones del MCR con las líneas celulares OK (ATCC
CRL 1840) de riñon de zarigüeya, CHANG (ATCC CCL 13) de hígado humano y
LLC-PK, (ATCC CRL 1392) de riñon de cerdo.
2. Adaptar el crecimiento de las líneas celulares al medio MCR y establecer sus
parámetros de crecimiento mediante cinéticas, comparándolos con las células
cultivadas en MEM.
3. Analizar al microscopio de luz la morfología de las células cultivadas en MCR,
comparándolos con las células cultivadas en MEM.
4.
Realizar pruebas de viabilidad de las líneas celulares después de un proceso de
criopreservación, comparándolos con las células congeladas en MEM.
Realizar ensayos de citotoxicidad para cada línea celular en ambos medios.
Determinar la concentración de proteínas totales y el perfil de proteínas mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida de las tres líneas celulares cultivadas en
ambos medios.
5. ANTECEDENTES
5.1 Medio de cultivo
El medio de cultivo es el componente fundamental en todo el sistema de cultivo
de células (Ham RG. 1979); los componentes mínimos del medio basal incluyen sales,
aminoácidos, precursores de ácidos nucleicos, ácidos grasos, vitaminas, azucares y otros
factores metabólicos que son críticos para la supervivencia de las células que se
propagan en ellos (Ham., 1982).
Eagle en 1955, realizó la primera investigación sistemática acerca de los
requerimientos nutritivos de las células en cultivo in vitro.
propagadas
requieren
de
una
mezcla
de
aminoácidos,
Las líneas celulares
vitaminas,
cofactores,
carbohidratos y sales, además son suplementadas con proteínas del suero.
Los medios de cultivo están formados por los siguientes elementos (Freshney.,
2000; Eagle., 1955):
Aminoácidos
Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales.
También se adicionan otros aminoácidos, pues los requerimientos pueden variar de una
célula a otra. Un suplemento común es glutamina, a concentración de 2 mM, aunque
existen algunas líneas celulares que pueden utilizar el glutamato. (Freshney., 2000)
Vitaminas
Los medios de cultivo se suplementan con vitaminas del grupo B, siendo los
demás grupos de vitaminas aportados por los componentes del suero. La limitación de
vitaminas se manifiesta en la supervivencia de las células y en la reducción de la tasa de
crecimiento más que en la densidad celular. (Freshney., 2000)
Glucosa
Es la fuente de energía en muchos medios. Metabolizada preferentemente vía
glucólisis hacia piruvato que puede ser convertido en lactato o acetoacetato, el cual
entra al ciclo de Krebs y produce CO2. La acumulación de ácido láctico en el medio
propio de células embrionarias y transformadas, parece indicar un funcionamiento
diferente del ciclo de Krebs en estas células respecto al modelo in vivo. En estos casos
la mayor parte del CO2 parece proceder de un uso de la glutamina/glutamato (Freshney.,
2000).
Hormonas y factores de crecimiento
En los medios no definidos, estos factores son proporcionados por el suero. Los
tipos de suero empleados son: fetal de bovino, de caballo y humano (Freshney., 2000).
Entre estos factores de crecimiento se encuentran, por ejemplo:
1. Los factores de adhesión celular, como la
fibronectina.
2. Inhibidores de proteasas. Después del tratamiento con tripsina de un cultivo, el
exceso de actividad enzimàtica se inhibe por la adición de suero al medio. En ausencia
de éste deben usarse inhibidores de proteasas como el inhibidor de tripsina de soya.
3. Hormonas. El complemento hormonal dependerá especialmente del tipo celular, se
utilizan, hormona de crecimiento, Tiroxina 3, hidrocortisona, dexametasona, hormona
folículo estimulante.
4. Factores de crecimiento peptídico. En la actualidad se han identificado algunos
polipéptidos de actividad mitogénica: FGF (Fibroblast Growth Factor), EGF (Epidermal
Growth Factor) y PDGF (Platelet Derived Growth Factor). Asimismo se han aislado
otros factores con mayor especificidad de acción tales como IGF-1 (insulin-like growth
factor-1), NGF (neural growth factor), TGF-0 (beta transforming growth factor), entre
otros.
5. Proteínas y poliaminas. La inclusión de albúmina bovina añade indefinición al medio,
por ello se recomienda el uso de BSA (sero albúmina bovina) libre de ácidos grasos. La
transferrina
se requiere como portador de Fe, y se cree que puede tener actividad
mitogénica. (Freshney., 2000)
Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular
Dependiendo del medio de cultivo, éste incluye en su formulación nucleósidos,
intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato y lipidos, por mencionar algunos. La adición
de piruvato en el medio permite a las células incrementar su producción endógena de
CO2 haciéndole independiente del suministro exógeno del mismo. Por ejemplo, el
medio L15 de Leibovitz contiene una concentración superior de piruvato y no contiene
bicarbonato sódico, y no requiere aporte de CO2 en la fase gaseosa. (Freshney., 2000)
Antibióticos y antifúngicos
A fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo, éste se suele
suplementar con antibióticos de diferente espectro de acción. La adición de antibióticos
debe ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo. Es
importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o más antibióticos. Las
mezclas de uso más común son: penicilina (100 U/ml) / estreptomicina (100 [ig/ml),
gentamicina (50 |ig/ml) y anfotericina-B (2.5 (ig/ml) (Freshney., 2000).
5.2 Desarrollo de nuevos medios de cultivo
En los últimos años ha tomado especial importancia el diseño de formulaciones
de medios definidos o químicamente definidos, suplementados con suero o libres de
suero para el cultivo de distintas líneas celulares (Dodson et al., 1995). Un medio de
cultivo definido se refiere a un medio en el cual los componentes adicionados han sido
identificados y se conoce su concentración
precisa, por otra parte un
medio
químicamente definido se describe como en el medio en el cual no solamente se sabe la
concentración precisa de sus componentes sino también la estructura química de cada
°uno de ellos (Zimmerman et ai, 2000).
Se han realizado distintas formulaciones de medios de cultivo suplementándolos
con diferentes substratos, o bien utilizando multi-medios para aumentar el crecimiento
de líneas celulares de mamíferos.
Dodson et al. (1990); evaluaron la capacidad de las células satélite de músculo
para adherirse, proliferar y diferenciarse en siete medios de cultivo: CRCM-30, DMEM
bajo en glucosa, DMEM alto en glucosa, MCDB-104, McCoy's 5A, Ham's FIO y
Medio 199 suplementados con suero de caballo y 11 substratos; con el cual demostraron
que el uso de multi-medios puede incrementar sustancialmente el crecimiento y
diferenciación del cultivo primario de las células satélite. También demostraron que el
substrato de gelatina fue superior a los otros diez, ya que facilitó el crecimiento de las
células. Finalmente demostraron que al utilizar combinaciones de substrato/medio se
optimiza la diferenciación en el cultivo primario de las células de satélite.
Sieber-Blum et al. (1985); suplementaron el medio de cultivo definido MCDB
202, con 21 componentes diferentes (MCDB 202-21) clasificados dentro de seis
categorías: (1) factores de transporte, (2) estimuladores del metabolismo, (3) hormonas,
(4) factores trópicos, (5) vitaminas y (6) nutrientes esenciales de bajo peso molecular;
para observar la proliferación de las células de la cresta neural de codorniz
y su
diferenciación a células adrenérgicas y melanocitos. Los resultados mostraron que la
formulación MCDB 202-21 favoreció la proliferación y diferenciación terminal de las
células, el cual se puede utilizar en el estudio de diferenciación de las células cresta
neural, en niveles celulares y moleculares.
Erbach et al.
(1994); utilizaron una versión modificada del método de
optimización simple para diseñar un medio de cultivo químicamente definido con
concentraciones altas de K + (ÍCSOM), para el crecimiento de pre-implantes de embrión
de ratón; los resultados mostraron que de 5 - 6 divisiones celulares fueron posibles
cuando los embriones fueron cultivados por 96 h. Este fue un hallazgo significativo para
la formación de nuevos medios de cultivo para el cultivo de zigotos y blastocistos.
La línea celular NSO de mieloma, crece normalmente en un medio de cultivo
suplementado con suero o en un medio libre de suero suplementado con derivados de
lipoproteína animal. Gorfien et al. (2000), adaptaron el crecimiento de esta línea celular
en el medio CD Hibridoma (formulación químicamente definida, libre de proteína)
suplementado con varios lípidos de origen animal y vegetal y complementado con
ciclodextrina, el cultivo permitió obtener una densidad celular dos veces mayor que en
el medio suplementado con suero y se cultivó por más de 15 pasajes.
Spens y Hággstrom (2005); diseñaron un medio químicamente definido, libre
de proteína y de componentes animales, designado como RITM01, para el cultivo de las
células de mieloma NSO. El medio basal que se usó fue un medio libre de suero y libre
de proteína, el cual fue suplementado con fosfatidilcolina, colesterol, (3-eiclodextrina y
citrato férrico. Dicho medio, incrementó la concentración de aminoácidos y el
crecimiento celular significativamente.
Diamond et al. (1995); diseñaron un medio libre de caseína, YI-S, que consistía
de un caldo nutritivo, una mezcla de vitaminas y suero, el cual recomendaron para la
sustitución del medio TYI-S-33 dependiente de caseína, el cual es el más usado para el
cultivo axénico de Entamoeba histolytica y otros protozoarios parásitos.
Espinosa et al. (2003); valoraron diferentes medios líquidos definidos [caldo
triptona de soya (CTS), CTS suplementado con 10% de suero equino (CTS-se) y caldo
de Casman (CC)] para la multiplicación de G. vaginalis.
Se definió el pH óptimo del
medio seleccionado, se estableció la cinética de crecimiento y se caracterizó el perfil de
proteínas por electro foresis en geles de poliacri lamida de G. vaginalis en el medio de
cultivo seleccionado. En conclusión, encontraron que el medio CC a pH 7.2 en
condiciones de aerobiosis fue el mejor para la propagación de G. vaginalis
reproducible.
de modo
5.3. Antecedentes directos
Los esfuerzos para reducir el suero de los medios de cultivo han llevado a
muchos investigadores a utilizar hidrolizados de proteínas comerciales de bajo costo a
partir de tejidos animales (tales como peptonas y triptosas), de productos de leche
(lactoalbumina y caseína), de microorganismos (extracto de levadura y bacto-peptona)
por mencionar algunos (Hink, 1970; Schlaeger y Schumpp., 1992; Jan et al. 1994).
El efecto benéfico de los hidrolizados de proteínas sobre el crecimiento de líneas
celulares de mamíferos se refleja más que en su crecimiento, en la producción de
distintas moléculas, tales como proteínas recombinantes, antibióticos, etc. (Nyberg et
al., 1999; Heidemann et al., 2000; Franek y Katinger., 2002).
El extracto de levadura y la peptona son de los aditivos más comúnmente usados
en medios de cultivo en la industria del cultivo celular, para el crecimiento de células
y/o para la mejor formación de productos, por ejemplo, antibióticos, bioinsecticidas y
proteínas recombinantes. (Iding et al., 2001).
En este contexto, Gaudreau et al., (2002), utilizaron extracto de levadura y
extracto de papa como promotores de crecimiento en siete cultivos de bacterias lácticas
que fueron evaluados por espectro fotometría automatizada, tomando en cuenta dos
aspectos del crecimiento celular: (1) la obtención màxima de biomasa y (2) el rango de
crecimiento superior especifico.
Por otra parte, se ha estudiado el efecto de la adición de peptona a un medio
libre de suero o suplementado con suero para el crecimiento de células de hibridoma en
varios sistemas. La suplementación de un medio definido con peptonas resultó en un
incremento significativo en el número de células y en la producción de anticuerpos
monoclonales específicos en elcultivo de células (Jan et al. 1994).
Primatone RL® es otro hidrolizado de proteína el cual favorece el crecimiento
de células de mamíferos. Este hidrolizado enzimàtico de carne se ha utilizado para
remplazar el suero fetal de caballo en medios de cultivo para células de humano y de
roedor; y además es un importante aditivo para el medio de cultivo de células de
hibridoma de ratón, con el cual el suero se reduce hasta el 1% (Mizrahi. 1977). SE
considera un suplemento de medios de cultivo de bajo costo y natural, el cual sirve
como una fuente de aminoácidos, oligopéptidos, sales de hierro, algunos lípidos y
elementos trazas de bajo peso molecular (Schlaeger y Schumpp., 1992). Al adicionar
Primatone RL® a los medios de cultivo de células de mamíferos e insectos se mejora el
crecimiento de las células ya sea en presencia y/o ausencia de suero (Schlaeger., 1996).
Con el propósito de optimizar las condiciones del cultivo en suspensión de la
línea celular HL-60 y aumentar la producción celular Schumpp y Schlaeger., (1990),
realizaron una mezcla de medio RPMI-1640, DMEM, HamF12 y IMDM suplementado
con transferrina, insulina, Primatone RL®, Pluronic F68, etanolamina y selenio. Con
dicho medio lograron una gran productividad de las células HL-60.
Pham et al. (2003);
establecieron que la línea celular HEK293-EBNA1
(293SFE) era capaz de crecer en un medio libre de suero suplementado con peptonas de
origen animal con lo cual se mejoró significativamente la expresión de proteínas
recombinantes y la regulación de la expresión de genes, comparada con la línea original
293SF. Posteriormente, Pham et al. (2004) demostraron que los amino-péptidos juegan
un rol importante no solo proporcionando sustratos para la síntesis de proteínas
recombinantes, sino también en la regulación de la expresión de genes.
Recientemente se han utilizando hidrolizados de proteínas de plantas, con el fin
de sustituir no solo el suero de los medios de cultivo celulares, sino todo aquel producto
de origen animal, durante la producción de proteínas recombinantes (Burteau et al.
2003; Franek et al. 2000).
Burteau et al. (2003);
probaron el efecto y productividad de las peptonas de
plantas en cultivos de células CHO 320, un clon de las células C H O K1 genéticamente
modificada para secretar el interferón-y(INF-y) humano. Se utilizaron 8 diferentes
peptonas de plantas, de las cuales la peptona de trigo fue la que mejoró en un 30% el
crecimiento de las células y en un 60° o la producción del INF-y.
Franék et al. (2000, 2005); utilizaron peptonas de harina de soya y de trigo para
promover el crecimiento y la producción de células de origen animal. Con lo que
sugieren que los hidrolizados pueden proporcionar péptidos, que ejercen un efecto
positivo y especifico en los cultivos de células animales.
En nuestra región se han realizado distintos trabajos de investigación, para el
diseño de medios de cultivo que sean eficaces, económicos y accesibles utilizando
distintos hidrolizados de proteínas o tejidos animales.
En 1988 Said et al; diseñaron un medio de cultivo (PEHPS) para el cultivo
axénico de Entamoeba
histolytica
y E. invadens.
Dicho medio, fue utilizado para la
evaluación de varias drogas con propiedades potenciales antiamébicas (González y
Said, 1989). El medio PEHPS también permite el crecimiento de Trichomonas
vaginalis
(Castro et ai. 1996).
En 1998 Rivas Morales; diseñó un medio utilizando peptona de colágeno y
extracto de levadura (Medio C. Rivas) para la producción de biomasa de
brasiliensis a escala piloto (Patente en tramite No. 9810892).
Nocardia
El medio C. Rivas se ha utilizado en forma de caldo para la activación y
conservación de cepas bacterianas causantes de enfermedades gastrointestinales, tales
como Escherichia
Enterobacter
coli, Staphylococcus
aerogenes
aureus, Bacillus cereus, Salmonella
typhi
y
(Carreón, 2001; Espinosa, 2001; Viveros, 2004). Asimismo
Patena et al,. (2002); Silva et al., (2002) y Treviño et al., (2003), utilizaron el medio C.
Rivas (agar) para evaluar la actividad antibacteriana de extractos de plantas utilizando el
método de difusión en placa
El medio de cultivo C. Rivas fue modificado para el crecimiento y la
propagación de hongos dermatofitos, tomando como base el medio Saboraud y se ha
utilizado para evaluar la actividad antifungica de extractos de plantas (Padrón et al.,
2003; García, 2004; González, 2004). También se ha empleado
para desarrollar un
proceso biotecnológico que permitió reducir los costos de producción del hongo
entomopatógeno P. fumosoroseus
a nivel de reactor de 14 L (Elias SM. 2002; Lozano
et ai, 2003).
Igualmente se han evaluado diferentes medios de cultivo a base de sacarosa
como fuente de carbono y harina de soya o peptona de colágeno como fuente de
nitrógeno, para mejorar la producción de blastosporas de Paecilomyces
Con los datos obtenidos (Galán et ai.
fumosoroseus.
2003; Gutiérrez. 2001; Quintero ZI. 2001)
concluyeron que el medio de cultivo utilizado con peptona de colágeno representa una
alternativa para la producción de P. fumosoroseus
de almacenaje.
debido a su estabilidad en el proceso
En base a los datos anteriores, se considera que los hidrolizados de proteínas
tales como la peptona de colágeno y el extracto de levadura pudieran ser una fuente
alterna nutricional adecuada para el diseño de nuevos medios de cultivo de células de
mamíferos.
5.4. Líneas Celulares
Células OK (ATCC CRL 1840)
La línea celular OK fue establecida a partir del riñon de la zarigüeya americana
Didelphys
virgirtiana.
Esta línea fue caracterizada con respecto a su morfología, y
constitución cromosómica. Las células crecen en Medio Esencial Mínimo de Eagle con
el 10% de suero fetal de bovino (Koyama et al. 1978; Schwegler et al. 1989) y se
utilizan como modelo de estudio de las funciones del túbulo proximal de riñon (Yuan et
al., 1991; Watson. 1992; Gekleef al., 1995).
Células de CHANG (ATCC CCL-13)
Esta línea fue establecida a partir de tejido normal de hígado (Chang. 1954). La
línea celular de CHANG se propaga en el medio Esencial Mínimo de Eagle,
suplementado con 10% de suero fetal de bovino (Murphy y Landau. 1962), se utiliza
para estudiar la función hepática.
Células LLC-PKi (ATCC CRL 1392)
La línea celular LLC-PK| fue establecida en 1958, a partir de riñon normal de
cerdo (Hull et a/.1976; Lifschitz. 1982). Las células son de tipo epitelial
y no-
tumorigénicas; al igual que las células OK, forman domos, pero además producen una
considerable cantidad de activadores plasminogénicos (Rabito y Karish, 1982 y 1983).
Estas células conservan características del túbulo proximal de riñon (Watson. 1992;
Sandeep et al, 2005). Las células LLC-PK| se utilizan en estudios de nefrotoxicidad
(Gstraunthaler et al. 1990; Urakami et ai. 2005).
6. METODOS
6.1. Material biológico
a) Líneas Celulares
Se utilizaron las líneas OK de riñon de zarigüeya (ATCC CRL 1840), CHANG
de hígado humano (ATCC CCL-13) y LLC-PK, de riñon de cerdo (ATCC CRL 1392).
Las tres líneas celulares se cultivaron en
medio esencial mínimo de Eagle (MEM)
suplementado con 10% de suero fetal de bovino, 100 unidades/ml de penicilina G y 100
[ig/ml estreptomicina, a 37°C, en atmósfera húmeda y 5% de CO2.
b) Suero fetal de bovino
Se utilizó suero fetal de bovino (Fetal Bovine SERUM Qualified GIBCO) estéril, el
cual fue descomplementado por calentamiento a 56°C por 30 min. Se distribuyó en
alícuotas de 20 mi y se congeló a -20°C hasta su uso.
c) Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM)
Se disolvieron 10 g de medio MEM de una presentación comercial (GIBCO BRL,
Grand Island, USA) en 800 mi de agua Milli Q, añadiendo 2.2 g de N a H C 0 3 y 1 mi de
solución de antibióticos 100X de penicilina G- estreptomicina. Se ajustó el pH a 7.0 con
HC1 1N y se aforó a 1000 mi con agua Milli Q. El medio se esterilizó por filtración a
través de membranas con diámetro de poro de 0.22 (im (CORNIG); y se distribuyó en
volúmenes ue iuu o zuu mi en ooieiias ue viunu esiei ucs> uun lapun uv ivjvu. uv mv«^«
el medio por 3 días a 37 °C para determinar su esterilidad y luego se almacenó a 4°C.
El medio se complementó con 10 % de suero fetal de bovino después se colocó en
prueba de esterilidad durante 3 días a 37°C, se usó inmediatamente o se almacenó a 4°C
hasta su uso.
6.2. Preparación del medio de cultivo diseñado (MD)
a) Medio de cultivo diseñado MD
Para la formulación del "medio de cultivo diseñado" (MD) se inició
con
combinaciones a base de peptona de colágeno y extracto de levadura de grado industrial
(SENSIENT, Jalisco, Méx.) como fuente de nitrógeno y de vitaminas respectivamente,
glucosa, sales inorgánicas (CaCl2, NaCl, KC1, MgSCU, NaF^PO,»), rojo de fenol y
bicarbonato de sodio. Los componentes se disolvieron en 800 mi de agua Milli Q y se
les adicionó 1 mi de solución de antibióticos 100X de penicilina G- estreptomicina. Se
ajustó el pH a 7.0 con HC1 1N y se aforó a 1000 mi con agua Milli Q. El medio se
esterilizó por filtración a través de membranas con diámetro de poro de 0.22[im
(CORNIG); se distribuyó el medio en volúmenes de 100 y 200 mi en botellas estériles
de tapón de rosca. Se incubó por 3 días a 37 °C para determinar su esterilidad y luego
se almacenó a 4°C. El medio se complementó con 10 % de suero fetal de bovino y se
colocó en prueba de esterilidad durante 3 días a 37°C, se usó inmediatamente o se
almacenó a 4°C hasta su uso.
Para la adaptación de las líneas celulares al medio MD, se utilizaron diferentes
proporciones de medio MEM y MD con la finalidad de sustituir al 100% el medio
testigo (MEM). Para esto, se realizaron mezclas de los medios MEM y MD con
incrementos progresivos desde 50:50 hasta 5:95 (MEM:MD). En paralelo se cultivaron
las 3 líneas celulares en medio MEM al 100% como testigo. Simultáneamente, para
todos los parámetros analizados, se compararon los cultivos de las 3 líneas celulares
provenientes de MCR, con sus contrapartes cultivadas en MEM.
6.3. Cultivo de las líneas celulares OK, CHANG Y LLC-PK|
a) Resiembra y mantenimiento
En condiciones de esterilidad, se retiró el medio de cultivo de las cajas Petri
(CORNÍNG), donde estaban creciendo las células, y se lavaron con buffer de fosfatos
(PBS). Se añadieron 0.5 mi de tripsina al 0.25% y se incubaron durante 5 min a 37 °C
con 5% de CO2 y atmósfera húmeda. Se adicionaron 2 mi de medio con suero y se
resuspendieron. Se sembraron 1 x 103 células por mi en cajas Petri, a las cuales se les
añadieron 3 mi de medio MEM o MCR y se incubaron
a 37°C con 5% de CO2 y
atmósfera húmeda.
6.6. Adaptación de las líneas celulares al medio MD
Se utilizó el medio MEM para la adaptación progresiva de las líneas celulares en
medio MD. Se prepararon proporciones con distintos porcentajes del MEM/MD. La
propagación de las líneas celulares comenzó con la proporción 50:50 y 25:75
(MEM/MD) mediante resiembras de las células cada vez que se formó una monocapa
confluente en cajas Petri, después de 5 a 10 pasajes, se resembraron las células
propagadas en la mezcla 25:75 a la siguiente mezcla y así sucesivamente hasta llegar a
la proporción 5:95 (MEM/MD).
6.6.Morfología de las células cultivadas en MEM y MCR
Se cultivaron las células en MEM y en las mezclas 50:50, 27:75 y 5:95 (MEM:MD)
sobre cubreobjetos de vidrio en una microplaca de 6 pozos (CORNING) a 37°C con 5%
de CO2 y atmósfera húmeda. Después de que se formó una monocapa confluente, se
lavaron las células con PBS y se fijaron con metanol durante 10 min. Posteriormente se
lavaron con agua corriente y se dejaron secar a temperatura ambiente. Se tiñeron
durante 60 min con colorante Giemsa GS-500 (SIGMA). Se retiró el colorante, se lavó
con agua corriente. Por último se montaron los cubreobjetos con las células teñidas en
un portaobjetos con resina y se analizaron al microscopio de luz.
6.6.Criopreservación de las células en MEM y MD
Se seleccionaron cultivos de células con el 85 % de confluencia, se eliminó el medio
de cultivo con vacío y se lavaron las células con PBS. Se añadieron 0.5 mi de tripsina al
0.25 % y se incubaron los cultivos durante 5 min a 37°C con 5 % de CO2 en atmósfera
húmeda. Las células se cosecharon en tubos cónicos graduados de 15 mi con tapón de
rosca y se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 min. El sedimento celular se ajustó a
una concentración de 1 x 106 céls/ml, se resuspendió en un volumen de medio MEM
y/o MCR y se completó con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células fueron
colocadas en viales para congelación estériles de 2 mi de capacidad (CORNING) y
congeladas sucesivamente a 4°C por 30 min a -20°C por 2 h, a -70°C durante toda la
noche y por último se almacenaron a -196°C en nitrógeno líquido.
Para la descongelación se tomó un tubo con las células congeladas y se incubó
directamente a 37°C en baño de agua. El contenido se pasó a un tubo cónico estéril y se
centrifugó a 1000 rpm durante 10 min. Se eliminó el medio con DMSO y se
resuspendió el sedimento con medio completo MEM y/o MCR según correspondiera.
Se dividió la suspensión en dos cajas Petri de cultivo y se les agregaron 3 mi de medio
MEM y/o MCR completo. Se incubaron los cultivos a 37°C con 5% de CO2 y atmósfera
húmeda. Con la suspensión que quedó en los tubos cónicos se determinó la viabilidad
con azul tripano 0.1% (Trypan Blue Solution SIGMA), se contaron 100 células y se
calculó el porcentaje de células vivas y muertas.
6.7. Cuantificación de elementos esenciales y no esenciales
La determinación de la concentración de arsénico, cadmio, cobalto, hierro,
mercurio, plomo y zinc presentes en la peptona y extracto de levadura de grado
industrial y grado cultivo celular, se realizó utilizando la metodología NOM-117-SSA11994. Para el análisis de cobalto se empleó la metodología EPA-200.7. Los análisis se
llevaron a cabo en el Laboratorio de Servicios Clínicos y Análisis Toxicológicos, S.A.
de C.V., con autorización (SS) TA-01-03 y Núm. de acreditación A-038-003/03.
6.8. Preparación del medio de cultivo diseñado (MCR)
En la segunda formulación (MCR) se cambió la peptona de colágena y extracto de
levadura de grado industrial
S1GMA),
por reactivos grado cultivo celular, peptona (Peptone,
extracto de levadura (Yeast extract, SIGMA); glucosa, sales inorgánicas
(CaCl 2 , NaCl, KC1, M g S 0 4 , NaH 2 P0 4 ), rojo de fenol y bicarbonato de sodio. Los
componentes se disolvieron en 800 mi de agua Milli Q y se adicionó 1 mi de solución
de antibióticos 100X de penicilina G- estreptomicina. Se ajustó el pH a 7.0 con HC1 1N
y se aforó a 1000 mi con agua Milli Q. El medio se esterilizó por filtración a través de
membranas con diámetro de poros de 0.22|im(CORNIG); se distribuyó el medio en
volúmenes de 100 y 200 mi en botellas estériles de tapón de rosca. Se incubó por 3 días
a 37°C para determinar su esterilidad
y luego se almacenó a 4°C. El medio se
complementó con 10 % de suero fetal de bovino y se colocó en prueba de esterilidad
durante 3 días a 37°C, se usó inmediatamente o se almacenó a 4°C hasta su uso.
Después de preparar el medio MCR se adaptaron las células utilizando diferentes
proporciones de medio MEM y MCR con la finalidad de sustituir al 100% el medio
testigo (MEM). Se realizaron los siguientes ensayos: cinéticas de crecimiento, análisis
morfológico en microscopía de luz, y análisis de citotoxicidad con HgCU; también se
determinó la concentración total de proteínas, así como el patrón de proteínas en geles
de poliacrilamida; por último se llevó a cabo la criopreservación
de las 3 líneas
celulares y se midió su viabilidad con azul tripano. Simultáneamente, para todos los
parámetros analizados, se compararon los cultivos de las 3 líneas celulares provenientes
de MCR, con sus contrapartes cultivadas en MEM.
Con el medio MCR se empezó la adaptación de las células con la mezcla 10:90
(MEM/MCR), después de 5 pasajes se resembró a la proporción 5:95 y por último se
resembró las células en el 100% del medio MCR.
6.9. Cinéticas de crecimiento de las líneas celulares cultivadas en M E M y MCR
Se realizaron cinéticas durante 10 días en el medio MCR con peptona y extracto de
levadura grado cultivo celular y el medio control (MEM). Por separado, y a partir de
cada cultivo de células (OK, CHANG y LLC-PKj) en fase logarítmica de crecimiento,
se retiró el medio
y se lavaron dos veces con PBS.
Se despegaron las monocapas
confluentes con tripsina al 0.25% y se cosecharon en tubos cónicos de 15 mi. Los
cultivos se centrifugaron a 1000 rpm/10 min, el sedimento celular se resuspendió en 2
mi de medio con suero MEM o MCR; se contó el numero de células y se preparó una
suspensión
de 25000 cél/ml;
se incubaron las cajas a 37°C con 5% de CO2 en
atmósfera húmeda. Cada 24 h durante 10 días, se tripsinizaron dos cajas Petri de cada
línea celular tanto en MEM como MCR y se contó el número de células, utilizando un
hemocitómetro.
Análisis
estadístico:
se calculó el tiempo de duplicación para cada variante para
esto, empleamos Nc = Ni * 2", donde Nc = número de células a las c horas, Ni =
número inicial de células y n = número de divisiones a las c horas. Puesto que N =
T/TD, donde T son las horas del cultivo y TD es el tiempo de duplicación, entonces TD
= T/n (n = número de divisiones a las c horas). Los resultados se analizaron mediante la
prueba no paramétrica de Mann-Whitney con un nivel de significancia de 0.05, con el
programa estadístico SPSS versión 11.0.
6.10. Morfología de las células cultivadas en MEM y MCR
Se cultivaron las células en MEM y en MCR sobre un cubreobjetos de vidrio en una
microplaca de 6 pozos (CORNING) a 37°C con 5% de CO2 y atmósfera húmeda.
Después de que se formó una monocapa confluente, se lavaron las células con PBS y se
fijaron con metanol durante 10 min. Posteriormente se lavaron con agua corriente y se
dejaron secar a temperatura ambiente. Se tiñeron durante 60 min con colorante Giemsa
GS-500 (SIGMA). Se retiró el colorante, se lavó con agua corriente. Por último se
montaron los cubreobjetos con las células teñidas en un portaobjetos con resina y se
analizaron al microscopio de luz.
6.11. Ensayo de citotoxicidad con HgCh
Se utilizaron monocapas confluentes de las células cultivadas en MEM y en MCR
con ingredientes de grado cultivo celular, en microplacas de 96 pozos. Se trataron con
concentraciones variables de HgCl 2 (0, 10, 15 y 20 jiM) y se incubaron durante 6 horas
a 37°C, 5% de CO2 en atmósfera húmeda. Después se lavaron dos veces las células con
solución salina balanceada de Hanks (SSBH IX), se agregó a cada pozo 200 [il de una
mezcla 5:1 de MTT (2 mg/ml) y de PMS (3.3mg/ml) y se incubaron a 37°C durante 75
min. Se eliminaron los reactivos, se lavaron las células con SSBH, se agregaron 200 [ú
de alcohol isopropílico acidificado y se dejó reposar la microplaca durante 15 min,
posteriormente se resuspendió el alcohol, se colocó el sobrenadante en una microplaca
nueva y se leyó en un lector de microplacas a 545 nm (E1A multi- well reader, SIGMA
Diagnostics).
Análisis estadístico:
para el análisis de los datos se utilizó la prueba de ANO VA de 1
factor con un nivel de significancia de 0,05 con el programa estadístico SPSS versión
11.0.
6.12. Determinación de proteínas totales de las células cultivadas en MEM y
MCR
Se sembraron 5,000, 10,000, 20,000 y 30,000 células en
200
del medio de
cultivo respectivo en una microplaca de 96 pozos y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 y
atmósfera húmeda durante 24 horas. Después de este tiempo se eliminó el medio de
cultivo y se lavó con TBS (buffer salino tris, pH 7.4). Por separado, se adicionaron
diferentes concentraciones de albúmina (sero albúmina bovina, SIGMA) partiendo de
una solución de 1000 ng/ml de NaOH
para utilizarse como curva estándar 1000 ng/ml
de NaOH 1N en volumen de 50 fil en la primera línea de la microplaca (Tabla I), la cual
previamente se dejó vacía y se agregaron 50 |il de NaOH 1N a los pozos con células. Se
incubó a 37°C, el 5% de CO2 en atmósfera húmeda por 15 minutos; se añadieron 200 jal
de reactivo azul de Coomassie (Bio- Rad) a diluido 1:5 en agua Milli Q de cada pozo de
la curva y a las células, se incubó a temperatura ambiente con agitación moderada, se
leyó a 630 nm y filtro diferencial de 405 nm en un lector de microplacas (EIA multiwell Reader, SIGMA Diagnostics) según el método descrito por Chopsis and Eng, 1985.
Análisis estadístico:
los resultados se analizaron con la prueba de ANOVA de 1 factor
con un nivel de significancia de 0.05 con el programa estadístico SPSS versión 11.0.
Tabla I. Curva estándar de proteínas por el micro-método de Azul de Coomassie.
Volumen adicionado
de NaOH 1N
Concentración de
proteínas
(Hg/ml)
Volumen de SAB
0
0
50
1
1
49
5
5
45
10
10
40
15
15
35
20
20
30
W
(MD
6.13. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. (Laemmli et al. 1970)
a) Preparación preliminar de las células
Se cultivaron las células OK, CHANG y LLC-PK¡ en cajas de cultivo con 3 mi de
medio MEM y/o MCR y se incubaron durante 48 h a 37°C, 5% de CO2 en atmósfera
húmeda.
b) Lisis Celular
Después de incubar las células se eliminó el medio de cultivo y se lavaron dos veces
con PBS a 4 °C. Se adicionó 1 mi de buffer de lisis + inhibidores de proteasas y se
rasparon las células, el lisado se colocó en un tubo eppendorf (uno por cada línea celular
en su medio de cultivo respectivo) en hielo.
c) Determinación de proteínas por el método de Hartree (Hartree. 1972)
1. Se colocaron por duplicado en tubos de vidrio las siguientes soluciones:
Estándar de SAB con las siguientes concentraciones 50, 100, 150, 200 y 250 jal,
muestra de 25 jil; agua Milli Q 250 ^xl (como blanco). Se completó el volumen
de los tubos a 250 |il con agua Milli Q.
2. Se adicionaron 200 |il de la solución "A" a cada uno de los tubos, se agitaron y
se incubaron en baño de agua a 50°C por 10 min. Se dejaron enfriar a
temperatura ambiente por 12 min.
3.
Se agregaron 20 jil de la solución "B", se agitaron y se dejaron reposar 10 min a
temperatura ambiente.
4. Se agregaron 700 |¿1 de la solución U C", se agitaron y se incubaron en un baño
de agua a 50°C por 10 min. Se dejó enfriar por 10 min.
5. Se colocaron 200 ¿il del contenido de cada uno de los tubos en una microplaca
iniciando en la posición Al con el blanco, enseguida por duplicado las
soluciones estándar de menor a mayor concentración y por último las muestras
de la misma forma.
6. La placa se leyó a 492 nm, con el método de regresión lineal, colocando en el eje
de las ordenadas la absorbancia y en el eje de las abcisas la concentración; la
curva estándar y las muestras se leyeron por duplicado.
d) Preparación de equipo para electroforesis
Se utilizó un equipo Bio-Rad® para realizar las electroforesis. Se colocaron 4 mi de
solución para el gel separador y se agregó agua Milli Q hasta que quedó cubierta la
superficie, se dejó reposar por 25 min para permitir que se polimerice. Después de este
tiempo se eliminó el agua y agregó 1.5 mi de solución para el gel concentrador y se
colocó el peine que sirvió como guía para hacer los carriles donde se colocaron las
muestras. Completada la polimerización de los dos geles, se colocaron en la cámara de
electroforesis y se adicionó el buffer de corrida IX. Para la colocación de las muestras
se mezclaron 1.5 mi del Usado celular con 1.5 mi de buffer de muestra 2X se hirvieron
durante 3 min para desnaturalizar las proteínas. Después de esto se cargaron los camlcS
del gel, con los microlitros calculados a partir de la curva estándar que correspondieran
a 10 |ig/ml o 20 jig/ml.
Se corrió el gel a 70 V y cuando las muestras entraron al gel separador se subió el
voltaje a 110 V aproximadamente por 2.5 h, cuando el frente del colorante llegó 1 cm
antes de la base del gel, se apagó la fuente de poder; se sacaron los geles y se tiñeron
con solución de azul de coomassie al 0.5 % durante 30 min. Posteriormente se lavaron
con agua Milli Q y se colocaron en la solución decolorante (metanol-ácido acético),
durante toda la noche para eliminar el exceso de colorante del gel, finalmente se pasó a
la solución conservadora (glicerol al 1 %). Por último se tomaron fotografías donde se
observó el patrón de proteínas de las células en estudio
6.14. Criopreservación de las células en MEM y MCR
Se seleccionaron cultivos de células con el 85 % de confluencia, se eliminó el medio
de cultivo con vacío y se lavaron las células con PBS. Se añadieron 0.5 mi de tripsina al
0.25 % y se incubaron los cultivos durante 5 min a 37°C con 5 % de CO2 en atmósfera
húmeda. Las células se cosecharon en tubos cónicos graduados de 15 mi con tapón de
rosca y se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 min. El sedimento celular se ajustó a
una concentración de 1 x 106 céls/ml, se resuspendió en un volumen de medio MEM
y/o MCR y se completó con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células fueron
colocadas en viales para congelación estériles de 2 mi de capacidad (CORNING) y
congeladas sucesivamente a 4°C por 30 min, a -20°C por 2 h, a -70°C durante toda la
noche y por último se almacenaron a -196°C en nitrógeno líquido.
Para la descongelación se tomó un tubo con las células congeladas y se incubó
directamente a 37°C en baño de agua. El contenido se pasó a un tubo cónico estéril y se
centrifugó a 1000 rpm durante 10 min. Se eliminó el medio con DMSO y se
resuspendió el sedimento con medio completo MEM y/o MCR según correspondiera.
Se dividió la suspensión en dos cajas Petri de cultivo y se les agregaron 3 mi de medio
MEM y/o MCR completo. Se incubaron los cultivos a 37°C con 5% de CO2 y atmósfera
húmeda. Con la suspensión que quedó en los tubos cónicos se determinó la viabilidad
con azul tripano al 0.1% (Trypan Blue Solution S1GMA), se contaron 100 células y se
calculó el porcentaje de células vivas y muertas.
7. R E S U L T A D O S
7.1 Morfología de las líneas celulares en el medio de cultivo con ingredientes
industriales (MD)
No se observaron diferencias morfológicas entre los tres tipos celulares que se
cultivaron en la proporción 50:50 y 25:75 (MEM:MD) con respecto a las crecidas en el
medio control. En cambio, en las tres líneas propagadas en la proporción 5:95
(MEM:MD) se observaron diferencias en la relación núcleo-citoplasma, los núcleos
eran grandes e irregulares y el citoplasma escaso; además presentaron mayor afinidad
tintorial (ver figuras 1, 2 y 3).
i cf
f
#
m
w
I Y ^
i
r
%
ful
y
-
\
m
Figura. I. Morfología de las células OK cultivadas en M E M
y mezclas MEM:MD. (a) MEM, (b) 50:50, (c) 25:75 y (d)
5:95. (Magnificación 40 X).
m %
» • *
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•
•
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<-M •Sil.
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«
•
«
Figura. 2. Morfología de las células de CHANG cultivadas
efl MEM y mezclas MEM:MD. (a) MEM, (b) 50:50, (c)
25:75 y (d) 5:95. (Magnificación 40 X).
I
•
**
m
c)
%
I
m
s
9
d)
4
I
iü
*
»
0
t
V
v t xV v
Figura. 3. Morfología de las células LLC-PKi cultivadas en
MEM y mezclas MEM:MD. (a) MEM, (b) 50:50, (c) 25:75
y (d) 5:95. (Magnificación 40 X).
7.2 Criopreservación de las células en MEM y M D
Después de 45 días de permanecer congeladas en nitrógeno líquido se determinó la
viabilidad con azul de tripano de las células congeladas en MD y en MEM.
Los
porcentajes de viabilidad obtenidos para cada una de las mezclas de medio y para el
medio MEM se muestran en la tabla II.
Tabla II. Porcentaje de viabilidad de las líneas celulares en los medios MEM y MD
% Viabilidad
Línea celular/ Medio
MEM
(control)
MEM: M D
50:50
MEM: MD
27:75
OK
97
90
90
CHANG
95
91
92
LLCPK-1
92
85
80
7.3 Cuantifícación de elementos esenciales y no esenciales
La tabla III muestra los resultados del análisis de algunos metales presentes en la
peptona y extracto de levadura de grado industrial y calidad cultivo celular, los cuales
poseen concentraciones elevadas de hierro y plomo respectivamente, así como
disminución en los niveles de zinc en el extracto de levadura grado industrial.
Tabla III. Comparación de las concentraciones de la formulación del MD y del MCR
Metal
(mg/Kg)
Peptona
grado cultivo
celular
<
Arsénico
Cadmio
Cobalto
Hierro
Mercurio
Plomo
Zinc
0.010
<0.1
<4.0
<1.2
<0.004
<0.4
<0.1
Peptona
grado
industrial
Extracto de
levadura grado
cultivo celular
Extracto de
levadura
grado
industrial
<0.010
<0.010
<0.010
<0.1
<4.0
138.0
<0.004
<0.4
<0.1
<0.1
<4.0
30.5
<0.004
1.72
2.35
<0.1
<4.0
56.5
<0.004
3.51
1.08
Resultados de los ensayos realizados con la propagación de las células en
MCR al 100%
7.4. Adaptación de las líneas celulares al medio MCR
En el presente trabajo se lograron propagar las líneas celulares OK, CHANG y
LLC-PK, en el medio MCR al 100%. Las líneas celulares
OK y CHANG se
subcultivaron durante 50 pasajes y la línea LLC-PKi hasta el pasaje 33. En estos
pasajes, las células se sometieron a un proceso de congelación
para su conservación
prolongada.
7.5. Cinéticas de crecimiento de las líneas celulares
En la figura 4 se muestra la cinética de crecimiento de las células OK cultivadas
tanto en MEM como en MCR, se observó un patrón de crecimiento similar en los dos
medios, entre las 24 y 120 h se presentó el crecimiento exponencial y a partir de ese
momento llegaron a la confluencia. Las células en MEM y MCR presentaron un tiempo
de duplicación de 26.08 y de 26.34 h respectivamente.
OKMEM
OK MCR
1000000
3
«
u
T3
ó
100000
Z
10000 n
1
i
0
1
2
1
3
1
4
1
5
1
6
1
7
1
8
9
1
1
1
1
10
11
12
Tiempo (días)
Figura 4. Curva de crecimiento de la línea celular OK propagada
en M E M y M C R
En la figura 5 se muestran los resultados de la cinética de la línea celular
C H A N G , en MCR. Se observa una tendencia de crecimiento similar a las cultivadas en
MEM, al igual que en las células OK, a las 24 h se observó la fase exponencial que se
extendió hasta los 120 h. Las células mostraron tiempos de duplicación de 25.80 en
M E M y de 26.54 h en M C R .
—•—MEM CHANG
— M C R CHANG
Tiendo (días)
Figura 5. Curva de crecimiento
propagada en MEM y MCR
de las células
CHANG
En la figura 6, se muestran la cinética de crecimiento de las células LLC-PK.1 en
MCR,
la cual presentó menor tiempo de duplicación
células cultivadas en MEM (29.95 h).
(27.87 h) con respecto a las
—•— MEM LLC-PK1
-•— MCR LLC-PK1
l000000
i trt
3
íooooo
rj
-o
I
o
z
10000
Tiempo (días)
Figura 6. Curva de crecimiento de las células LLC-PKj
propagada en MEM y MCR
Al comparar el número de células por día, de cada línea celular mediante la prueba
Mann - Whitn debido a que seguían una distribución normal según el estadístico
Kolmogorov- Smimov), no se encontraron diferencias significativas entre las líneas
celulares cultivadas en MEM y las cultivadas en MCR con una p< 0,05.
7.6. Morfología d e las células cultivadas en M E M y M C R
De acuerdo con el análisis morfológico realizado a monocapas confluentes de
células OK (figura 7 a - b), CHANG (figura 8 a - b) y LLC-PK, (figura 9 a - b) en el
pasaje No. 30 en el medio MCR, no se observaron diferencias con respecto a las células
cultivadas en MEM. Lo anterior, tomando en cuenta estándares morfológicos tales
como la forma del núcleo, aspecto del citoplasma, distribución de la cromatina,
presencia de nucléolos y relación núcleo-citoplasma.
Figura 7. Morfología de las células OK propagadas en a) MEM y b) en
MCR ( 4 0 X).
F i g u r a 8. Morfología de las células CHANG propagadas en a) MEM y b) en MCR
(40 X).
Figura 9. Morfología de las células LLC-PK, propagadas en a) MEM y b) en MCR
(40 X).
7.7. Ensayo de citotoxicidad con HgCl2
Los resultados de los ensayos de citotoxicidad muestran el efecto tóxico de
concentraciones variables de mercurio sobre las células OK., CHANG y LLC-PK|
en
MCR y en MEM, medida en función de la capacidad de enzimas deshidrogenasas
presentes en las células vivas, para reducir el MTT. La absorbancia a 545 nm es
directamente proporcional al número de células viables. Como se observa en las figuras
10, 11 y 12,
la concentración de 20 jxM de HgCl2 disminuye notablemente la
viabilidad.
Al comparar los valores mediante la prueba ANOVA de un solo factor, no se
encontraron diferencias significativas entre las líneas celulares cultivadas en MEM y las
cultivadas en MCR con una p< 0,05.
Figura 10. Efecto del cloruro mercúrico sobre la viabilidad
de las células OK. Las células se incubaron por 6 h a 37°C y
atmósfera de C 0 2 con 10, 15 y 20 jaM de HgCl 2 . Promedio ±
DE de cuatro experimentos por triplicado.
MCR
MEM
1 0 0 -i
90 80 •
TJ
•o
70
60
2 50
<u
•o 40
30
20
10
0
10
15
20
Concentración de HgCb (jiM)
Figura 11. Efecto del cloruro mercúrico sobre la viabilidad
de las células de C H A N G . Las células se incubaron por 6 h a
37°C y atmósfera de C 0 2 10, 15 y 20 \iM de HgCl 2 . Promedio
± DE de cuatro experimentos por triplicado.
MCR
MEM
Figura 12. Efecto del cloruro mercúrico sobre la viabilidad
de las células L L C - P K | . Las células se incubaron por 6 h a
37°C y atmósfera de C02 con 10, 15 y 20 ¿iM de HgCl 2 .
Promedio ± DE de cuatro experimentos por triplicado.
160696
7.8. Determinación de proteínas totales de las células en MEM y MCR
La figura 13, 14 y 15 se muestra la concentración de proteínas totales de las
células OK, CHANG y LLC-PKi respectivamente, propagadas tanto en MEM como en
MCR; a partir de inóculos de 5000, 10 000, 20 000 y 30 000 células/ml, sembradas
como se describe en la sección de métodos.
Las células en MCR y en MEM no presentan diferencias significativas entre las
concentraciones de proteínas de las tres líneas celulares estudiadas con una p<0,05,
según el análisis estadístico de ANOVA de un solo factor.
5000
10000
20000
30000
Células ml
Figura 13. Concentración de proteínas totales de la línea
celular O K , en M E M y M C R . Promedio ± DE de tres
experimentos por triplicado.
«
35,0
MEM
30.0
MCR
S
S
25
I
20.0 -
'° '
Û
o 15.0
I" 10,0
ü
5.0
0,0
5000
10000
20000
30000
Células mi
Figura 14. Concentración de proteínas totales de la línea
celular de CHANG, en MEM y MCR. Promedio ± DE de tres
experimentos por triplicado.
35.0 -,
•MËM
-
•.
MCR
§> 25.0 E
g
20.0-
5
S 15.0
D.
g 10.0
-
5,0 -I
0.0
5000
10000
20000
30000
Celui as/ml
Figura 15. Concentración de proteínas totales de la línea
celular LLC-PK,, en MEM y MCR. Promedio ± DE de tres
experimentos por triplicado.
7.9. Eleetroforesis en geles d e poliacrilamida SDS
En figura 16 se puede observa el perfil de proteínas en geles de poliacrilamida entre
las líneas celulares cultivadas en M E M y MCR. Se observa que los perfiles
electroforéticos fueron similares; aunque existe diferencia en la intensidad en una de las
bandas de las células LLCPK-1 cultivadas en M C R con respecto a la misma línea
celular proveniente de MEM.
1
2
3
4
5
6
F i g u r a 16. Perfil electroforético d e proteínas totales. En el
carril 1 se muestran las células OK en MEM, en el 2 las células
OK. en MCR. En los carriles 3 y 4 las células de CHANG en
MEM y MCR respectivamente. En los carriles 5 y 6 se
muestran las células
LLC-PKi
en
MEM
y
MCR
respectivamente.
* Diferencia en la intensidad en una de las bandas de las
células LLCPK-1 cultivadas en MCR con respecto al MEM
7.10. Criopreservación de las células en MEM y M C R
En la tabla IV, se muestran los valores del porcentaje de viabilidad de las células
cultivadas en MEM y MCR, después de un proceso de descongelación de 30 y 120 días
para las células en MCR y 120 para las células en MEM.
Tabla IV. Porcentaje de viabilidad de las líneas celulares en MCR y MEM
Línea
celular
Medio de
cultivo
OK
MEM
LLCPK-1
CHANG
MCR
MEM
MCR
MEM
MCR
Pasaje
85
31
50
76
31
50
S/P*
19
33
Tiempo de
congelación
(días)
120
120
30
120
120
30
120
120
30
95
92
98
94
93
94
92
90
92
%
Viabilidad
(*Sin pasaje)
8. DISCUSION
El diseño del medio de cultivo con ingredientes altemos se inició con una
formulación a base de peptona de colágeno y extracto de levadura de grado industrial
(medio MD), con una concentración de 1 g de peptona y 0.25 g de extracto de levadura,
sin embargo con esta formulación las tres líneas celulares estudiadas en este trabajo
(OK, CHANG y LLCPK-1) se adaptaron al cultivo hasta una mezcla de MEM:MD de
25:75, determinado a través de la formación de monocapas confluentes. Sin embargo
al trasnferirlas a la mezcla 10:90 (MEM:MD) no lograron proliferar. Por este motivo se
decidió aumentar la concentración del extracto de levadura a 0.75 g, considerando que
ésta puede aportar las vitaminas presentes en el MEM;
considerando
que
el extracto
de levadura es
rico
lo anterior, debido a que
en vitaminas
hidrosolubles
particularmente del grupo B. Las vitaminas son nutrientes orgánicos requeridos por las
células de mamíferos, sin embargo muchos mamíferos han perdido la habilidad de
sintetizarlas, por lo que deben de ser adicionadas suplidas como
nutrientes, con la
función de facilitar la transformación que siguen los substratos a través de las vías
metabólicas. Además muchas vitaminas hidrosolubles son precursores de co-enzimas
que son necesarias para numerosas reacciones bioquímicas en las células (Abadie F,
1968; Flandreau JC, 1969). La respuesta de las células al cambio de la concentración
del extracto de levadura fue muy favorable y las líneas celulares se cultivaron hasta en
una proporción de MEM:MD de 5:95 y después de 5 pasajes se adaptaron al 100 % del
medio MD, sin embargo después de 96 h de incubación las células morían, por lo que se
aumentó la concentración de peptona de colágeno de 1 g a 1.2 g y además se agregó
una mezcla de vitaminas al 1.5, a pesar este cambio las células no proliferaron en el
medio MD al 100%, por lo cual solamente se cultivaron hasta la mezcla 5:95
(MEM:MD). No obstante en esta última mezcla se observó que el crecimiento celular
fue más lento y se presentaron alteraciones morfológicas con respecto a las cultivadas
en el medio control. Se supuso que en los componentes utilizados podrían existir
elementos desfavorables al crecimiento celular.
Con el fin de determinar la presencia y concentración de elementos tóxicos en la
peptona y extracto de levadura de grado industrial, se realizó el análisis de metales; los
resultados obtenidos evidenciaron la presencia de concentraciones elevadas de hierro y
plomo respectivamente, así como disminución en los niveles de zinc en el extracto de
levadura grado industrial. El hierro es considerado un metal esencial en la actividad
celular normal, sin embargo en exceso puede causar toxicidad en células hepáticas
(Hughes, 2002; Rouault, 2003). Se ha encontrado que el Fe libre inhibe la expresión de
la ferroportina en la línea celular PC 12 de rata tratada con factor de crecimiento
nervioso (Yanming et al., 2005).
Los resultados obtenidos también muestran que el extracto de levadura grado
industrial contiene cantidades altas de plomo, un elemento no esencial y tóxico
(Tchounwou et al., 2004). Se han realizado diversos estudios para observar el efecto
tóxico del plomo sobre distintas líneas celulares, en el cual se observó que su efecto
principal fue sobre la síntesis de DNA, lo que influyó directamente sobre la
proliferación celular (Fischer y Skreb, 1980).
De acuerdo a lo anterior, se puede sugerir que la presencia y la alta
concentración de metales pesados tales como plomo y de hierro, así como la
disminución de zinc, podrían ser los responsables de que no se haya logrado la
adaptación de las tres líneas celulares utilizadas en el 100 % medio de cultivo propuesto
(MD), sino solamente hasta la mezcla 25:75 (MEM:MD).
Se continúo con la investigación, utilizando la peptona y extracto de levadura
con calidad de cultivo celular (se le denominó medio MCR), ya que los efectos
benéficos de hidrolizados de proteínas se conocen desde hace más de dos décadas. Los
hidrolizados de proteínas son generalmente usados como mezclas de nutrientes
balanceadas que pueden remplazar total o parcialmente el suero o utilizarse como
aditivo para los medios de cultivo celular (Franék et al., 2000) Asimismo la peptona de
colágena y el extracto de levadura son hidrolizados de proteínas de bajo costo por lo que
son muy atractivos para la aplicación en la tecnología del cultivo celular.
Con esta formulación (MCR) se logró adaptar las células hasta el 100% de dicho
medio; lo cual se relaciona con la adaptación de diversas líneas celulares en medios de
cultivo con diferentes hidrolizados de proteínas, tales como peptonas y extractos de
levadura (Schlaeger y Schumpp., 1992; Jan et al. 1994., Gaudreau et al., 2002). Los
resultados obtenidos sugieren que la peptona y el extracto de levadura de calidad cultivo
celular usados en el medio de cultivo contienen una relación de metales adecuada para
los requerimientos nutricios, además de la fuente de nitrógeno y vitaminas juegan un
rol importante para la adaptación de las líneas celulares de mamífero al 100% del medio
diseñado (MCR). Asimismo existen trabajos con medios de cultivo libres de suero, con
los cuales se ha observado que las líneas celulares logran adaptarse favorablemente y
presentar un crecimiento similar o superior a los medios utilizados como control
(Hammond et al1984;
Kallel et al., 2002; Mochizuki., 2005).
Con respecto a la cinética de crecimiento de las células OK, CHANG y LLCPKi, tanto en MEM como en MCR se observó un patrón de crecimiento similar. En los
dos medios se distingue una curva con fases bien diferenciadas; al comparar los valores
mediante la prueba Mann-Whitney no se encontraron diferencias significativas entre las
líneas celulares cultivadas en MEM y las cultivadas en MCR con una p< 0,05. Burteau
et al, 2003, observaron que el crecimiento de las células CHO aumentaba en un 30%,
cuando se utilizó un medio de cultivo libre de proteína fortificado con peptonas de
origen vegetal.
Se realizó un análisis al microscopio de luz con el objetivo de comparar la
morfología de las células cultivadas en el medio MCR con las propagadas en MEM. Los
estándares morfológicos tomados en cuenta para el análisis fueron la forma del núcleo,
del citoplasma, distribución de la cromatina, presencia de nucléolos y relación núcleocitoplasma. No se observaron diferencias morfológicas entre los tres tipos celulares que
se cultivaron en el MCR con respecto a las crecidas en el medio control MEM. En base
a estos resultados se puede considerar que las células
lograron adaptarse al medio
MCR. Gorfien et al., 1993 realizó un estudio donde se cultivaron distintas líneas
celulares de mamíferos (células endoteliales de arteria pulmonar de bovino, porcino,
ovino, de vena de canino y de cordón umbilical) en medios de cultivo libres de suero
donde utilizó el análisis morfológico como parámetro para observar la correcta
adaptación en dicho medio, todas las líneas celulares en el medio libre de suero
mostraron una morfología normal al compararlas con las propagadas en SU medio
original.
Con el propósito de determinar la respuesta de las células (OK, CHANG y
LLCPK-1) frente a un agente tóxico (HgCh), cultivos provenientes de MCR y MEM
fueron expuestos durante 6 h a diferentes dosis de HgCl2. La respuesta citotóxica fue
analizada mediante el ensayo de reducción del MTT. Los resultados muestran que las
células propagadas en el medio MCR presentaron una susceptibilidad similar al efecto
citotóxico en todas las concentraciones probadas con respecto las propagadas en el
medio control en las tres líneas celulares y en ambos medios se observó que el efecto
más tóxico fue con la concentración de 20 JÍM después. Los resultados anteriores se
relacionan con los ensayos realizados por Carranza-Rosales et al, 2005 en los cuales
observaron la susceptibilidad de la línea celular OK frente a diferentes concentraciones
de HgCh (1, 10 y 15 jíM) donde encontraron que el efecto mas marcado sobre las
células OK fue después de 6 a 9 h con la concentración de 15 nM. La toxicidad de los
metales pesados depende del tipo y la especie química del metal, y para cada una de
ellas, dependiendo del modelo de estudio, la concentración tóxica es diferente
(Klaassen, 1996). Por mencionar algunos ejemplos de dosis tóxicas en modelos
celulares, Bucio et al., 1995, demostraron que concentraciones de 50 y 100 fiM de
HgCh son tóxicas para la línea celular hepática WRL-68; mientras que Suwalsky et al.,
2000, utilizaron dosis de hasta 500 ¿iM de HgCl 2 para observar efectos dañinos en
eritrocitos humanos. Por su parte, Araragi et al., 2003, emplearon concentraciones en el
rango de 1-10 mM del metal para inducir apoptosis en una línea de células de leucemia
humana. La sensibilidad de las células utilizadas en este trabajo en respuesta a dosis
tóxicas de cloruro mercúrico, es característica de cada una de ellas.
Con respecto a la concentración proteínas totales, para las células OK en MCR
es 2.62% mayor que las células en MEM, sin embargo las células de CHANG en MCR
fueron 11.26% menor que las células de CHANG en MEM y las LLCPK-1 presentaban
el 17.24% menos que las LLCPK-1 cultivadas en MEM. Sin embargo al ser comparadas
estadísticamente con la prueba ANOVA de un solo factor (p<0.05) no se encontraron
diferencia significativa entre las líneas celulares en MEM y MCR.
Con el objetivo de observar la diferencia entre el perfil de proteínas de las
células cultivadas en el medio MCR y en MEM se hizo una electroforesis en geles de
poliacri lamida.
Los
resultados
mostraron
que
no
existen
diferencias
entre
la
concentración de las bandas de las líneas celulares OK y CHANG; a diferencia de las
células LLC-PKi en MCR la cual presento mayor concentración en una de sus bandas
con respecto al MEM. Se han realizado estudios para caracterizar el perfil de proteínas
de distintas líneas célulares, para evaluar nuevos medios de cultivos. Espinoza et al,
2003 determinaron el perfil de proteínas por electroforesis PAGE- SDS de
vaginalis
Gardnerella
para evaluar tres medios de cultivo CTS, CTS- se y CC, los cultivos se
concentraron a 800 g y se procesaron. En los resultados se observó un patrón similar
para todas las variables, se identificaron 14 proteínas de diferentes pesos moleculares.
La proteína de 14 kDa, se expresó en todas las variantes, excepto para los cultivos CTSse, cuando se incubaron en aerobiosis. Por otra parte Pham et al, 2003, demostraron que
el aditivo de peptona GPN3, presentaba un efecto positivo para la expresión de
proteínas de la línea celular 293SFE creciendo en un medio libre de suero.
Con la finalidad de analizar la capacidad de las células para soportar un proceso
de criopreservación después de ser cultivadas en el medio MCR, procedimos a congelar
las células como se describe en la sección de métodos.
Después de 30 días para las
células en MCR y 120 días para las células en MEM de permanecer congeladas en
nitrógeno líquido determinamos la viabilidad celular con azul de tripano.
Los
resultados muestran que el medio MCR soporta el proceso de criopreservación celular y
mantiene las células con un alto porcentaje de viabilidad al igual que el medio de
referencia MEM. Existen otros estudios donde se ha determinado la viabilidad de las
células después de un proceso de criopreservación, por ejemplo, Choi JW et al., 2007,
evaluaron las condiciones óptimas de congelación de cultivos primarios de riñon de
embrión de pollo (CEK), ellos observaron
que la viabilidad de las células fue de un
50.8%, cuando la concentración de DMSO fiie de 20% (v/v) por lo que ellos mencionan
que el proceso de criopreservación puede facilitar el mantenimiento de un stock de la
células primarias CEK para el laboratorio. Por su parte, Sui et al, 2007, investigaron el
proceso de criopreservación en 5 líneas celulares de mamíferos cultivadas en un medio
con diferentes concentraciones de d-alosa. Las líneas celulares incluidas fueron
OVCAR-3 (human ovarían cáncer), HeLa (human cervical cáncer), HaCaT (human skin
keratinocytes), HDF (human dermal fibroblasts) and NIH3T3 (murine fibroblasts). Las
células fueron descongeladas a las 24 horas, 7 y 30 días después; los resultados
obtenidos sugieren que la d-alosa provee un efecto de protección para las células de
mamíferos en el proceso de congelación. Paranjape 2003, adaptaron la línea celular de
riñon (PS) a temperaturas de 40°C cuando en realidad crecen a 37 °C. La viabilidad de
las células a 37 °C y a 40 °C fue entre 90-95%. Esta característica del medio de cultivo
diseñado es deseable para la conservación de las líneas celulares a largo plazo.
9. CONCLUSIONES
9.1 Conclusión general
Se diseñó un nuevo medio de cultivo MCR para
mamífero tales como: OK, CHANG y LLCPK-1
extracto de levadura, que conserva las
la propagación de células de
a base de peptona de colágena y
características
fisiológicas
similares a las
cultivadas en el medio control MEM.
9.2 Conclusiones específicas.
Se logró adaptar a la mezcla 25:75 (MEM:MD) los cultivos de células
OK,
CHANG y LLCPK.-1 utilizando una fuente de proteínas y vitaminas (grado industrial).
La alta concentración de metales
tales como plomo y
hierro y una
menor
concentración de zinc presentes en las fuentes de proteínas y vitaminas grado industrial,
podrían ser las responsables de la adaptación de las células solamente hasta la mezcla
25:75 (MEM:MD).
Se adaptaron exitosamente las células OK, CHANG y LLC-PKi al nuevo medio
de cultivo MCR, ya que no se encontró diferencias significativas en las cinéticas de
crecimiento de las células propagadas en ambos medios de cultivo: MEM y MCR
En las cinéticas de crecimiento de las células OK, CHANG y LLC-PKi tanto en
MEM como en MCR no se encontraron diferencias significativas tanto en las
células propagadas en el medio de cultivo MEM como en MCR por lo que se puede
decir por lo tanto que las células lograron adaptarse favorablemente al nuevo medio
de cultivo MCR.
La morfología
microscopio de luz,
de las células
OK, CHANG y LLC-PK|
observadas
al
cultivadas en el nuevo medio de cultivo MCR no presenta
diferencias respecto las células cultivadas en el medio control MEM.
Las células
OK, CHANG y LLC-PKi
frente
al cloruro mercúrico, fueron
igualmente susceptibles en ambos medios de cultivo: MCR y MEM.
La concentración de proteínas totales de las tres líneas celulares OK, CHANG y
LLC-PKi
no mostró diferencia significativa respecto a
el nuevo medio de cultivo MCR y el medio control MEM.
las células cultivadas en
Los patrones de proteínas por PAGE-SDS entre las líneas celulares cultivadas en
el nuevo medio de cultivo MCR y el medio control MEM fueron similares, aunque
existe diferencia en la concentración en una de las bandas de la línea LLC-PK)
propagada en el medio de cultivo MCR con respecto a la proveniente
a las del
medio control MEM.
Las células cultivadas en el nuevo medio de cultivo MCR
conservaron
características fisiológicas similares a las cultivadas en el medio de cultivo control
MEM, por lo tanto el
nuevo medio de cultivo MCR es una alternativa para el
cultivo de células de mamíferos.
LITERATURA CITADA
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APÉNDICE
Composición y preparación de las soluciones de trabajo.
Acrilamida
: Se complementó el contenido de un frasco de acrilamida / bis-
acrilamida (Acrylamide, SIGMA) con 40 mi de agua Milli Q. Se almacenó a 4°C.
Amortiguador
de pH isotónico de Tris IX (salino TD): se pesaron 8 g de NaCl,
3.75 g de KC1, 0.1 g de Na2HPC>4 y 3.0 g de Trizma base. Se disolvieron los
componentes en 800 mi de agua Milli Q. Se agregaron 15 mi de HC1 1 N y se dejó en
agitación hasta que la solución adquirió la temperatura ambiente. Se ajustó a pH 7.4 con
HC1 1N y se aforó a 1000 mi con agua Milli Q. Se distribuyó en frascos de vidrio con
50 mi y se esterilizaron en autoclave por 15 min. a 121°C. Se almacenaron a
temperatura ambiente.
Antibiótico,
mezcla ¡00X[penicilina
(200,000 VI) y estreptomicina
(0.5
g/mi)]:
la mezcla se preparó a partir de Penicilina G-sódica cristalina (Lakeside) de 1 x 106
unidades y sulfato de estreptomicina (Lakeside) de 1 g. Se disolvieron los componentes
en forma individual en 2 mi de agua Mili Q. Se tomaron 0.4 mi del frasco de penicilina
y se mezclaron con 1 mi de la solución de estreptomicina. La mezcla se aforó a 100 mi
con agua Milli Q y se esterilizó por filtración. Se almacenó en fracciones de 1 mi a
-20°C.
Bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio]
a 2 mg/ml (MTT): se
pesó 0.02g de MTT (Research Organics) y se disolvió en 10 mi de SSBH. Se preparó al
momento de usarse.
Buffer de corrida 5X (se diluyó a IXpara
correr el gel): Se disolvieron 15 g de
Tris base (125 mM), 94 g de glicina (1.25 M) y 5 g de SDS en 1 L agua Milli Q.
Buffer de fosfatos
(PBS): Se pesaron 5.84 g de NaCl, 2.18 g de K 2 H P 0 4 y 0.66 g
de KH2PO4, se colocaron en 800 mi de agua Milli Q, se mezclaron y se ajustó el pH a
7.2. Se aforó a 1000 mi y se colocó en frascos de vidrio de 100 y 200 mi con tapón de
rosca, se esterilizaron en autoclave por 15 min a 121°C. Se almacenaron a temperatura
ambiente.
Buffer para gel concentrador
(pH 6.8): Se disolvieron 31.5 g de Tris - HC1
(1M) en 200 mi agua Milli Q.
Buffer para gel separador
(pH 8.8): Se disolvieron 47.3 g de Tris - HC1 ( 1.5 M)
en 200 mi agua Milli Q.
Buffer de lisis: Se disolvieron 0.8 g de Tris- base 10 mM (pH 7.6) y 5 g de
NP-40 1% en 500 mi de agua Milli Q.
Buffer de muestra (2X): Se disolvieron 3.94 g de Tris-HCl 10 m M (pH 6.8), 10
g de SDS 4%, 50 mi de glicerol 20%, 0.5 g de azul de bromofenol 0.2% y 5 mi de p mercaptoethanol 2% en 195 mi agua Milli Q.
Buffer salino Tris (TBS), pH 7.4: Se pesaron 7.89 g de NaCl, 0.315g de Tris
base, 0.402 g de K.C1, 0.197 g de M g S 0 4 y 0.021 g de CaS0 4 - Se disolvieron en 800 mi
de agua Milli Q y se ajustó el pH a 7.4. Se distribuyeron en frascos de vidrio de 100 mi,
se esterilizaron en autoclave por 15 min. a 121°C. Se almacenaron a -20°C.
TM
Cóctel inhibidor de proteasas:
Se utilizò el cóctel de proteínas: Complemete
Mini (1 tableta para 10 mi de buffer de lisis).
Gel concentrador:
Se disolvieron 5.1 mi de agua Milli Q, 1.0 mi de Buffer
concentrador 4X, 1.3 mi de Acrilamida, 75 (al de SDS al 10%, 75(il de Persulfato de
amonio y 10 jxl de TEMED. El TEMED se adicionó al final. Se combinò y se colocó
inmediatamente, se añadió suavemente 1 mi agua sobre la superficie del gel. Se dejó
polimerizar 30 min.
Gel separador,
al 10°o: Se disolvieron 5.85 mi de agua Milli Q, 3.75 mi de
buffer separador 4X, 5.0 mi de acrilamida, 150 jal de SDS al 10%, 150 ni de persulfato
de amonio y 10 jal de TEMED. El TEMED se adicionó al final. Se combinó y se puso
inmediatamente el gel, se añadió suavemente 1 mi de agua sobre la superficie del gel.
Se dejó polimerizar 25-30 min.
Isopropanol
ácido (HCl 0.04 M en isopropanol):
se mezclaron 160 jal de HC1
12.5 M con 49.84 mi de isopropanol. Se almacenó a temperatura ambiente.
Mercurio:
se preparó una solución stock concentrada en agua Milli Q (se
esterilizó por filtración) y a partir de ahí se prepararon las soluciones de trabajo en el
medio de cultivo estéril correspondiente, sin suero.
Metasulfato
de Fenazina
a 3.5 mg/ml
(PMS):
se pesaron 0.035 g de PMS
(SIGMA) y se disolvió en 10 mi de agua Milli Q. Se preparó al momento de usarse.
NaOH I N. Se pesaron 4 g de NaOH y se disolvió en 100 mi de agua Milli Q, se
almacenó a temperatura ambiente.
Persulfato de amonio al 10°o: Se disolvió l g de Persulfato de amonio en 10 mi
agua Milli Q.
Reactivo de Coomassie
1:5 en agua Milli Q (Coomassie
blue dye Bio-Rad):
se
pesaron 100 m g de azul de Coomassie G-250 y se disolvieron en 50 mi de etanol al
95%, adicionando 100 mi de H3PO4 al 85%, la mezcla se aforó a 1 litro de agua Milli Q.
Rojo de fenol solución
al 1%: se pesó 1 g de rojo de fenol (SIGMA) y se
disolvió en 6 mi de NaOH 1N, se aforó a 100 mi con agua Milli Q. Se filtró a través de
papel Wahtman # 1 y después se esterilizó por filtración con membranas Millipore de
0.22 |am. Se almacenó a -20°C.
SDS 10%: Se disolvieron 20 g de SDS en 200 mi agua Milli Q.
Ser o albumina bovina (BSA) 1000 fig/ml de NaOH: se pesaron 25 mg de BSA
(SIGMA) en 25 mi de NaOH 1 N y se congelaron en alícuotas de 500 ¡il.
Solución A: se disolvieron 10 g de carbonato de sodio (Na2C04) y 0.25 g de
tartrato de sodio y potasio (KNaC4H40é 4H2O) en aproximadamente 50 mi en agua
Milli Q, se agregaron 50 mi de hidróxido de sodio (NaOH) y se aforo a 100 mi de agua
Milli Q. Se almacenó en frascos ámbar a temperatura ambiente.
Solución
B: se disolvieron 0.39 g de sulfato de cobre ( C u S 0 4 5H2O) en
aproximadamente 20 mi de agua Milli Q, después se agregaron 0.62 g de tartrato de
sodio y potasio (KNaC4H406 4H2O), se le adicionaron 2.5 mi de NaOH 1N y se
completó el volumen a 22.5 mi de agua Milli Q. Se guardó en un frasco ámbar a
temperatura ambiente.
Solución
C: se diluyó 1 mi de reactivo de Folin-Ciocalteu con 15 mi de agua
Milli Q (se preparó inmediatamente antes de usarse).
Solución estándar SAB lmg/ml:
se disolvieron 100 mg de seroalbúmina bovina
en 20 mi de agua Milli Q con agitación lenta y se aforo a 100 mi con agua Milli Q.
Solución
salina balanceada
de Hanks (SSBH IX): se pesaron 0.07 g de de
CaCl 2 , 1.0 g de Glucosa, 7.2 g de NaCl, 0.4 g de KC1, 0.2 g de M g S 0 4 y 0.12 g de
Trizma base. Se disolvieron los componentes en 800 mi de agua Milli Q y se ajustó el
pH a 7.0 con HC1 5 N. Se aforó a 1000 mi. Posteriormente se ajustó la osmolaridad a
300 ± 10 mOsm con NaCl. Se esterilizó por filtración y se distribuyó en de 100 mi en
frascos de vidrio, estériles con tapón de rosca. Se almacenaron a -20°C.
Solución Reveladora:
se disolvió 0.5 g de azul de Coomassie R250 en 40 mi de
metanol y 10 mi de ácido acético glacial y se aforo a 100 mi de agua Milli Q, se filtró
con papel Whatman # 1. Se almacenó en un frasco ámbar a temperatura ambiente.
Solución decolorante:
se mezclaron 400 mi de metanol, 70 mi de ácido acético
glacial y 530 mi de agua Milli Q. Se almacenó a temperatura ambiente.
Solución conservadora:
se preparó una solución de glicerol al 1%.
RESUMEN CURRICULAR
Gloria Elena Espinosa Ayala
Candidato para el Grado de
Doctorado en Ciencias con Especialidad en Biotecnología
Tesis: DISEÑO DE UN MEDIO DE CULTIVO A BASE DE PEPTONA DE
COLAGENO Y EXTRACTO DE LEVADURA PARA LA PROPAGACIÓN DE
TRES LINEAS CELULARES DE MAMIFEROS.
Campo de estudio: Biología celular.
Datos personales: Nacido en Monterrey, Nuevo León el 5 de Agosto de 1978 hija de
Juan Espinosa Monrroy y Silvia Ayala Hernández.
Educación: Egresado de la Universidad Autónoma de Nuevo León, grado obtenido
Químico Bacteriólogo Parasitólogo.
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