Francisco Javier ACOSTA REYES: Interacción de ADN rico en

Francisco Javier Acosta-Reyes
Departament d’Enginyeria Química, Universitat Politècnica de Catalunya, Barcelona, España.
Doctorado en Polímeros y Biopolímeros
Contacto: [email protected], http://macrom.upc.edu/
INTERACCIÓN DE ADN RICO EN ADENINAS Y TIMINAS CON DROGAS
Abstract
El estudio de estructural a nivel atómico del ADN resulta de gran interés, en particular para secuencias ricas
en adeninas y timinas (ATs), ya que estas constituyen principalmente regiones no codificantes etiquetadas
inicialmente como ADN basura, pero que recientemente se ha descrito que desempeñan un papel importante
mediante funciones de regulación y estructurales. En nuestra investigación nos hemos enfocado en las
interacciones entre ADN rico en ATs y drogas (fármacos experimentales). Recientemente hemos determinado la
estructura del octámero A4T4 con la droga 4.4’-Bis(imidazolinilamino)difenilamina, un agente antiparasitario en
fase de pruebas contra la tripanosomiasis y la malaria. Esta droga interactúa con el surco estrecho de ADN con
especificidad por secuencias AATT y AAAA.
Uno de los principales objetivos del estudio de las interacciones entre drogas y ADN es la identificación de
potenciales drogas contra enfermedades especificas o anticancerígenas. En nuestro caso es contra enfermedades
relegadas en la búsqueda de curas, por ser predominantes en países en vías de desarrollo. Como es el caso de la
tripanosomiasis africana o la malaria que es provocada por el Plasmodium falsiparum cuyo genoma presenta un
contenido de 80% de ATs, lo que lo convierte en una diana perfecta para nuestros estudios. Siendo México uno
de los países Americanos con presencia de malaria o paludismo, según se ha reportado en el “World Malaria
Report 2012” por el “World Health Organization”.
Así mismo identificar las particularidades estructurales que permiten la interacción entre una droga y una
secuencia especifica de ADN podría permitir en el futuro un diseño mas racionalizado de las drogas para poder
combatir enfermedades especificas y disminuir efectos colaterales de las actuales. En general, con el auge que
tiene el ADN en aplicaciones biotecnológicas, ciencias genómicas y medicina genómica, resulta necesaria un
mayor profundización sobre el conocimiento estructural del ADN. Por medio de esta línea de investigación se
estaría aportando tanto conocimiento de ciencia básica, como atacando problemas de carácter e interés mundial
como es el cáncer, aplicaciones biotecnológicas y genómicas, pero también los de carácter local en
enfermedades particulares de México.
Introducción
El descubrimiento del ADN, su estructura y su función es probablemente el descubrimiento
biológico más significativo del siglo XX debido a su alto impacto en la ciencia y la medicina. Con la
propuesta de un modelo estructural de la doble hélice, con bases apareadas hacia el centro (Watson and
Crick) se logra explicar tanto propiedades físicas como biológicas que antes era imposible. Con esto se
marcan las pautas que después abrirían paso al desarrollo de ciencias como la biología molecular, la
genética y la relación que estas guardan entre sí y con la bioquímica. Conocer las particularidades en la
estructura tridimensional de diferentes secuencias de ADN nos permitirá explicar e interpretar de mejor
manera el proceso de interacción que genera el ADN para llevar a cabo sus diversas funciones.
El ADN, o ácido desoxirribonucleico, por definición es un Biopolímero cuyas unidades repetitivas
son nucleótidos y que constituye el material genético de las células y en su secuencia contiene la
información para la síntesis de proteínas. Aunque cada unidad de repetición individual es muy pequeña,
pueden ser moléculas muy grandes que contienen millones de nucleótidos (como cromosomas).
En los organismos vivos, el ADN no suele existir como una molécula individual, sino que se
entrelazan dos cadenas largas en la forma de una doble hélice (Fig. 1). Una base ligada a un azúcar se
denomina nucleósido y una base ligada a un azúcar y uno o más grupos fosfato se llama un nucleótido.
Si varios nucleótidos están unidos entre sí, como en el ADN, este polímero se denomina
oligonucleótido.
Oligonucleótido
Nucleótidos
Figura 1. Doble hélice de ADN tipo B formada por las cadenas entrelazadas [PDB-ID: 1ENN].
Niveles estructurales del ADN
La estructura primaria (Fig. 2-a) del ADN está definida por la secuencia de nucleótidos que
componen una cadena de ADN. El orden de los nucleótidos en esta secuencia guarda toda la
información genética y a su vez determina la posibilidad de apareamiento con otra cadena de secuencia
complementaria que generará su estructura secundaria. La estructura secundaria (Fig. 2-b) corresponde
a las características de una cadena de doble hélice, dextrógira o levógira, según el tipo de ADN. Con
dos cadenas antiparalelas, pues el extremo 3´ de una se enfrenta al extremo 5´ de su homóloga. Existen
varios tipos de conformaciones del ADN; las formas A, B, C, D y Z. La estructura terciaria (Fig. 2-c)
esta referida a la forma en la que se almacena el ADN en un espacio, para la formación de los
cromosomas o en su interacción con proteínas.
La realización de este proyecto esta mas centrada en el análisis de la estructura secundaria, cuales
son sus modificaciones y características al interactuar con drogas o fármacos y también de secuencias
con interés particular.
a)
b)
c)
Figura 2. a) Estructura primaria definida por la secuencia, b) estructura secundaria definida por la doble hélice y c) estructura terciaria
definida por la conformación que adopta el ADN en un espacio dado, como en la formación de un nucleosoma [PDB-ID: 1AOI ]
Interacción del ADN con drogas
La trascripción y la replicación son procesos vitales para la supervivencia y proliferación de células, así
como para el funcionamiento de sus procesos. El ADN comienza su transcripción o replicación solo
cuando recibe la señalización necesaria, la cual a menudo es la unión de una proteína reguladora a una
región especifica de ADN. Esta actividad de reconocimiento específico puede ser mimetizada por
pequeñas moléculas, con lo que las funciones del ADN pueden ser artificialmente moduladas, ya sea
inhibiéndoles o activándoles. Estas pequeñas moléculas ya sean sintéticas o naturales pueden actuar
como un fármaco mediante la inhibición o activación de una función del ADN, para curar o controlar
una enfermedad.
Dependiendo del sitio objetivo de la droga (secuencia objetivo), se podría dar activación de una
región especifica que podría producir mayores cantidades de una proteína requerida, o bien restringir la
síntesis de una proteína, la replicación o inducir la muerte celular. En este modo de inhibición se
prevén aplicaciones para la destrucción de células, como antitumorales o antibióticos.
Las drogas pueden unirse al ADN de manera covalente y no-covalente (Sheng, Gan and Huang). La
unión covalente con el ADN es irreversible e invariablemente conduce a una inhibición completa de los
procesos del ADN y subsecuentemente a la muerte celular. Un ejemplo de una droga de unión
covalente es el Cis-platin usado como fármaco anticancerígeno, el cual genera una retícula entre las
cadenas con la unión de los cloros a los nitrógenos de las bases del ADN.
La unión no-covalente de drogas con el ADN puede darse en las dos siguientes formas:
• ¨Minor groove binders¨ (Bailly and Chaires; Moreno et al.). Este tipo de drogas aprovechan la
forma del surco estrecho para acoplarse a él y generan interacciones tipo van der Waals para su
unión. Adicionalmente, estas drogas pueden formar enlaces de hidrogeno con las bases,
preferentemente con el N3 de la adenina y el O2 de la timina. La mayor parte de las drogas de
unión al surco menor tienen una preferencia por secuencias ricas en A-T, la cual se puede deber a
una mejor interacción por fuerzas de van der Waals, debido a que el surco menor en las zonas A-T
es más estrecho que en las zonas C-G, y también debido al impedimento estérico generado por el
grupo amino del C2 de la guanina. Sin embargo algunas poliaminas sintéticas como lexitropsinas e
imidazol-pyrrol han sido diseñadas para unirse específicamente al surco menor de regiones C-G
(Goodsell et al.).
•
Intercaladores (Baguley; Valls et al.). Este tipo de drogas contienen grupos heterocíclicos planares
que se intercalan a los pares de bases. El complejo se estabiliza por medio de las interacciones π-π
del apilamiento de las bases y la droga. Los intercaladores inducen fuertes perturbaciones
estructurales en el ADN.
La unión no-covalente es reversible y preferida a la covalente, debido a que esta última al
interactuar, si no hay una especificidad perfecta la droga, se puede unir a sitios no deseados y quedarse
ahí inamovible generando efectos colaterales o tóxicos. Aun así la alta fuerza de enlace en la unión
covalente es una de sus mayores ventajas. Por esto permanece como un gran reto el diseño de nuevas
drogas que interactúen con el ADN.
a)
b)
c)
Figura 3 Ejemplos de unión droga – ADN [PDB ID]. a) complejo ADN con minor groove binder, Pentamidina [3EY0]. b) complejo
ADN con un intercalador, derivado de antraquinona [1XCS]. c) ADN unido covalentemente al cisplatin [1AU5].
Nuestra investigación esta dirigida principalmente al estudio de minor groove binders selectivos a
secuencias ricas en adeninas y timinas, las cuales son mas abundantes en regiones de ADN no
codificante.
El ADN no codificante
El ADN del genoma de un organismo puede dividirse conceptualmente en dos: el que codifica las
proteínas (los genes), y el que no codifica. En muchas especies, sólo una pequeña fracción del genoma
codifica proteínas. Por ejemplo, sólo alrededor del 1,5% del genoma humano consiste en exones que
codifican proteínas (20.000 a 25.000 genes), mientras que más del 90% consiste en ADN no
codificante (Wolfsberg, McEntyre and Schuler).
El ADN no codificante (también denominado ADN basura) corresponde a secuencias del genoma
que no generan una proteína (procedentes de transposiciones, duplicaciones, translocaciones y
recombinaciones de virus, etc.), incluyendo los intrones. Hasta hace poco tiempo se pensaba que el
ADN no codificante no tenía utilidad alguna, pero estudios recientes indican que eso es inexacto. Entre
otras funciones, se postula que el llamado "ADN basura" regula la expresión diferencial de los genes
(Consortium et al.). La presencia de tanto ADN no codificante en genomas eucarióticos y las
diferencias en tamaño del genoma entre especies representan un misterio que es conocido como el
"enigma del valor de C" (Gregory).
Por otro lado, algunas secuencias de ADN desempeñan un papel estructural en los cromosomas: los
telómeros y centrómeros contienen pocos o ningún gen codificante de proteínas, pero son importantes
para estabilizar la estructura de los cromosomas. Algunos genes no codifican proteínas, pero sí se
transcriben en ARN: ARN ribosómico, ARN de transferencia y ARN de interferencia (ARNi, que son
ARN que bloquean la expresión de genes específicos) (Bossu et al.; Goto et al.). Algunas secuencias de
ADN no codificante representan pseudogenes que tienen valor evolutivo, ya que permiten la creación
de nuevos genes con nuevas funciones (Hirotsune et al.).
Las zonas de ADN no codificante, normalmente son ricas en pares de bases AT (Field and Wills;
Katti, Ranjekar and Gupta). Por ejemplo el protozoo Dictyostelium discoideum contiene un 78% de AT en el total de su material genético (Eichinger et al.), Plasmodium falciparum contiene un 80% de A-T
(Jiang et al.), Arabidopsis thaliana contiene un 64% de A-T, Saccharomyces cerevisiae contiene un
62% de A-T, entre otros.
Por todo lo anterior se prevé que aún existen funciones del ADN sin descubrir y una necesidad de
explicar mejor las funciones que ya se conocen. Por esto se han seleccionado para este proyecto
secuencias representativas de zonas de ADN no codificante y ricas es A-T.
Cristalografía de rayos X.
Para resolver la estructura de las secuencias seleccionadas de ADN, se llevan a cabo los siguientes
pasos; Empleando la técnica de cristalización por difusión de vapor se cristalizan en ADN o ADNDroga de estudio. Al ser un proceso multiparamétrico, no se puede hacer un diseño racionalizado de las
condiciones de cristalización y esta fase puede ser muy tardada, a la vez que es una fase crucial de la
que dependerán algunas de las siguientes fases. Con los cristales obtenidos se hace difracción de rayos
X, si los patrones obtenidos presentan el orden y resolución suficiente se pasa a la fase de resolución de
la estructura en caso contrario se ha de regresar a la fase de cristalización. En la fase de resolución se
lleva acabo la interpretación de los diagramas de difracción, se determina la celdilla unitaria, se hace
asignación de grupo espacial, se asignan los índices de Miller y se indexan las intensidades. Tras una
corrección y escalado de intensidades en nuestro caso se asignan fases principalmente por remplazo
molecular empleando como modelo de búsqueda un modelo teórico de nuestra molécula de ADN de
estudio. Después se lleva acabo el refinado de la estructura y la validación de la misma, para corroborar
que no hay errores en distancias de enlaces, ángulos, conformaciones, y demás parámetros helicoidales.
Oligonucleotido
• Secuencia de interes (rica en AT)
• Oligonucleotido sintético de la secuencia
seleccionada de alta pureza.
Cristalización
• Se lleva acabo un barrido con todas las
posibles condiciones de cristalización.
Variando precipitante, pH, temperatura, conc.
se sales e iones, conc. del oligonucléotido
Si los resultados
obtenidos de la
difracción no son útiles
se ha de volver a la fase
de cristalización
buscando condiciones o
modificando factores que
puedan mejorar la
cristalización
Difracción de rayos X
• Durante esta fase se seleccionan los mejores
cristales y se someten a una fuente de rayos x
para obtener un patron de difracción.
Análisis de resultados y resolución de
la estructura
• Se genera un modelo teórico del DNA
• Se procesan los datos de la difracción
• Se acopla el modelo a la interpretación de la
difracion por remplazo molecular
Afinamiento de la estructura y
validación
• Se optimizan las posiciones atómicas en
bases a las zonas de densidad electrónica
• Se comprueban distancias de enlace, ángulos
de torsión, etc.
Figura 4. Diagrama general del proceso de cristalografía de ADN
A 4 T 4 con 4.4’-Bis(imidazolinilamino)difenilamina
Recientemente se han obtenido resultados al resolver una estructura de un complejo ADN-droga de
la secuencia A 4 T 4 con la droga experimental 4.4’-Bis(imidazolinilamino)difenilamina (Fig. 5-a), grupo
espacial hexagonal P6 1 22 formando columnas de oligonucleótidos apilados en forma HASO (Helical
arrangement of stacked oligonucleotides) (Campos et al.), favorecido por las interacciones de stacking
π-π entre drogas adyacentes que interactúan en el surco menor reconociendo las bases nitrogenadas.
Las columnas de oligonucleótidos presentas tres orientaciones de cruce, estabilizadas por las
interacciones intermoleculares de la droga con cadenas vecinas (Fig. 5b) .
a)
b)
Figura 5. a) Interacción de la droga en el surco estrecho, b) Cruce de columnas de oligos estabilizados por la droga.
Esta droga presenta una potente actividad antiprotozoaria, en particular contra la tripanosomiasis y
contra la malaria, siendo la ultima causada por el Plasmodium falciparum, que como se menciono
anteriormente, contiene un aproximado de 80% de A-T en su genoma.
La malaria causa unos 219 millones de casos de infectados y aproximadamente 660 mil muertes
anuales (World Health). A pesar de los esfuerzos por reducir la transmisión e incrementar el
tratamiento, ha habido muy poco cambio en las zonas que se encuentran en riesgo de la enfermedad
desde 1992 (Hay et al.). La tasa de mortalidad puede duplicarse en los próximos años debido a la
resistencia a medicamentos e insecticidas (Breman). Siendo México uno de los países Americanos aun
con presencia de malaria según se ha reportado en el “World Malaria Report 2012” por el “WHO”.
Bucle de ADN: (AT) 3 T 3 A(AT) 3
Otra estructura en estudio un bucle de ADN (llamado en inglés hairpin o stem loop) se forma
cuando se da el apareamiento entre dos zonas complementarias de una misma cadena de ADN, dejando
una zona central, entre las regiones complementarias, que queda desapareada formando el bucle. La
formación de bucles de ADN representa uno de los mecanismos mediante el cual se regulan vías
metabólicas del ADN como la transcripción, la replicación y la recombinación. La formación de bucles
de ADN podría tener diferentes funciones dependiendo del contexto celular en el que se encuentren; en
algunos casos el bucle por sí mismo es un requisito para la regulación, mientras que en otros casos el
incremento de la concentración efectiva local de la proteína puede influir.
Para el bucle se ha estudiado la secuencia (AT) 3 T 3 A(AT) 3, la cual presentaría un tetrabucle –TTTAy un tallo con 6 pares de bases. La secuencia es un factor determinante en la formación de bucle
(Forsdyke, 1998). La Formación del bucle se corroboró con análisis de dispersión dinámica de luz
donde se obtuvo un diámetro hidrodinámico de la especie monomérica de 28.4 Å, mientras que la
altura teórica del bucle con una altura de 3.38 Å por par de bases es de 27.04 Å. Tras la cristalización,
los diagramas de difracción presentaron una baja resolución. De estos se obtuvo la celdilla unitaria y el
grupo espacial P1 pseudo P3 2 . Pero fue imposible resolver la estructura por lo que se llevo acabo una
aproximación diferente al analizar manualmente las difracciones y ver la orientación de los oligos en la
celdilla, el numero de moléculas por columna y las rotaciones en el apilamiento para generar las
repeticiones que dan lugar a las difracciones. Por lo cual fue necesario construir un modelo teórico de
bucle usando el tetraloop del PDB-ID: 1BAE y un par de bases de apareamiento Hoogsteen antes del
bucle para favorecer el acoplamiento al confrontar los bucles de las moléculas en una columna recta,
con las rotaciones por o ligo debidas. Este modelo se comprobó con la simulación teórica de los
patrones de difracción los cuales correspondían al diagrama de difracción experimental.
Figura X Diagrama de difracción experimental del cristal, b) Diagrama teórico del modelo generado, c)Modelo teórico de acoplamiento
de 2 oligos en bucles, d) Columna de bucles de ADN en la celdilla unitaria.
Referencias
Baguley, B. C. "DNA Intercalating Anti-Tumour Agents." Anticancer Drug Des 6.1 (1991): 1-35.
Bailly, C., and J. B. Chaires. "Sequence-Specific DNA Minor Groove Binders. Design and Synthesis of
Netropsin and Distamycin Analogues." Bioconjug Chem 9.5 (1998): 513-38.
Bossu, J. P., et al. "Two Regulatory Elements of Similar Structure and Placed in Tandem Account for
the Repressive Activity of the First Intron of the Human Apolipoprotein a-Ii Gene." Biochem J 318 (
Pt 2) (1996): 547-53.
Breman J. G. "Ears of the Hippopotamus: Manifestations, Determinants, and Estimates of the Malaria
Burden."(2001) Supplement Vol. 64(1) of the American Journal of Tropical Medicine and Hygiene.
Campos, L., et al. "Overview of the Structure of All-at Oligonucleotides: Organization in Helices and
Packing Interactions." Biophys J 91.3 (2006): 892-903.
Consortium, Encode Project, et al. "Identification and Analysis of Functional Elements in 1% of the
Human Genome by the Encode Pilot Project." Nature 447.7146 (2007): 799-816.
Eichinger, L., et al. "The Genome of the Social Amoeba Dictyostelium Discoideum." Nature 435.7038
(2005): 43-57.
Field, D., and C. Wills. "Long, Polymorphic Microsatellites in Simple Organisms." Proc Biol Sci
263.1367 (1996): 209-15.
Goodsell, D. S., et al. "Structure of a Dicationic Monoimidazole Lexitropsin Bound to DNA."
Biochemistry 34.51 (1995): 16654-61.
Goto, K., et al. "Identification of an Osteoblastic Silencer Element in the First Intron of the Rat
Osteocalcin Gene." Biochemistry 35.33 (1996): 11005-11.
Gregory, T. R. "The C-Value Enigma in Plants and Animals: A Review of Parallels and an Appeal for
Partnership." Ann Bot 95.1 (2005): 133-46.
Hay, Simon I., et al. "The Global Distribution and Population at Risk of Malaria: Past, Present, and
Future." The Lancet Infectious Diseases 4.6 (2004): 327-36.
Hirotsune, S., et al. "An Expressed Pseudogene Regulates the Messenger-Rna Stability of Its
Homologous Coding Gene." Nature 423.6935 (2003): 91-6.
Jiang, H., et al. "Detection of Genome-Wide Polymorphisms in the at-Rich Plasmodium Falciparum
Genome Using a High-Density Microarray." BMC Genomics 9 (2008): 398.
Katti, M. V., P. K. Ranjekar, and V. S. Gupta. "Differential Distribution of Simple Sequence Repeats in
Eukaryotic Genome Sequences." Mol Biol Evol 18.7 (2001): 1161-7.
Moreno, T., et al. "Coiled-Coil Conformation of a Pentamidine-DNA Complex." Acta Crystallogr D
Biol Crystallogr 66.Pt 3 (2010): 251-7.
Sheng, J., J. Gan, and Z. Huang. "Structure-Based DNA-Targeting Strategies with Small Molecule
Ligands for Drug Discovery." Med Res Rev 33.5 (2013): 1119-73.
Valls, N., et al. "Variable Role of Ions in Two Drug Intercalation Complexes of DNA." J Biol Inorg
Chem 10.5 (2005): 476-82.
Watson, J. D., and F. H. Crick. "Molecular Structure of Nucleic Acids; a Structure for Deoxyribose
Nucleic Acid." Nature 171.4356 (1953): 737-8.
Wolfsberg, T. G., J. McEntyre, and G. D. Schuler. "Guide to the Draft Human Genome." Nature
409.6822 (2001): 824-6.
World Health, Organization. "World Malaria Report 2012." World Health Organization.
Availabe
http://www.who.int/malaria/publications/world_malaria_report_2012/en/index.html
(2013).