DEPARTAMENTO ACADEMICO DE ZOOTECNIA NOMBRE DEL CURSO: VIROLOGIA VETERINARIA

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE ZOOTECNIA
NOMBRE DEL CURSO: VIROLOGIA VETERINARIA
NOMBRE DE LA PROFESORA: M.C. MARÍA DEL ROSARIO SALAZAR LOMELÍ
TEMA X. EL DIAGNÓSTICO VIRAL POR EL LABORATORIO
OBJETIVO: Que el alumno conozca los diferentes métodos diagnostico para la identificación viral.
INTRODUCCION:
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El diagnóstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que se enfrenta la medicina actual, por lo cual se
emplean método serológicos para el dx viral:
Los métodos serológicos, se basan en la detección de la respuesta del hospedero a la infección.
En muchos casos el diagnóstico de infección viral se hace por el cuadro clínico del paciente y la presencia de anticuerpos contra
el agente viral sospechoso; sin embargo, hay algunas técnicas rápidas para demostrar los antígenos virales y también se sabe de
técnicas para amplificar su material genético.
Métodos serológicos utilizados en el laboratorio para reconocer las infecciones por virus se clasifican:
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METODOS SEROLOGICOS DIRECTOS
METODOS SEROLOGICOS INDIRECTOS
Ambos usados para demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de
anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.
A continuación se describen las principales técnicas para diagnóstico viral.
METODOS DIRECTOS: Son los metodos de laboratorio utilizados para evidenciar al virus o algunos de los antígenos virales que se
pueden encontrar presentes en los tejidos o fluidos, mediante las siguientes técnicas de laboratorio
1. Por aislamiento viral y cultivos celulares (El virus como agente infeccioso)
2. Técnicas inmunológicas como: Inmunofluorescencia (IF),prueba de aglutinacion
3. PCR, electroforesis, hibridación del acido nucleico (La presencia de ácidos nucleicos virales)
4. Microscopía electrónica (El virus como partícula viral)
A CONTINUAICON SE DESCRIBEN CADA UNO DE LOS METODOS ANTES MENCIONADOS
1. Por aislamiento viral y cultivos celulares (El virus como agente infeccioso). Procedimiento que permite mantener y reproducir
células in vitro vivas en un medio nutritivo artificial (In Vitro) o en organismos vivos (In vivo)
2. Técnicas inmunológicas como: Inmunofluorescencia (IF), Test de Aglutinación (La presencia de antígenos virales)
Inmunofluorescencia directa (IF): técnica cualitativa, puede ser utilizada para detectar antígenos virales presentes en células
infectadas o para detectar anticuerpos generados contra antígenos virales.
En el primer caso es necesario enfrentar células infectadas a anticuerpos específicos o antisueros generados contra un
determinado virus. En el segundo caso, el suero problema se enfrenta a células infectadas con un virus conocido.
El principio básico de la inmunofluorescencia directa consiste en que las muestras clínicas son recolectadas y colocadas sobre
portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluoresceína
que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior de las células. La reacción
antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.
Esta técnica se sigue para el diagnóstico del virus de influenza, coronavirus, ADV, y CMV
También es útil para confirmar los hallazgos de cultivo viral
Este método es fácilmente aplicable en tejidos que se pueden colocar sobre una placa a manera de huella y a partir de ésta aplicar
la técnica; un ejemplo es el caso de biopsias de cerebro para el diagnóstico de rabia en cerebros de animales
Desventajas de la tecnica:
La realización de la reacción es laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de
fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero, así como una recolección y preparación de la
muestra adecuada.
Prueba de Aglutinación.: Es un método simple, de un solo paso. Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial
de anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos.Luego se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno
y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se
confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecíficas.El test de aglutinación ha sido
usado para detectar antígeno de Rotavirus en heces.
VENTAJAS: técnica rápida y barata.
3. PCR, electroforesis, hibridación del acido nucleico (La presencia de ácidos nucleicos virales)
1.- LA PRESENCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS VIRALES (PCR). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR consiste
en una reacción enzimática mediante la cual se amplifica selectivamente una secuencia específica de ADN en relación a la de otras
secuencias presentes en la misma mezcla de reacción. Mediante el empleo de ésta técnica es posible en pocas horas obtener millones
de copias de la secuencia en estudio a partir de unas pocas de copias dicha secuencia contenidas en una muestra. Estas muestras
pueden provenir de aislamientos en cultivos celulares infectados, así como también de muestras clínicas en donde no se conoce el
titulo viral del cual se parte. Una vez realizada la amplificación de la secuencia a estudiar, este producto es analizado por
electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida y visualizadas las bandas (productos de amplificación), por tinción con bromuro de
etidio en un transiluminador UV, o por tinción con nitrato de plata y posterior revelado.
VENTAJAS DE SU USO: La técnica de PCR ha experimentado un desarrollo y aplicabilidad muy acelerados, gracias a su alta
sensibilidad y a la condición de no requerir agente vivo.
DESVENTAJAS: Su implementación requiere de infraestructura física y personal muy especializados. Diagnostica y caracteriza
la mayor parte de los virus conocidos y se considera una gran herramienta para estudio molecular.
2. ELECTROFORESIS: es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de
separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel,
habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Se pueden detectar algunos virus con genoma segmentado por electroforesis del ácido
nucleico, observando su patrón de migración en geles de agarosa o poliacrilamida. El diagnóstico de rotavirus representa un buen
ejemplo del empleo de esta técnica, dado que su genoma es RNA segmentado, lo que ha permitido desarrollar un método simple y
rápido para su detección en deposiciones, que se usa rutinariamente en diversos laboratorios. En los virus que no tienen un genoma
fragmentado (adenovirus, herpes simplex, citomegalovirus, etc.) pueden usarse enzimas de restricción (endonucleasas) que cortan el
genoma en secuencias específicas, originando varios segmentos que conforman un patrón de movilidad electroforética característico
que permite identificar al virus y sus variantes genéticas.
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Esta técnica se usa extensamente en investigación para estudiar variación antigénica.
3.- HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Esta técnica se basa en la capacidad de las moléculas de ácido nucleico de una hebra
de reconocer, por apareamiento de bases, a hebras de ácido nucleico que poseen secuencias nucleotídicas complementarias.
La detección del híbrido puede realizarse usando sondas de ácidos nucleicos marcadas. Hay sondas radioactivas en que se visualiza la
formación del híbrido mediante una autorradiografía; otras sondas son biotiniladas, detectándose la formación del híbrido mediante una
reacción inmunoquímica.
Otras veces se detectan los híbridos por la diferente velocidad de migración en geles de electroforesis (heteroduplex).
Algunos ensayos se pueden realizar por la técnica de hibridación en filtro, que emplea como soporte un filtro de nitrocelulosa sobre el
cual se realiza la reacción. La hibridación in situ se realiza en un corte de tejido o sobre una monocapa de cultivo celular.
Esta última técnica constituye en la actualidad un buen método de diagnóstico para el virus papiloma.
4. Microscopía electrónica (El virus como partícula viral) Es un método de recuento directo, es decir que los virus pueden medirse en
términos del número total de partículas virales, independientemente de su función como agentes infecciosos.
DESVENTAJA DE SU USO:
Esta técnica no revela las estructuras internas del virus sino su forma y dimensiones, necesita de una alta concentración de viriones
(aproximadamente 109 partículas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible.
Técnica poco utilizada
El uso de equipo especializado y costoso, el elevado nivel técnico que requiere, la baja sensibilidad cuando hay un bajo número de
partículas virales y el hecho de que en algunos casos la morfología no es suficiente para un diagnóstico viral definitivo, hacen que este
sistema sea poco usado y sólo se emplee a nivel investigativo o académico.
METODOS INDIRECTOS
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Son las que se utilizan con más frecuencia porque detectan el agente viral mediante anticuerpos específicos contra el virus
Reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del huésped
Detección de anticuerpos específicos antivirales por técnicas inmunológicas como
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3.
Inhibición de la hemaglutinación (IHA)
Fijacion del complemento
ELISA
1.-Inhibición de la hemoaglutinación (IHA) es una de los métodos indirectos más comunes para cuantificar antígeno virales
hemoaglutinantes en suspensión. Algunos virus poseen proteínas en sus superficies capaces de aglutinar a eritrocitos de ciertas
especies, lo cual al unirse a los receptores en la superficie de los glóbulos rojos de algunas especies, y al unirse a más de un glóbulo
rojo producen la aglutinación fenómeno que se usa en el laboratorio para diagnóstico. En los cultivos infectados con este virus se
encuentran hemaglutininas en el medio de cultivo, o en el caso de los huevos embrionados en el líquido amniótico o alantoideo. Al
colocar esos líquidos en presencia de glóbulos rojos se produce la hemoaglutinación.
Esta técnica se hace en microplacas de plástico en forma manual y demora 3 a 5 horas en dar resultados.
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VENTAJAS DE SU USO: Actualmente se usa principalmente en diagnóstico y caracterización de virus influenza. Los
anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación tienen buena correlación con los neutralizantes en reflejar nivel de inmunidad, y
su medición es más sencilla.
2. FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO. La fijación del complemento por el anticuerpo unido al antigeno hace que se genere un
complejo de ataque de membrana. Si el anticuerpo se une al eritro cito este se destruye y sobreviene la hemolisis. Se realiza cuando un
antígeno se pone en contacto con un anticuerpo específico en presencia de complemento.
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En esta técnica el complejo virus-anticuerpo específico utiliza glóbulos rojos de cordero sensibilizados con hemolisina
(anticuerpo anti-glóbulos rojos de cordero). Si en la reacción se forma el complejo antígeno-anticuerpo, se fija el complemento
que hay en el medio y al agregar los glóbulos rojos sensibilizados no se produce la hemólisis porque no hay complemento libre y
los eritrocitos sedimentan al fondo del tubo o pocillo formando un botón.
En cambio, si no se forma el primer complejo, el complemento queda libre, se une a los glóbulos rojos sensibilizados y los lisa.
DESVENTAJAS: Esta técnica es relativamente compleja, pues usa muchos reactivos, los que deben estar debidamente
estandarizados. Su sensibilidad y especificidad no son muy altas y han sido superadas por otras técnicas. Los anticuerpos
fijadores del complemento duran sólo algunos años después de la infección, de modo que son indicadores de un proceso reciente.
3.- VALORACION INMUNOABSORBENTE LIGADA A ENZIMA (ELISA) es una técnica inmunoenzimática, cuantitativa, se
basan habitualmente en la captura del antígeno viral presente en la muestra clínica (suero problema), al combinarse con el anticuerpo
fijado a una fase sólida conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. La reacción se
revela a través de la acción enzimática de dicha enzima sobre un sustrato, que al combinarse desarrolla una coloración de intensidad
proporcional a la cantidad de antígeno o anticuerpo presente, cuantificable mediante un espectrofotómetro.
VENTAJAS DE SU USO: Por esta técnica se puede procesar gran número de muestras en forma rápida y automatizada, no
requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofotómetros
especialmente diseñados, siendo entonces una técnica más objetiva.
CONCLUSION
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El diagnóstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que se enfrenta la medicina actual, por lo tanto, la
tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de
investigación de ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido.
En muchos casos el diagnóstico de infección viral se hace por el cuadro clínico del paciente y la presencia de anticuerpos contra el
agente viral sospechoso; sin embargo, hay métodos serológicos, para demostrar los antígenos virales y también se sabe de técnicas
para amplificar su material genético, que se basan en la detección de la respuesta del hospedero a la infección, para demostrar los
antígenos virales.
LITERATURA CITADA
Brock, D. 1990. Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Biología de Microorganismos. Prentice Hall. New Jersey. 13: 488-489.
Fettner, A.G., 2004. Disease Causes and Theories of Causation, Virus: Agent of Change McGraw-Hill, New York,USA.
Goldstein, B.G. 2002. Introductory Experiments in Virology William C. Publishers, Dubuque.
Mohanty, S.B. 1991: Virología Veterinaria. Interamericana, Mexico. Pp.89-99
Zinsser E. 1994. Diagnóstico Viral Rápido. Microbiología. 20ed. Editorial Médica Panamericana. 62: 1249-1260.