Resumen de investigación - Universidad Autónoma de Madrid

Resumen de investigación
Par-4 Downregulation Promotes Breast Cancer
Recurrence by Preventing Multinucleation following
Targeted Therapy
Se ha descrito que la down-regulación del gen Par-4 es necesaria y suficiente para
promover la reaparición tumoral tras la eliminación del tumor primario. Las células
tumorales con bajo niveles de expresión de Par-4 sobreviven a la quimioterapia
evadiendo el programa de multinucleación y apoptosis dependiente de Par-4 que es
desencadenado por el tratamiento. Esta multinucleación dependiente de Par-4 se ha
identificado como un mecanismo de muerte celular en las células adictas a un oncogen,
lo que establece a Par-4 como un regulador negativo de la reaparición del cáncer de
mama.
Andrea Tabero Truchado
Universidad Autónoma de Madrid
07/12/2013
INTRODUCCIÓN
La reaparición del cáncer de mama suele ser una enfermedad incurable y ocasiona la mayoría
de muertes ocasionadas por este tipo de cáncer. Las células neoplásicas residuales que
sobreviven a la terapia contra el tumor primario constituyen el reservorio de donde
posteriormente resurge el tumor y por tanto son el mayor obstáculo en la búsqueda de una
terapia eficaz para el tratamiento de cánceres humanos. Por este motivo, entender los
mecanismos por los que estas células residuales sobreviven a la terapia es una prioridad en las
líneas de investigación centradas en este ámbito. Con este objetivo, Alvarez y su equipo han
desarrollado modelos en ratones transgénicos condicionales para el desarrollo de tumores
mamario inducidos por las vías de HER2/neu, MYC y Wnt1/p53. Estos modelos presentan
características de la enfermedad muy similares a las que se describen en las mujeres afectadas,
incluyendo la supervivencia de células cancerosas residuales tras la terapia y la eventual
reaparición espontánea del cáncer. En estos modelos la administración de doxiciclina (dox)
induce la activación del oncogén en el epitelio mamario resultando en la formación de un
adenocarcinoma invasivo primario. Los tumores desarrollados en este modelo responden a las
distintas terapias de forma muy similar a los tumores desarrollados por mujeres que padecen
esta enfermedad. Dado que la reaparición de tumores en estos modelos ocurre en ausencia
del oncogén iniciador se deduce que las células que sobreviven y resurgen lo hacen mediante
la activación de vías de crecimiento y supervivencia alternativas, independientes del oncogén
iniciador. El supresor de tumores Par-4 (prostate apoptosis response 4) se presentó como un
buen candidato para formar parte de alguna de estas vías. Esta proteína codificada en el gen
Pawr es una proteína proapoptótica que aparece silenciada en múltiples cánceres humanos y
cuya re-expresión induce muerte celular en algunas líneas de células tumorales. Ratones con
Par-4 silenciado presentan una predisposición al desarrollo de tumores y a la tumorigénesis
espontánea. Recientemente se ha relacionado la down-regulación de Par-4 con el diagnóstico
de cáncer de mama, asociándolo con un mayor riesgo de reaparición de la enfermedad y con
una respuesta menor a la quimioterapia.
RESULTADOS
Par-4 está down-regulada durante la reaparición de tumores en ratones
Se analizaron por PCR cuantitativa e inmunoblotting los tumores primarios y los tumores
espontáneos recurrentes en los ratones transgénicos MTB/TAN, MTB/TOM y MTB/TWnt1. Los
resultados mostraron que existía una down-regulación tanto del mRNA como de la proteína
Par-4 en las células de los tumores recurrentes en los tres modelos de ratones (Figuras 1A-1E).
Una inmunofluorescencia para Par-4 en los tumores inducidos por la vía HER2/neu muestra
que Par-4 es detectable en los tumores primarios mientras que su expresión se encuentra
claramente disminuida en los tumores recurrentes (Figura 1F). Estos resultados demostraron
que Par-4 está frecuentemente -y espontáneamente- down-regulado durante el proceso de
reaparición en tumores mamarios inducidos por tres vías relevantes en el cáncer humano.
Figura 1. Par-4 está down-regulada
durante la reaparición de tumores
mamarios
(A-D) PCR cuantitativa (A) y análisis
por western blot (B-D) mostrando la
expresión de Par-4 en tumores
HER/neu, MYC y Wnt:p53 +/primarios (Pri) y recurrentes (Rec).
(E) Cuantificación de los niveles de
proteína Par-4, comparados con los
de tubulina.
(F) Análisis por inmunofluorescencia
de Par-4 en tumores HER2/neu
primarios y recurrentes.
Se demostró que estos resultados también eran observables cuando la reaparición del tumor
ocurría tras un tratamiento quimioterapeútico. Para ello los ratones a los que se les había
inducido tumoración fueron tratados con Adriamicina y ciclofosfamida (CA) durante dos
semanas, seguidas de otras dos semanas de tratamiento con paclitaxel (T). Este tratamiento
provocó una regresión tumoral, tras la cual se interrumpió el tratamiento. Los tumores que
reaparecieron tras la quimioterapia mostraban una clara reducción de la expresión de Par-4.
Par-4 está down-regulado en las células de cáncer de mama humano que sobreviven
a la quimioterapia.
Se comparó la expresión de Par-4 en biopsias de tumores primarios con la expresión de esta
proteína en tumores residuales extraídos por cirugía tras un tratamiento quimioterapeútipo.
Se encontró que la expresión de Par-4 estaba disminuida en el segundo caso en 13 de los 21
pacientes mientras que sólo aumentaba en uno de los pacientes (Figuras 2A y 2B). Estos
resultados apuntan a un modelo según el cual la quimioterapia selecciona células cancerosas
con bajos niveles de expresión de Par-4.
Figura 2. Par-4 está downregulado en las células de cáncer
de
mama
humano
que
sobreviven a la quimioterapia.
(A y B) Expresión de Par-4 en
biopsias de cáncer de mama
realizadas antes del tratamiento y
en tumores residuales aparecidos
tras la quimioterapia.
La down-regulación de Par-4 es necesaria y suficiente para la reaparición del tumor.
Para probar si la down-regulación de Par-4 promueve la reaparición tumoral se usó un modelo
de ratón Par-4 knockdown para determinar la implicación de Par-4 en la propensión a
reaparecer de tumores primarios inducidos por la vía HER2/neu. Se suprimió la expresión de
Par-4 en un cultivo de células tumorales procedentes de un tumor mamario primario inducido
por la vía HER2/neu (Prim 1) usando shRNAs retrovirales. Se han identificado dos horquillas
diferentes que disminuyen la expresión de Par-4 hasta niveles similares a los encontrados en
las células tumorales recurrentes: Par-4.891 y Par-4.1011 (Figura 3A). Las células control
expresan un shRNA dirigido contra el gen de la luciferasa o un vector vacío (MLP). Ambos tipos
de células se inyectaron en el tejido mamario de ratones y se permitió la formación de
tumores primarios con la aplicación de dox. Ambos tipos de tumores presentaban una tasa de
crecimiento similar lo que sugiere que Par-4 no está implicada en la formación del tumor
primario.
Una vez formados los tumores se retiró la dox para que comenzara la down-regulación de
HER2/neu y con ello la regresión tumoral, que se produjo en igual medida en ambos tipos de
tumores.
Los tumores control reaparecían con una latencia media de 110 días (Figuras 3B y 3C) mientras
que los tumores que expresaban cualquiera de los dos Par-4 shRNAs reaparecían 3-5 semanas
más rápido que los control, con una latencia media de 76-90 días (Figuras 3B y 3C). Además se
observó que la expresión de Par-4 disminuía espontáneamente en los tumores recurrentes que
se originaban de células control (Figura 3D).
Para analizar el efecto del knockdown Par-4 en la reaparición tumoral en sitios distantes se
examinaron los pulmones de los ratones (ya que en estos modelos se sabe que la reaparición
tumoral suele producirse en los pulmones). Se determinó que los ratones con tumores
recurrentes procedentes de células Par-4 knockdown presentaban tasas de metástasis
significativamente mayores que los ratones con tumores recurrentes control. En conjunto,
estos resultados permiten establecer que la down-regulación de Par-4 promueve la reaparición
de tumores mamarios tanto a nivel local como distal.
Figura 3. Las down-regulación
de Par-4 es necesaria y
suficiente para la reaparición
tumoral.
(A) Análisis por Western que
muestra la expresión de Par-4
en células tumorales primarias
HER2/neu control y Par-4
knockdown.
(B y C) RFS de los tumores
control y de los tumores que
expresan uno de los dos
shRNAs dirigidos a Par-4.
(D) Análisis por Western que
muestra la expresión de Par-4
en 4 tumores recurrentes
originados a partir de células
control (MLP)
(E) RFS de controles tumor y
tumores que expresan el
cDNA codificante para Par-4.
(F) Análisis por Western que
muestra la expresión de Par-4
endógeno y ectópico en
tumores
primarios
y
recurrentes.
Hasta ahora se había probado que la down-regulación de Par-4 es necesaria para promover la
reaparición tumoral. Para testar si esta down-regulación es también suficiente para provocar
este efecto se forzó la expresión de Par-4 introduciendo en las células tumorales un epítopo de
Par-4 o un vector control, pK1. En los tumores primarios no se observan diferencias pero la
reaparición del tumor se retrasaba 3 semanas en los tumores que expresaban Par-4. Como en
el caso anterior los tumores recurrentes procedentes de células control down-regulaban
espontáneamente la expresión del Par-4 endógeno. Además la mayoría de los tumores
recurrentes originados de tumores que expresaban forzosamente Par-4 no sólo disminuyen la
expresión del Par-4 endógeno sino que también eliminan la expresión del Par-4 ectópico.
(Figura 3F).
Las células con una baja expresión de Par-4 pre-existentes sobreviven
preferencialmente a la down-regulación del oncogén producida por la
quimioterapia.
Para comprobar si las células en las que Par-4 ha sido silenciado presentan una mayor
supervivencia tras la down-regulación del oncogén HER2/neu se realizó un ensayo de
competencia celular. En este ensayo se administraron células tumorales primarias expresando
un shRNA de Par-4 y células tumorales primarias control en una proporción 1:1. Durante el
desarrollo del tumor primario esta proporción se mantuvo pero las células Par-4 knockdown
suponían un 80%-90% de las células presentes en las lesiones residuales aparecidas tras el
tratamiento (Figuras 4A y 4B), confirmando así que las células tumorales pre-existentes en el
tumor primario con bajos niveles de expresión de Par-4 sobreviven preferencialmente a la
down-regulación del oncogen y conforman el reservorio a partir del que se originan los
tumores recurrentes.
Figura 4. La down-regulación de Par-4 promueve la supervivencia celular tras la inactivación del
oncogen por el tratamiento quimioterapeútico.
(A) Inmunofluorescencia de un ensayo de competencia in vivo que muestra tumores primarios y lesiones residuales
formados a partir de la inyección de células Par-4 knockdown (verde) y células control (rojo).
(B) Cuantificación de la proporción relativa de células Par-4 knockdown y células control en tumores primarios y
lesiones residuales.
Par-4 induce multinucleación y muerte celular en las células de los tumores
recurrentes.
Se investigaron las consecuencias de re-expresar Par-4 en las células de tumores recurrentes
que lo habían down-regulado espontáneamente. Se observó que la re-expresión de esta
proteína inducía altos niveles de muerte celular en células de tumores recurrentes pero sólo
niveles bajos en células de tumores primarios (Figura 5A). Estos resultados sugieren que una
elevada expresión de Par-4 es incompatible con la supervivencia celular en tumores
recurrentes pero no en tumores primarios. Esto encaja con un modelo según el cual el
descenso en los niveles de expresión de Par-4 es necesario para la supervivencia de células en
las que la vía HER2/neu ha sido inhibida. Se observó que 24h después de re-expresar Par-4 en
cultivos celulares procedentes de tumores recurrentes aparecía gran número de células
mutinucleadas (Figura 5B) y disminuía la tasa de crecimiento del cultivo celular. Un análisis por
imagen in vivo reveló que la re-expresión de Par-4 resulta en una citocinesis aberrante . Un
análisis molecular de este proceso permitió determinar que la causa era un aumento en la
fosforilación de MLC2, lo que requiere la actividad de la kinasa ZIP.
Figura 5. Par-4 induce multinucleación y muerte celular en las células de los
tumores recurrentes
(A) Medida de la viabilidad celular tras la transdución retroviral de Par-4 en
células primarias o recurrentes.
(B) Células multinucleadas en un cultivo de células recurrentes tras 24h de
re-expresión de Par-4.
(C) Imagen in vivo de células tumorales recurrentes expresando y sin
expresar Par-4.
CONCLUSIONES
Se ha identificado la proteína supresora de tumores proapoptótica Par-4 como un regulador
negativo crítico en la reaparición de tumores en el cáncer de mama. La expresión de Par-4
disminuye espontáneamente en los tumores reaparecidos tras una regresión tumoral en
ratones con tumores mamarios inducidos por las vías HER2/neu, MYC o Wnt1;p53 +/-.
Se ha establecido que la down-regulación de Par-4 es necesaria y suficiente para promover la
reaparición de tumores mamarios y que las células tumorales con niveles bajos de Par-4 preexistentes son seleccionadas durante la quimioterapia por presentar una supervivencia mayor
en ausencia de expresión del oncogén. De esta forma constituyen el reservorio celular a partir
del cual se desarrolla la reaparición de tumores, lo que explica que los tumores recurrentes
presentes niveles bajos de esta proteína.
Por otro lado se han descrito las bases del mecanismo de supervivencia de las células que
expresan niveles bajos de Par-4, ya que esta proteína es la responsable de la multinucleación,
el arresto del ciclo celular y finalmente la inducción de apoptosis.
Todos estos datos permiten relacionar los niveles bajos de expresión de Par-4 con un alto
riesgo de reaparición tumoral en mujeres con cáncer de mama así como con una respuesta
menor a tratamientos de quimioterapia. Además algunos datos sugieren que la downregulación de Par-4 podría mediar algunos aspectos relacionados con la malignidad de algunos
subtipos de cáncer de mama.
Personalmente me parecen muy interesantes estos nuevos datos porque abren la puerta a
nuevas estrategias terapeúticas enfocadas a restaurar la expresión de Par-4 en tumores que
presenten bajos niveles de expresión de esta proteína con el fin de evitar la reaparición del
cáncer tras el tratamiento de los tumores primarios.