Influencia de la concentración de ácido glutámico y glicerol en la

ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de
Azúcar
ISSN: 0138-6204
[email protected]
Instituto Cubano de Investigaciones de los
Derivados de la Caña de Azúcar
Cuba
Frias, Alina; Villa, Pilar M.; Torres, Esmérida; Santo Tomás, Julio F.; Redondo, Delfa
Influencia de la concentración de ácido glutámico y glicerol en la síntesis de meta bolitos
antimicrobianos de Pseudomonas aeruginosa cepa PSS
ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. XXXIX, núm. 3, septiembre-diciembre, 2005,
pp. 14-19
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar
Ciudad de La Habana, Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120688003
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Alina Frias, Pilar M. Villa, Esmérida Torres, Julio F. Santo Tomás, Delfa Redondo
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA)
e.mail: [email protected]
RESUMEN
En el presente trabajo se informa sobre la influencia significativa que ejerce la concentración de dos fuentes de carbono sobre la producción de metabolitos antimicrobianos
empleando la cepa Pseudomonas aeruginosa PSS. Dichos metabolitos son especialmente atractivos para su uso en el control biológico de Alternaria alternatti. El cultivo se realizó a escala de zaranda empleando un diseño factorial 22 con glicerol y ácido glutámico como fuentes de carbono, a dos concentraciones (5 y 10 gL-1). Como variable respuesta
se empleó el porcentaje de inhibición del crecimiento de Alternaria alternatti. Los mejores resultados en cuanto a la producción de metabolitos antimicrobianos fueron alcanzados en el medio con ácido glutámico a 5gL-1, urea y fosfato, al ser más económico y
obtenerse rendimientos producto/sustrato de 30 %.
Palabras clave: Biocontrol, Pseudomonas aeruginosa, metabolitos antimicrobianos,
fuentes de carbono.
ABSTRACT
Present paper reports the significant influence of the concentration of two carbon sources
on the production of antimicrobial metabolites from Pseudomonas aeruginosa PSS strain.
Such metabolites are specially attractive for biological control of Alternaria alternatti.
The culture was carried out at shaker scale by jeans of a 22 factorial design with glicerine and glutamico acid as carbon sources at two concentrations (5 and 10 gL-1). The behaviour of inhibition degree of Alternaria alternatti growth was taken as response variable.
The best results according antimicrobial metabolite production were achieved with 5gL-1
glutamic acid, urea and phosphate, since it resulted cheaper than glycerine one and led
to product/substrate yields around 30 %.
Key words: Biocontrol, Pseudomonas aeruginosa, antimicrobial metabolites, carbon
sources.
14
ICIDCA No. 3, 2005
INTRODUCCIÓN
Actualmente existe un interés creciente
en estudiar los metabolitos secundarios producidos
por
especies
del
género
Pseudomonas, para el control biológico de
hongos fitopatógenos (1,2,3,4,5,6,7,8).
Estos metabolitos son producidos durante la fase estacionaria del crecimiento
microbiano y su síntesis depende de las
condiciones de cultivo, siendo los factores
nutricionales de gran importancia puesto
que son la llave para incrementar los niveles de producción de los metabolitos (9, 10).
Entre los requerimientos nutricionales
que más afectan la producción de metabolitos secundarios se encuentran la fuente de
carbono y su concentración. La utilización
del carbono es central para la sobrevivencia,
crecimiento y competitividad de los microorganismos en cualquier comunidad. (11).
Dado estos antecedentes y todo el trabajo previo que viene realizando un grupo de
investigadores del Instituto Cubano de
Investigaciones de los Derivados de la Caña
de Azúcar (ICIDCA), en la obtención de un
producto biológico a partir de Pseudomonas
aeruginosa cepa PSS con el fin de ser
empleados en el control biológico contra
hongos fitopatógenos, nos trazamos como
objetivo evaluar la influencia de la concentración de carbono en la producción de
metabolitos antimicrobianos empleando la
cepa P. aeruginosa PSS.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismo
Se empleó la cepa Pseudomonas aeruginosa PSS, perteneciente a la colección del
Instituto Cubano de Investigaciones de los
Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA)(12).
Influencia de la concentración de carbono
en la producción de metabolitos antimicrobianos
Se realizó un diseño factorial 22 , con la
siguiente matríz del diseño:
Tipo de Sustrato
Acido Glutámico ( -1)
Glicerol (1)
ICIDCA No.3, 2005
Concentración de fuente
de carbono
5 gL-1
10 gL -1
-1
-1
1
1
Se empleó la urea como fuente de nitrógeno (0,85gL-1) y el KH2PO4 a (0,56gL-1) (13)
Desarrollo del inóculo
Se partió de un cultivo previamente crecido 24 horas sobre placa Petri con King B
agar y luego se transfirió a matraces con invaginación conteniendo King B caldo, incubado en zaranda rotatoria durante 8 horas.
Posteriormente, se transfirieron 10 mL del
cultivo a otro matraz con 100 mL del mismo
medio anteriormente citado, el cual se incubó a 30 °C y 175 r.min-1, hasta que el cultivo
alcanzó 18 horas de crecido.
Condiciones de Fermentación
El inóculo fue transferido en una relación
de 1:10 a matraces invaginados de 250 mL de
capacidad que contenían 90 mL de los
medios glutámico y glicerol. Se incubaron
por triplicado en zaranda rotatoria durante
24 horas a 30 °C pH 7 y 175 r.min-1.
Análisis realizados
Crecimiento: Mediante densidad óptica a
600 nm en espectrofotómetro OPTON PM
2ª.
pH: Se realizaron en pH metro Pacitronic
MV 870.
Sideróforos: Se determinó por el método
espectrofotométrico (14) y se calculó la concentración mediante el coeficiente de absorción molar E=2000 LM-1 cm-1
Determinación de azúcares por cromatografía en fase reversa en HPLC: Las muestras se
centrifugaron, filtraron y se inyectaron directamente al sistema cromatográfico. Los perfiles cromatográficos se obtuvieron en un cromatógrafo líquido isocrático con un detector
de índice de refracción. Se empleó una
columna cromatográfica SUPERCOSIL LCNH2, 5 μm, 250x4,5, con una pre-columna
SUPERCOSIL LC-NH2, 5 mm y válvula de
inyección RHEODYNE, con lazo de 20 μL.
Como fase móvil se empleó acetonitrilo:
agua 80:20, con flujo de 2 mL.min-1. La concentración de los azúcares se calculó
mediante el programa BIOCROM por el
método del estándar externo.
Concentración del principio activo: El
caldo obtenido por fermentación se centrifugó durante 20 minutos a 10 000 r.min-1 y
8 mL del sobrenadante fue llevado hasta
pH=3 con HCl 1N y extraído 3 veces con
15
1,4 mL de acetato de etilo. Se centrifugó y la
fracción orgánica fue evaporada hasta
sequedad en estufa al vacío a 45 °C (13).
Ensayos in vitro: Se llevaron a cabo
mediante el ensayo de actividad antibiótica
por la técnica del envenenamiento del
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA),
se empleó el hongo fitopatógeno Alternaria
alternatti como organismo prueba determinando el por ciento de inhibición del crecimiento micelial comparado con un testigo(15).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La superficie de respuesta de los valores
de crecimiento de la cepa PSS contra los
factores evaluados (medio y concentración
de sustratos) (figura 1), indica diferencias
entre las condiciones estudiadas, para 5 y
10 gL-1 respectivamente.
Los datos del efecto de la concentración
de los sustratos carbonados sobre la obtención de metabolitos antimicrobianos (sideróforos y antibióticos), se ajustaron al modelo siguiente:
Y= B0 + B1X1+ B2X2 + B12X1X2
donde X1 es sustrato y X2 concentración,
observándose los siguientes resultados:
La concentración de sustratos influye significativamente para un nivel de confianza de
99 % en la producción de sideróforos. Se
alcanzan los mejores resultados con 5 gL-1 de
ácido glutámico como fuente de carbono.
(figura 2)
Figura 2. Superficie de respuesta obtenido para
la producción de sideróforos por la cepa P. aeruginosa PSS
Figura 1. Superficie de respuesta obtenida sobre
el crecimiento de P. aeruginosa PSS
En el análisis de varianza realizado se
observó que esta diferencia es significativa
para un nivel de confianza del 99 %, donde
los mejores resultados obtenidos fueron con
el medio glutámico a 5 gL-1.
Estos resultados están relacionados con
los mecanismos de asimilación de las fuentes de carbono. En el caso del ácido glutámico debe ser mediante su conversión a α
cetoácido mediante desaminación oxidativa, siendo incorporado directamente al
ciclo de Krebs. Por su parte, el glicerol se
fosforila y oxida a dihidroxiacetona fosfato,
que a su vez se isomeriza a gliceraldehído-3
fosfato, un compuesto intermediario que se
encuentra tanto en la vía glicolítica como en
la gluconeogénica. (16)
16
Para los metabolitos con actividad antibiótica hay influencia significativa de la
concentración de sustrato para un nivel de
confianza del 99 %, lo cual puede observarse al lograr la máxima inhibición (100 %)
del desarrollo micelial de Alternaria alternatti, cuando se emplea el ácido glutámico a
5gL-1 como fuente de carbono (figura 3).
El análisis de la superficie de respuesta
indica que el medio glutámico a una concentración de 5 gL-1, favorece el crecimiento
y la producción de los metabolitos antimicrobianos (sideróforos y antifúngicos), lo
que evidencia una vez más que los factores
nutricionales, influyen de manera significativa en el proceso fermentativo, coincidiendo con lo reportado por diferentes autores
(1,9, 17, 18, 19).
Entre los factores que incrementan la
producción de metabolitos sideróforos y
antibióticos, está el suplemento de aminoácidos al medio, reportándose el ácido glutáICIDCA No. 3, 2005
Tabla 1. Rendimientos Producto/Sustrato y
concentración de metabolitos antimicrobianos en
los medios glutámico y glicerol para 5 y 10 gL -1.
Medios de
producción
Glutámico 10gL -1
Glutámico 5 gL -1
Glicerol 10 gL -1
Glicerol 5 gL -1
Figura 3. Superficie de respuesta para el porciento de inhibición del crecimiento micelial de
Alternaria alternatti
mico como una de las fuentes más empleadas (20, 19, 21).
Por otra parte, los microorganismos prefieren una fuente de carbono específica para
la producción de un metabolito secundario
en particular (22,23).
El rendimiento Producto/Sustrato con
respecto a la concentración de metabolitos
antimicrobianos (mgL-1), varía desde un 6 %
(glicerol-5gL-1) hasta 30 % alcanzado en el
medio glutámico a 5 gL-1. Tanto para el glicerol como para el glutámico el empleo de
10 gL-1 no resulta efectiva, dado los bajos
rendimientos alcanzados (tabla 1).
Si analizamos estequiométricamente la
molécula de ácido glutámico podemos
observar que brinda un mayor aporte energético por la contribución tanto de carbono
como de nitrógeno a la célula. Además, es
conocido que los aminoácidos intervienen
en la vía de obtención del ácido chiquímico
el cual es un precursor en la biosíntesis de
aminoácidos aromáticos que son importantes precursores de numerosos metabolitos
secundarios (24), por lo que el empleo del
glutámico favorece la producción de metabolitos antimicrobianos por parte de la cepa
P. aeruginosa PSS.
Cabe señalar que la concentración de la
fuente de carbono incide significativamente
en la producción de metabolitos sideróforos
y antibióticos por la cepa P. aeruginosa PSS,
al reportarse variaciones en la concentración de estos metabolitos antimicrobianos
aún cuando se mantengan las mismas condiciones de fermentación (25,26).
ICIDCA No. 3, 2005
Concentración
de metabolitos
antimicrobianos
(mgL -1)
200
360
275
150
Rendimientos
Producto/
Sustrato
%
13.30
30.0
16.76
6.10
Los resultados obtenidos con la concentración de ácido glutámico (5 gL-1), permite emplear éste como fuente de carbono
y nitrógeno en el medio que contenga urea
(0,85 gL-1) y fosfato (0,56 gL-1), por lo que
sería una alternativa en la producción de
metabolitos antimicrobianos para el control de Alternaria alternatti causante de
enfermedades en tomate, papa y otros cultivos.
CONCLUSIONES
• La concentración de la fuente de carbono
influye significativamente en la producción de metabolitos antimicrobianos producidos por la cepa Pseudomonas aeruginosa cepa PSS.
• El medio compuesto por glutámico (5 gL-1)urea-fosfato, es idóneo para la producción
de metabolitos antimicrobianos contra
Alternaria alternatti, por ser el más económico y obtenerse los mejores rendimientos producto/sustrato.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. De Souza, J.T.; Weller, D.M. y
Raaijmakers, J. Frequency, diversity and
activity of 2,4-diacetylphloroglucinol-producing fluorescent Pseudomonas spp. in
dutch
take-all
decline
soils.
Phytopathology 93 (1), 203.
2. De Souza, J.T. Distribution, diversity, and
activity
of
antibiotic-producing
Pseudomonas spp. Tesis para optar por el
título académico de Doctor en Ciencias
Biológicas. Universidad de Wageningen,
Holanda, 2002.
17
3. Thomashow, L.S. y Weller, D.M. Role of
phenazine antibiotic from Pseudomonas
fluorescens in biological control of
Gaeumannomyces graminis var. tritici. J.
Bacteriol. 170: p. 3499-3508, 1998.
4. Duffy, B.K. y Défago, G. Zinc improves
biocontrol of Fusarium crown and root rot
of tomato by Pseudomonas fluorescens
and represses the production of pathogen
metabolites inhibitory to bacterial antibiotic biosynthesis. Phytopathol 87: p. 12501257, 1997.
5. Keel, C.; Weller, D.M.; Natsch, A.; Défago,
G.; Cook, R.J. y Thomashow, L.S.
Conservation of the 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthesis locus among fluorescent Pseudomonas strains from diverse
geographic locations. Appl. Environ.
Microbiol. 62: p. 552-563, 1996.
6. O´Sullivan, D.J. y O´Gara, F. Traits Of
fluorescent Pseudomonas spp. Involved in
supresión of plant root pathogens.
Microbiol. Rev.56: p. 662-676, 1992.
7. Howie, W.J. y Suslow, T.V. Role of antibiotic biosynthesis in the inhibition of
Pythium ultimun in the cotton spermosphere and rhizosphere by Pseudomonas
fluorescens Mol. Plant-Microbe Interact.4:
p. 393-399.
8. Gutterson, N. Microbial fungicides: recent
approaches to elucidating mechanism.
Crit. Rev. Biotechnol. 10: p. 69-91, 1990.
9. Duffy, B. K. y Défago, G. Environmental
factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas fluorescens biocontrol strains. Appl. Environ.
Microbiol.65: p.2429-2438, 1999.
10. Ownley, B.H.; Weeler, D.M. y
Thomashow, L.S. Influence of in situ and
in vitro pH on suppression of
Gaeumannomyces graminis var. tritici by
Pseudomonas
fluorescens
2-79.
Phytopathology 82: p. 178-184, 1992.
11. Brewer, D.; Mason, F.G. y Taylor, A.
(1987). The production of alamethicins by
Trichoderma spp. Can. J. Microbiol.33: p.
619-625, 1987.
12. Villa, P. M.; Díaz de Villegas, M. E.;
Frias, A. Influencia de diferentes parámetros en la producción de metabolitos de
Pseudomonas sp. cepa PSS. Informe interno ICIDCA. p 35, 1998.
13. Villa, P. M. Producción de metabolitos a
partir de Pseudomonas fluorescentes para
su uso en el control biológico de hongos
18
fitopatógenos. Tesis para optar por el título de Maestro en Microbiología.
Universidad de La Habana, 1999.
14. Villa, P. M.; Díaz de Villegas, M. E.;
Stefanova, M. y Zayas, O. Obtención de
un biopreparado efectivo contra hongos
fitopatógenos a partir de Pseudomonas sp.
cepa PSS como agente de control biológico. Avances en Biotecnología Moderna II
41, Habana´95.
15. Bagnasco, P., De La Fuente, L.; Gualtieri,
G.; Noya, F. y Arias, A. Fluorescent
Pseudomonas spp. as biocontrol agents
against forage legume root pathogenic
fungi. Soil Biology and Biochemistry. 30:
p.1317-1322, 1998.
16. Stryer, L. Matabolismo de loas ácidos
grasos.
En: Bioquímica.
4ta.
ed.
Barcelona: Editorial Reverté, S.A., 1995. p
606-607.
17. Thomashow, L. S. y Weller, D. M.
Current concepts in the use of introduced
bacteria for biological disease control:
mechanisms and antifungal metabolites.
In: Stacey, G. y Keen, N.T. (eds.). PlantMicrobe Interactions, p. 187-236, [S.I]:
Chapman Hall, 1996.
18. Slininger, P. J; Van Cauwenberger, J.E.;
Bothast, R.J.; Weller, D.M.; Thomashow,
L.S. y Cook, R.J. (1996). Effect of growth
culture physiological state, metabolites,
and formulation on the viability, phytotoxicity, and efficacy of the take-all biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2-79
stored encapsulated on wheat seed. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 45:391-398.
19. Slininger, P. J y Shea-Wilbur,. M. A.
Liquid-culture, pH, temperature and carbon (not nitrogen) source regulated phenazine productivity of the take-all biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2-79.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: p. 994800, 1995.
20. Díaz de Villegas, M. E.; García, L.; Bell, A.;
Villa, P. M.; Cabrera, Y.; Cepero, E. y Torres,
E. Producción y purificación de sideróforos
a partir de Pseudomonas aeruginosa PSS.
Informe Premio Anual del Instituto Cubano
de Investigaciones de los Derivados de la
Caña de Azúcar (ICIDCA), 2000.
21. Casida, L. E. Competitive ability and
survival in soil of Pseudomonas strain
679-2 a dominant, nonobligate bacterial
predator of bacteria. Appl. Environ.
Microbiol.58: p. 32-37, 1992.
ICIDCA No. 3, 2005
22. Alstrom, S. Factors associated with
determinant effects of rhizobacteria on
plant growth. Plant Soil. 102:p. 3-9, 1987.
23. Douglas, W. J. y Gutterson, N. I.
Multiple
antibiotic
produced
by
Pseudomonas fluorescent Hr37 and their
differential regulation of glucose. Appl.
Environ. Microbiol. 52: p. 1183-1189,
1986.
24. Herbert, R.B. The Biosynthesis of
Secondary
Metabolites.
Editorial
Chapman and Hall. Cap. 5 p. 80,1981.
ICIDCA No. 3, 2005
25. Harrison, L. A; Letendre, L; Kovacivich, P;
Pierson, E. y Weller, D. Purification of an
antibiotic
effective
against
Gaeumannomyces graminis var tritici by
biocontrol agent Pseudomonas aureofaciens.
Soil. Biol. Biochem, 25: p. 215-222, 1993.
26. Gurusiddaiah, S; Gealy, D. R; Kennedy,
A. C y Ogg, A. G. Jr. Isolation and characterization
of
metabolites
from
Pseudomonas fluorescens D7 for control of
downy brome (Bromus tectorum). Weed
Science 42: p.492-501, 1992.
19