CAPITULO I Y II

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL ECUADOR
SEDE IBARRA
PUCE - SI
ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y AMBIENTALES
E.C.A.A.
INFORME FINAL DE TESIS PREVIO A LA OPTENCIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERÍA AGROPECUARIA
TÍTULO:
“CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA COLECCIÓN DE AJIES
(Capsicum spp) y CALABAZAS (Cucurbita spp.) DEL BANCO DE
GERMOPLASMA DEL INSTITUTO NACIONAL AUTÓNOMO DE
INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS (INIAP), ECUADOR.”
AUTORA:
Diana M. Farinango Cervantes
ASESOR:
Biol. Galo Pabón.
IBARRA- 2007
AUTORIA
Declaro que la presente investigación es de total responsabilidad de la
autora
……………………………………
Diana María Farinango Cervantes
C.I. 100211737-0
2
PRESENTACIÓN
La presente investigación titulada “Caracterización Molecular de la Colección
de Ajíes (Capsicum spp. L.) y Calabazas (Cucurbita spp. L.) del Banco de
Germoplasma
del
Instituto
Nacional
Autónomo
de
Investigaciones
Agropecuarias (INIAP), Ecuador.” está conformada por cinco capítulos que
se detalla a continuación.
El Capítulo I, está conformado por: planteamiento del problema el mismo
que detalla los problemas relacionados con los cultivos de ají y calabazas,
debido a la pérdida de variedades puras y la proliferación de plagas y
enfermedades;
justificación
se
menciona
la
importancia
de
la
caracterización molecular para identificar material promisorio, así como la
conservación de germoplasma; objetivos se plantea estudiar la variabilidad
genética de la colección de ají y calabazas mediante la caracterización
molecular empleando la técnica de RAPDs.
En el Capítulo II, se detalla la revisión bibliográfica de los cultivos de ají y
calabazas y la técnica molecular RAPDs, obtenida en libros y páginas web
disponibles.
En el Capítulo III, se describe la metodología como: los protocolos
empleados en la fase experimental y el análisis estadístico aplicado a los
resultados obtenidos.
En el Capítulo IV, se presenta los resultados obtenidos y una discusión
referente a la caracterización morfológica y molecular.
El Capítulo V comprende, conclusiones y recomendaciones del presente
estudio.
3
DEDICATORIA
A DIOS por darme la fuerza necesaria para seguir adelante.
A mis padres Carlos y María, quienes supieron guiarme e inculcarme valores
morales y éticos durante mi formación profesional, así como también por
todo el apoyo que me brindaron durante los momentos más difíciles de mi
vida. Gracias por todo su apoyo y amor
A mi hermano Danny por el cariño y la amistad brindada, a demás de ser mi
motivación.
A la memoria de mi abuelita
Flora por su cariño, cuidado y dedicación
mientras estuvimos juntas.
4
AGRADECIMIENTO
Al culminar la presente tesis de grado, misma que es requisito fundamental
para la obtención del título profesional de Ingeniería Agropecuaria, quiero
dejar constancia de mi más sincero agradecimiento a la Universidad Católica
del Ecuador Sede Ibarra por haberme formado profesionalmente durante 6
años; junto a todos aquellos docentes quienes con su tiempo y conocimiento
supieron inculcarme los más altos valores morales y éticos.
Al INIAP y especialmente al DENAREF por el apoyo brindado para la
ejecución de la presente investigación.
Al Ing. César Tapia, Biol. Gabriela Piedra, y al Dr. Eduardo Morillo por la
asistencia técnica recibida durante la realización de esta investigación.
Así también a todo el personal técnico del DENAREF por el compañerismo
y amistad brindados.
Al Biol. Galo Pavón por la amistad y apoyo al aportar con sus conocimientos
técnicos en el desarrollo de esta tesis.
A mis compañeros y amigos de la promoción 2000”B” quienes con sus
consejos supieron alentarme durante el difícil camino de mi carrera
profesional.
A mis amigas Doris, Priscila y Anita quienes me apoyaron en todo momento
compartiendo sus conocimientos y sobre todo su amistad.
5
RESUMEN
Esta investigación que consta de dos partes fue desarrollada en el
Departamento
Nacional
de
Recursos
Filogenéticos
y
Biotecnología
(DENAREF) del INIAP. La primera parte se centra a la caracterización
molecular de 71 accesiones de ají (Capsicum spp), en cambio en la segunda
se caracteriza a 25 accesiones de calabazas (Cucurbita spp).
Se utilizaron cuatro análisis, análisis de agrupamiento (UPGMA), análisis de
coordenadas principales (PCO), boostrap, y análisis de varianza molecular
(AMOVA). Los resultados más sobresalientes son: para ají, el análisis
UPGMA determinó 5 gurpos sugiriendo una estrecha relación genética entre
las 6 especies, así también el análisis PCO determinó 5 grupos donde a
demás identificó al ecu 2261 como una mezcla varietal entre las especies C.
annum y C. chinense, al igual que al ecu 12846 como otra mezcla varietal de
las especies C annum y C. baccatum; por otra parte el análisis boostrap
determinó la robustez estadística de los ecus 5429, 5444, 5445, 5462, 5463,
5371 de la especie C. annum con un valor de 81%; el análisis AMOVA
determinó que un 23% de la varianza aporta a la diferenciación de las 5
especies analizadas, mientras que el 77% aporta a la diversidad
intraespecífica. Los resultados para calabazas son: el análisis UPGMA
determinó 4 grupos sugiriendo una diferenciación genética entre las
especies analizadas, el análisis PCO determinó 3 grupos donde se observa
una significativa diferencia a nivel molecular de cada una de las especies, el
análisis boostrap determinó una robustez estadística de la especie C. pepo
con un valor de 72%, por último el análisis AMOVA determinó que un 38%
de la varianza aporta a la diferenciación de las 3 especies, mientras que el
62% aporta a la diversidad intraespecífica.
Palabras Claves: UPGMA, PCO, Boostrap, AMOVA.
6
ABSTRACT
This research consisting in two parts was carried out at the National
Department of Phylogenetic Resources and Biotechnology (DENAREF) of
INIAP. The first part was focussed on the molecular characterization of 71
assents of red hot chilli pepper (Capsicum spp.), and in the second one 25
assents of pumpkins (Cucurbita spp.) were characterized.
Four kinds of analysis were used, grouping analysis (UPGMA), main
coordinates analysis (PCO), boostrap and molecular varieties analysis
(AMOVA). The most outstanding results were: for red hot chilli pepper, the
analysis UPGMA determined 5 groups suggesting a narrow genetic
relationship between the 6 species, as well as the analysis PCO determined
5 groups where ecu 2261 as a mixture of several kinds of varieties was
identified between the species C. annum and C. chinense, as well as ecu
12846 as a mixture of varieties of the species C. annum and C. baccatum.
On the other hand, the boostrap analysis determined the statistic robustness
of the ecus 5429, 5444, 5445, 5462, 5463, 5371 and the species C. annum
with the value 81%. The AMOVA analysis determined that 23% of the kinds
of varieties contribute to the differentiation of the 5 analysed species, while
77% contributes to the intraspecific diversity. The result for pumpkins are: the
UPGMA analysis determined 4 groups suggesting a genetic differentiation
between the analysed species, PCO analysis determined 3 groups where a
notable difference at a molecular level of each of the species is observed, the
boostrap analysis determined a statistic robustness of the species C. pepo
with the value 72%, and finally the AMOVA analysis determined that 38% of
the variety contributes to the differentiation of the 3 species, while 62% are
contributed by the intraspecific diversity.
7
PORTADA…………………………………………………………………………...1
PRESENTACIÓN…………………………………………………………………..3
DEDICATORIA……………………………………………………………………...4
AGRADECIMIENTO………………………………………………………………..5
RESUMEN…………………………………………………………………………..6
Abstrac……………………………………………………………………………….7
INDICE……………………………………………………………………………….8
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………………………...15
1.2 JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………..17
1.3 OBJETIVOS…………………………………………………………………..19
1.3.1
OBJETIVO GENERAL………………………………………………19
1.3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS……………………………………….19
1.4 HIPÓTESIS……………………………………………………………………19
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1 CULTIVO DE AJÍ (Capsicum L.)
2.1.1 Origen, taxonomía e importancia del cultivo de ají……………………..20
2.1.2 Clasificación taxonómica…………………………………………………..21
2.1.3 Descripción botánica……………………………………………………….21
2.1.4 Ecología y adaptación……………………………………………………..23
2.1.5 Métodos de propagación…………………………………………………..23
2.1.6 Prácticas culturales y producción…………………………………………24
2.1.7 Control de principales plagas y enfermedades…………………………24
2.1.8 Tecnología de cosecha y poscosecha…………………………………...25
2.1.9 Formas de utilización ……………………………………………………...25
2.2
CULCTIVO DE CALABAZAS (Cucurbita spp.)
2.2.1 Origen, taxonomía e importancia del cultivo de calabazas………….26
2.2.2 Clasificación taxonómica: según Jeffrey (1990) ………………………27
2.2.3 Descripción botánica………………………………………………………27
2.2.4 Ecología y adaptación……………………………………………………..29
2.2.5 Métodos de propagación………………………………………………….30
2.2.6 Prácticas culturales y producción………………………………………...30
2.2.7 Control de principales plagas y enfermedades…………………………30
2.2.8 Tecnología de cosecha y poscosecha…………………………………..30
8
2.2.9 Formas de utilización………………………………………………………31
2.3 Caracterización molecular…………………………………………………...33
2.3.1 Marcadores moleculares………………………………………………......33
2.3.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)…………………………...35
2.3.3 Polimorfismo del ADN amplificado al azar (RAPDs)……………………37
2.3.4 Ventajas de los RAPDs……………………………………………………39
2.3.5 Desventajas de los RAPDs………………………………………………..40
2.3.6 Relación entre caracterización morfológica y molecular……………….40
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 DE CAMPO………………………………………………………………….42
3.1.1.1 Insumos……………………………………………………………………42
3.1.1.2 Herramientas……………………………………………………………..42
3.1.1.3 Recurso humano…………………………………………………………42
3.1.1.4 Material de oficina………………………………………………………..42
3.1.2 DE LABORATORIO………………………………………………………..43
3.1.2.1 Materiales de Laboratorio……………………………………………….43
3.1.2.2 Reactivos………………………………………………………………….44
3.2 MÉTODOS…………………………………………………………………….45
3.2.1. UBICACIÓN………………………………………………………………..45
3.2.2. DESCRIPCIÓN DE LA INVESTIGACIÓN………………………………45
3.2.2.1 Caracterización molecular………………………………………………45
3.2.2.2 Primers evaluados……………………………………………………….51
3.2.3. Análisis estadístico para datos moleculares…………………………..52
3.2.3.1 Análisis PCO……………………………………………………………...55
3.2.3.2 Análisis de varianza molecular (AMOVA)……………………………..55
3.2.3.3 Boostrap…………………………………………………………………..55
3.2.4. Relación de datos morfológicos y moleculares………………………...56
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUCIÓN
4.1 Resultados y discusión………………………………………………………57
4.1.1 Datos pasaporte (Género Capsicum.)……………………………………57
4.1.2 Género Capsicum L………………………………………………………..57
4.1.2.1 Caracterización molecular de Capsicum L……………………………57
4.1.2.2 Productos de amplificación……………………………………………...59
9
4.1.2.3 Similitud genética………………………………………………………...60
4.1.2.4 Análisis de agrupamiento (UPGMA)…………………………………...60
4.1.2.5 Análisis de coordenadas principales (PCO)…………………………..63
4.1.2.6 Distancia genética de nei………………………………………………..66
4.1.2.7 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)…………………………….66
4.1.2.8 Correlación entre marcadores morfológicos y moleculares………....67
4.2.1 Datos pasaporte (Género Cucurbita.)……………………………………68
4.2.2 Género Cucurbita L……………………………………………………......68
4.2.2.1 Caracterización molecular de Cucurbita L……………………………68
4.2.2.2 Productos de amplificación……………………………………………...69
4.2.23 Similitud genética…………………………………………………………70
4.2.2.4 Análisis de agrupamiento (UPGMA)…………………………………...70
4.2.2.5 Análisis de coordenadas principales (PCO)…………………………..72
4.2.2.6 Distancia genética de nei……………………………………………….74
4.2.2.7 Análisis de varianza molecular (AMOVA)…………………………….74
4.2.2.8 Correlación entre marcadores morfológicos y moleculares………...75
4.3 Hipótesis………………………………………………………………………75
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones género (Capsicum L.)………………………………………..76
5. 2 Conclusiones género (Cucurbita L.)……………………………………….78
5.3 Recomendaciones …………………………………………………………...79
10
Lista de Cuadros
Cuadro 4.1
Rendimiento de ADN de 71 accesiones de
Capsicum L. de germoplasma del DENAREF
– INIAP…………………………………………58
Cuadro 4.2
Lista de primers analizados (C. capsicum L)59
Cuadro 4.3
Lista
de
los
5
primers
polimórficos
seleccionados con sus respectivas secuencias
de nucleótidos, rango de amplificación y
número
de
polimorfismos
evaluados
(C.
capsicum L.)…………………………………...59
Cuadro 4.4
Matriz de distancia genética de nei. ………..66
Cuadro 4.5
Análisis de bandas binarias por población…67
Cuadro 4.6
Rendimiento de ADN de 25 accesiones de
Cucurbita L. de germoplasma del DENAREF –
INIAP………………………………………….68
Cuadro 4.7
Lista de primers analizados (C. cucurbita L)69
Cuadro 4.8
Lista
de
los
8
primers
polimórficos
seleccionados con sus respectivas secuencias
de nucleótidos, rango de amplificación y
número
de
polimorfismos
evaluados
(C.
cucurbita L.)……………………………………69
Cuadro 4.9
Matriz de distancia genética de nei…………74
Cuadro 4.10
Análisis de bandas binarias por población…74
11
Lista de Figuras
Figura 3.1
Extracción del ADN genómico………………47
Figura 3.2
Cuantificación
de
ADN
en
geles
de
agarosa………………………………………...49
Figura 3.3
Scriniing
de
Capsicum,
primers
OPA12,
OPA18, OPA 20, OPAN 02, OPAS 01;
scriniing para cucúrbitas primers OPA 09,
OPA 12, OPA 19, OPAC 03, OPAC 05, OPAC
08, OPAC 09, OPAC 11……………………..51
Figura 3.4
Figura 3.4. Evaluación de primers, scriniing de
capsicum y cucúrbitas ………………………53
Figura 4.1
Perfiles RAPDs obtenidos en Capsicum L. con
el primer OPA – 20. Carriles 1 – 29 ADN
amplificado. A la izquierda el tamaño en pares
de bases (pb) de algunas bandas polimórficas
evaluadas. (M) Marcador. Ecu 2231, Ecu
2233,Ecu 2236, Ecu 2242, Ecu 2243, Ecu
2249, Ecu 2252, Ecu 2258, Ecu 2259, Ecu
2261, Ecu 2262, Ecu2263, Ecu 2264, Ecu
2265, Ecu 2266, Ecu 2267, Ecu 2268, Ecu
2269, Ecu
2270, Ecu 2271, Ecu 3834, Ecu
5347, Ecu 5357, Ecu 5429, Ecu 5444, Ecu
5445,
Ecu
5462,
Ecu
5463,
Ecu
5371…………………………………………….60
Figura 4.2
Dendograma en base a datos moleculares de
la colección de Ají (Capsicum L.) usando el
coeficiente de Jaccard, agrupamiento UPGMA
y Boostrap. ……………………………………62
12
Figura 4.3
Distribución en el plano definido por el primer
y segundo eje (C1 y C2) del PCO basado en
el coeficiente de similitud de Jaccard en la
comparación dos a dos de 71 accesiones de
ají (Capsicum L.) con 36 polimorfismos
RAPDs………………………………………….65
Figura 4.4
Perfiles RAPDs obtenidos en Cucurbita L. con
el primer OPAC – 11. Carriles 1 – 25 ADN
amplificado. A la izquierda el tamaño en pares
de bases (pb) de algunas bandas polimórficas
evaluadas. (M) Marcador, (-) Control Negativo,
Ecu 4976, Ecu 4977, Ecu 4978, Ecu 4979,
Ecu 4980, Ecu 4981, Ecu 4983, Ecu 4984,
Ecu 4992, Ecu 5308, Ecu 5309, Ecu 5310,
Ecu 5311, Ecu 5312, Ecu 5313, Ecu 5326,
Ecu 5329, Ecu 5330, Ecu 5338, Ecu 5343,
Ecu 12382, Ecu 12393, Ecu 12399, Ecu
12400, Ecu 12408…………………………….70
Figura 4.5
Dendograma en base a datos moleculares de
la colección de calabazas (Cucurbita L.)
usando
el
coeficiente
de
Jaccard,
agrupamiento UPGMA y boostrap. …………72
Figura 4.6
Distribución en el plano definido por el primer
y segundo eje (C1 y C2) del PCO basado en
el coeficiente de similitud de Jaccard en la
comparación dos a dos de 25 accesiones de
calabazas (Cucurbita L.) con 36 polimorfismos
RAPDs…………………………………………73
13
Lista de Anexos
Anexo 1
Datos
pasaporte
de
la
colección
nacional de Capsicum L.
Anexo 2
Matriz básica de datos (MBD) generada
a partir de datos moleculares de
Capsicum L.
Anexo 3
Matriz de similitud generada a partir de
datos moleculares de Capsicum L.
Anexo 4
Registro fotográfico de Capsicum L.
Anexo 5
Datos
pasaporte
de
la
colección
nacional de Cucurbita L.
Anexo 6
Matriz básica de datos (MBD) generada
a partir de datos moleculares de
Cucurbita L.
Anexo 7
Matriz de similitud generada a partir de
datos moleculares de Cucurbita L.
Anexo 8
Registro fotográfico de Cucurbita L.
14
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La zona andina constituye uno de los principales centros de diversificación y
domesticación de plantas cultivadas en el mundo. Es así que la diversidad y
disponibilidad de recursos vegetales de interés económico sea más grande
en países como Ecuador; donde la agricultura ha tenido un proceso
dinámico de desarrollo y modernización, contribuyendo a que desaparezcan
especies de importancia económica (Tapia et al. 1996).
Los ajíes pertenecen al orden Solanales, familia solanaceae, y género
Capsicum; se adapta a climas tropicales húmedos y suelos con buen
drenaje, puede ser utilizado desde condimento en los alimentos hasta la
medicina, además de tener
un alto potencial para ser utilizado en la
elaboración de productos deshidratados, de ahí su importancia para el
cultivo de este género.
El cultivo de calabazas que pertenece al orden violaceae, familia
cucurbitaceae, y género Cucurbita L., se adapta a ecologías diferentes y
suelos bien abonados, es consumido en sopas, dulces, etc; así como
también puede ser aplicado en la medicina; sin embargo la importancia
económica de este cultivo no es tan representativa como el ají.
Estos son dos ejemplos representativos de la gran variabilidad genética y
morfológica en casi todo el mundo, principalmente en Perú y Bolivia.
En la actualidad
la diversidad de estas
especies
ha
disminuido
drásticamente debido a diferentes causas como por ejemplo la creencia de
que estas especies atraen a culebras, la influencia de la cultura occidental,
así como la erosión genética que produce la pérdida de recursos
15
filogenéticos o germoplasma vegetal, lo que constituye una amenaza a la
seguridad alimentaria local y regional.
De acuerdo a datos presentados en un seminario con comunidades de
Cotacachi, se puede apreciar que en estos dos cultivos existe una
disminución marcada de los nombres vulgares o tradicionales con que se
conoce a estos productos (Tapia, C. 2004, citado por Pavón, G. 2004)
Por otra parte la utilización de marcadores moleculares basados en
caracteres morfológicos particularmente en plantas se ha empleado desde
que el hombre practica la agricultura, y ha seleccionado individuos con
características que forman la base de fitomejoramiento de una variedad y
con una propiedad agronómica específica. (1)
En el Ecuador la investigación científica apenas ha iniciado por lo que, los
resultados en muchos casos son únicamente preliminares, es así que el
Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) ha conformado
un Banco
de Germoplasma el
cual
esta en
proceso activo de
caracterización, evaluación y potenciación genética desde 1980. La
caracterización morfoagronómica y molecular son fundamentales, ya que
permiten la identificación de materiales promisorios para fitomejoradores,
agricultores conservacionistas, con el fin de estimular su uso en la
agricultura, la industria, etc.
16
1.2 JUSTIFICACIÓN
Los problemas agronómicos relacionados con producción, adaptabilidad,
patología y entomología pueden ser mejorados a través de la identificación
de materiales promisorios de cada uno de estos cultivos.
El potencial genético que representan las especies de ajíes y calabazas son,
entre otros cultivos, afectados por la erosión genética, por lo que es urgente
plantear estrategias y métodos que permitan proteger estos recursos
genéticos.
Ya que estos cultivos son importantes en la seguridad alimentaria, así como
en la economía a pesar de la marginación de algunas de sus especies.
La colección, caracterización, evaluación y conservación de germoplasma es
base primordial para rescatar y difundir las especies y variedades que
pertenecen a estos géneros y utilizarlas a demás en proyectos de Turismo
Comunitario, que actualmente se desarrollan en comunidades agrupadas de
la Unión de Organizaciones Campesinas de Cotacachi (UNORCAC).
Es por eso que a través de esta investigación se puede establecer
semejanzas y diferencias entre diferentes tipos y variedades de dichos
cultivos de una misma especie, permitiendo desarrollar estrategias que
potencien aun más su uso dentro de una política de desarrollo sustentable.
Es así que para recuperar y promover estos cultivos se puede establecer las
características sistemáticas de los grupos, especies, variedades, tipos, etc;
su nominación científica (revisión taxonómica) así como las semejanzas y
diferencias categóricas que se establecen a través de una caracterización
molecular.
Ya que con la utilización de nuevas técnicas de biología molecular se puede
explorar la variación de secuencias a nivel de ADN de cada uno de los
individuos en estudio permitiendo distinguir entre genotipos estrechamente
17
relacionados. Lo que permite establecer una relación más especificas entre
cada una de las especies a través de una caracterización morfológica y
molecular. Permitiendo crear estrategias de desarrollo sustentable a través
de bases científicas.
El Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos y Biotecnología
(DENAREF) del INIAP dispone de una colección de 71 entradas de ají y 25
entradas de calabazas, mismos que fueron descritos completamente para
ampliar el conocimiento de estos cultivos y sus propiedades, permitiendo al
investigador plantear trabajos de selección, bioprospección, mejoramiento,
etc.
18
1.3
OBJETIVOS
1.3.1
OBJETIVO GENERAL
Estudiar la variabilidad genética de 71 accesiones de Capsicum spp.
L. (Ajíes) y 25 accesiones de Cucurbita spp. L. (Calabazas) del Banco
de Germoplasma del INIAP, mediante la caracterización molecular de
sus genotipos.
1.3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar molecularmente el germoplasma recolectado mediante la
técnica de amplificación de ADN al azar (RAPDs) de 71 accesiones
de ají y 25 accesiones de calabazas.
Determinar
la variabilidad genética de los géneros Capsicum. y
Cucurbita.
Determinar correlaciones entre caracteres morfológicos y moleculares
utilizando técnicas de análisis multivariado.
1.4 HIPÓTESIS
Las entradas de la colección nacional de ají y calabazas del INIAP presentan
variabilidad genética.
19
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1 Cultivo de ají (Capsicum L.)
2.1.1 Origen, taxonomía e importancia del cultivo de ají
El cultivo de Capsicum se remonta a la época precolombina, a través de
expediciones arqueológicas realizadas en Tehuacán, México se encontró
restos de chile fechados entre 5 y 7 mil años A. C. De igual manera en
Sudamérica, se encontraron restos en Ancón y Huaca Prieta en Perú con
fechas de más de 2 mil años A. C. (Pozo O., et al., 1991)
De acuerdo a bases arqueológicas las especies cultivadas de Capsicum se
desarrollaron en tres centros de origen: a) C. annuum en México y
Guatemala, b) C. chinense y C. frutescens en la cuenca del Amazonas, y por
último c) C. baccatum y C. pubescens en Bolivia y Perú. (Pozo O., et al.,
1991)
El género Capsicum, al cual pertenece el ají abarca entre 20 y 30 especies
originarias de las regiones tropicales y subtropicales de América,
probablemente en Perú y Bolivia, ya que se ha encontrado semillas
ancestrales de más de 7000 años. (2)
Después del descubrimiento de América, estas especies principalmente
Capsicum annum, han sido llevadas a distintas regiones del mundo y han
pasado a ser el principal condimento de comidas típicas de muchos países.
A pesar de que su cultivo es reducido; se encuentra ampliamente extendido,
siendo China, Estados Unidos y México los principales productores a nivel
mundial. (2)
20
2.1.2 Clasificación taxonómica
Según Cronquist (1981):
Reino:
Plantae
División:
Magnoliophyta
Clase:
Magnoliopsida
Orden:
Solanales
Familia:
Solanaceae
Género:
Capsicum L.
2.1.3. Descripción Botánica
Son plantas de crecimiento simpodial, sus tallos y ramas se forman de nudos
superiores donde generalmente existen yemas floríferas y dos ramillas que
forman un dicasio (Cronquis A, 1981, citado por Pavón G. 2004). La rama
más grande continúa con su crecimiento, en cuyo nudo superior se repite la
norma de inflorescencias y ramas, las hojas son elípticas con ápice agudo y
base asimétrica (Brako y Zaruchi, 1993).
Generalmente tiene dos flores por nudo con pedicelos erectos o doblados en
la antesis, su cáliz es cupular, glabro, con dientes cortos y prominentes.
Corola amarillo verdosa, blanco lechoso o morado, anteras azules. Los
frutos maduros presentan constricción anular en la unión con el pedicelo, y
la pulpa es firme de color rojo o amarillo y, a veces, blanco (Judd et al.,
1999)
A continuación se describen las principales especies de mayor explotación:
Capsicum annuum: Es la especie que presenta mayor variabilidad en
cuanto a forma, tamaño y color de frutos. En México se tiene la mayor
variabilidad de formas cultivadas y sus parientes silvestres. (Pozo O., et al.,
1991)
Pozo (1991), cita a Pickersgill (1971) quién propone a C.annumm var.
aviculare como la progenitora silvestre de C. annuum domesticada.
21
La planta es herbácea, de hábito perenne en condiciones naturales, pero
cultivada como anual en la mayoría de los casos. El sistema radical es
pivotante, alcanzando entre 0,7 y 1,2 m de profundidad y un diámetro de 0,5
a 0,9 m alrededor del eje central, las raíces adventicias se generan bajo el
hipocótilo. El tallo presenta ramificación dicotómica y sobre las ramas se
disponen hojas de tamaño medio, enteras, de forma oval-oblonga, glabras y
de color verde intenso. Las flores son perfectas y se presentan solitarias en
las axilas de las ramificaciones; su cáliz es dentado, a demás posee cinco
pétalos de color blanco y anteras amarillenta-azules o púrpuras. Después de
un proceso de autofecundación se inicia el desarrollo del fruto que constituye
el órgano de consumo de la especie. (3)
Capsicum baccatum L.: Comprende un conjunto de plantas herbáceas de
diferente porte y tamaño, con período de vida generalmente menor a un año.
Su crecimiento es simpodial; los tallos y ramas se forman de sectores en
cuyo nudo superior hay, por lo general, yemas floríferas y dos ramillas que
forman un dicasio, una de ellas más desarrollada que la opuesta. La rama
más grande continúa el crecimiento y en su nudo superior se repite la norma
de inflorescencia y ramas. (4)
Hojas generalmente elípticas, con el ápice agudo y la base asimétrica,
aunque existe bastante variación. Dos flores por nudo, rara vez una, con
pedicelos erectos o doblados en la antesis. El cáliz es cupular, glabro, con
los
dientes
muy
cortos
y
prominentes.
Corola
amarillo
verdosa,
ocasionalmente entre blanco lechoso o morado y las anteras azules. Cáliz
de los frutos maduros, generalmente con una constricción anular en la unión
con el pedicelo; las venas no se prolongan en los dientes; márgenes
doblados hacia arriba. Fruto de pulpa firme, rojo o amarillo y, a veces,
blanco. (5)
Capsicum chinense. Se caracteriza principalmente por la ausencia de cáliz
dentado, la corola es de color blanca opaca y su fruto presenta constricción
entre la base del cáliz y el pedúnculo. Las formas cultivadas de esta especie
22
son de gran importancia en el mercado mundial lo que le permite competir
con la especie C. annuum. (Pozo O., et al., 1991)
Capsicum frutescens. Esta especie está muy relacionada con C. chinense,
siendo difícil la distinción entre ellas; se caracteriza por presentar corolas de
color blanco verdoso, frutos decíduos, no presenta constricción entre la
base del cáliz y el pedúnculo. El tipo de chile denominado “tabasco” es el
más representativo de la especie, fue introducido de México a Luisiana,
EE.UU en 1888; lo cual marco el inicio de la mundialmente famosa “salsa
tabasco”. (Pozo O., et al., 1991)
Capsicum pubescens. Fue descrita por primera vez por Ruiz y Pavón en
1799, sin embargo permaneció desconocida fuera de Sudamérica hasta la
primera mitad del presente siglo, presenta una distribución muy amplia y
gran variabilidad genética. Presenta flores de color violeta de forma
campanada, la semilla es rugosa de color negro. Según varios
investigadores, esta especie fue introducida a México y América Central
entre 1930 y 1940. (Pozo O., et al., 1991)
El gran problema que presenta esta especie, es que, sus características son
silvestres (picante, fruto hueco, planta perenne, abundantes semillas). (6)
2.1.4 Ecología y adaptación
Este género se adapta a climas tropicales húmedos con y sin estación seca
marcada. Crece bien en condiciones de alta humedad relativa, y altitudes
entre el nivel del mar y los 2500 m. s. n. m. Los suelos sueltos con buen
drenaje, disminuyen el riesgo de la enfermedad producida por el Fusarium
sp. y la marchitez causada por Phytophthora sp. (Bukasov,M:S, 1981).
2.1.5 Métodos de propagación
Se propaga por semilla, la germinación se produce a los 15 a 17 días y,
después de crecer por 20 a 25 días, se trasplanta a viveros. Se recomienda
23
germinar las semillas en almácigo, trazándose surcos de un centímetro de
profundidad y espaciados cada 10 cm. (IPGRI, AVRDC y CATIE, 1995).
2.1.6 Prácticas culturales y producción
Después de 45 a 60 días, se trasplantan al sitio definitivo plantas con una
altura aproximada de 15 cm. Generalmente el distanciamiento es de un
metro entre surcos y 0,5 a 0,6 m entre plantas. (León, J. 1987.)
Debe tener buen control de malezas, especialmente hasta la floración y las
primeras etapas de fructificación. Al momento del trasplante debe recibir un
aporque, efectuándose dos a tres aporques adicionales (IPGRI, AVRDC y
CATIE, 1995).
2.1.7 Control de principales plagas y enfermedades
Además de ser un cultivo sensible a las bajas temperaturas, es muy
susceptible a los hongos como (Phytophthora sp.) que produce la muerte de
las plantas cuando éstas ya están fructificando. Esta situación obliga a
utilizar el sistema de almácigo y trasplante para su cultivo. Los almácigos
deben sembrarse en un suelo o substrato desinfectado. (7)
Otra enfermedad que tiene el ají común es la podredumbre del tallo,
originada por el hongo Sclerotium rolfsii, que ataca a nivel del suelo. Se
controla rotando cultivos y evitando los suelos pesados con mal drenaje.
(León, J. 1987.)
También es atacada por el perforador del fruto Gnorischema gudmanella,
polilla cuyas larvas minan las hojas y penetran en los frutos, y el pulgón
Macrosiphurn
euphorbidae,
que
succiona
la
savia,
produciendo
amarillamiento, deformación de hojas y brotes, pudiendo marchitar la planta;
estas plagas transmiten virus ya que producen un medio adecuado
principalmente para el desarrollo del hongo de la fumagina (León, J. 1987.)
24
2.1.8 Tecnología de cosecha y poscosecha
En las condiciones actuales no se tienen cuidados especiales durante la
cosecha, que se realiza de manera esporádica, ya que no existe un gran
mercado para los frutos. El período de cosecha puede durar entre 60 días,
en las variedades más herbáceas, hasta varios meses en las variedades
herbáceas con tallo leñoso. (IPGRI, AVRDC y CATIE, 1995)
2.1.9 Formas de utilización
Presenta múltiples usos, desde condimentos en los alimentos, hasta las
aplicaciones medicinales; pasando por la obtención de materia prima, con
niveles artesanales e industriales. Se emplea mundialmente en la industria
farmacéutica y de alimentos. (Collazos et al., 1975). Recientemente, se ha
incorporado la capsaicina, una amida aromática, en los repelentes
atomizadores que se expenden para autodefensa.
A demás sus múltiples variedades, como por ejemplo largos carnosos,
dulces, picantes, etc; pueden cultivarse a nivel
industrial, obteniendo
productos como condimentos, conservas, pastas, salsas que son muy
populares en países de Hispanoamérica como México. Así también puede
ser utilizado como estimulante digestivo, para el dolor de cabeza, e incluso
para tratar heridas y otras enfermedades de animales. (2), (8)
Esta especie, puede ser consumida en fresco, deshidratado ahumado, en
salsas, encurtidos, también se puede utilizar como colorante y saborizante.
(Pozo O., et al., 1991)
Por otra parte el uso de material genético sirve para buscar nuevas fuentes
de resistencia a enfermedades fungosas y virosas que atacan al chile como
por ejemplo Redondo (1979) detectó 19 colectas de C. annuum
denominados “Criollos de Morelos” con resistencia al hongo Phytophthora
capsici Leo., que causa la enfermedad denominada “marchites del chile”.
(Pozo O., et al., 1991)
25
2.2 Cultivo de calabazas. (Cucurbita spp..)
2.2.1 Origen, taxonomía e importancia del cultivo de
calabazas
Basándose en evidencias fotogeográficas y en relaciones huésped –
parásito se ha sugerido el sur y centro de México como centro de origen de
este género, sin embargo algunas especies como C. maxima son nativas de
América del Sur. (Nuez F. et. al., 2000)
El centro y sur de México forman parte de la región conocida como
Mesoamérica, centro de diversidad genética de cerca de 50 especies
cultivadas, convirtiéndose en uno de los cultivos originarios más importantes
de dicha región. (Hernández S., 1991)
Las especies domesticadas de Cucúrbitas son probablemente las plantas
más antiguas cultivadas en América, así por ejemplo de acuerdo a
evidencias arqueológicas donde se encontró restos de semillas, pedúnculos
y cáscara de C. pepo, indican la existencia de poblaciones silvestres de esta
especie en México y al este de EE.UU. al rededor de 10000 y 30000 años.
(Nuez F. et. al., 2000)
Según Lira. R, 1990, la especie C. pepo pudo haberse domesticado cuando
menos en dos ocasiones y regiones diferentes, teniendo en cada caso como
posibles progenitores a C. fraterna y C. texana respectivamente. Por otra
parte la especie C. moschata se cultivaba en México, América del Sur y el
sudoeste de los EE.UU en tiempos precolombinos. Sin embargo el ancestro
silvestre de esta especie aun se desconoce.
Por último la especie C. argyrosperma fue domesticada al parecer al sur de
México existiendo evidencias arqueológicas de su cultivo hace 5200 años
A.C.. Poblaciones silvestres de la subespecie sororia, que se encuentran en
México y América Central dieron lugar a la subespecie domesticada
argyrosperma. (Nuez F. et. al., 2000)
26
2.2.2 Clasificación taxonómica: Según Jeffrey (1990):
Reino:
Plantae
División:
Magnoliophyta
Clase:
Magnoliopsida
Orden:
Violaceae
Familia:
Cucurbitaceae
Género:
Cucurbita L.
2.2.3 Descripción Botánica
Son plantas monóicas o dioicas, y raramente hermafroditas; rastreras,
trepadoras o subarbustivas, las flores pueden ser actinomorfas o
ligeramente zigomorfas masculinas o estaminadas poseen estambres en
forma de columna donde los filamentos y las anteras se hallan soldados,
mientras que las flores femeninas o pistiladas son solitarias con tres
estaminoides, un estilo corto y tres a cinco estigmas bilobados; presentan
un ovario ínfero tricarpelar con 4 a 5 carpelos en posición horizontal, (Lira.
R, 1995 y Nuez. F. et. al., 2000).
La corola es de forma tubular – campanulada, los colores van desde
amarillo pálido hasta amarillo anaranjado brillante. (Lira. R 1995). Los tallos
son híspidos o escabrosos, huecos, angulosos y con tendencia a producir
raíces en los nudos (Cronquist A, 1981.).Los frutos de plantas cultivadas
son del tipo pepo teniendo una gran variedad de formas, tamaños, colores,
texturas, etc.
Las plantas silvestres son relativamente uniformes en cuanto a su forma,
coloración y tamaño. (Bailey, s/a; Judd et al., 1999. y Lira. R 1995). El
género presenta zarcillos ramificados, que en los tipos semierguidos están
abortados; las hojas son de lámina simple y lobuladas (Lira R, 1990).
Entre las especies cultivadas más importantes para la alimentación se
encuentran C. moschata, C. pepo, C. maxima, C. mixta, C. ficifolia, C,
argyrosperma, mismas que se describen a continuación.
27
Cucurbita argyrosperma: Presenta dos sub-especies: Argyrosperma,
formada por cuatro variedades -argyrosperma, callicarpa, stenosperma y
palmieri-, tres de las cuales incluyen a todos los tipos cultivados, mientras
que la cuarta corresponde a poblaciones espontáneas del noroeste de
México, generalmente conocidas bajo el nombre Cucurbita palmieri L.H.
Bailey; y Sororia, que comprende poblaciones silvestres con amplia
distribución desde México hasta Nicaragua. (León J, 1987.).
Las especies C. palmeri Bailey y C. sororia Bailey fueron clasificadas como
taxones infraespecíficos de C. argyrosperma. (Merrick y Bates, 1989). Son
plantas herbáceas, rastreras o trepadoras no muy vigorosas, sus raíces son
fibrosa, el tallo es angular, las hojas están sobre los pecíolos, sus lóbulos
son obtusos, triangulares y apiculados, los zarcillos son desarrollados
presentando de dos a cuatro ramificaciones pubescentes, las flores son
estaminadas, su receptáculo es campanulado, la corola es de color amarillo
con blanco y anaranjado en el limbo, el fruto usualmente conserva la forma
del ovario. (Lira R, 1995)
Cucurbita moschata: Se conocen como zapallos, es de gran importancia
aquí y en otras zonas del mundo. Sus hojas son aterciopeladas, orbiculares,
con 5-7 lóbulos redondeados y poco pronunciados, no erguidas y con
pequeñas manchas blanquecinas en la unión de las nervaduras, las que son
producidas por una delgada capa de aire bajo la epidermis (Lira R, 1990).
La flor es amarilla y tubular. El pedúnculo es anguloso, acampanado o
ensanchado en su unión con el fruto. (León J, 1987)
Producen frutos que son frecuentemente grandes, pueden ser de forma
aplanada, redondeada, oval, o con cuello curvo. En norteamérica se
reconocen tres tipos comerciales como son “Cheese” de fruto oblongo,
“Crookneck” de fruto redondo y, “Bell” de fruto cilíndrico o acampanado.
(Robinson y Decker Walters, 1997)
28
Cucurbita pepo: Dentro de esta especie, se ha definido dos subespecies,
la Subs. pepo y la Subs. ovífera. Cucúrbita pepo es altamente polimórfico ya
que presenta una diversidad de frutos mayor que la de cualquier otra
especie de la familia de las Cucurbitáceas. (Nuez. F, 2000.)
Son plantas rastreras, trepadoras o subarbustivas, anuales. Sus raíces son
fibrosas, el tallo es angular, las hojas reencuentran sobre los pecíolos, los
zarcillos presentan de dos a seis ramificaciones, sus flores son estaminadas
y pistiladas, la corola es de color anaranjado. (Lira R, 1995)
Los frutos pueden ser verdes, amarillos, anaranjados, blancos, veteados, de
formas planas, redondeadas, ovales, alargadas, etc. Por tal razón en
función de la forma del fruto se clasifican en : “Pumpkin” fruto redondo de
color naranja, “Scallop” fruto pequeño y aplanado, “Acorn” fruto pequeño u
asurcado, “Crookneck” fruto alongado, “Straightneck” fruto cilíndrico,
“Vegetable marrow” fruto cilíndrico, “Cocozelle” fruto largo y cilíndrico,
“Zucchini” fruto largo y cilíndrico. (Paris, 1986)
2.2.4 Ecología y adaptación
En función de su adaptación ecológica, las especies del género Cucúrbita
puede dividirse en dos grupos: especies mesofíticas, aquí se incluyen las
especies cultivadas más importantes y especies silvestres ya que poseen
raíces fibrosas; se distribuyen desde el sudeste de EE.UU hasta el centro de
Argentina, por debajo de elevaciones de hasta 1300m. Las especies
xerófitas que poseen raíces carnosas y almacenan reservas, se adaptan a
regiones más áridas o zonas de elevada altitud desde el sudoeste de
EE.UU. hasta el sur de México. (Merrick. L., 1995)
Por otra parte según Bailey, s/a (1999), el género Cucúrbita se adapta a
diferentes climas, como los trópicos húmedos de América del sur o las
zonas templadas y frías.
29
2.2.5 Métodos de propagación
Se propaga por semillas. La siembra se hace directamente en el campo
definitivo, colocando tres semillas por sitio. Después de 15 días se elimina
una de estas plantas. (Esquina-Alcazar y Gulik, 1983). Se recomienda
humedecer las semillas el día anterior a la siembra en una solución con
fungicidas para lograr una germinación más uniforme (Lira R, 1990).
2.2.6 Prácticas culturales y producción
La siembra se efectúa al inicio de la estación lluviosa en camas levantadas,
para evitar el exceso de agua. Los frutos se empiezan a cosechar de los
cuatro a seis meses, dependiendo de la variedad (Esquina-Alcazar y Gulik,
1983). El abonamiento debe efectuarse hasta los 50 días de la siembra,
después de este período la planta no muestra respuesta significativa en
rendimiento (Lira R, 1990).
2.2.7 Control de principales plagas y enfermedades
En zonas agrícolas bajo riego, tienen problemas con el pique o gusano
barrenador de tallos (Melittia cucurbitae); el gusano barrenador de los frutos
y guías (Diaphania nitidalis), y la mosca minadora (Liriomyza sp.). (León J,
1987).
Entre las principales
enfermedades tenemos chupadera (Rhizoctonia
solani, Fusarium sp.), el oidium (Erisiphe cichoracearum), el mildiu
(Pseudoprerenospora cubensis) y la cercosporiosis (Cercospora citrulina).
(Lira R, 1990).
2.2.8 Tecnología de cosecha y poscosecha
La cosecha se realiza manualmente, cuando la cáscara está verde y dura.
No existe tecnología específica para la poscosecha. Los frutos se conservan
30
bien por 15 a 30 días en lugares frescos y ventilados y por 90 días cuando
son almacenados a 10ºC y 75% de humedad relativa. (Lira R, 1990)
2.2.9. Formas de utilización
Según el modo de consumo se clasifica en “calabazas de verano” y
“calabazas de invierno”, dependiendo de si el fruto se consume en estado
inmaduro o maduro respectivamente. Las calabazas de verano suelen ser
de carne blanca o amarilla, corresponde a la especie C. pepo, mientras que
las de invierno que poseen carne naranja, pueden ser de las especies C.
pepo, C. moschata, o C. argyrosperma. (Robinson y Decker -
Walters,
1997)
Las calabazas de verano poseen un gen dominante que determina la dureza
de la cáscara con el fin de consumir el fruto antes de que comience la
lignificación de la corteza, pueden ser consumidos hervidos o fritos;
mientras que las calabazas de invierno generalmente se consumen asadas.
Sin embargo de todas las especies se puede hacer pasteles y dulces, o
semillas tostadas. (Robinson y Decker - Walters, 1997)
A demás, según Lira R. (1995), la pulpa de los frutos maduros, es
consumida como dulce, los tallos tiernos, flores y los frutos inmaduros se
consumen como verdura cocida, frita, etc. La cáscara dura se utiliza como
recipiente en las zonas rurales. En la medicina los usos se presentan en el
cuadro 2.1:
31
Cuadro 2.1. Usos en la medicina.
PAÍS O REGIÓN
ESPECIES
PARTES USADAS
Brasil
C. moschata
Fruto
Diurético
Semilla
Tenífugo y Vermífugo
China
C. moschata
USOS O PROPIEDADES
Raíz
Dolor de dientes
Flores
Tónico estomacal
Semilla
Curación de hemorroides y anemia
Tratamiento de asma bronquial
C. pepo
Colombia
Jamaica
Fruto
C. máxima
Semilla
Vermífugo
C. moschata
Raíz
Febrífugo
C. moschata
Semilla
Diurético
C. pepo
Península de
C. argyrosperma
Yucatán
C. moschata
C. pepo
Raíz
Mordedura de serpientes
Enfermedades de la piel
Hojas
Jugo para curar granos y erupciones
de la piel
Flores
Estimulante del apetito
Fruto
Resina, jugo de cáscara y pulpa
para quemaduras y llagas. El fruto
de C. moschata se considera
pectoral, refrescante, y útil para
enfermedades del cuero cabelludo.
semilla
Antihelmíntico, tenífugo, vermífugo,
gelactógeno, y el aceite para
curar hemorroides y heridas.
México
C. moschata
en general
C. pepo
Venezuela
C. moschata
C. pepo
Semilla
Antihelmíntico
Semilla
Fiebres eruptivas y el aceite
para úlceras
Fuente: (Lira, R 1995)
Puede ser considerado importante desde el punto de vista nutricional,
cultural y en ciertos casos económicos, ya que ciertas especies han
representado parte fundamental de la dieta y otros aspectos de la vida
humana (Lira R, 1995)
A sí por ejemplo las semillas presentan altos contenidos de aceites (más de
39%), proteínas (44%) y fósforo (1%); los ápices de las guías, así como las
flores y frutos tiernos y maduros, destacan por sus contenidos de calcio y
fósforo (Lira R, 1990).
32
2.3 Caracterización molecular
Corresponde a una serie de técnicas que permite detectar diferencias a nivel
de las secuencias de ADN. Mediante el análisis molecular se puede evitar la
influencia del ambiente en la variabilidad, a este efecto se lo conoce como
neutralidad de los caracteres moleculares. (Ferreira y Grattapaglia, 1998)
Entre las numerosas aplicaciones de estas técnicas se puede conocer y
caracterizar el contenido genético de los organismos. Así también resulta ser
útil en estudios de mapeo genético, filogenia, sistemática molecular,
mejoramiento asistido por marcadores moleculares, e identificación varietal.
(Ferreira y Grattapaglia, 1998)
La caracterización molecular emplea como herramienta útil a los marcadores
moleculares en el proceso de obtención y caracterización genética de
nuevas variedades, detección de patógenos, controles sanitarios y de
calidad de la cadena agroalimentaria; así como también en la detección y
cuantificación
de
organismos
genéticamente
modificados
mediante
marcadores de Reacción en cadena de la Polimeraza (PCR). (Nuez y
Carrillo, 2000)
2.3.1 Marcadores Moleculares
“Tradicionalmente los marcadores utilizados en estudio de genética y
mejoramiento eran aquellos controlados por genes asociados a caracteres
morfológicos en general fenotipos de fácil identificación visual que
contribuyeron significativamente al desarrollo teórico del análisis de
ligamiento y en la construcción de las primeras versiones de mapas
genéticos. Sin embargo el bajo número de estos marcadores y la posibilidad
de interferencia epistática o ambiental limitaban su uso”. (9)
Con la llegada de las técnicas modernas de la biología molecular, surgieron
diversos métodos de detección de polimorfismo genético directamente a
nivel de ADN, permitiendo
que estos marcadores generalmente puedan
33
acelerar los programas de mejoramiento genético (Ferreira y Grattaplaglia
1998).
Marcador molecular es cualquier fenotipo molecular, oriundo de la expresión
de un gen o de segmentos específicos de ADN que puede ser detectado y
su herencia monitoreada. Es así que un marcador molecular recibe el
nombre de marcador genético cuando su comportamiento se rige de acuerdo
con las leyes básicas de la herencia mendeliana. (Ferreira y Grattaplaglia
1998).
Así también un marcador molecular es cualquier característica química o
molecular medible que es heredada según el Modelo Mendeliano Simple
(Walton, 1993 citado por Tapia, 1998), incluyendo tanto a los que analizan
directamente los ácidos nucleicos (ADN y RNA), como también a los que
analizan los productos del ADN como son las proteínas (principalmente las
isoenzimas).
Los marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar
con un rasgo genético, que son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el
ADN (genes conocidos o fragmentos de secuencia y función desconocida).
Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequívocamente con un
rasgo genético, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o
cuantificables). (10)
Un buen marcador molecular debe reunir una serie de características para
maximizar su utilidad: así por ejemplo, debe tener buena distribución a lo
largo del genoma, un alto grado de polimorfismo, así como también la
técnica para analizar el marcador debe ser rápida, práctica y debe poder
repetirse con fiabilidad en otros laboratorios. (11)
Hay que tomar en cuenta que los marcadores moleculares no son afectados
por el medio ambiente, ya que se basan en las propiedades del ADN y la
información genética no cambia aunque las plantas estén sujetas a
condiciones extremas y variadas. Al igual que los marcadores morfológicos y
34
bioquímicos, los marcadores moleculares detectan la variación natural entre
individuos. Una ventaja puede ser la posibilidad de analizar locis únicos
(regiones únicas en el genoma) o locis múltiples (regiones repetidas a través
del genoma). (1)
Para analizar el ADN, se dispone de ciertas técnicas moleculares tales
como: los RFLP (Fragmentos de Restricción de ADN de Longitud
Polimórfica), marcadores basados en la Reacción de la Cadena de la
Polimerasa (PCR), o sea RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar),
microsatélites, minisatélites y AFLP (Fragmentos Amplificados de ADN de
Longitud Polimórfica), permitiendo obtener un muestreo extensivo de los
genomas a nivel de ADN, sin la influencia ambiental. “Esta información se
interpreta analizando cada marcador como un carácter fenotípico distinto e
independiente de los demás”. (Caetano-Anolis, 1993, Tapia, 1998, Yaguachi
y; Medina, 2003)
“Los marcadores genéticos, son abundantes en el estudio de una población
segregante, son neutros, con mínimo o nulo efecto epistático o pleiotrópico.
No presentan efecto ambiental, y si el ambiente tiene alguna influencia,
como puede ser el caso de las proteínas, la influencia es de tipo cuantitativo,
no cualitativo. Pueden ser extraídos de semilla o de partes vegetativas en los
primeros estadios del desarrollo de la planta. (Nuez y Carrillo, 2000)
2.3.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica
desarrollada por Kary Mullis en 1983, misma que consiste en la síntesis
enzimática in vitro de secuencias específicas de ADN, en presencia de la
enzima Taq polimerasa, esta enzima es un tipo de ADN polimerasa
termoestable aislada de la eubacteria termofílica Thermus aquaticus.
La PCR, se basa en el apareamiento y polimerización enzimática de un par
de oligonucleótidos utilizados como iniciadores “primers” delimitando la
35
secuencia de ADN de doble cadena de la amplificación (Ferreira y
Grattapaglia, 1998).
Cada ciclo de PCR consta de tres etapas:
1) Denaturación o desnaturalización
La desnaturalización del ADN de doble cadena se produce al incrementar la
temperatura a rangos de 92 a 95ºC. Es aquí donde los enlaces de
hidrógeno, que unen las cadenas y que individualmente son débiles, se
rompen. Luego las dos cadenas de ADN disociadas permanecen libres hasta
que la temperatura sea reducida para facilitar el anillamiento de los primers.
2) Anillamiento o complementación
“Permite la hibridación de los primers con su secuencia complementaria en
el ADN molde. En esta fase la temperatura depende de la secuencia de
nucleótidos del primer pero generalmente está entre 37 y 60ºC.”
3) Elongación
“Se incrementa la temperatura para activar la Taq polimerasa, para realizar
la extensión de la nueva cadena incorporando desoxirribonucleótidos a partir
de cada terminal 3’ de los primers, produciendo una cadena complementaria
al ADN molde en la región limitada por los primers.”
Luego de 30 ciclos de amplificación se obtiene aproximadamente 106
moléculas de una secuencia específica de nucleótidos. Para visualizar estos
fragmentos amplificados se realiza una electroforesis en el gel de agarosa
tiñendo los fragmentos con bromuro de etidio, que produce fluorescencia
anaranjada cuando se expone a la luz ultravioleta. (Weising et al, 1994;
Ferreira & Grattapaglia, 1998; Willians et al., 1993)
36
2.3.3 Polimorfismo del ADN amplificado al azar (RAPDs)
(Random Amplified Polymorphic DNA) utiliza la tecnología de PCR
modificada, trabaja con un solo primer
de secuencia aleatoria que está
formada por 10 nucleótidos que le permiten unirse en muchos loci diferentes
debido a su menor especificidad para luego amplificar secuencias de ADN al
azar. (Phillips, 1998)
La asunción de heredabilidad tiene dos componentes: fidelidad de la
transmisión y modo de herencia de los caracteres en cuestión. El
conocimiento de estos dos componentes es una información crítica para
RAPDs, ya que este marcador es expresado de forma dominante. (Jeffreys
et al., 1988; Hadrys et al., 1992; Riedy et al., 1992)
La repetibilidad es un problema en el uso de RAPDs ya que puede ser muy
sensitiva a las condiciones en las que se lleva a cabo. Es por eso que se
debe estandarizar todas las condiciones experimentales utilizadas durante la
amplificación con el fin de reducir la falta de repetibilidad inherente a la
técnica.
(Dowling ert al., 1996; Bachmann, 1994; Hadrys et al., 1992)
Los RAPDs pueden no ser
independientes cuando los fragmentos
amplificados están asociados con frecuencias repetitivas del genoma,
cuando las relaciones alélicas son desconocidas, o cuando existe la
formación de heteroduplex. (Ayliffe et al., 1994; Danforth & Freeman-Gallant,
1996; Felsenstein, 1985)
La homología de los fragmentos RAPDs asume que estos fragmentos
amplificados son únicos (Hadrys et al., 1992). Sin embargo para probar esta
asunción se ha sugerido herramientas como el análisis southernblot usando
el producto RAPD como sonda en la hibridación, o bien la digestión con
enzimas de restricción par observar perfiles de bandas congruentes.
(Dowling et al., 1996 Fritsh & Rieseberg, 1992; Rieseberg, 1996)
37
El análisis de RAPDs requiere de cinco elementos básicos que son descritos
a continuación:
ADN molde: Se conforma por el ADN de doble cadena que proviene del
organismo que se desea analizar, es decir que el ADN utilizado por la Taq
polimerasa como molde sintetiza nuevas cadenas polinucleótidas. (Yaguachi
y Medina, 2003)
A demás depende de las técnicas de extracción y almacenamiento; siendo
de 10 a 50 ng/50 ml (volumen de reacción) como concentraciones óptimas.
(Tapia, 1998 citado por Yaguachi y Medina, 2003).
Primer o iniciador: Generalmente están constituidos por una cadena de 10
nucleótidos, contienen más de un 50% de bases de guanina, y citosina para
su buen funcionamiento (Weising et al., 1994, Tapia, 1998, Yaguachi y
Medina, 2003). “Gallardo y Moyano (2002) citan a Entrala quien afirma que
para elegir un primer para amplificar un fragmento de ADN se toma en
cuenta lo siguiente”:
1) La longitud de cada primer debe comprender entre 18 y 24 bases, ya que
los primers de mayor longitud no aumenta el rendimiento, mientras que los
más cortos carecen de especificidad.
2) “Ambos primers deben tener una temperatura similar a (-5ºC de
diferencia)”.
3) “La relación bases púricas: pirimidínicas debe ser 1:1 (máximo 40 – 60%)”
4) “La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1 – 2 bases
púricas.
5) “Para evitar la formación de dímeros de primers es necesario comprobar
que estos no contengan secuencias complementarias entre sí.
38
.Desoxinucleótidos Trifosfatos : “Tapia (1998), menciona a Estrella el cual
se expresa que se requieren concentraciones adecuadas de dATP, dGTP,
dCTP, y dTTP para la síntesis de la cadena”.
Solución del bufer: Generalmente deben tener iones de potasio y
magnesio en concentraciones óptimas, así como también deben ser
calibradas a un pH de 8,3; para obtener bandas fuertes se aplica un amplio
rango de concentraciones de magnesio, obteniendo cambios cualitativos de
los patrones de bandas.
Taq polimerasa: Es una enzima termoestable extraída de la bacteria
Thermus aquaticus su función es restituir la doble cadena de ADN a través
de una síntesis que parte de un punto determinado que es fijado por el
primer. (Willians et al., 1993; Wolf et al., 1993; Tapia, 1998)
Para que la técnica de RAPDs sea eficiente se toma en cuenta cuatro
factores:
1) Número de ciclos de amplificación.
2) Cantidad de ADN inicial.
3) Longitud del ADN.
4) Temperatura.
(Phillips et al., 1995; Tapia, 1998.)
2.3.4 Ventajas de los RAPDs
Las ventajas más importantes de esta técnica se basan en su simplicidad,
rapidez y bajo costo, ya que utiliza pequeñas cantidades de ADN que
generan numerosos polimorfismos distribuidos por todo el genoma.
A si también se puede realizar un muestreo de regiones de ADN altamente
repetitivo como de regiones de ADN de copia única.
39
“Esta técnica no requiere del desarrollo previo de una biblioteca de sondas
específicas, ni poseer información previa de la secuencia genética del
organismo objetivo de estudio”.
Se
realiza
aproximadamente
en
tres
horas
permitiendo
manejar
simultáneamente un gran número de muestras sin utilizar el ADN
recombinante ni de radioactividad, ya que no se utiliza sondas ni procesos
de autoradiografía.
El bajo costo de esta técnica se debe a que no se requiere de instalaciones
de laboratorio sofisticados. (Ferreira & Grattapaglia, 1998)
“A demás estos marcadores fueron más eficientes que los RFLPs en el
mareamiento de polimorfismos ligados a loci de resistencia a enfermedades
y más eficientes en tiempo y mano de obra. Los segmentos RAPDs una vez
amplificados y separados por electroforesis pueden ser fácilmente aislados
del gel”. (Ferreira & Grattapaglia, 1998, Yaguachi y Medina, 2003)
2.3.5 Desventajas de los RAPDs
“Se obtiene poca información genética por locus, los genotipos heterocigotos
no pueden ser discriminados directamente de los homocigóticos, limitación
conocida como “dominancia””. (Ferreira &Grattapaglia, 1998)
“Otra desventaja puede ser el inconveniente de una baja consistencia
(repetitiva), sin embargo empleando una metodología controlada y constante
(termociclador, tipo y concentración de reactivos, etc) se puede conseguir
resultados satisfactorios”. ((12) citado por Chalampuente y Prado, 2005)
2.3.6 Relación entre caracterización morfológica y molecular
Es necesario establecer el grado de concordancia entre los caracteres
morfológicos y marcadores moleculares, ya que estas dos técnicas
maximizan la información y la utilidad de las colecciones de germoplasma.
40
Los caracteres morfológicos son influenciados por el medio ambiente siendo
algunos de ellos poco convenientes para el estudio de la biodiversidad;
mientras que los marcadores moleculares no consideran las interacciones
del genotipo con el medio ambiente, es por eso que la combinación de estos
dos métodos provee un amplio y real conocimiento de la diversidad de
especies. (Hillis, 1987).
Para comparar matrices de datos moleculares se utiliza los coeficientes de
similitudes en base a Jaccard o Nei, mientras que para datos morfológicos
se realiza una transformación (Z) en cada característica y luego se ejecuta
una transformación de rangos o análisis de componentes principales. Este
tipo de comparación da como resultado la identificación de correlaciones
entre caracteres morfológicos y moleculares. (Mantel, 1967)
41
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 DE CAMPO
3.1.1.1 Insumos
♦ Semillas de 71 accesiones de Capsicum y 25 accesiones de Cucúrbitas
del Banco Nacional de Germoplasma del INIAP
♦ Humus
3.1.1.2 Herramientas
♦ Palas
♦ Macetas plásticas
♦ Regaderas
♦ Invernadero
3.1.1.3 Recurso humano
♦ Técnicos INIAP
♦ Tesista
3.1.1.4 Material de oficina
♦ Computadora
♦ Hojas
♦ Cámara fotográfica
♦ Otros
42
3.1.2 DE LABORATORIO
3.1.2.1 Materiales de laboratorio
♦ Sílica gel
♦ Papel toalla
♦ Papel aluminio
♦ Papel filtro
♦ Papel cera (parafilm)
♦ Micro filtros
♦ Tijeras
♦ Pinzas
♦ Gradillas
♦ Guantes
♦ Mascarillas
♦ Morteros y pistilos
♦ Tubos eppendorf de 2, 1.5 y 0.6 ml
♦ Tubos PCR
♦ Puntas amarillas
♦ Puntas azules
♦ Erlenmeyer de vidrio de 250 y 1000 ml
♦ Vasos de precipitación
♦ Balanza eléctrica
♦ Vortex
♦ Micro pipetas
♦ Micro centrífuga
♦ Micro estufa
♦ Baño María
♦ Termocicladores MJPT100
♦ Cámara de electroforesis
♦ Cámara de luz UV
♦ Refrigerador
43
3.1.2.2 Reactivos
♦ Buffer de extracción de ADN (Tris, EDTA, Na CL, SDS, PVP, CITAB,
B. Mercapto etanol).
♦ Acetato de Potasio
♦ Acetato de Sodio
♦ Acetato de Amonio
♦ Etanol, Isopropanol
♦ CIA
♦ EtOH NaAC
♦ Tris – EDTA (TE)
♦ Tris – Ácido Acético – EDTA (TAE)
♦ ARNasa
♦ Aceite Mineral
♦ Agarosa
♦ Bromuro de etidio
♦ Blue Juice
♦ Marcador
♦ Buffer 5X
♦ Primer RAPDs
♦ dNTPs
♦ Taq polimerasa
44
3.2 MÉTODOS
3.2.1. UBICACIÓN
Provincia:
Pichincha
Cantón:
Mejía
Parroquia: Cutuglahua
Sitio:
Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones
Agropecuarias (INIAP). Departamento Nacional de
Recursos Fitogenéticos y Biotecnología (DENAREF).
Estación Experimental Santa Catalina (EESC), Quito.
3.2.2. Descripción de la investigación
3.2.2.1 Caracterización molecular
A) Extracción del ADN genómico
Para la extracción de ADN en Capsicum, se probó con varios protocolos de
extracción tales como: Extracción de ADN (Mariack), extracción de ADN de
Yuca (Colombo 1998), y Colombo (1998) modificado por Piedra* (2004,
comunicación personal). Hasta que finalmente se definió el protocolo de
extracción de ADN de Yuca (Colombo 1998) para las especies en estudio, el
mismo que se detalla a continuación. (Figura 3.1)
El buffer de este protocolo consta de: Tris pH 8 (1M), NaCl 5M, EDTA Ph 8
(0.5M), CTAB, Agua estéril autoclavada.
Se tomo de 3 a 5 hojas jóvenes, las cuales fueron secadas en sílica gel,
durante 1 semana aproximadamente; hasta que estén completamente
secas.
Se vierte 0.5 g de tejido seco de cada accesión en tubos eppendorf de
2ml, a esto se le añade 1ml de buffer precalentado, más 25 ul de B.
45
mercapto etanol, y se agita suavemente hasta que la mezcla se torne
homogénea.
Las muestras se incubaron en baño maría a 65ºC durante dos horas,
debiendo agitarlas cada 30 minutos.
Luego se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minutos, se transfiere el
sobrenadante a tubos nuevos de 2 ml; para luego aforar los tubos a 1 ml
con el buffer de extracción, a demás de agregar 1 ml de CIA; agitar
suavemente.
Se centrifugó una vez más a 4000 rpm por 15 minutos ó a 14000 rpm
por 5 minutos.
Se captura el sobrenadante sin contaminarla con la interfase, para luego
adicionar 1 ml de buffer de extracción más 1 ml de CIA, y centrifugarlo a
14000 rpm por 5 minutos; retirando nuevamente el sobrenadante a tubos
nuevos.
Seguidamente se adiciona 800 ul de isopropanol frío (igual volumen de
sobrenadante). Centrifugando de inmediato a 12000 rpm durante 15
minutos, debiendo chequear cada 2 minutos.
Se retira el isopropanol del pelet, y se lava con 1 ml de etanol 70%.
Se puede secar a temperatura ambiente o en micro estufa por 30 minutos
a una temperatura de 37ºC.
Finalmente se resuspendió el ADN en 100 ul de TE a temperatura
ambiente por toda la noche.
Es necesario resaltar que en el presente proceso el ADN de varias
accesiones se mostró contaminado, para corregir tal circunstancia se realizó
una limpieza con Acetato de Amonio; el cual se describe a continuación.
Se adiciona a los tubos 350 ul de acetato de amonio 7.5M, y se agita
suavemente.
Luego se da un vórtex y se centrifuga a 14000 rpm durante 5 minutos.
Se transfiere el sobrenadante a tubos nuevos y se añade 700 ul de
isopropanol frío, para luego agitarlo suavemente.
Se vuelve a centrifugar a 14000 rpm por cinco minutos.
46
Finalmente al pelet precipitado se le añade 250 ul de etanol 70%,
agitándolo suavemente; para luego eliminar el etanol y dejar secar el
pelet.
El pelet es resuspendido 50 o 100 ul de TE. Y conservado a -20ºC hasta
su utilización.
Sílica Gel
Maceración
de Tejido
Centrífuga
Centrífuga
Formación del
Pelet
Lavado de
Pelet con
Etanol al 70%
Mezcla
Homogenea
Baño María
Sobrenadante + 1ml
de buffer y1ml de CIA
Micro estufa
37ºC
Pelet Seco
(ADN)
Figura 3.1. Extracción del ADN genómico.
Para la extracción de ADN en cucúrbitas se siguió el protocolo Dellaporta et
al, mismo que está conformado por: Tris pH 8, EDTA, NaCl, SDS al 20%, y
agua destilada estéril.
47
La deshidratación de hojas, y macerado se procesan igual que en
capsicum, variando únicamente en el tiempo de secado del material
vegetal ya que las hojas son más gruesas.
Se procedió a macerar el tejido deshidratado, del cual se tomo alrededor
de 0.1 gr
adicionando PVP que es un antioxidante, para luego ser
vertidos en tubos eppendorf de 2 ml.
Se añade 30ul de B. mercaptoetanol (antioxidante), 200ul de SDS, y se
aforó la muestra a 2 ml con el buffer de extracción. Se agitaron los tubos
hasta que la mezcla se torne homogénea.
Luego se incubó a 65ºC en baño maría por 20 minutos.
Los tubos fueron retirados para dejar enfriar a temperatura ambiente,
luego se añadió 300ul de acetato de potasio 5M, se mezclo; e
inmediatamente se incubó en hielo por 30 minutos.
Una vez que las muestras están a temperatura ambiente, se
centrifugaron a 10000 rpm durante 10 minutos.
El sobrenadante fue filtrado a tubos nuevos, a los cuales se les añadió
0.7 vol de Isopropanol frío. Es decir que en 500 ul de sobrenadante se
añadió 350 ul de isopropanol y se agitaron suavemente.
Una vez más las muestras fueron incubadas a – 20ºC durante una hora.
Posteriormente se centrifugaron a 10000 rpm por 10 minutos, los
contaminantes son eliminados, dejando el pelet o pastilla, mismo que fue
secado en la micro estufa a 37ºC.
Luego de secado el pelet se disolvió en 700 ul de TE, se dejó a baño
maría por 30 minutos para minimizar el tiempo.
El ADN volvió a ser precipitado adicionando 0.1 vol. de acetato de sodio
(Na Ac) 3M y 0.7 vol. de isopropanol frío. Es decir que en 750 ul de ADN
disuelto en TE, se adicionó 75 ul de NaAc 3M y 525 ul de isopropanol.
Debe ser agitado suavemente.
Se centrifugo por última vez a 12000 rpm durante 10 minutos, debiendo
chequearse cada tres minutos.
Seguidamente se lavó el pelet con 350 ul de etanol 70%. Y se secón en
la micro estufa.
48
Una ves seco el pelet se agrego 100 ul de TE, esto es de acuerdo al
tamaño del pelet. Y se sometió a baño maría a una temperatura de 65ºC
durante 30 minutos.
Las muestras al ser enfriadas se les dio un vórtex para homogenizar el
ADN.
Finalmente se verifico y cuantifico cada una de las muestras.
Al igual que en capsicum, el ADN de varias accesiones se mostró
contaminado, por lo que se aplicó una limpieza con Acetato de Amonio; el
cual ya fue descrito anteriormente.
B) Cuantificación de ADN
La integridad y concentración del ADN fueron analizadas por electroforesis
en geles de agarosa 0,8% en tampón TAE 1X y cuantificadas
comparativamente por la intensidad de sus bandas con las del estándar ADN
Low Mass Ladder (10068-013, INVITROGEN)
Una vez listo el gel se mezclaron en parafilm: 4 ul de ADN de cada muestra,
con 1 ul de blue juice. El volumen de carga fue 2 ul a partir del segundo
poso, una vez cargadas todas las muestras se colocó en el primer poso 2ul
de marcador ADN Low Mass Ladder
Posteriormente se llevó el gel a la cámara de luz ultravioleta. La
concentración de ADN de cada una de las muestras se estandarizó
diluyéndolo en tampón TE 0,1M tartrazine, hasta lograr una concentración
final de 5 ng/ul tanto para cucúrbitas como para Capsicum. (Figura 3.2)
49
Gel Agarosa
+TAE 1X
Mezcla en
Parafilm
Cámara de Luz Ultravioleta
Figura 3.2. Cuantificación de ADN en geles de agarosa
C) Reacción RAPDs
Se utilizó tubos PCR, y en cada uno de estos se colocó alícuotas de 2 ul de
ADN (5 ng/ul) para cucúrbitas y 3 ul de ADN (5 ng/ul) para Capsicum.
Se preparo una mezcla con los siguientes componentes para los dos
géneros:
Componentes
1Rx
5X buffer
2,2 ul
Primer (1,0 uM)
0,4 ul
DNTPs (2,5 mM cada uno)
0,8 ul
Taq polimerasa (5U/ul)
0,13 ul
H2O ultra pura
2,3 ul
Volumen final
5,83 ul
Luego se extrajo 5,4 ul de la mezcla y se coloco en los tubos PCR tanto para
las 25 muestras de cucúrbitas, como para las 71 muestras de Capsicum, la
reacción fue cubierta con una gota de aceite mineral con el fin de evitar su
evaporación. Estas reacciones fueron amplificadas en un termociclador MJ –
Research, de acuerdo al siguiente programa:
50
PASOS
TEMPERATURA
TIEMPO
1
2
Denaturación inicial
Denaturación cíclica
94
94
5 min.
30 seg.
3
Anillamiento
42
1 min.
4
Elongación
72
2 min.
40 veces el paso 2 hasta el paso 4
6
Elongación final
72
7 min.
7
Conservación de la muestra
4
5 min.
Se usó el 1 Kb DNA Ladder Marker (10381-010 INVITROGEN) como
marcador de referencia en los productos amplificados, estos fueron
visualizados en geles de agarosa al 2% en tampón TAE 1X con bromuro de
etidio.
La electroforesis se realizó a 110 V. finalmente las bandas de ADN fueron
visualizadas bajo un transiluminador UV, a la vez que fueron documentadas.
3.2.2.2 Primers evaluados
Se realizó un sondeo preliminar (screening), donde se probaron 145 primers
pertenecientes a los Kits OPA, OPAC, OPAN, OPAM, OPR, OPS, OPW,
OPAA, de Operon Technologies. Para esta prueba se escogieron cinco
accesiones morfológicamente diferentes de cada género. Como resultado se
seleccionaron cinco primers para Capsicum y ocho primers para cucúrbitas,
que presentaron polimorfismos reproducibles y confiables, los mismos que
se emplearon para la amplificación del ADN de las 71 accesiones de
capsicum y las 25 accesiones de cucúrbita respectivamente estudiadas.
(Figura 3.3)
51
Scriniing de Capsicum
Scriniing de Cucúrbitas
Figura 3.3. Scriniing de Capsicum primers OPA 12, OPA18, OPA 20, OPAN 02, OPAS 01; scriniing
para cucúrbitas primers OPA 09, OPA 12, OPA 19, OPAC 03, OPAC 05, OPAC 08, OPAC 09, OPAC
11
3.2.3. Análisis estadístico para datos moleculares
La codificación de bandas polimórficas se evaluaron a través de las variables
presencia (1) o ausencia (0), los cuales se registraron por inspección en una
matriz de datos binarios en el programa NTEDIT del paquete estadístico
NTSYS pc ver.2,0 (Applied Biostatistis Inc, 1998), que es un programa
utilizado para determinar similitudes genéticas entre especies, basándose en
caracteres moleculares.
Es importante mencionar que no se tomo en cuenta polimorfismos que
involucren datos dudosos (9). (Figura 3.4)
Los tamaños de las bandas polimórficas se calcularon mediante la aplicación
LENGTH (Templeton 1988), expresándose en pares de bases (pb). La
principal ventaja de esta codificación es que proporciona el mismo peso a
52
todos los individuos independientemente del número de bandas. El número
de locus es el número de bandas diferentes observadas en el germoplasma
en estudio.
Al comparar dos accesiones, los estados posibles a un mismo locus son:
ACCESION Y
ACCESION X
+
-
+
A
C
b
d
Es necesario recalcar que el número de dobles ausencias (carácter <<d>>)
corresponde al número de locus homocigotos para el alelo nulo en dos
individuos ya que solo informa sobre la ausencia del alelo amplificado, por
tanto no es considerado como una evidencia de similitud entre dos
accesiones. Es así que la selección del índice de similaridad sobre este tipo
de marcadores moleculares tiene que basarse en características de la
técnica utilizada.
Codificación de Bandas Polimórficas (Presencia
(1), Ausencia (0), y Dudoso (9) en Capsicum
Codificación de Bandas Polimórficas (Presencia
(1) y Ausencia (0), en Cucúrbitas
Figura 3.4. Evaluación de primers, scriniing de capsicum y cucúrbitas
53
A) Matriz de similitud y distancias
Empleando un coeficiente de asociación para cuantificar el parecido o
similitud entre dos muestras, debido a la naturaleza de la información
proporcionada por los RAPDs se empleo el algoritmo de Jaccard.
Esto permitió calcular la similitud genética entre pares de accesiones
mediante la opción SIMQUAL del paquete estadístico NTSYS. La base
molecular para la presencia de una banda RAPDs aún no está claramente
entendida, sin embargo se considera que la ausencia de una banda
compartida no necesariamente implica un ancestro común o similitud
genética entre muestras, clones o accesiones.
Es así que el coeficiente de Jaccard fue considerado como el mejor
algoritmo para obtener una matriz de similitud y distancia en este estudio,
debido a que no se considera a la ausencia de banda entre dos muestras
como elemento a favor de la similitud entre ellas.
El coeficiente de Jaccard se expresa de la siguiente manera:
Mxy
F=
(Mt – Mxyo)
Donde:
F
= Coeficiente de Jaccard
Mxy
= Número de fragmentos compartidos entre dos accesiones
Mt
= Número total de bandas en la matriz de datos
Mxyo
= Número de bandas en la matriz
Sobre la matriz obtenida se aplicó la técnica Cluster análisis empleando el
método de agrupamiento UPGMA (media Aritmética No Ponderada; (Sneath
& Sokal, 1973) mediante la opción de SAHN CLUSTERING del paquete
estadístico NTSYS.
54
Y a través de la opción TREE DISPLAY se visualizaron los agrupamientos o
relaciones
entre
entradas
de
la
colección
generando
diagramas
arborescentes o dendrogramas que demuestran las relaciones genéticas
entre accesiones.
3.2.3.1 Análisis de la PCO
La estructuración de la diversidad genética, puede ser visualizada a través
de un análisis multivariado en coordenadas principales (PCA). El PCO es un
método de ordenación homólogo al análisis de componentes Principales
(PCA) adaptado especialmente a datos cualitativos. “Al igual que el análisis
de
componentes
principales,
este
método
indica
cuantos
factores
independientes explican la diversidad total, que fracción de la diversidad es
explicada y el peso de estos factores (factor loading).
El análisis PCO no utiliza la distancia euclideana y posibilita la
representación de variables e individuos en un mismo campo de proyección
(plotting). (Crisci 1983, citado por Piedra 2002).
3.2.3.2 Análisis de varianza molecular (AMOVA)
Este análisis utiliza datos crudos o una matriz de distancia ya calculada,
permite diferenciar genéticamente a cada especie a demás de identificar los
polimorfismos existentes. El PhiPt es considerado como una medida que
facilita la comparación entre datos codominantes, haploides y binarios, es
decir que es considerado como un parámetro de diferencia genética entre
especies. (Flanagan N., 2005 (13))
3.2.3.3 Boostrap
Consiste en tomar muestras (con reemplazamiento) de elementos que
constituyen la muestra original. Cada genotipo es expresado en n bandas
donde son elegidas aleatoriamente. Cada muestra da información para todos
55
los genotipos dando lugar a una matriz de similaridad y una matriz de
distancia. (Duque, 1998)
Con un número adecuado de muestras se puede calcular un promedio de
distancias entre i y j dando una opinión objetiva sobre la significancia y
fuerza de las ramas que contienen a los diferentes grupos. (Duque, 1998)
3.2.4 Relación de datos morfológicos y moleculares.
Para el estudio de la diversidad genética de un cultivo se utiliza avanzadas
técnicas moleculares, así como también rasgos morfológicos. Sin embargo
la diversidad molecular no considera las interacciones genotipo por medio
ambiente; por lo que estas dos técnicas se complementan una con otra.
(Taba, 1991)
Al comparar matrices de datos se debe calcular para caracteres
moleculares, distancias genéticas o coeficientes de similaridad utilizando
algoritmos principalmente de Jaccard o Nei; mientras que los datos
morfológicos son estandarizados. Una vez obtenidas las matrices de los dos
tipos de caracteres se comparan con el comando MXCOMP del sotware
NTSYS-pc (Rohlf, 1990) o mediante el estadístico Mantel (Mantel, 1967),
este tipo de comparación da como resultado la identificación de
correlaciones entre los caracteres morfológicos y moleculares.
Este análisis utiliza matrices de distancia moleculares “X” obtenidas con el
coeficiente de Jaccard y las morfológicas “Y” obtenidas con el coeficiente de
Gower; y se las correlaciona entre ellas con el valor estadístico Mantel que
se define como:
Z=
j
k X jk Y jk
Donde:
X
jk
y Y
jk
= son elementos de js líneas y ks columnas de Xnxn y Ynxn
respectivamente, y k es < j.
56
CAPÍTULO IV
4.1 Resultados y discusión
Los resultados se presentan de forma separada para cada género, iniciando
por Capsicum L., que es el género que agrupa a los ajíes y luego Cucurbita
L. que agrupa a las calabazas. Posteriormente se hace una discusión de
nuestros resultados para cada una de las especies.
4.1.1 Datos pasaporte (Género Capsicum.)
Las accesiones de Capsicum fueron colectadas en ocho provincias de la
Sierra ecuatoriana tanto del norte (Carchi, Imbabura, Pichincha), centro
(Chimborazo y Tungurahua), sur (Azuay y Loja), y en la zona oriental (Napo).
A demás se incluyen países como Bolivia, México y Perú. Las colectas están
comprendidas entre los 1200 y 3500 de altitud m.s.n.m Los datos pasaporte
de las accesiones analizadas se detallan en el anexo 1.
4.1.2 Género Capsicum L.
De las 73 accesiones inicialmente sembradas bajo invernadero en el INIAP,
los (ecu-12860 y 12863), no germinaron por presentar contaminación de
semillas, por lo que fueron excluidas del análisis molecular, por tanto los
datos moleculares
registrados para las 71 accesiones restantes se
muestran en el anexo 2.
4.1.2.1 Caracterización molecular de Capsicum L.
Con una modificación del protocolo de extracción ADN de yuca Colombo
modificado por Piedra se obtuvo un ADN de buena calidad, con rendimientos
que oscilaron entre 1.66 y 50 ug/muestra, con una media de 6.13 ug/muestra
de ADN. (cuadro 4.1).
57
Cuadro 4.1. Rendimiento de ADN de 71 accesiones de Capsicum L. de
Germoplasma del DENAREF – INIAP.
ENTRADA
RENDIMIENTO
ENTRADA
ADN ug/muestra
ECU - 2231
RENDIMIENTO
ADN ug/muestra
12.5
ECU - 12833
5
ECU - 2233
8.33
ECU - 12834
2.5
ECU - 2236
8.33
ECU - 12835
3.33
ECU - 2242
6.25
ECU - 12839
3.33
ECU - 2243
5
ECU - 12840
50
ECU - 2249
3.33
ECU - 12841
2.5
ECU - 2252
2.5
ECU - 12842
3.33
ECU - 2258
2.5
ECU - 12843
5
ECU - 2259
12.5
ECU - 12844
5
ECU - 2261
5
ECU - 12845
3.33
ECU - 2262
3.33
ECU - 12846
1.66
ECU - 2263
6.25
ECU - 12847
2.5
ECU - 2264
1.66
ECU - 12848
5
ECU - 2265
1.66
ECU - 12849
8.33
ECU - 2266
1.66
ECU - 12851
2.5
ECU - 2267
1.66
ECU - 12852
3.33
ECU - 2268
6.25
ECU - 12853
5
ECU - 2269
5
ECU - 12854
4.16
ECU - 2270
5
ECU - 12855
3.33
ECU - 2271
1.66
ECU - 12857
6.25
ECU - 3834
8.33
ECU - 12859
6.25
ECU - 5347
8.33
ECU - 12861
3.33
ECU - 5357
12.5
ECU - 12862
2.5
ECU - 5429
12.5
ECU - 12864
3.33
ECU - 5444
12.5
ECU- 12865
3.33
ECU - 5445
3.33
ECU - 12866
16.66
ECU - 5462
2.5
ECU - 12867
2.5
ECU - 5463
8.33
ECU - 12868
2.5
ECU - 5371
8.33
ECU - 12869
2.5
ECU - 5528
6.25
ECU - 12870
4.16
ECU - 5529
5
ECU - 5530
6.25
ECU - 6222
5
ECU - 6233
12.5
ECU - 6225
6.25
ECU - 7019
25
ECU - 11991
5
ECU - 11992
1.66
ECU - 11993
5
ECU - 12831
5
ECU - 12832
3.33
Media= 6.13
58
4.1.2.2 Productos de amplificación
En un sondeo preliminar de 73 primers RAPDs se seleccionaron 5 primers
OPA–12, OPA–18, OPA–20, OPAN–02, OPAS–01, que generaron alrededor
de 98 bandas RAPDs, de los cuales 36 se consideraron polimórficas, con
una tasa de polimorfismo de 2,3 polimorfismos por primer. El numero de
bandas osciló entre 1 a 23 productos RAPDs obtenidos y el tamaño de las
bandas varió entre 250 pb a 1640 pb para Capsicum. (cuadro 4.2 y 4.3). En
la figura 4.1 se muestra un ejemplo de la amplificación obtenida.
Cuadro 4.2.
Lista general de primers analizados. (C. capsicum L.)
#
Primer
#
Primer
#
Primer
#
Primer
#
Primer
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
OPA-05
OPA-06
OPA-09
OPA-12
OPA-13
OPA-14
OPA-15
OPA-17
OPA-18
OPA-19
OPA-20
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
OPAC-01
OPAC-03
OPAC-05
OPAC-06
OPAC-08
OPAC-09
OPAC-11
OPAC-12
OPAC-13
OPAC-15
OPAC-16
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
OPAN-02
OPAN-03
OPAN-04
OPAN-07
OPAN-09
OPAN-10
OPAN-11
OPAN-12
OPAN-13
OPAN-14
OPAN-17
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
OPAM-01
OPAM-02
OPAM-03
OPAM-04
OPAM-05
OPAM-06
OPAM-07
OPAM-08
OPAM-09
OPAM-10
OPAM-12
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
OPAS-01
OPAS-02
OPAS-03
OPAS-04
OPAS-05
OPAS-06
OPAS-07
OPAS-08
OPAS-09
OPAS-10
OPAS-11
23
OPAC-17
38
OPAN-18
51
OPAM-13
69
OPAS-12
24
OPAC-18
39
OPAN-20
52
OPAM-14
70
OPAS-13
25
OPAC-19
53
OPAM-15
71
OPAS-14
26
OPAC-20
54
OPAM-16
72
OPAS-15
55
OPAM-17
73
OPAS-16
56
OPAM-18
57
OPAM-20
Cuadro 4.3. Lista de los 5 primers polimórficos seleccionados con sus respectivas secuencias de
nucleótidos, rango de amplificación y número de polimorfismos evaluados (C. capsicum
L.)
Secuencia de
Nucleótidos
Nº de
productos
Rango de
Amplificación
5' - 3'
obtenidos
(pb)
(pb)
OPA - 12
OPA - 18
OPA - 20
OPAN - 02
TCGGCGATAG
AGGTGACCGT
GTTGCGATCC
CACCGCAGTT
9 – 23
5 – 18
1 – 13
5 – 21
300 - 1600
300 - 1030
400 - 1640
250 - 1050
940, 799, 682, 560, 478, 343, 301
1005, 824, 681, 565, 545, 506, 436, 334
1532, 1108, 854, 657, 623, 421
1067, 927, 774, 707, 592, 452, 394, 309, 265
OPAS - 01
CTACTGCGCT
1 – 17
350 - 1640
1830, 1093, 799, 733, 593, 480
Primer
Polimorfismos evaluados
59
M
29
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
3054 pb
2036 pb
1636 pb
1018 pb
506 pb
396 pb
344 pb
298 pb
Figura 4.1.
Perfiles RAPDs obtenidos en Capsicum L. con el primer. OPA - 20 Carriles 1 – 29 ADN amplificado. A la izquierda el
tamaño en pares de bases (pb) de algunas bandas polimórficas evaluadas. (M) Marcador. Ecu 2231, Ecu 2233, Ecu
2236, Ecu 2242, Ecu 2243, Ecu 2249, Ecu 2252, Ecu 2258, Ecu 2259, Ecu 2261, Ecu 2262, Ecu 2263, Ecu 2264,
Ecu 2265, Ecu 2266, Ecu 2267, Ecu 2268, Ecu 2269, Ecu 2270, Ecu 2271, Ecu3834, Ecu 5347, Ecu 5357, Ecu 5429,
Ecu 5444, Ecu 5445, Ecu 5462, Ecu 5463, Ecu 5371.
4.1.2.3 Similitud genética
Los valores de similitud obtenidos en la comparación dos a dos entre las
entradas de Capsicum varían entre 0,00 a 0,86 con un valor medio de 0,43.
Los valores obtenidos son similares a otros resultados tales como en cacao
(0,49) (Colombo et al., 2000), tomate de árbol (0,54) (Chalanpuenta D.,
Prado P., 2005), oca (0,72) (Piedra G., 2002). (anexo 3)
4.1.2.4 Análisis de agrupamiento (UPGMA)
Al igual que en el caso de la caracterización morfoagronómica de Tomate de
árbol, (Chalanpuenta D., Prado P., 2005), en el género Capsicum no se
observa una correspondencia con el agrupamiento morfológico ya que con
los resultados del análisis de agrupamiento se ubican en mismo cluster
accesiones que son diferentes morfológicamente. Esto sugiere que hay una
estrecha relación genética entre cada una de las especies,
En cuanto a la robustez de los grupos descritos el análisis boostrap
determinó la robustez estadística de los ecus 5429, 5444, 5445, 5462, 5463,
5371 que pertenecen a la especie C. annum con un valor de 81. Mientras
que los
ecus 2262 y 2263 que pertenecen a la especie C. pubescens
60
25
26
27
28
presentan un valor de 77 que también es significativo. Por último el resto de
accesiones presentan un valor de 58 que es medianamente significativo.
Esto quiere decir que los porcentajes más altos demuestran que las
accesiones que representan a las dos especies C. annum y C. pubescens se
pueden considerar como las más puras del resto de accesiones a pesar de
que se encuentran agrupados en el mismo cluster con diferentes especies.
figura 4.2
Sin embargo en otros estudios realizados los resultados boostrap son más
significativos, así por ejemplo en la colección de P. tuberosus en las
entradas TC525, TC118 y en el grupo de chuines las líneas TC353 y TC354
obtuvieron un valor de 100% (Tapia C., 1998)
El dendograma generado a partir del análisis UPGMA dividió a las 71
entradas de Capsicum en 5 grupos principales representados con los
códigos A, B, C, D y E en la figura 4.2
Grupo A:
Este grupo está formado por nueve entradas de las cuales 6 son C.
bacatum, 1 es sp., 1 es C. frutescens, y 1 es C. annum.
Grupo B:
Está formado por treinta y cuatro entradas, donde 21 son C. pubescens, 1 es
C. baccatum, 10 son C. annum, y 2 pertenecen a C. frutescens.
Grupo C:
Se forma por diecisiete entradas; 11 son C. annum, 5 son C. chinense, y 1
es sp.
Grupo D:
Está formado por diez entradas, de las cuales 6 son C. pubescens, 3 C.
annum, y 1 C. chinense.
Grupo E:
Está formada únicamente por una sola entrada que pertenece a C annum.
61
Figura 4.2 Dendograma en base a datos moleculares de la colección de ají (Capsicum L.) usando en
coeficiente de Jaccard, agrupamiento UPGMA y boostrap.
62
4.1.2.5 Análisis de coordenadas principales (PCO)
La variabilidad representada por los dos primeros vectores se puede
observar en la figura 4.3. El primer vector, que representa el 9,8% de la
variabilidad total dentro del grupo 1, está
formado por dos especies, la
especie C. annum que agrupa a los ecus 5529, 5530, 12840, 12843, 12847
y 12855, y la especie C. chinense que agrupa a los ecus 12841, 12842,
12845, 12848 y 12853. La relación entre estas dos especies se debe a que
comparten características morfológicas al presentar frutos alargados y
redondos, ligera pubescencia en tallo y corrugación en corte transversal del
fruto. EL ecu (12846) al no saber de que especie es, se puede sugerir que
es una mezcla varietal, ya que comparte características como fruto alargado,
y ligera pubescencia en tallos; siendo estas las principales similitudes entre
las especies C. annum y C chinense del resto de especies. anexo 4
Así también en la parte inferior de este mismo vector, tenemos al grupo dos
que está conformado por la especie C. annum con los ecus 6222, 6223 y
7019 y a la especie C. pubescens con los ecus 12835 y 12839. La relación
entre estas dos especies es que presentan un fruto alargado.
A demás se observa un grupo de entradas, los ecus 2231, 2233, 2236,
2242, 2269 y 3834 que corresponden a la especie C. baccatum, y los ecus
11993, 12831, 12833, 12834 y 12870 que pertenecen a la especie C annum.
Se sugiere que existe una mezcla varietal de la especie C. baccatum en
relación a la especie C. annum ya que esta última de acuerdo con el análisis
boostrap es considerada una especie pura; sin embargo la especie C.
baccatum comparte caracteres morfológicos como frutos alargados y
corrugación transversal del fruto, siendo esta la razón por las cual se
encuentran agrupadas en un mismo cluster. anexo 4
Por otra parte el ecu (2261 no está identificado) que también se encuentra
en la zona intermedia del eje, puede ser otra mezcla varietal de las especies
C. annum, y C. baccatum, ya que comparte características morfológicas de
las mismas; como es la forma del fruto que es alargado. Cabe mencionar
63
que esta accesión no fue analizada morfológicamente, pero si fue tomada en
cuenta para el análisis molecular.
En el vector 2 que está representado con un 7.7% de la variabilidad total
observada, forma el grupo cuatro, que pertenece a la especie C. pubescens
con los ecus 2243, 2249, 2252, 2258, 2262, 2263, 2264, 2265, 2266, 2267,
2270 y 2271; así como también la especie C. baccatum con el ecu 2268. En
este grupo es importante mencionar que de acuerdo al análisis boostrap la
especie C. pubescens se considera pura, por tanto la presencia de un ecu
de la especie C. baccatum sugiere que se debe a un mal etiquetado, ya que
el ecu 2268 tiene más características morfológicas y moleculares de la
especie C. pubescens así por ejemplo presenta frutos ligeramente
alargados, corrugación intermedia longitudinal del fruto, floración y
fructificación tardía. Este grupo difiere significativamente del resto de
accesiones.
Finalmente el grupo cinco que se encuentra en una zona intermedia está
conformado por la especie C. pubescens con los ecus 11991, 11992, 12832,
12844, 12849, 12851, 12852, 12857, 12861, 12865, 12866, 12867, 12869; la
especie C. frutescens con los ecus 2259, 5347 y 5357, la especie C. annum
con los ecus 5371, 5429, 5444, 5445, 5462, 5463, 5528, 6225, 12854,
12859, 12864 y 12868; y la especie C. chinense con el ecu 12862. En este
caso de igual manera se sugiere una mezcla varietal entre las especies C.
pubescens y C. annum, ya que las características morfológicas que
comparten se basan en que poseen frutos alargados y, la escasa
pubescencia en hojas; la relación de estas dos especies con la especie C.
chinense se basa en el color de anteras que puede ser morado claro u
oscuro. Por otra parte cabe mencionar que el ecu 12682 que pertenece a la
especie C. chinense puede estar mal etiquetado ya que sus características
morfológicas como corrugación en corte transversal del fruto, floración y
fructificación tardía corresponden a los ecus 5528, 12854, 12859 y 12868
que pertenecen a la especie C. annum, debido a que se encuentran
agrupadas en el mismo cluster. anexo 4
64
Así como en el caso de este género Capsicum, que el análisis PCO permitió
sugerir que existen mezclas varietales entre especies, de igual manera en
otras investigaciones como en oca (Oxalis tuberosa Mol.) (Piedra G. 2002)
se pudo distinguir posibles híbridos; al igual que en P. tuberosus (Tapia C.
1998). De ahí la importancia de este análisis.
Figura 4.3.
Distribución en el plano definido por el primer y segundo eje (C1 y C2) del PCO basado
en el coeficiente de Similitud de Jaccard en la comparación dos a dos de 71 accesiones
de ají (Capsicum L.) con 36 polimorfismos RAPDs.
65
4.1.2.6 Distancia genética de nei
Este análisis se realizó en las 69 accesiones, ya que los
ecus (2261 y
12846) no tienen identificación de especie. (cuadro 4.4)
Cuadro 4.4 Matriz de distancia genética de nei.
A
B
0,232
0,035
0,092
0,108
C
0,215
0,358
0,282
F
0,130
0,168
P
0,248 0.00
C. annum (A)
C. baccatum (B)
C. chinense (C)
C. frutescens (F)
C. pubescens (P)
Como se puede observar en el cuadro, este análisis nos permite ver a que
distancia genética se encuentra una especie de la otra con el fin de ver
cuanta diferencia o similitud hay entre cada una de ellas.
Así por ejemplo, la mayor distancia corresponde a C. baccatum con 0,232,
con respecto a C. chinense; por otra parte, las distancias genéticas entre las
especies analizadas son de diferente orden y sus diferencias son
medianamente significativas.
4.1.2.7 Análisis de varianza molecular (AMOVA)
La descomposición de la varianza mediante el AMOVA determinó que un
23% de la varianza aporta a la diferenciación de las 5 especies analizadas,
mientras que el 77% aporta a la diversidad intraespecífica.
El mayor número de bandas binarias que fue de 34, y la frecuencia de
bandas mayores al 5% que fue de 30 se obtuvo en la especie C. pubescens,
seguido de la especie C. annum con 31 y 27 respectivamente, luego la
especie C. baccatum con 25; la especie C. frutescens con 11 y finalmente la
especie C. chinense con 9 respectivamente. (cuadro 4.5)
66
Cuadro 4.5 Análisis de bandas binarias por población
Población
No. Bandas
No. Frecuencia de
Bandas. >= 5%
No. Bandas Privadas
C.
annum
C.
C.
C.
C.
baccatum chinense frutescens pubescens
31
25
9
11
34
27
0
25
1
9
0
11
0
30
0
Por otra parte se identifico una banda exclusiva de una determinada taxa
para la especie C. baccatumen. Es así que, de acuerdo a estos resultados
la diferenciación genética entre especies es medianamente significativa.
Los valores de PhiPT demuestran que la diferenciación genética entre la
especie C. baccatum y C. chinense es altamente significativa una de la otra
con un valor de 0,440 en relación al resto de especies, ya que la diferencia
genética de las especies C. annum, C. pubescens y C. frutescens no es
significativo.
4.1.2.8 Correlación entre marcadores morfológicos y moleculares
El valor de correlación (r) obtenido a partir de este análisis fue de 0.25
(p=0.60) que es un valor bajo al igual que el obtenido en tomate de árbol
(Chalanpuente D. Prado P., 2005) y otras investigaciones (Beer et al., 1993 y
Scout et al., 1997), en comparación con otros estudios de caracterización
(Tapia, 1998) y (Piedra G. 2002) que son moderadamente significativos; por
tanto este resultado sugiere una correlación baja entre ambos tipos de
información (morfológica y molecular).
Los valores de PhiPT permiten corroborar que la relación entre la fase
morfológica y el análisis molecular no es significativa.
67
4.2.1 Datos pasaporte (Género Cucurbita.)
De las 25 accesiones de Cucúrbitas en estudio, solo cinco fueron colectados
en Ecuador, específicamente en la Provincia de Loja. Las 20 restantes
proceden de varios países de América, Asia, Europa y África. Las colectas
realizadas en la Provincia de Loja, comprenden altitudes entre los 1200 y
2010 m.s.n.m. (anexo 5)
4.1.4 GÉNERO Cucurbita L.
De las 30 accesiones de esta especie, cinco fueron eliminados por escasez
de semilla en el Banco de Germoplasma del INIAP, por lo que fueron
excluidas del análisis molecular. Los datos moleculares registrados para las
25 accesiones restantes se muestran en el anexo 6.
4.2.2.1 Caracterización molecular de Cucurbita L.
Con el protocolo de extracción de ADN de Caña de Azúcar de Dellaporta
et.al, se logro obtener un ADN de buena calidad, con rendimientos que
oscilaron entre 1.66 y 50 ug/muestra, con una media de 11.83 ug/muestra de
ADN (cuadro 4.6).
Cuadro 4.6. Rendimiento de ADN de 25 accesiones de Cucúrbita L. de germoplasma del DENAREF –
INIAP.
ENTRADA
CANTIDAD ENTRADA
CANTIDAD
ADN(ug)
ADN(ug)
ECU - 4976
ECU - 4977
ECU - 4978
ECU - 4979
ECU - 4980
ECU - 4981
ECU - 4983
ECU - 4984
ECU - 4992
5
5
5
5
3.32
6.25
3.32
12.5
3.32
ECU - 5326
ECU - 5329
ECU - 5330
ECU - 5338
ECU - 5343
ECU - 12382
ECU - 12393
ECU - 12399
ECU - 12400
ECU - 5308
16.6
ECU - 12408
5
Media = 11.83
ECU - 5309
25
ECU - 5310
ECU - 5311
ECU - 5312
16.6
25
16.6
ECU - 5313
25
50
3.32
25
3.32
12.5
5
5
1.66
1.66
68
4.2.2.2 Productos de amplificación
En un sondeo preliminar de 30 primers arbitrarios se seleccionaron 8 primers
(OPA–09, OPA–12, OPA–19, OPAC–03, OPAC–05, OPAC–08, OPAC–09,
OPAC–11), que generaron alrededor de 98 bandass RAPDs de los cuales
51 se consideraron polimórficas, con una tasa de polimorfismo de 2,04
polimorfismos por primer. El número de bandas oscilo entre 3 a 18 productos
RAPDs obtenidos y el tamaño de las bandas varió de 250 a 1640pb (cuadro
4.7 y 4.8). En la figura 4.4 se muestra un ejemplo de la amplificación
obtenida.
Cuadro 4.7.
Lista de primers ensayados en el screening de polimorfismo en C. cucurbita L.
#
Primer
#
Primer
#
Primer
1
OPA 06
11
OPAC 01
21
OPAC 17
2
OPA 09
12
OPAC 03
22
OPAC 18
3
OPA 12
13
OPAC 05
23
OPAC 19
4
OPA 13
14
OPAC 08
24
OPAC 20
5
OPA 15
15
OPAC 09
25
OPAN 02
6
OPA 15
16
OPAC 11
26
OPAN 03
7
OPA 17
17
OPAC 12
27
OPAN 04
8
OPA 18
18
OPAC 13
28
OPAN 07
9
OPA 19
19
OPAC 15
29
OPAN 09
10
OPA 20
20
OPAC 16
30
OPAN 10
Cuadro 4.8. Lista de los 8 primers polimórficos seleccionados con sus respectivas secuencias de
nucleótidos, rango de amplificación y número de polimorfismos evaluados (C. cucurbita
L.)
Secuencia de
Nº de
Rango de
Nucleótidos
productos
Amplificación
5' - 3'
obtenidos
(pb)
OPA – 09
GGGTAACGCC
3 – 14
300 - 1030
1053, 905, 825, 757, 520, 370
OPA - 12
TCGGCGATAG
4 – 13
300 - 1500
1370, 1175, 1067, 815, 689, 520, 462, 410
OPA - 19
CAAACGTCGG
3 – 13
250 - 1640
1327, 1213, 1065, 979, 736, 680, 654, 558
OPAC - 03
CACTGGCCCA
6 – 18
250 - 1500
1577, 1162, 1106, 713, 679, 615, 528
OPAC - 05
GTTAGTGCGG
6 – 17
350 - 1020
942, 756, 683, 590, 491, 469, 449
OPAC - 08
TTTGGGTGCC
3 – 11
450 - 1050
1233, 894, 852, 535
OPAC - 09
AGAGCGTACC
4 – 12
400 - 1100
1164, 972, 751, 690, 608
OPAC - 11
CCTGGGTCAG
6 –15
450 - 1100
1246, 1131, 982, 857, 687, 551
Primer
Polimorfismos evaluados
(pb)
69
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 (-)
3054 pb
2036 pb
1636 pb
1018 pb
506 pb
396 pb
344 pb
298 pb
Figura 4.4.
Perfiles RAPDs obtenidos en Cucurbita L. con el primer. OPAC - 11 Carriles 1 – 25 ADN amplificado. A la izquierda
el tamaño en pares de bases (pb) de algunas bandas polimórficas evaluadas. (M) Marcador, (-) control negativo,
Ecu 4976, Ecu 4977, Ecu 4978, Ecu 4979, Ecu 4980, Ecu 4981, Ecu 4983, Ecu 4984, Ecu 4992, Ecu 5308, Ecu
5309, Ecu 5310, Ecu 5311, Ecu 5312, Ecu 5313, Ecu 5326, Ecu 5329, Ecu 5330, Ecu 5338, Ecu 5343, Ecu 12382,
Ecu 12393, Ecu 12399, Ecu 12400, Ecu 12408.
4.1.4.3 Similitud genética
Los valores de similitud obtenidos en la comparación dos a dos entre las
entradas de Cucúrbitas varían entre 0,21 a 0,89 con un valor medio de 0,55.
Los valores obtenidos son similares a otros resultados tales como para
cacao (0,49) (Colombo et al., 2000), tomate de árbol (0,54) (Chalanpuenta
D., Prado P., 2005), oca (0,72) (Piedra G., 2002). (anexo 7)
4.1.4.4 Analisis de agrupamiento (UPGMA)
Del agrupamiento UPGMA se observa una correspondencia con el
agrupamiento morfológico, sugiriendo una diferenciación genética entre las
especies analizadas.
En cuanto a la robustez de los grupos descritos, el análisis boostrap
determinó la robustez estadística de la especie C. pepo con un valor de 72 y
de C. moschata con 70.
70
En otros estudios realizados los resultados boostrap son más significativos,
así por ejemplo en la colección de P. tuberosus en las entradas TC525,
TC118 y en el grupo de chuines las líneas TC353 y TC354 obtuvieron un
valor de 100% (Tapia C., 1998), en el género Capsicum los ecus 5429, 5444,
5445, 5462, 5463, 5371 que pertenecen a la especie C. annum 81%.
El dendograma generado a partir del análisis UPGMA dividió a las 25
entradas de Cucúrbitas en 4 grupos principales representados con los
códigos 1, 2, 3, y 4 en la figura 4.5.
Grupo 1:
Este grupo está formado por dos entradas que pertenecen a la especie C.
pepo.
Grupo 2:
Está formado por ocho entradas, pertenecientes a la especie C. pepo.
Grupo 3:
Se forma por diez entradas; pertenecientes a la especie C. moschata.
Grupo 4:
Está formado por cinco entradas, que pertenecen a la especie C.
argyrosperma.
71
Figura 4.5. Dendograma en base a datos moleculares de la colección de Calabazas (Cucurbita L.)
usando
en coeficiente de Jaccard y el agrupamiento UPGMA.
4.2.2.5 Análisis de coordenadas principales (PCO)
La variabilidad representada por los dos primeros vectores se puede
observar en la figura 4.6. El primer vector, que representa el 18% de la
varianza total pertenece a la especie C. pepo, mismo que está conformado
por los ecus
4976, 4977, 4978, 4979, 4980, 4981, 4983, 4984, 4992 y
12382; es necesario mencionar que este último ecu en el análisis
morfológico, se agrupó en la especie C. moschata, no así en el molecular.
anexo 8
72
A demás, se puede observar un grupo de entradas correspondientes a los
ecus 5326, 5329, 5330, 5338, 5343 de la especie C. argyrosperma,
localizados en una posición intermedia del eje entre el vector 1 y 2
respectivamente.
En el vector 2 que está representada con un 13% de la variabilidad total
observada, agrupa a los ecus 5308, 5309, 5310, 5311, 5312, 5313, 12393,
12399, 12400 y 12408 que corresponden a la especie C. moschata. anexo 8
Finalmente de acuerdo a este análisis se puede observar que cada especie
está agrupada en un mismo cluster, por lo que difiere significativamente a
nivel molecular una especie de la otra.
Mientras que en otros cultivos como en el caso del género Capsicum se
sugiere que existen mezclas varietales entre especies, o mala etiquetación
de las mismas; así también, en otras investigaciones como en oca (Oxalis
tuberosa Mol.) (Piedra G. 2002) se pudo distinguir posibles híbridos; al igual
que en P. tuberosus (Tapia C. 1998).
Figura 4.6.
Distribución en el plano definido por el primer y segundo eje (C1 y C2) del PCO basado
en el coeficiente de Similitud de Jaccard en la comparación dos a dos de 25 accesiones
de calabazas (Cucurbita L.) con 51 polimorfismos RAPDs.
73
4.1.2.6 Distancia genética de nei
Este análisis se realizo en las 25 accesiones de calabazas. (cuadro 4.9)
Cuadro 4.9. Matriz de distancia genética de nei.
A
M
0,324
0,372
P
0,362 0.00
Especie
C. argyrosperma (A)
C. moschata (M)
C. pepo (P)
En este análisis podemos observar la diferencia genética entre cada
especie, así por ejemplo; la mayor distancia corresponde a C. pepo con
0,372, con respecto a C.argyrosperma. Sin embargo las distancias genéticas
entre las especies analizadas son del mismo orden y sus diferencias no
parecen significativas.
4.2.2.7 Análisis de varianza molecular (AMOVA)
La descomposición de la varianza mediante el AMOVA determino que un
38% de la varianza aporta a la diferenciación de las 3 especies analizadas,
mientras que el 62% aporta a la diversidad intraespecífica.
El mayor número de bandas binarias así como la frecuencia de bandas
mayores al 5% por especie! que fue de 45, se obtuvo en la especie C. pepo ,
seguido de la especie C.moschata con 42 y finalmente la especie C
argyrosperma con 35 respectivamente (cuadro 4.10)
Cuadro 4.10 Análisis de bandas binarias por especie
Población
No. Bandas
No. Frecuencia de
Bandas. >= 5%
No. Banda Privadas
C.
C.
C.
argyrosperma moschata pepo
35
42
45
35
0
42
1
45
2
74
Por otra parte se identificaron bandas exclusivas de un determinado taxa, así
por ejemplo una para la especie C. moschata y dos para C. pepo.
Los valores de PhiPT demuestran que cada especie se identifica
significativamente una de la otra, siendo la más alta diferencia genética entre
la especie C. moschata y C. pepo con un valor de 0,390.
4.2.2.8 Correlación entre marcadores morfológicos y moleculares
El valor de correlación (r) obtenido fue de 0.49 (p=0.002), que es un valor
relativamente bajo en comparación con otros estudios de caracterización
(Chalanpuente D., Prado P., 2005); (Tapia, 1998 y Piedra G. 2002), lo que
sugiere una correlación moderada entre ambos tipos de información
(morfológica y molecular).
Sin embargo con los valores de PhiPT permite corroborar que la relación
entre la fase morfológica y el análisis molecular es significativa.
Otros autores reportan así mismo correlaciones moderadas (ej, oca, Piedra
G. 2002 y jícama, Tapia C. 1998), y correlaciones bajas (tomate de árbol,
Chalanpuente D., Prado P., 2005).
4.3 Hipótesis
Una vez obtenidos y discutidos los resultados de la colección nacional de ají
y calabazas, se confirma la variabilidad genética.
75
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones género (Capsicum L.)
La caracterización molecular, diferencio cinco grupos que se conforman
de la siguiente manera: (Grupo A, C. baccatum, C. frutescens, C. annum
y sp), (Grupo B, C. pubescens,
C. baccatum,
C. annum, y C.
frutescens), (Grupo C, C. annum, C. chinense, y sp.), (Grupo D, C.
pubescens, C. annum, y C. chinense.), (Grupo E, C annum).
No se obtuvo un agrupamiento definido de cada una de las especies,
debido a la estrecha relación genética que existe entre las accesiones de
Capsicum spp.
La técnica RAPDs no detecto una mínima variación genética del
germoplasma en estudio.
El análisis “bosstrap” determinó a los ecus 5429, 5444, 5445, 5462, 5463,
5371 como las especies más puras al tener un porcentaje del 81%.
El Análisis PCO detectó posibles mezclas varietales de los ecus 12846 y
2261.
La PCO también detectó un mal etiquetado del ecu 2268 y 12682.
La distancia de nei determinó que la mayor distancia genética está entre
la especie C. baccatum y C. chinense con 0.232.
El análisis AMOVA determinó que un 23% corresponde a la
diferenciación genética entre especies, mientras que el 77% aporta a la
diversidad intraespecífica.
76
El valor de correlación entre datos morfológicos y moleculares no fue
significativo (0,25), demostrando un bajo grado de concordancia entre
estas dos etapas.
Los análisis empleados para la obtención de resultados moleculares en
ají son fundamentales para la identificación de la variabilidad genética.
77
5. 2 Conclusiones género (Cucurbita L.)
En el género cucúrbitas se identificó cuatro grupos: (Grupo A, C.
pepo), (Grupo B, C. pepo), (Grupo C, C. moschata.), (Grupo D,
argyrosperma.).
Se obtuvo un agrupamiento definido tanto en el análisis UPGMA
como en la PCO de cada una de las especies, debido a una marcada
diferencia genética que existe entre estas.
En este caso, la técnica RAPDs si detectó una variación genética.
El análisis “bosstrap” determinó a los ecus 4976 y 4978 de la especie
C. pepo como las más puras con un valor de 72%.
La distancia de nei determinó que la mayor distancia genética está
entre la especie C. pepo y C. argyrosperma con 0.372.
El análisis AMOVA determinó que un 38% corresponde a la
diferenciación genética entre especies, mientras que el 62% aporta a
la diversidad intraespecífica.
El valor de correlación entre datos morfológicos y moleculares fue
relativamente bajo (0,49), demostrando una correlación moderada
entre estas dos etapas.
78
5.3 Recomendaciones
Realizar una nueva evaluación molecular principalmente del género
capsicum, utilizando técnicas más eficientes en la detección de
polimorfismos como son Microsatélites (Abrev. SSRs, del inglés
Simple Sequence Repeats), AFLPs (Del inglés Amplified Fragment
Length Polymorphism).
Es importante para futuras investigaciones obtener una mayor
cantidad de polimorfismos, ya sea de estas especies en estudio como
de otras, ya que proporcionaría un mejor conocimiento de la
variabilidad genética.
Se recomienda evitar la mezcla de cultivares de distintas especies en
un mismo sitio, ya que existen plantas alógamas como es el caso de
las calabazas que intercambian material genético y producen mezclas
varietales.
Se debería establecer estrategias para la conservación in situ y ex
situ
tanto de cucúrbitas como de capsicum, para mantener la
diversidad y evitar la erosión genética. Ya que en la actualidad es el
principal problema debido a la introducción de nuevas variedades
comerciales.
79
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88
ANEXOS
Género Cucurbita L.
Anexo 1.
Datos pasaporte de la colección nacional de Capsicum L.
Código
de Banco
(ECU)
Genero
Especie
Nombre
común
No. Colector
Colector
Localidad
Observaciones
2 231
Capsicum
baccatum
Ají
ECU-05-0005
C. Nieto
ECU, Cotopaxi, Salcedo, Salcedo, 2 600
msnm, 00.55S, 79.36W
Planta verde intenso, frutos
pequeños.
2 233
Capsicum
baccatum
Ají
ECU-06-0007
C. Nieto, E.
Peralta
ECU, Chimborazo, Guamote, La Matriz,
Matriz, 3 063 msnm, 01.55S, 78.42W
Frutos rojos, largos y
delgados.
2 236
Capsicum
baccatum
Ají
ECU-19-0010
2 242
Capsicum
baccatum
Ají
ECU-06-0016
C. Nieto, E.
Peralta
ECU, Chimborazo, Penipe, Penipe, 2 460
msnm, 01.33S, 78.31W
2 243
Capsicum
pubescens
Ají
ECU-04-0017
R. Castillo
ECU, Carchi, Montúfar, Pioter, Pioter, 3 378
msnm, 00.39N, 77.47W
2 249
Capsicum
pubescens
Ají
ECU-11-0023
A. Ortega, R.
Castillo, J.
Sánchez
ECU, Loja, Gonzanamá, Gonzanamá,
Gonzanamá, 2 045 msnm, 04.13S, 79.25W
2 252
Capsicum
pubescens
Ají
ECU-11-0026
A. Ortega, R.
Castillo, J.
Sánchez
ECU, Loja, Gonzanamá, Gonzanamá,
Gonzanamá, 2 045 msnm, 04.13S, 79.25W
2 258
Capsicum
pubescens
Ají rocoto
ECU-0032
R. Castillo,
G. García, M.
Holle
ECU, Loja, Loja, Yangana, Yangana, 1 200
msnm, 04.24S, 78.28W
2 259
Capsicum
frutescens
Ají dulce
ECU-0033
M. Holle, R.
Castillo, F.
Vivar
ECU, Loja, Calvas, El Lucero, El Lucero, 1
200 msnm, 04.24S, 79.28W
2 261
Capsicum
spp.
PER-0035
R. Castillo,
E. Peralta
PER, Cusco, Cusco, Cusco, 3 500 msnm
2 262
Capsicum
pubescens
Chauchamushuri
ECU-0036
ECU, Tungurahua, Patate, Hacienda San
Luis, 2200 msnm, 01.18S, 78.30W
R. Castillo, J. ECU, Imbabura, Otavalo, San Pablo, Gualabí,
Ochoa
2 780 msnm, 00.10N, 78.12W
Fruto muy aromático.
Fruto rojo, pequeño.
Fruto grande, alargado.
Continuación Anexo 1.
2 263
2 264
Capsicum
pubescens
Capsicum
pubescens
Ají rocoto
ECU-0037
Ají poncho
amarillo
ECU-0038
R. Castillo, J.
ECU
Ochoa
E. Peralta, C. ECU, Azuay, Oña, Oña, Baijón, 2 372 msnm,
Nieto
03.27S, 79.09W
2 265
Capsicum
pubescens
Ají rocoto
ECU-0039
E. Peralta, C.
Nieto
ECU, Loja, Saraguro, Saraguro, Saraguro, 2
500 msnm, 04.24S, 79.28W
2 266
Capsicum
pubescens
Ají
ECU-0040
E. Peralta, C.
Nieto
ECU, Loja, Saraguro, La Matriz, San
Francisco, 2 500 msnm, 04.24S, 79.28W
2 267
Capsicum
pubescens
Ají
redondo
ECU-0041
E. Peralta, C.
Nieto
ECU, Loja, Saraguro, La Matriz, San
Francisco, 2 500 msnm, 04.24S, 79.28W
2 268
Capsicum
baccatum
Ají rocoto
ECU-0042
E. Peralta, C.
Nieto
ECU, Azuay, Sigsig, Gima, Hierbabuena, 3
000 msnm, 03.18S, 78.51W,
2 269
Capsicum
baccatum
Ají yunga
ECU-0043
E. Peralta, C.
Nieto
ECU, Loja, Saraguro, El Tablón, San José,
2680 msnm, 03.30S, 79.22W
2 270
Capsicum
pubescens
Ají rocoto
ECU-0044
E. Peralta, J.
Tola
ECU, Loja, Saraguro, Celán, Santa Rosa,
2620 msnm, 03.34S, 79.18W
2 271
Capsicum
pubescens
Ají
ECU-0045
E. Peralta, J. ECU, Loja, Saraguro, Urdaneta, Baber, 2 640
Tola
msnm, 03.36S, 79.11W
3 834
Capsicum
baccatum
Ají
RC-1074
5 347
Capsicum
frutescens
Capsicum
frutescens
5 357
R. Castillo
ECU
Frutos rojo intenso, de 1 cm
de diámetro.
PI-188477
MEX
Cultivar Uvilla.
PI-281396
MEX
Continuación Anexo 1
5 429
5 444
5 445
5 462
5 463
5 371
5 528
5 529
5 530
6 222
Capsicum
annuum
Capsicum
annuum
Capsicum
annuum
Capsicum
annuum
Capsicum
annuum
Capsicum
annuum
Capsicum
annuum
Capsicum
annuum
Capsicum
annuum
Capsicum
annum
PI-511884
MEX
PI-224405
MEX
PI-260436
BOL
PI-511879
MEX
PI-511880
MEX
PI-438657
MEX
Cultivar Guajillo ancho.
PI-438616
MEX
Cultivar Xcatic.
PI-5529
MEX
Cultivar Dulce.
PI-438662
MEX
Cultivar Pimento.
Ají rocoto
CS-076
C. Tapia, J.
Velásquez
ECU, Napo, Quijos, Cuyuja, Cuyuja, 2 400
msnm
6 223
Capsicum
annum
Ají rocoto
CS-077
C. Tapia, J.
Velásquez
ECU, Napo, Quijos, Cuyuja, Cuyuja, 2 400
msnm
6 225
Capsicum
annum
Ají
CS-082
C. Tapia, J.
Velásquez
ECU, Napo, Quijos, Cuyuja, Cuyuja, 2 260
msnm
7 019
Capsicum
annuum
Ají rocoto
JEE-023
J. Estrella
ECU, Pichincha, Quito, San José de Minas, 2
450 msnm
Planta de estructura
arbórea. Frutos rojos
brillantes.
11 991
Capsicum
pubescens
Ají rocoto
WTS-9
K. Williams,
C. Tapia
ECU, Carchi, Tulcán, Malgonada, El Laurel, 2
490 msnm, 0.50.027N, 78.3.303W
Fruto rojo intenso, 5-6 cm
largo x 8 ancho, lobado en
pedicelo, ápice hundido.
Continuación Anexo 1.
11 992
Capsicum
pubescens
11 993
Capsicum
annuum
Ají rocoto
WTS-13
K. Williams,
C. Tapia
ECU, Imbabura, Cotacachi, Apuela, Santa
Rosa, 1 660 msnm, 0.21.274N, 78.30.757W
Fruto 6x4 cm., rojo brillante,
cordado en pedicelo y
hundido en ápice. Picante
WTS-14
K. Williams,
C. Tapia
ECU, Imbabura, Cotacachi, Apuela, Santa
Rosa, 1 660, 0.21.274N, 78.30.757W
Fruto 6x2cm, rojo brillante,
pedicelo obtuso y ápice
punteado. Flor blanca.
CTMTFP-001
C. Tapia, M.
Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Imbabura: Pimampiro,
Pimampiro. Barrio San José. 0°22.844’N,
77°56.835W. 2 200 msnm.
Tres meses de cultivo.
Siembra: 30 x 50.
12 831
Capsicum
annuum
12 832
Capsicum
pubescens
CTMTFP-008
C. Tapia, M.
Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Carchi. Tulcán, Maldonado,
Bellavista. 0°50.552’ N, 78°04.003 W. 2
320 msnm.
Poco picante. Altura: 80 cm.
Pétalos blancos con base
morada.
12 833
Capsicum
annuum
CTMTFP-014
C. Tapia, M.
Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Imbabura. Antonio Ante.
Chaltura. El Rosario.
0°29.998’N, 78°11.588W. 2 190 msnm.
Asociación con tomate de
árbol.
12 834
Capsicum
annuum
CTMTFP-015
C. Tapia, M.
Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Imbabura. Urcuquí. Pablo Arenas.
Plaza Barba Donoso. 0°29.998’N,
78°11.588’W. 2 210 msnm.
12 835
Capsicum
pubescens
CTMTFP-018
C. Tapia, M:
Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Imbabura. Urcuquí. Cahuasquí.
Santo Domingo. 0°30.584’, 78°12.836’W. 2
245 msnm.
La planta tiene cinco años de
vida.
12 839
Capsicum
pubescens
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha. Barrio
Lourdes. 4°03.711’S, 79°38.917’W. 1 710
msnm.
Tres plantas maduras
ají
Pubescens
MTFP-002
Pubescens
Continuación Anexo 1.
12 840
Capsicum
annuum
MTFP-003
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha.
Mercado Central. 4°03.711’S, 79°39.283’W.
1 710 msnm.
12 841
Capsicum
chinense
MTFP-004
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha.
Mercado Central.. 4°03.711’S, 79°39.283’W.
1 710 msnm.
12 842
Capsicum
chinense
MTFP-005
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha. Centro
Comercial Paltense. 4°03.711’S,
79°39.283’W. 1 710 msnm.
Muy picante. Se puede
localizar en le sector La
Supa. Color amarillo.
12 843
Capsicum
annuum
MTFP-006
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha. Centro
Comercial Paltense. 4°03.711’S,
79°39.283’W. 1 710 msnm.
Muy picante.
12 844
Capsicum
pubescens
MTFP-007
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha. Centro
Comercial Paltense. 4°03.711’S,
79°39.283’W. 1 710 msnm.
MTFP-008
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha. El
Progreso. 4°03.533’S, 79°38.842’W. 1 700
msnm.
MTFP-009
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha. Barrio
Santa Marianita. 4°03.287’S, 79°38.502’W.
1 640 msnm.
Fruto alargado
Pubescens
12 845
Capsicum
chinense
12 846
12 847
Capsicum
annuum
MTFP-010
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha.
Chapongo. 4°02.539’S, 79°38.195’W. 1 570
msnm.
12 848
Capsicum
chinense
MTFP-011
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Paltas. Catacocha. Barrio
Sigro. 3°59.525’S, 79°35.436’W. 1 800
msnm.
Muy picante. Pequeño.
Muy picante
Continuación Anexo 1.
12 849
Capsicum
pubescens
MTFP-012
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. Sucre. Plateado Bajo. Muy picante. Altura: 2 m
3°58.883’S, 79°13.876’W. 2 075 msnm.
12 851
Capsicum
pubescens
MTFP-014
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. El Valle. Jipiro Alto.
3°58.087’S, 79°11.464’W. 1 940 msnm.
El picante pasa rápido.
12 852
Capsicum
pubescens
MTFP-017
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. Yangana. Yangana.
4°22.338’S, 79°10.481’W. 1 740 msnm.
Picante. Altura: 1.50 m
12 853
Capsicum
chinense
MTFP-018
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. Yangana. Yangana.
4°22.338’S, 79°10.481’W. 1 740 msnm.
Suave. Altura: 1.50 m
12 854
Capsicum
annuum
MTFP-020
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. Yangana. Yangana
Centro. 4°21.913’S, 79°10.617’W. 1 655
msnm.
12 855
Capsicum
annuum
MTFP-021
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. Yangana. Yongana
Centro. 4°21.913’S, 79°10.617’W. 1 655
msnm.
12 857
Capsicum
pubescens
MTFP-023
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. Yangana. Yangana
Centro. 4°21.932’S, 79°10.544’W. 1 670
msnm.
12 859
Capsicum
annuum
MTFP-027
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. Yangana. Barrio
Soro. 4°21.984’S, 79°10.600’W. 1 650
msnm.
Altura con guía: 4 m
12 861
Capsicum
pubescens
MTFP-029
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. Malacatas. Centro.
4°13.123’S, 79°15.606’W. 1 395 msnm.
Muy picante.
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Loja. Loja. Malacatas. Santanilla. Picante.
4°13.422’S, 79°16.060’W. 1 450 msnm.
Pubescens
Pubescens
Pubescens
12 862
Capsicum
chinense
MTFP-030
Pubescens
Continuación Anexo 1.
12 864
Capsicum
annuum
MTFP-038
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Azuay. Gualaceo. Bulcay.
Centro. 2°51.993’S, 78°46.634’W. 2 040
msnm.
Rojo
12 865
Capsicum
pubescens
MTFP-039
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Azuay. Gualaceo. Bulcay.
Centro. 2°51.993’S, 78°46.634’W. 2 040
msnm.
Rocoto: rojo y pequeño
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Azuay. Gualaceo. Bulcay.
Centro. 2°51.993’S, 78°46.634’W. 2 040
msnm.
Rocoto: rojo y grande
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Azuay. Gualaceo. Bulcay.
Centro. 2°51.993’S, 78°46.634’W. 2 040
msnm.
Rocoto: verde y grande
Pubescens
12 866
Capsicum
pubescens
MTFP-040
Pubescens
12 867
Capsicum
pubescens
MTFP-041
Pubescens
12 868
Capsicum
annuum
MTFP-045
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Pelileo. San
Blas. 1°19.964’S, 78°31.867’W. 2 350
msnm.
12 869
Capsicum
pubescens
MTFP-046
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Pelileo. San
Blas. 1°19.964’S, 78°31.867’W. 2 350
msnm.
12 870
Capsicum
annuum
M. Tacán, F.
Paredes
Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Pelileo.
Guadalupe. 1°20.081’S, 78°31.556’W. 2 350
msnm.
Pubescens
MTFP-049
Anexo 5.
ECU
Datos pasaporte de la colección nacional de Cucúrbita L.
Género
Especie
Nombre
común
No.
Colector
Colector
Localidad
Observaciones
Cultivar Yumurta.
4 976
Cucurbita pepo
PI-173681
USDA
TUR
4 977
Cucurbita pepo
PI-181912
USDA
SYR
4 978
Cucurbita pepo
PI-5 3320
USDA
HUN, Tapioszele
Cultivar Ovari Feher.
4 979
Cucurbita pepo
PI-508468
USDA
COR, Seúl
Cultivar Golden Zucchini.
4 980
Cucurbita pepo
PI-418966
USDA
CHN
4 981
Cucurbita pepo
PI-357931
USDA
YUG
4 983
Cucurbita pepo
PI-234616
USDA
ZAF
4 984
Cucurbita pepo
PI-267757
USDA
USA, Iowa
Cultivar Long Green
Bush.
Cultivar Buff Pie.
4 992
Cucurbita pepo
PI-234617
USDA
ZAF
Cultivar Skorsie.
5 308
Cucurbita moschata
PI-371941
MEX
5 309
Cucurbita moschata
PI-419083
CHN
5 310
Cucurbita moschata
PI-288239
EGY
5 311
Cucurbita moschata
PI-267754
ITA
Cultivar Gian Spanish
G8785.
5 312
Cucurbita moschata
PI-244706
BRA
Cultivar Paca 595.
5 313
Cucurbita moschata
PI-234251
JPN
Cultivar White Rind
Sugar.
5 326
Cucurbita
argyrosperma
Cucurbita
argyrosperma
Cucurbita
argyrosperma
Cucurbita
argyrosperma
Cucurbita
argyrosperma
PI-512 12 6
MEX
PI-438720
MEX
PI-442237
MEX
PI-458722
ARG
PI-489692
GTM
5 329
5 330
5 338
5 343
Continuación Anexo 5.
12382 Cucurbita pepo
12 393
Lineño
Cucurbita moschata
12399 Cucurbita moschata
2 de mate
TACT-433
C. Tapia,
T.Andres
TACT-447
C. Tapia,
T.Andres
TACT-455
C. Tapia,
T.Andres
Ecuador, Loja, Catamayo,San Pedro de la Bendita
Santiago, 2010 msnm, 03.59S, 79.30W
Ecuador, Loja, Celica, Cerro Verde, 1300 msnm, 04.10S, 79.5 3W
Ecuador, Loja, Gonzanamá, Sacapalca, La casa vieja,
Duplicado para Cucurbit
Network, New York, USA.
Duplicado para Cucurbit
Network, New York, USA.
Duplicado para Cucurbit
Network, New York, USA.
1500 msnm, 04.09S, 79.32W,
12400 Cucurbita moschata
TACT-456
C. Tapia,
T.Andres
Ecuador, Loja, Catamayo, Poroto, 12 00 msnm, 04.02S,79,22W
Duplicado para Cucurbit
Network, New York, USA.
Cucurbita moschata
TACT-466
C. Tapia,
T. Andres
Ecuador, Loja, Vilcabamba, San Pedro de Vilcabamba, 1600msnm
Duplicado para Cucurbit
Network, New York, USA.
12408
Anexo 6. Matriz Básica de Datos (MBD) generada a partir de Datos Moleculares de Cucúrbita L.
Nº
ECU
1
4976
2
4977
3
4978
4
4979
5
4980
6
4981
7
4983
8
4984
9
4992
10
5308
11
5309
12
5310
13
5311
14
5312
15
5313
16
5326
17
5329
18
5330
19
5338
20
5343
21
12382
22
12393
23
12399
24
12400
25
12408
A9-1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
1
1
A9-2
A9-3
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
A9-4
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
0
0
1
1
0
1
1
1
1
1
A9-5
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
0
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
A9-6
A 12 - 1
0
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
A 12 - 2
A 12 - 3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
A 12 - 4
1
0
1
0
0
0
0
0
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1
1
1
1
Anexo 7. Matriz de similitud generada a partir de datos moleculares de Cucúrbita L.
ECU-4976
ECU-4976
ECU-4977
ECU-4978
ECU-4979
ECU-4980
ECU-4981
ECU-4983
ECU-4984
ECU-4992
ECU-5308
ECU-5309
ECU-5310
ECU-5311
ECU-5312
ECU-5313
ECU-5326
ECU-5329
ECU-5330
ECU-5338
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1
ECU-4977
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ECU-4978
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ECU-4979
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1
ECU-4980
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1
ECU-4981
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1
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1
ECU-4992
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1
ECU-5308
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ECU-5309
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1
ECU-5310
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ECU-5311
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ECU-5312
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ECU-5313
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ECU-5326
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0,3030303
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ECU-5329
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ECU-5330
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ECU-5338
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ECU-5343
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0,1714286
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0,5
0,44
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0,4285714
1
ECU-12382
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0,2727273
0,4333333
0,5416667
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0,4642857
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0,4
0,2285714
0,2352941
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0,3448276
0,2916667
0,1666667
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0,2307692
0,1851852
1
ECU-12393
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0,2368421
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0,4
0,4117647
0,3529412
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0,3428571
0,4117647
0,4242424
0,5333333
0,516129
0,4666667
0,3846154
0,25
0,1621622
0,2727273
0,3703704
0,2333333
0,4444444
ECU-12399
0,125
0,2702703
0,2777778
0,3055556
0,3666667
0,3823529
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0,3529412
0,3529412
0,46875
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0,6071429
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0,4583333
0,3
0,1666667
0,3225806
0,3846154
0,2413793
0,3103448
ECU-12400
0,1935484
0,3333333
0,2702703
0,3333333
0,4
0,3714286
0,3529412
0,3823529
0,3428571
0,5
0,46875
0,5862069
0,6206897
0,4666667
0,5
0,25
0,1944444
0,3125
0,3703704
0,1935484
0,3
ECU-12408
0,2666667
0,2894737
0,2972973
0,3243243
0,34375
0,3243243
0,3055556
0,3333333
0,2972973
0,53125
0,4117647
0,516129
0,5483871
0,4516129
0,4230769
0,2424242
0,2222222
0,3030303
0,3103448
0,2258065
0,25
Continuación anexo 7
ECU-12393
ECU-12399
ECU-12400
ECU-12408
1
0,7916667
1
0,6923077
0,8695652
1
0,6071429
0,76
0,875
1