El gen humano MBNL, implicado en la distrofia miotónica, y su homólogo en la mosca del vinagre Drosophila melanogaster son intercambiables funcionalmente Amparo García López, Carmen Llobell Martínez ([email protected], [email protected]) Departamento de Genética, Universidad de Valencia Tutor: Rubén Artero Allepuz INTRODUCCIÓN La Distrofia Miotónica (DM) es el tipo de distrofia muscular más común en adultos, con una frecuencia de 13.5/100000 nacidos vivos en Occidente, pero no tiene ningún tipo de tratamiento eficaz. Es una enfermedad con una presentación clínica muy variable, pues afecta de un modo u otro a múltiples órganos y sistemas. Síntomas característicos son miotonía (incapacidad para relajar los músculos), debilidad muscular, cataratas y degeneración de la retina, aparición de resistencia a tratamientos con insulina, hipogonadismo, arritmias cardiacas y calvicie frontal en varones entre otras manifestaciones patológicas. Se distinguen a nivel clínico dos tipos: La DM1 (distrofia miotónica clásica, tipo I o de Steinert; OMIM 160900), caracterizada por el inicio distal de la miotonía en las extremidades y DM2/PROMM (distrofia miotónica tipo II; OMIM 602668 /miopatía miotónica proximal; OMIM 600109), con un inicio proximal y una manifestación más ligera de los síntomas que en la DM1. En ambos casos, la mutación sigue una herencia autosómica dominante y de una generación a la siguiente se da el fenómeno de la anticipación genética, es decir, la enfermedad se agrava y los síntomas aparecen más pronto en generaciones sucesivas. La esperanza de 1 vida media para un paciente con la forma adulta de DM1 es de 53 años de edad mientras que esta esperanza de vida es de apenas 35 años para los casos de DM congénita, la forma más grave de la enfermedad. Al estudiar la base genética de la DM se han encontrado mutaciones dinámicas en regiones no codificantes del genoma: una expansión del triplete CTG en la región 3’UTR (región no traducida del transcrito) del gen Proteína Kinasa de la DM (DMPK) para pacientes con DM1 o de la secuencia CCTG en el primer intrón del gen ZNF9 en pacientes con DM2. Para el caso de los tripletes CTG, la población normal es polimórfica dentro de un rango entre 5 y 37 copias. En los pacientes con DM1, sin embargo, se da una expansión enorme, que puede llegar a las 3000 copias. El grado de expansión de los trinucleótidos se correlaciona con la gravedad de la enfermedad y, de hecho, el grado de expansión aumenta en cada generación lo cual proporciona una explicación molecular para la anticipación genética (para una compilación de información clínica y una revisión -hasta el 2001- de la patogénesis molecular de la enfermedad, véase Harper, 2001). Se han propuesto tres hipótesis para explicar cómo esas mutaciones dinámicas en regiones no codificantes de un gen pueden causar la DM. En primer lugar, se propone que puede existir haploinsuficiencia de DMPK debido a la presencia de las expansiones. Se ha observado que las expansiones de tripletes en el gen DMPK conducen a una alteración en la maduración de los transcritos DMPK así como a la retención de estos transcritos en el núcleo. Los knock-outs de DMPK en ratón, sin embargo, sólo manifiestan debilidad muscular leve y conducción cardiaca anormal, pero no miotonía. Se concluye, por tanto, que la falta de proteína DMPK puede contribuir a la patología DM1, pero no es su desencadenante principal. También se ha propuesto que las expansiones del trinucleótido CTG en el gen DMPK podrían alterar la estructura regional de la cromatina (ver Fig.2). De hecho, varios estudios muestran que la expresión de los genes adyacentes a DMPK en el genoma, DMWD y SIX5, está reducida en pacientes con DM1 (Frisch y col. 2001). El cierre local de la cromatina alrededor del gen DMPK podría explicar bien la presencia de cataratas e hipogonadismo en pacientes con DM1. El knock-out en ratón de SIX5 provoca cataratas en los ratones mientras que el homólogo en Drosophila de esta proteína, Dsix4, conduce a hipogonadismo en los mutantes nulos para este gen. Finalmente, la hipótesis de la 2 dominancia del RNA (ver Fig.2) propone que las repeticiones CUG en el RNA de DMPK interaccionan con proteínas de unión al RNA de tal modo que su secuestro en las expansiones bloquea su función normal. Un apoyo decisivo para esta hipótesis procede del trabajo de Mankodi y col. (2000) los cuales, expresando una expansión de trinucleótidos CUG en un mRNA heterólogo (gen de la actina de músculo) en ratones transgénicos consiguen que éstos animales desarrollen miotonía y miopatía musculares. Por tanto, los transcritos con repeticiones CUG son suficiente para producir un fenotipo similar a DM1 independientemente del gen DMPK. Aunque la DM1 se debe, probablemente, a una combinación de todas las hipótesis presentadas arriba, existe cierto consenso en que el origen de la característica más definitoria de la DM1, la miotonía, se explica mejor con el modelo de la dominancia del RNA. De hecho, se han aislado varias proteínas en virtud de su capacidad para unir específicamente repeticiones CUG de doble cadena, entre ellas, la proteína humana de la familia Muscleblind (Mbl) denominada MBNL (Fig.1). Se ha demostrado que esta proteína se une a las repeticiones CUG a partir de un umbral de unas 50 repeticiones, probablemente debido a un cambio conformacional en estas repeticiones que pasan de disponerse preferentemente como RNA de cadena sencilla a RNA de doble cadena. La unión de la proteína MBNL a los trinucleótidos CUG es directa y además específica de secuencia, de modo que una proteína recombinante, por sí sola, es capaz de unir un RNA que contiene repeticiones CUG. Este resultado descarta que exista una proteína adicional que actúe como puente en esta unión. La interacción ocurre también in vivo, y tanto la proteína nuclear MBNL como sus parálogos MBLL y MBXL colocalizan con inclusiones nucleares de repeticiones CUG. Resultados muy similares se obtienen con las expansiones CCUG, responsables de la DM2. Estas observaciones sugieren, pues, que el secuestro de esta familia de proteínas Mbl es una de las rutas principales de patogénesis de ambas enfermedades (Miller y col. 2000; Fardaei y col. 2002). Un apoyo adicional a esta hipótesis es la regulación de la expresión de estas proteínas durante la diferenciación de los mioblastos en mamíferos. Mientras la expresión de la proteína MBNL se activa en los mioblastos cuando éstos entran en diferenciación (Miller y col. 2000), la expresión de MBXL se inhibe y su expresión constitutiva consigue inhibir marcadores de diferenciación terminal como la 3 miosina sarcomérica (Squillace y col. 2002). Estos datos son congruentes con una función de estas proteínas durante la miogénesis. Además, el homólogo de estas proteínas en Drosophila, la proteína fundadora de la familia, Muscleblind, tiene una localización nuclear y se activa durante la miogénesis. La expresión de Mbl depende del regulador miogénico general Dmef2 y se ha implicado en la diferenciación terminal de la musculatura (Artero y col. 1998). Figura 1. La proteína MBNL humana se une específicamente a las repeticiones (CUG) expandidas. A la izquierda se representa que las repeticiones mayores de 20 copias se pliegan espontáneamente en horquillas de RNA de doble cadena mientras que las repeticiones de menos de 10 copias son principalmente de cadena sencilla. A la derecha se muestra un gel con el resultado de un ensayo de entrecruzamiento con luz ultravioleta (“UV croslinking”) en el que se demuestra que la proteína MBNL (marcada como EXP) se une a la secuencia CUG y que esta unión es proporcional al número de repeticiones CUG (corchete). Recientemente se ha empezado a aclarar la base molecular de algunos de los síntomas de la enfermedad DM1 siendo en todos los casos el común denominador una alteración en la maduración alternativa de genes específicos (Fig.2). La miotonía parece tener su origen en la maduración anormal del transcrito que codifica para un canal de cloro específico de músculo (Charlet-B y col. 2002; Mankodi y col. 2002). Una maduración alterada, desviada hacia una variante poco señalizadora, explica la resistencia a insulina que presentan los pacientes con DM1 (Savkur y col. 2001). Otras alteraciones en la maduración de genes específicos son las que afectan a los genes de la Troponina T cardiaca (Philips y col. 1998), y del gen relacionado con la Miotubularina (MTMR1; Buj-Bello y col. 2002). Para la maduración del canal de cloro, la Troponina T Cardiaca y receptor de la insulina se ha demostrado que la alteración en la 4 maduración es debida a un aumento de la actividad del factor de maduración CUG-BP. La relación causal entre el secuestro de Mbl por las expansiones y la alteración en la actividad de CUG-BP, sin embargo, no se ha aclarado. Figura 2. Modelo de la base (CTG)n DMWD DMPK DMPK la Distrofia Miotónica. Las flechas CUG-BP AAA Muscleblind molecular de algunos síntomas de SIX5 ClC-1 IR cTNT tau MTMR1 curvas indican el efecto inhibidor de Miotonía Resistencia a insulina Problemas cardíacos ¿? las expansiones CTG en el locus Retraso mental ¿? ? DMPK sobre la expresión de los genes cercanos. Las proteínas Mbl se unen a expansiones CUG quedando aberrantemente secuestradas de su función normal. Como consecuencia de la presencia de las expansiones, se produce un incremento en la concentración de la proteína CUG-BP, un factor de maduración de los transcritos, que provoca una serie de alteraciones en el procesado de ciertos mensajeros, entre ellos un canal de cloro específico de músculo y un receptor de insulina. La proteína Mbl fue identificada y caracterizada molecular y genéticamente por dos equipos (Artero, 1995; Begemann y col. 1997; Artero y col. 1998). Los embriones mutantes homocigotos para este gen mueren en el último estadio embrionario no llegando a eclosionar del huevo en forma de larva (ver Fig.3). Los mutantes mbl presentan un fenotipo en el que algunas características de la diferenciación terminal de la musculatura están afectadas, como son la estructura de los sarcómeros y los anclajes de los músculos a la epidermis de la larva. Los músculos de los embriones mutantes para mbl presentan características ultraestructurales de hipercontracción y desorganización de las bandas Z en los sarcómeros, un defecto también encontrado en pacientes con DM (Ludatscher y col. 1978). El defecto homólogo a la ausencia de matriz extracelular en los lugares de anclaje de los músculos a la epidermis podría estar relacionado con la flexión permanente de las articulaciones (artrogriposis) que se da en casos congénitos de DM1. Por otra parte, los clones mutantes mbl en ojo de moscas 5 adultas muestran defectos en la diferenciación terminal de los fotorreceptores. Estos fotorreceptores no diferencian la estructura captadora de luz denominada rabdómero donde se acumulan las rodopsinas. De modo semejante, se han descrito pacientes de DM1 con pérdidas de fotorreceptores y degeneración de la retina (Harper, 2001). Así pues, se encuentra una correlación directa entre el fenotipo de los mutantes mbl en Drosophila y los síntomas de los pacientes con DM1. Esto apoya la hipótesis de que la ruta de patogénesis en este último caso sea un secuestro aberrante de MBNL, y probablemente de sus parálogos MBLL y MBXL, lo cual les impide realizar su función normalmente. Debe tenerse en cuenta en estas comparaciones, además, que el mutante mbl en Drosophila es completamente nulo para esta función mientras que en los pacientes con DM1 adultos el secuestro de estas proteínas es probablemente incompleto. ♀ ♂ embrión mutantes mbl pupa Larva de er 1 estadio prepupa Larva de o 2 estadio Larva de 3er estadio Figura 3. Ciclo de vida de Drosophila. Las mutaciones en el gen mbl son recesivas y letales en homocigosis. La letalidad se produce en las últimas fases del estadio embrionario de manera que no nacen larvas mutantes para este gen (X). El análisis de la unidad de transcripción mbl en Drosophila revela una organización genómica compleja, con varios exones distribuidos sobre unas 150 kb de DNA genómico y separados en ocasiones por intrones de hasta 80 kb (Fig.4). El transcrito mbl primario sigue un patrón de maduración complejo, dando lugar al menos a cuatro mRNAs por procesado alternativo. Estos cuatro mRNAs, denominados mblA, mblB, mblC y mblD comparten la secuencia 5´-UTR y los primeros dos exones (incluyendo el ATG y el extremo N-terminal de las proteínas codificadas) pero se diferencian en sus porciones 3´ dando lugar a cuatro ORFs de diferentes longitudes y extremos C-terminales. Aunque se desconoce la expresión específica de tejido de cada 6 una de estas isoformas proteicas, si que se han producido anticuerpos que reconocen la región común a todas ellas mostrando que la proteína Mbl se expresa en toda la musculatura somática del embrión así como en el sistema nervioso central (SNC) (ver Fig.5). Existen distintas inserciones de elementos P en el locus mbl que han servido para generar mutantes nulos de este gen (ver Fig.4). Una de estas mutaciones nulas, el alelo mblE27 consiste en una pequeña deleción que elimina completamente el primer y segundo exón del locus mbl (Fig.4). Figura 4. Locus genómico de mbl. La línea horizontal representa, en el extremo superior, el DNA genómico con la distancia expresada en kilobases. En la parte superior se representan dos tipos de elementos genéticos, por una parte inserciones de elementos P (triángulos) y por otra, una deleción generada por escisión imprecisa del elemento P 55/7 (deleción E27 cuya extensión se representa con barras horizontales). En la parte inferior se representa la estructura exón-intrón del locus mbl con los cuatro transcritos primarios generados mediante procesado alternativo del transcrito primario. Figura 5. Patrón de expresión de la proteína Mbl. Tinción de embriones silvestres en distintos estadios de desarrollo con anticuerpo anti-Mbl. La proteína Mbl es nuclear y se expresa en grandes cantidades en los últimos estadios del desarrollo embrionario (11-16). Para cada una de las fotografías se indica el estadio embrionario 7 y los tejidos teñidos. (A) estadio 11, mesodermo cefálico (flecha) y suave señal en el resto del mesodermo. (B,C) estadio 13, mesodermo visceral (flecha) y somática (flecha curva). (D) estadio 15, mesodermo somático y visceral y SNC. (E) estadio 16, no hay expresión en el corazón (flecha). (F) estadio 16, visión lateral. (G) estadio 16, sistema nervioso central. (H) estadio 16, musculatura faríngea (asterisco) y el órgano de Bolwig (flecha). (I) detalle que muestra la expresión en Mbl en núcleos celulares individuales. Figura tomada de Artero et al (1998). El análisis de las secuencias de la proteína humana y de Drosophila revela una homología estructural clara (ver Fig.6). La proteína Mbl contiene dos copias de un dedo de zinc del tipo Cys3His con un espaciado típico de CX7CX6CX3H mientras que todas las isoformas de la proteína humana, incluida KIAA0248, contiene cuatro copias de dicho motivo. El origen de los dos últimos dedos de zinc de la proteína humana parece ser debido a una duplicación de los dos primeros. Este tipo de dedos de zinc se encuentra también en las proteínas TTP de ratón y PIE-1 en C. elegans. En ambos casos se ha demostrado que estas proteínas utilizan estos motivos proteicos para unirse a transcritos específicos y controlar su estabilidad. La conservación estructural de los dedos de zinc entre estos y otros miembros de esta familia proteica indica que Mbl puede tener una función molecular relacionada con la estabilidad de transcritos específicos y que esta función depende de la unión de Mbl a secuencias específicas semejantes a las ya descritas para otros miembros de la familia. Figura 6. MBNL y Mbl son homólogo s estructura les. Análisis de la secuencia primaria de las proteínas Muscleblind. La proteína humana parece ser el resultado de una duplicación de la proteína completa de la 8 mosca. La primera pareja de dedos de Zinc en la proteína humana tiene un 66% de aminoácidos idénticos a los de la mosca mientras que la segunda pareja tiene una identidad del 50%. Las proteínas son mas divergentes en secuencia en su región Cterminal, sin embargo, ambas se caracterizan por poseer regiones altamente hidrofóbicas. ZF, motivo Zinc-finger; A, región rica en alaninas; TM región predicha transmembrana; F, región rica en Fenilalaninas; CK2 y PKC, sitios de fosforilación para los enzimas caseína kinasa 2 y proteína kinasa C respectivamente. Las limitaciones éticas que impone la experimentación en humanos hacen necesario el uso de organismos modelo en los que estudiar enfermedades tales como la Distrofia Miotónica. Estos organismos modelo han de combinar la facilidad de manipulación con la relevancia de los descubrimientos que se realicen en ellos. Drosophila combina idealmente bien ambos criterios ya que posee un ciclo de vida corto (12 días, ver Fig.3) y produce gran cantidad de descendencia. Además, por ser el organismo modelo objeto de estudio de Genétistas durante mas de 70 años se han desarrollado una amplia variedad técnicas y herramientas de estudio que ofrecen enormes ventajas para la experimentación. Drosophila también posee un genoma que es una versión simplificada del genoma humano lo que se traduce en una menor redundancia genética. Así, por ejemplo, existen 3 genes mbl humanos y solo uno en Drosophila. Estas ventajas experimentales no impiden que los descubrimientos en Drosophila sean relevantes en biomedicina. Todas las rutas de señalización importantes están conservadas entre Drosophila y humanos y también lo están muchos procesos biológicos que van desde el aprendizaje al sueño. En nuestro caso, para demostrar que Drosophila es un modelo adecuado para estudiar la ruta de patogénesis de la DM, decidimos evaluar el grado de conservación funcional entre Mbl y sus homólogos estructurales humanos. Si la proteína humana es capaz de sustituir a la de insecto en algunas o todas las funciones podemos concluir que ambas proteínas están ejerciendo un papel molecular equivalente y nuestros descubrimientos en Drosophila serán extrapolables a humanos. El test más estricto para demostrar dicha conservación funcional consiste en la sustitución del gen de la mosca por el gen humano comprobando que se produce una recuperación en el fenotipo mutante para mbl (ver Fig.7) 9 normal mutante mutante Figura MBNL 7. Estrategia experimento de para un de un rescate fenotipo mutante. Las mutaciones en el locus mbl han sido descritas como recesivas y letales en estadio embrionario tardío de manera que los embriones mutantes mbl no llegan a eclosionar del huevo en forma de larva (columna central). Para comprobar el grado en el que la proteína humana MBNL puede funcionar in vivo en Drosophila, nos servimos de técnicas genéticas para expresar artificialmente este gen en embriones mutantes para el locus mbl (columna derecha, producto del gen MBNL representado en verde). Si la proteína humana es funcional veremos que hay rescate, esto es, una mejoría en el fenotipo mutante (columna izquierda, el rescate se representa por la llegada hasta el estadio de larva), si no es funcional en absoluto, no veremos ningun cambio (no representado). OBJETIVOS Un primer objetivo del trabajo de investigación que aquí se presenta es demostrar que el gen mbl de Drosophila y el gen MBNL humano, son también homólogos funcionales, es decir, a pesar de ser tan distantes evolutivamente, ambas proteínas son intercambiables de manera que, en ausencia de una de ellas, la otra puede sustituirle en su función. La confirmación de la homología funcional entre la proteína de la mosca y la humana abriría un abanico de posibilidades para el estudio de la Distrofia miotónica, ya que demostraría que la información molecular y genética que se obtenga a partir de los estudios de mbl en la mosca podrían ser directamente exportables a humanos. Hay que destacar una vez más, el hecho de que en la mosca exista una sola copia del gen muscleblind y no tres, como en humanos, simplificando la obtención y el análisis de los resultados tanto genéticos como bioquímicos. 10 En segundo lugar, nos proponemos averiguar la causa primaria de la letalidad de los mutantes mbl, es decir, identificaremos en qué tejido la falta de función de mbl es responsable de la muerte de los mutantes ya que, la expresión del gen humano dirigida exclusivamente hacia ese tejido será capaz de rescatar el fenotipo mientras que la expresión exclusiva en otros tejidos no lo hará. Por ejemplo, si la expresión de la proteína MBNL en el músculo es capaz de rescatar el fenotipo pero no lo hace la expresión en el SNC podemos concluir que mbl es requerido en el tejido muscular para la supervivencia hasta el estadio de larva. METODOLOGÍA 1. SISTEMA GAL4/UAS El sistema GAL4/UAS (Brand y Perrimon, 1993; ver Fig. 8) permite dirigir la expresión de una proteína de interés bajo un patrón de expresión deseado. Este sistema hace uso del factor de transcripción de levadura GAL4 y de su unión a las secuencias reguladoras llamadas UAS de manera que, por un lado, se construye una línea de moscas transgénicas que contenga en su genoma una construcción donde la región codificante de la proteína GAL4 este bajo el control de las regiones reguladoras de interés (Enhancer Z) y que reciben el nombre de drivers. Por otro lado, se construye otra línea de moscas que contengan en su genoma una construcción donde la región codificante del gen de interés (gen X) quede bajo el control de las secuencias reguladoras de la transcripción UAS. Al cruzar estas dos líneas de moscas se obtienen descendientes que contienen ambas construcciones (GAL4 y UAS) de manera que, el enhancer Z dirigirá la expresión de la proteína GAL4 según su propio patrón y esta proteína GAL4 se unirá a las secuencias reguladoras UAS que dirigirán a su vez la expresión del gen X. De esta forma, lo que finalmente conseguimos es que el gen X se exprese bajo el control del enhancer Z. Nótese que debido a la natulareza binaria del sistema (línea UAS y línea GAL) la expresión de un mismo gen de interés puede ser 11 dirigida a distintas tejidos sin necesidad de generar nuevas moscas por transformación de la línea germinal Línea GAL4 Línea UAS Figura 8. Sistema de expresión dirigida GAL4/UAS. La línea GAL4 expresa constitutivamente la proteína GAL4 bajo el patrón de expresión de la región GAL4 enhancer Z GAL4 Expresión específica de tejido de Gal4 UAS gen X Activación transcripcional del gen X reguladora elegida. La línea UAS solo expresará el gen X cuando exista proteína GAL4 en la célula y esto solo ocurrirá en la descendencia resultante del cruce entre ambas líneas de moscas. 2. CRUCES GENÉTICOS Para comprobar si MBNL es el homólogo funcional del gen muscleblind haremos uso del sistema GAL4/UAS. Necesitamos disponer, por un lado, de una cepa de moscas que contenga una construcción UAS con el gen humano a testar, en nuestro caso el de la isoforma kiaa0428 del gen MBNL (línea UAS). Esta construcción incluye como marcador fenotípico para identificar a los transformantes una copia silvestre del gen white (w+). Por cruces genéticos se hace homocigota en un fondo genético mutante mbl en heterocigosis (stock 3, Fig. 9). Por otro lado, necesitamos una cepa de moscas que contenga una construcción GAL4 con el promotor adecuado (línea GAL4). En nuestro caso nos decidimos por una línea Gal4 que sigue el patrón de expresión del gen Dmef2 debido a que este gen se expresa en toda la musculatura del embrión solapando su expresión con la de mbl. Esta línea también está marcada fenotípicamente con w+ , y de igual manera, la haremos homocigota en un fondo genético mutante mbl en heterocigosis (stock 4 Fig. 9) 12 Al cruzar estas dos cepas de moscas se van a generar, entre otros, embriones mutantes mbl homocigotos en los que ocurre expresión del gen humano MBNL en el sistema muscular. En caso de que ocurra rescate, una posibilidad es que los embriones mutantes lleguen a nacer como larvas de primer estadio. Necesitamos pues, un marcador fenotípico en estadio larvario que nos permita identificar a estos embriones mbl homocigotos que superan el estadio embrionario y que emergen del huevo. Si partimos de cepas con un fondo genético yellow – white y con la mutación mbl equilibrada con un cromosoma CyO que contenga una copia salvaje del gen yellow (CyO - y+), conseguimos dicho sistema ya que, la mutación yellow, que en adultos genera un fenotipo característico de cuerpo amarillo, puede visualizarse en las mandíbulas y dentículos de las larvas, de manera que, solo las larvas con dos copias mutantes de mbl (y que por tanto no tienen el cromosoma equilibrador marcado con y+ ) tendrán las mandíbulas amarillas (ver Fig. 9). Figura 9. Esquema de trabajo para la obtención de las cepas para el experimento de rescate fenotípico Los cromosomas quedan separados por puntos y comas (;) y por líneas verticales cuando se indica el genotipo de la descendencia (½). El cromosoma Y se indica mediante el símbolo ( p ) . Cuando los dos cromosomas están en homocigosis solo se escribe una copia. El símbolo (+) indica la versión silvestre del cromosoma al que se opone. Las cruces (X) representan el cruzamiento entre machos y hembras de las dos cepas implicadas. Las flechas verticales (â) indican la descendencia de dicho cruce y las flechas curvas (Q) un cruce entre los machos y las hembras seleccionados que queda indicado por el globo sombreado en verde. Las hembras vírgenes son indicadas como ( ). Para facilitar el seguimiento de la estrategia empleada en el diseño de los cruces indicamos a continuación las características fenotípicas de los marcadores génicos utilizados y su tipo de herencia. Para todos ellos hemos seguido las indicaciones de nomenclatura recomendadas en la base de datos Flybase (http://www.flybase.org) : y (yellow), mutación recesiva cuerpo amarillo; w (white), mutación recesiva ojos blancos; Gla (Glazed), mutación dominante ojos cristalinos; mblE27 (muscleblind), alelo recesivo de muscleblind; wgsp1 (wingless), alelo dominante quetas axila; Ki (kinked), mutación dominante quetas ángulo recto; Sb (Stubble), 13 mutación dominante quetas cortas; ryrk (rosy), mutación dominante ojos rosa fuerte; CyO, cromosoma equilibrador con mutación dominante alas curvas (Cy); TM3, cromosoma balanceador con mutación dominante quetas cortas (Sb); UAS – MBNLkiaa , construcción UAS con el cDNA Kiaa de MBNLkiaa ; twi - Gal4, construcción Gal4 con el enhancer del gen twist ; Dmef2 - Gal4, construcción Gal4 con el enhancer del gen Dmef2. Construcción de la línea UAS-MBNLkiaa para el rescate En el laboratorio partíamos de una cepa muscleblind balanceada con CyO en un fondo mutante white. El primer paso era, pues, obtener una cepa muscleblind equilibrada con un cromosoma CyO que contuviese una copia silvestre del gen yellow (y+) y que estuviera en un fondo mutante yellow – white [stock 1]. Por otro lado, teníamos una línea UAS-MBNLkiaa localizada en el cromosoma 3 del genoma. Esta línea fue generada mediante transformación de la línea germinal (Sprandling, 1982) en un fondo white y estaba equilibrada con el cromosoma TM3. En este caso debíamos hacer dos cosas, conseguir introducir el cromosoma UASMBNLkiaa en un fondo yellow-white y marcar el cromosoma 2 equilibrando una mutación dominante con un cromosoma CyO - y+ [stock 2]. De este modo, el cruce entre hembras del stock 1 y machos del stock 2 nos permite obtener moscas que contienen la construcción UAS-MBNLkiaa en heterocigosis, en el fondo yellow-white adecuado y con una copia de mbl mutada frente al cromosoma equilibrador CyO - y+. Por autocruzamiento entre estos machos y hembras podemos establecer una línea UASMBNLkiaa homocigota [stock 3] Construcción de la línea Dmef2-GAL4 para el rescate Partíamos de una línea con dos construcciones GAL4 diferentes aunque sólo una de ellas nos interesaba. El cromosoma 2 contenía twi-GAL4 y el cromosoma 3, Dmef2GAL4, la de nuestro interés, todo ello en un fondo genético yellow-white. Disponíamos de una línea doblemente marcada con dos mutaciones dominantes y equilibrada en los 14 cromosomas 2 y 3 que utilizamos para poner las construcciones GAL4 sobre mutaciones dominantes de modo que pudiéramos seleccionar Dmef2-GAL4 y perder twi-GAL4. Por autocruzamiento de estos machos y hembras conseguimos establecer una línea Dmef2-GAL4 homocigota [stock 4] 3. EXPERIMENTO DE RESCATE Para llevar a cabo el experimento de rescate procedimos a realizar el cruce entre hembras vírgenes del stock 3 y machos del stock 4 de la siguiente manera (ver Fig.10). Aproximadamente 40 hembras vírgenes y 20 machos fueron puestos en un sistema de recogida de huevos. Tras un periodo de habituamiento de 24 horas se procedió a un cambio de placa cada 20 horas aproximadamente. Los huevos de cada placa retirada (de edad comprendida entre 0 y 20 horas) eran dispuestos en una nueva placa en pequeños grupos de entre 4-6 huevos para facilitar posteriormente el contaje. Pasadas aproximadamente 24 horas desde que una placa había sido puesta se empezó el contaje de las larvas nacidas (larvas primer estadio) clasificándolas como normales si poseían mandíbulas negras (fenotipo silvestre) o como rescatadas si poseían mandíbulas amarillas (fenotipo yellow). El número de larvas emergidas se anotó diariamente. Las larvas silvestres se sacan de la placa y se sacrifican y las rescatadas se pasan a una placa nueva para hacer un seguimiento del periodo de supervivencia. Figura 10. Procedimiento del experimento de rescate. El sistema de recogida de huevos consiste en un recipiente al que se acopla una placa con un medio sobre el que las moscas tienen preferencia para depositar los huevos. La placa pueden ser retirada tras una ventana de tiempo determinada, en nuestro caso, 20 horas 15 aproximadamente, de manera que bajo el microscopio puede hacerse un seguimiento del desarrollo de los huevos hasta su eclosión como larvas de primer estadio. Se van contando las larvas nacidas de mandíbulas negras y amarillas, estas últimas son trasladadas a una nueva placa donde se hace un seguimiento del número de horas que sobreviven. 4. PREPARACIONES DE CUTíCULA Para evaluar el abdomen contraído de los mutantes mblE27 y de los embriones rescatados se hicieron preparaciones de cutícula siguiendo protocolos estándar (ver Stern y Sucena, 2000) RESULTADOS Los stocks 3 y 4 descritos en el apartado de metodología fueron cruzados para generar embriones mutantes homocigotos mblE27 que al mismo tiempo expresan la proteína humana MBNL con un patrón general de musculatura (Dmef2). Con el fin de evaluar el grado de rescate de estos embriones, decidimos centrarnos en dos criterios: a) la viabilidad de los embriones, y en concreto, el % de embriones que superaban la letalidad embrionaria típica de mblE27 y b) la mejora en un carácter morfológico; el abdomen característicamente contraído de estos mutantes. La expresión de MBNL en la musculatura de embriones homocigotos mblE27 mejora notablemente su viabilidad La mutación mblE27 ha sido descrita como letal en fase embrionaria tardía (ver material suplementario, video 1 y 2). Nuestro primer experimento se dirigió a confirmar estas observaciones y ha establecer el porcentaje de mutantes mbl que superaban la letalidad en la fase embrionaria según nuestras condiciones experimentales. En un primer estudio piloto en el que se contaron un total de 238 larvas nacidas se obtuvo un porcentaje sobre el número de larvas mutantes esperadas (mblE27/mblE27) del 1.3%. En un segundo experimento control se analizaron 543 larvas y se obtuvo un porcentaje del 16 1.4%. En paralelo a estos dos experimentos control se realizaron sendos experimentos para determinar el porcentaje de larvas mutantes rescatadas con el gen humano (genotipo mblE27/mblE27; Dmef2-Gal4>UAS-MBNL). En el experimento piloto (experimento 1) se contaron un total de 74 larvas de primer estadio de las cuales 67 eran normales (mandíbulas oscuras) y 7 rescatadas (mandíbulas amarillas). Esto supone un 10% de larvas rescatadas sobre el total de larvas nacidas. Expresando este porcentaje sobre el número de larvas mutantes esperadas (33%, ver descendencia del cruce de rescate, Fig.9) el porcentaje es del 29.0% (ver grafico 1). Se realizó un segundo experimento (experimento 2) de rescate en el que se contaron un total de 730 larvas nacidas, de las cuales, 618 eran normales y 112 rescatadas. El porcentaje de larvas mutantes rescatadas expresado sobre el número de larvas mutantes esperadas fue sensiblemente superior, el 46.5% (ver material suplementario, video 3). Material suplementario. A) Video 1. Larva silvestre de primer estadio. Obsérvese el color oscuro de las mandíbulas (3 puntos en la parte anterior de la larva). B) Video 2. Embrión mutante homocigoto para mbl en el último estadio embrionario. A menudo se puede observar a estos embriones realizando movimientos para salir del huevo, sin embargo, estos movimientos son menos enérgicos y frecuentes de lo habitual y los mutante mbl mueren antes de conseguir eclosionar. C) Video 3. Larva mbl rescatada de primer estadio. Estas larvas presentan por lo general cierta dificultad para moverse sin embargo, gracias al aporte de proteína Mbl humana, consiguen sobrevivir más de 20 horas. Obsérvese el color amarillento de las mandíbulas. Las larvas rescatadas fueron mantenidas en placas con comida para evaluar su grado de rescate. En todos los casos, estas larvas mostraron una supervivencia de hasta un día (12-24), pero no se observó ninguna muda a larva de segundo estadio probablemente porque no se recuperó totalmente la funcionalidad de los músculos que ayudan a la larva a alimentarse o mudar o, probablemente, debido a un requerimiento de mbl en el SNC donde también se expresa. 17 La interpretación de estos datos demuestra que MBNL puede sustituir, al menos parcialmente, a mbl en su función, ya que el porcentaje de larvas mbl homocigotas nacidas se incrementa significativamente cuando les aportamos MBNL. Por otra parte, estos resultados indican que no existe una segunda mutación responsable de la letalidad embrionaria en la línea mblE27 empleada, esto es, que no existe otra mutación letal embrionaria sobre el mismo cromosoma que la mutación mblE27, ya que si la hubiera aunque la función de mbl fuera rescatada por la proteína humana, esta segunda mutación impediría el nacimiento de los embriones. Gráfico 1. Datos del rescate del fenotipo muscleblind por el gen humano MBNL. Se representa el porcentaje de larvas mutantes rescatadas cuyo genotipo se indica como y w; mblE27/mblE27; UAS- MBNL/Dmef2-Gal4 sobre el número de larvas mutantes esperadas. También se representa un control (mblE27/mblE27) que consiste en un contaje en paralelo del número de larvas emergidas en la misma cepa mutante para mbl sin ningún aporte de proteína MBNL exógeno. En los embriones mutantes mblE27rescatados se reduce una contracción del abdomen característica La cutícula de los embriones de Drosophila diferencia un patrón de bandas ventrales de unas estructuras quitinosas llamadas dentículos. Estos dentículos nos sirven como marcadores morfológicos del grado de contracción del abdomen, lo que, a su vez, resulta un indicador del grado de contracción de la musculatura subyacente. Se ha 18 descrito que los mutantes mblE27/ mblE27presentan un fenotipo de abdomen contraído. Con el fin de encontrar evidencias morfológicas del rescate producido por el gen humano se hicieron preparaciones de cutícula de embriones en el último estadio del desarrollo (ver métodos). La comparación entre los embriones mutantes mblE27y los embriones mutantes rescatados ( y,w; mblE27/ mblE27: UAS-MBNL/Dmef2-Gal4) muestra que, efectivamente, los embriones rescatados presentan un abdomen menos contraído que el del mutante no rescatado (ver Fig.11). Figura A B C Preparaciones mblE27; UAS-MBNLkiaa<Dmef2-GAL4 11. de cutícula. (A) visión ventral de un embrión silvestre, (B) visión ventral de un embrión mutante mbl, se observa un abdomen contraído que hace que la separación entre los dentículos (regiones oscuras) se acorten, (C) visión ventro-lateral de un embrión mutante mbl rescatado con el gen humano, se observa un abdomen menos contraído que en el mutante mbl de manera que se parece más al embrión silvestre. En su conjunto, los resultados obtenidos permiten concluir que se ha demostrado que la proteína humana y su homólogo en la mosca son homólogos funcionales y, por tanto, las observaciones y estudios en Drosophila son relevantes y extrapolables a la función de MBNL en humanos. El hecho de que Dmef2, el driver elegido para dirigir la expresión del gen humano, sólo se exprese en el sistema muscular indica que la causa primaria de la letalidad embrionaria de los mutantes mbl esta en el defecto muscular ya que cuando la función de mbl en el músculo es rescatada (en este caso por la proteína humana) desaparece la letalidad en ese estadio. Nótese que, aunque mbl se expresa también en el SNC (ver Fig.8), nuestros resultados demuestran que mbl no es requerido en este tejido para la viabilidad de la larva de primer estadio. 19 DISCUSION En este proyecto nos planteamos el uso de Drosophila como organismo modelo para el estudio de la Distrofia miotónica. Como una primera aproximación para establecer la validez de Drosophila en estos estudios nos propusimos demostrar que la proteína humana MBNL y la proteína Mbl de Drosophila eran homólogas funcionalmente y por tanto intercambiables in vivo. Para ello utilizamos el sistema UAS/GAL4 que nos permitió expresar la isoforma proteica MBNLkiaa en moscas mutantes muscleblind. De esta manera, si la proteína humana era capaz de hacer la función de la proteína Mbl, los mutantes para esta proteína, que normalmente mueren en estadio embrionario, serian capaces de proseguir su desarrollo hasta larvas. Así pues dirigimos la expresión de la isoforma proteica MBNLkiaa a toda la musculatura somática (Dmef2-MBNLkiaa). Los resultados obtenidos en los experimentos de rescate muestran un aumento significativo del número de embriones mutantes muscleblind que llegan a larva de primer estadio cuando se les aporta proteína humana MBNL exógena. Además, utilizando un criterio independiente para medir el rescate comprobamos una reducción en el fenotipo de abdomen contraído. En su conjunto, estos datos demuestran la homología funcional entre estas dos proteínas. Aunque en nuestros experimentos encontramos un rescate de la letalidad embrionaria este rescate es parcial en cuanto a la "cantidad" del rescate, esto es, el porcentaje de individuos rescatados no llega al 100%. En cuanto a la "calidad" del rescate, ya que los embriones rescatados no son capaces de completar el ciclo de vida. Este rescate parcial, en sus dos variantes, puede deberse a varias causas. En primer lugar hay que tener en cuenta que cada gen posee un patrón espacio-temporal de expresión, es decir, cada gen se expresa de forma natural, en unos tejidos y en un momento del desarrollo determinados y no en otros. Este patrón de expresión viene determinado para cada gen, principalmente, por las regiones reguladoras de la transcripción. En los experimentos de rescate la situación ideal sería expresar el gen humano con el patrón endógeno exacto y observar entonces el grado de rescate. Sin embargo, no siempre se conocen las regiones reguladoras de un gen, como en el caso de mbl, por esta razón, en 20 nuestro experimento hemos tenido que utilizar las regiones reguladoras del gen Dmef2 que dirige la expresión a toda la musculatura. Por tanto, en nuestro experimento no esperábamos un rescate total del fenotipo de las moscas mutantes mbl puesto que no se ha podido reproducir el patrón espacio-temporal de expresión. Por otro lado, también hay que tener en cuenta que, como se ha comentado anteriormente (ver introducción), existen distintas isoformas proteicas para Mbl . Estas isoformas podrían tener funciones específicas en determinados tejidos y estar sujetas cada una de ellas a un patrón espacio-temporal de expresión ligeramente diferente. Los tres genes humanos de muscleblind también presentan un completo procesado alternativo de manera que podría existir alguna conservación funcional especifica de isoforma entre las proteínas humanas y de Drosophila. En este experimento de rescate se ha trabajado con uno de los genes humanos, MBNL y en concreto con una de sus cinco isoformas, KIAA2048 de manera que podría estar siendo expresada en lugares y momentos del desarrollo donde su isoforma homóloga no lo hace. Además y en cualquier caso, faltaría en esos embriones la función específica desarrollada por el resto de isoformas. Por último, también hay que tener en consideración que podrían existir aspectos de la función mbl que son propios de la proteína de la mosca de manera que la humana no puede sustituirla. Si esto ocurriese tampoco podríamos conseguir un rescate total del fenotipo mutante mbl. Algunas de las razones por las que ocurre este rescate parcial se pueden comprobar experimentalmente y para ello nos planteamos una serie de experimentos futuros. Actualmente estamos realizando los cruces genéticos necesarios para realizar experimentos de rescate dirigiendo la expresión de la proteína humana a otros tejidos (elav-GAL4, expresión en el SNC; da-GAL4, expresión general en todo el embrión). De este modo, podremos determinar en qué tejidos se conserva la función de las dos proteínas y en cuales no. Además, nos proponemos realizar experimentos similares de rescate pero utilizando los otros genes humanos homólogos a mbl (MBLL y MBXL) ya que, aunque la conservación estructural es ligeramente inferior, podríamos obtener 21 grados de rescate superiores en determinados tejidos, dependiendo de la especificidad de función de estos tres parálogos humanos. Por otro lado, para investigar en qué aspectos y en qué medida se produce el rescate del fenotipo mbl por la proteína humana pueden realizarse diferentes pruebas sobre los embriones y larvas rescatadas. Por ejemplo, sería interesante ver si los defectos ultraestructurales de la musculatura de los mutantes mbl, como la desorganización de las bandas Z, están rescatados. De igual manera, sería interesante comprobar si se ha producido alguna mejoría en los anclajes de los músculos a la epidermis (ver introducción). BIBLIOGRAFIA Artero, R. (1995). Caracterización molecular de la región 54A de Drosophila melanogaster. Tesis Doctoral. Dept Genética. Univ. Valencia. Artero, R., Prokop, A., Paricio, N., Begemann, G., Pueyo, I., Mlodzik, M., PérezAlonso, M. and Baylies, M. K. (1998). The muscleblind gene participates in the organization of Z-bands and epidermal attachments of Drosophila muscles and is regulated by Dmef2. Developmental Biology 195, 131-143. Begemann, G., Paricio, N., Artero, R., Kiss, I., Pérez-Alonso, M. and Mlodzik, M. (1997). muscleblind, a gene required for photoreceptor differentiation in Drosophila, encodes novel nuclear Cys3His-type zinc-finger-containing proteins. 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