Indicaciones para reajustar el SPP

TÍTULO DEL PROGRAMA:Programa Nacional de Ciencias Básicas
TÍTULO DEL PROYECTO:Relación estructura actividad de un nuevo inhibidor de proteasas
hallado en la langosta Panulirus argus. Bases para el desarrollo de nuevos fármacos.
ENTIDAD EJECUTORA PRINCIPAL:Centro
Medicamentos (CIDEM).
Director:Marlene Porto Verdecia
de
Investigación
y
Desarrollo
de
Dirección: Avenida 26 No. 1605 e/ Puentes grandes y Boyeros, Plaza de la Revolución, La
Habana
Teléfono: 8810818
Fax: 8810830
E-mail:[email protected]
Firma Director:
ENTIDAD EJECUTORA PARTICIPANTE:
Teléfono:Fax: Nombre y Firma Director :
E-mail: -
JEFE DEL PROYECTO: Rolando Perdomo Morales
Entidad: Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM)
Teléfono: 8811424
Fax: 8810830Email:[email protected]
USUARIOS o CLIENTES:
Dirección:
Teléfono: km
Fax:
Nombre y Firma Director
DURACIÓN
Fecha de inicio: Enero/2014
E-mail:
Fecha terminación: Diciembre/2015
AVAL DEL ÓRGANO CIENTÍFICO o TÉCNICO DE LA ENTIDAD
Se adjunta
RESUMEN
En el presente proyecto se propone estudiar la relación estructura-función de un nuevo inhibidor
de proteasas hallado en el departamento de Bioquímica del Centro de Investigación y Desarrollo
de Medicamentos (CIDEM). Se pretende la identificación del sitio activo del inhibidor, así como la
modificación de la especificidad inhibitoria mediante técnicas de mutagénesis dirigida con la
finalidad de obtener candidatos o moldes para el desarrollo posterior de nuevos fármacos.
Casi el 50 % de los fármacos existentes en el mercado ejercen su efecto terapéutico a través de
la inhibición de enzimas. Por otra parte, las enzimas continúan siendo el blanco principal para el
desarrollo de nuevos fármacos por las principales compañías farmacéuticas y biotecnológicas, por
lo que el objetivo de este proyecto es dilucidar la relación estructura-actividad de un novel
inhibidor de peptidasas encontrado en la langosta espinosa P. argus.
PROBLEMA A RESOLVER. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
En el presente proyecto se propone estudiar la relación estructura-función de un nuevo
inhibidor de proteasas hallado en el departamento de Bioquímica del Centro de
Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Se pretende la identificación del sitio
activo del inhibidor, así como la modificación de la especificidad inhibitoria mediante
técnicas de mutagénesis dirigida con la finalidad de obtener candidatos o moldes para el
desarrollo posterior de nuevos fármacos.
Casi el 50 % de los fármacos existentes en el mercado ejercen su efecto terapéutico a
través de la inhibición de enzimas, lo cual representa más de 96 mil millones de dólares. Por
otra parte, las enzimas continúan siendo el blanco principal para el desarrollo de nuevos
fármacos por las principales compañías farmacéuticas y biotecnológicas. Por ejemplo, entre
el 50 y 75 % de los esfuerzos en la búsqueda de nuevos medicamentos en los Estados
Unidos están enfocados en las enzimas como blancos primarios (1). De todas las familias
de enzimas, las proteasas, peptidasas o enzimas proteolíticas, constituyen una de las
dianas con mayor potencial para el desarrollo de fármacos por las razones quese describen
a continuación.
Las enzimas proteolíticas representan alrededor del 2% de los genes en seres humanos,
organismos infecciosos y otras formas de vida. Su control sobre la síntesis, recambio y
activación de proteínas y otras funciones les permite regular procesos fisiológicos tales
como
la
concepción,
nacimiento,
digestión,
crecimiento,
diferenciación,
señalización/migración celular, respuesta inmune, cicatrización de heridas, envejecimiento y
apoptosis. Por otra parte, es conocido que las proteasas son esenciales para la replicación /
transmisión de virus, parásitos y bacterias que causan enfermedades infecciosas en
mamíferos, y que también están relacionadas con la proliferación de insectos y otras plagas
agrícolas que transmiten enfermedades, dañan los cultivos vegetales, y propagan
infecciones a través de poblaciones de animales (1).
Los inhibidores de proteasas han emergido con prometedoras aplicaciones terapéuticas en
el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer, infecciones parasitarias, fúngicas y
virales (por ejemplo, esquistosomiasis, malaria, C. albicans, VIH, hepatitis, herpes), y en
desórdenes
inflamatorios,
inmunológicos,
respiratorios,
cardiovasculares
y
neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer (1).
La farmacología moderna se basa en fármacos derivados de fuentes naturales y de los
conocimientos biológicos fundamentales extraídos de los estudios de su mecanismo de
acción. Sin embargo, ha sido examinada sólo una pequeña fracción de la biodiversidad total
de la Tierra. Por ejemplo, los océanos cubren más del 70% de la superficie de la Tierra y sin
embargo se sabe relativamente poco acerca de la biología, la química, e incluso la identidad
de sus habitantes. Por tanto, es evidente que los océanos representan una fuente aun poco
explorada de moléculas con potencial para el desarrollo de fármacos.
Recientemente, nuestro grupo ha hallado y caracterizado parcialmente un nuevo inhibidor
de peptidasas en la langosta espinosa Panulirus argus, que hemos nombrado panulirin
(Manuscrito en proceso de publicación). Panulirin es un péptido básico de 5 kDa. La falta de
homología con otras proteínas sugiere que representa una nueva familia de inhibidores.
Para ser efectivo como herramientas biológicas, los inhibidores de proteasa no sólo deben
ser muy potentes sino también muy selectivos en la unión a una proteasa particular.
Estudios preliminares muestran que panulirin es altamente específico por la tripsina de
mamíferosdebido probablemente a propiedades estructurales aún desconocidas. Este
hallazgo nos ha estimulado a realizar una mejor caracterización de panulirin centrados en
su prometedor potencial como molde para el desarrollo de nuevos fármacos y en
fisiopatologías donde se sabe que los inhibidores de proteasas representan los mejores
candidatos farmacológicos, como algunas infecciones (ej. hepatitis C y malaria) y en
enfermedad pulmonar obstructiva crónica, por solo mencionar un par de ejemplos. A través
de la caracterización molecular, se va a identificar el sitio reactivo (P1) ya que la naturaleza
de este sitio es responsable, en general, de la especificidad inhibitoria. Este conocimiento
será útil para la manipulación biotecnológica de la especificidad del inhibidor contra
peptidasas relacionadas con un trastorno fisiopatológico específico, lo cual podría conducir
a la obtención de una gran cantidad de candidatos para el desarrollo de fármacos.
El proyecto que presentamos pretende ser la contraparte nacional de un proyecto
internacional VLIR-UOS convocatoria 2013 con la Universidad de Leuven en Bélgica recién
aprobado
“Structure-activityanalysis
of
a
novel
peptidaseinhibitorfromtheCaribbeanspinylobster, Panulirus argus. A scaffoldfordevelopment
of biopharmaceutical leads”, a ejecutarse en los años 2013 hasta 2015. A través de dicho
proyecto se va a garantizar la formación de nuestro personal en técnicas novedosas y se va
a adquirir equipamientos, accesorios y reactivos necesarios para acometer dicha
investigación.
1. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery, by Robert A. Copeland ISBN 0471-68696-4 Copyright © 2005 by John Wiley & Sons, Inc.
2. Leung D, Abbenante G, Fairlie DP.Protease inhibitors: current status and future
prospects. J Med Chem.2000 Feb 10;43(3):305-41.
3. Peter Norman. Protease Inhibitors: Innovation Drives Drug Pipeline. Insight Pharma
Reports. Febrero 2009.
OBJETIVO GENERAL
Dilucidar la relación estructura-actividad de un novel inhibidor de peptidasas encontrado en
la langosta espinosa P. argus.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Clonar y secuenciar el cDNA de panulirin y determinar su perfil de expresión.
2. Obtener variantes recombinantes de panulirin e identificación del sitio P1
3. Determinación de especificidad inhibitoria frente a peptidasas representativas de las
cuatro clases mecanicistas en relación con el residuo de aminoácido que ocupa el
sitio P1.
METODOLOGÍA A UTILIZAR PARA ENFRENTAR EL PROBLEMA
RESULTADOS Y PLANIFICACIÓN DE LAS ACTIVIDADES PRINCIPALES
Resultados
Planificados
Entidad
Responsable
Actividades
Principales
Inicio
Término
Indicadores
verificables

Determinación
del transcripto
que codifica
para el inhibidor
panulirin a partir
de cDNA y
expresión en
tejido
Resultados
Planificados
Estudios in
silico de
relación
estructuraactividad para
determinar los
mutantes
viables para los
ensayos de
mutagénesis.
Clonaje y
secuenciación
de plásmidos
recombinantes
con la banda de
gen para
panulirin y
panulirin
mutado.
Diseño y
síntesis de
oligos
cebadores
 Obtención de
CIDEMmRNA
LEUVEN
 Optimización de
la PCR
 Secuenciación
de banda
amplificada
Actividades
Entidad
Principales
Responsable

CIDEMLEUVEN




CIDEMLEUVEN


Producción y
purificación de
las versiones
de panulirin
recombinante
CIDEMLEUVEN


Determinación y
análisis de
traducción a
proteína
Estudio de
modelación de
la proteína por
homologías
Determinar los
posibles sitios
P1 del inhibidor
Diseño de
oligos para
clonación.
Insertar banda
de interés en el
plásmido de
recombinación
Transformación
del vector de
expresión
Cinética de
evaluación de
expresión de la
proteína.
Escalar
producción del
recombinante.
Purificación por
cromatografía
de intercambio
catiónico.
01/14
03/14
Informe parcial e
introducción de
secuencia en
GenBanck
Inicio
Término
Indicadores
verificables
04/14
04/15
Informe parcial
04/14
04/15
Informe parcial
Publicación en
revista de
impacto
12/14
12/15
Informe parcial

Determinación
de la
especificidad
del inhibidor en
relación con las
variantes
naturales y
recombinantes
NOMBRE Y
APELLIDOS
Rolando Perdomo
Morales
Vivian
Montero
Alejo
Yamile
Vega
Hurtado
Anabel
Pacios
Michelena
Leandro Rodríguez
Viera

CIDEM

Selección de
las peptidasas
diana
Estandarización
de ensayo
enzimático para
cada peptidasa
diana
Determinación
de parámetros
cinéticos
01/15
12/15
RECURSOS HUMANOS PRINCIPALES
Categoría
Marcar si es
Grado
científica,
Jefe de
Entidad
Científico
docente o
Resultado
tecnológica
Investigador
x
Lic.
CIDEM
Auxiliar
Investigador
x
Lic.
CIDEM
Auxiliar
Téc.
Lic.
MSc.
Reserva
Científica
Investigador
Agregado
Informe final
Publicaciones en
revista de
impacto
% de
participación
30
20
CIDEM
30
CIDEM
15
CIMUH
15
Experiencia del Jefe del proyecto relacionada con el objetivo principal del proyecto
Licenciado en Bioquímica (1994), que se encuentra culminando su doctorado. Actualmente
es el jefe del grupo de Bioquímica del CIDEM y es reserva activa de la Subdirección de
Investigaciones del Centro. Desde sus comienzos a trabajar en el Centro (1995); ha estado
vinculado con investigaciones que persiguen la evaluación y desarrollo de métodos
alternativos para la determinación de pirógenos en productos inyectables. En este sentido
ha desarrollado procedimientos para la extracción y purificación de patrones moleculares
asociados a patógenos o pirógenos exógenos como endotoxinas, ácido lipoteicoico,
peptidoglicanos y b-1,3 glucanos. Tiene amplios conocimientos en los métodos existentes
para la detección de endotoxinas y otros pirógenos como el LAL y el ensayo de activación
de monocitos. Por otra parte, ha profundizado en los mecanismos de respuesta inmune
innata de la langosta espinosa P. argus, con lo cual se ha logrado proponer un nuevo
producto para la detección de pirógenos empleando componentes de los hemocitos de la
langostas y siguiendo una estrategia similar al LAL. Estas investigaciones han permitido
colateralmente el hallazgo de una nueva familia de inhibidores de proteasas (panulirin). En
este sentido, ha adquirido experiencia en el campo de la enzimología, incluyendo de
manera particular las herramientas necesarias para la caracterización cinética de
inhibidores de proteasas, y su relación estructura-actividad. Dichas investigaciones han
estimulado la búsqueda de nuevos fármacos no solo a partir de inhibidores de proteasas de
invertebrados marinos, sino incluyendo péptidos antimicrobianos, ambos con potencial para
ser empleados como moldes para el desarrollo de nuevos fármacos.
RECURSOS MATERIALES E INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE POR LAS ENTIDADES
PARA EJECUTAR EL PROYECTO
Debido a investigaciones precedentes desarrolladas y aun en ejecución en el CIDEM, seha
logrado una importante experiencia en el estudio del sistema inmune innato de la langosta,
lo cual ha permitido el hallazgo de nuevas moléculas de importancia farmacológica como
inhibidores de proteasas y péptidos antimicrobianos. Dicha experiencia se ha desarrollado
en paralelo con la infraestructura y recursos necesarios para llevar a cabo este tipo de
investigaciones. La mayor parte de los reactivos, accesorios y equipamientos necesarios
para ejecutar el proyecto están garantizados por un proyecto internacional VLIR-UOS con
Bélgica. Además, se debe mencionar que el CIDEM tiene experiencia en la actividad de
investigación y desarrollo de medicamentos, incluyendo sus etapas principalestales como
farmacología, toxicología, genotoxicidad, tecnología y farmacocinética, lo cual va a
contribuir al mejor diseño racional de medicamentos.
Presupuesto del Proyecto
VALOR EN MN/CUC / AÑO
ELEMENTOS DE
GASTOS
Salario
Salario
Complementario ( 9.09
- Vac.)
SUBTOTAL
Seguridad Social (14%)
Subcontrataciones
Pago del Contravalor
Impuesto sobre
utilización F.T. (15%)
Materiales
Dietas y Pasajes
Otros Gastos
SUBTOTAL
TOTAL DE GASTOS
DIRECTOS
Gastos Indirectos (ST x
1.0045)
TOTAL DE GASTOS
TOTAL GENERAL DEL
PROYECTO
I Año
MN
13905.10
II Año
CUC
MN
13905.10
CUC
TOTAL
MN
27810.20
1263.97
1263.97
2527.94
15169.07
1820.29
15169.07
1820.29
30338.14
3640.58
39309.16
39309.16
78618.32
2275.36
2275.36
4550.72
73.8
40676
24150
73.8
16907
22890
147.6
3300.00
46778.6
3300.00
46778.6
6600.00
93557.2
61947.68
61947.68
123895.36
15237.33
15237.33
30474.67
77185.01 64826.00 77185.01
39797
CUC
57583
47040
154370.02 104623.00
154370.02
104623