Virus PRODUCCIÓN DE MATERIAL LIBRE DE VIRUS USO DE

Virus
PRODUCCIÓN DE MATERIAL LIBRE DE VIRUS
USO DE SEMILLA LIBRE DE VIRUS
Para muchas especies propagadas vegetativamente, como por ejemplo papa, ajo, batata, frutilla, algunos
frutales, etc., la principal fuente de virus es la infección crónica de las mismas plantas. En estas especies las
plantas infectadas con virus producen descendencia igualmente enferma que aumentan, en cada
multiplicación, las mermas en los rendimientos. Con tales cultivos una de las formas más exitosas de control
involucra el desarrollo de clones libres de virus. Para este fin se necesita identificar líneas o ejemplares
pertenecientes a la variedad deseada.
Si todos los ejemplares de la variedad se encuentran infectados como comúnmente sucede, se deben realizar
intentos para liberar algunas plantas, o partes de ellas, del virus en consideración.
Una vez obtenido el clon libre de virus, es necesario mantener una línea madre, la que será fuente de
propágulos para multiplicación. En esta etapa se procura reproducir el material bajo condiciones en las que la
reinfección sea mínima o no tenga lugar (in vitro, invernáculos, zonas aisladas, etc.). Posteriormente la
producción es entregada para uso comercial.
Métodos para obtener plantas libres de virus
1. Material libre de virus ocurriendo naturalmente
Ocasionalmente se pueden encontrar libres de virus plantas individuales de una variedad o grupo aislado en
un lugar. Si todos los ejemplares están infectados, a veces se puede aprovechar la desigual distribución del
virus en la planta. Esto no es raro en algunos virus de árboles frutales; sin embargo muchas variedades
agámicas pueden estar totalmente infectadas siendo necesario algún método específico para sanearlas.
2. Cultivo de meristemas
El cultivo de meristemas apicales, extensivamente utilizado en las últimas décadas, se aplica principalmente
para producir plantas libres de patógenos, principalmente virus. También es importante para el
almacenamiento de germoplasmas a través de la técnicas de criopreservación.
3. Termoterapia
El tratamiento con calor a vegetales para liberarlos de patógenos ha sido aplicado como tal antes del uso del
cultivo de meristemas. Muchos virus han sido eliminados por medio de esta técnica. Los materiales usados
para los tratamientos pueden ser partes vegetales en dormancia, o bien en crecimiento vegetativo. En el
primer caso se suele utilizar agua caliente ( 35 a 54 °C) durante minutos u horas, según los casos. Para los
restantes el calor se aplica mediante aire ( 35 a 42 °C).
La termoterapia puede utilizarse combinada con el cultivo de meristemas, siendo a veces la única posibilidad
de regenerar plantas libres de virus. En los casos en que no es imprescindible, permite aumentar el tamaño de
los explantos mejorando la tasa de regeneración de plantas.
4. Quimioterapia
Debido a que la multiplicación de virus y el metabolismo de los hospedantes están íntimamente asociados, los
intentos que se han hecho para interferir selectivamente la replicación viral no han dado resultados
satisfactorios. Sin embargo, desde hace algunos años está siendo utilizada con éxito el Ribavirín (1-b-dribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamida). Este producto, también denominado Virasole, no es fácil de
conseguir y su precio es elevado. En ensayos realizados utilizando ribavirín al medio de cultivo de meristemas
in vitro se ha conseguido mejorar significativamente la obtención de plantas libres de virus.
5. Tratamiento con frío
En algunos pocos casos citados el tratamiento con frío parece tener un efecto similar al de la termoterapia
para eliminar virus de plantas.
PRINCIPIOS Y PRÁCTICAS DE OBTENCION DE PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS SISTÉMICOS
EL CULTIVO DE MERISTEMAS: FUNDAMENTOS
Las plantas tienen la propiedad del crecimento abierto, que resulta de la presencia de zonas de tejido
embrionario, los meristemas, en los cuales la formación de nuevas células continúan mientras otras partes
llegan a la madurez. El término meristema apical alude al conjunto de células cuyas divisiones agregan
nuevos elementos al tallo (meristema apical del tallo) o a la raíz (meristema apical de la raíz).
El meristema apical del tallo en Angiospermas está compuesto por el corpus, conjunto de células iniciales y
derivadas inmediatas que se dividen en varios planos, y por la túnica, constituida por una o dos capas de
células que se dividen anticlinalmente, ubicadas sobre el corpus.
Además de las que ocurren en el meristema, aún hay divisiones en las regiones subyacentes al mismo que
también contribuyen al crecimiento del tallo. Esta porción terminal del ápice es la que se utiliza normalmente
para regenerar plantas libres de virus, mediante su cultivo in vitro, en medios adecuados. De tal manera se
denomina “cultivo de meristemas” a la siembra del conjunto formado por el verdadero meristema más la
región adyacente que incluye a uno o dos primordios foliares. Una ventaja que esta técnica ofrece es que las
células constituyentes del meristema son genéticamente estables y por lo tanto las plantas regeneradas son
idénticas a las plantas donadoras de los meristemas.
A partir del descubrimiento de Morel y Martin en 1952 de que se podían obtener plantas Dahlia sanas
cultivando meristemas de plantas sistemáticamente infectadas por virus, se ha sucedido una ininterrumpida
serie de aplicaciones de esta técnica para sanear diversos cultivos, especialmente en el caso de los que se
propagan agámicamente. Esto se basa en la observación de que la concentración de virus disminuye hacia el
ápice siendo posible en muchos casos encontrar la zona del meristema apical, libre de partículas.
En general se acepta que esta situación se debería a la ausencia de tejidos de conducción en la zona
meristemática y al hecho de que la activa división de sus células estaría dejando a estas fuera del alcance del
virus.
El tamaño de la zona libre varía con la especie y virus involucrados. Así, en orquídeas es posible regenerar
plantas sanas cultivando brotes apicales de 5 mm. de longitud mientras que en papa no se obtienen plantas
sanas cuando los explantos exceden los 0,7 mm. de longitud.
De esto se deduce que para cada especie es necesario establecer el tamaño adecuado de los explantos para
regenerar plantas libres de virus.
Si bien en algunos casos se obtienen plantas a partir del cultivo de domos solamente, en otros se necesitan
por lo menos que el mismo esté acompañado de un primordio foliar.
Es claramente observable que hay que equilibrar dos situaciones que se contraponen. Por un lado, cuanto
mayor es el tamaño del explanto, mayor es el desarrollo de las plantas, pero a su vez disminuye la
probabilidad de obtener plantas libres de virus. Desde luego, como este es el objetivo principal, el porcentaje
de regeneración de plantas pasa a ser secundario.
Cuando se extrae un meristema para colocarlo en un medio artificial se le priva de la mayoría de los nutrientes
minerales y orgánicos que reciben de otros órganos de la planta. Para que su potencia continúe al cultivarlo in
vitro, es necesario suministrarle esos nutrientes al medio. Un adecuado equilibrio de reguladores de
crecimiento es esencial para conseguir regenerar las plantas. Además del suministro exógeno de hormonas
es necesario tener en cuenta que en el mismo meristema también existe una determinada concentración de
estas. Obviamente la disponibilidad de reguladores endógenos se relaciona con el tamaño del explanto y
parece ser la causa determinante de que por debajo de ciertas dimensiones no haya desarrollo.
PRODUCCIÓN DE PAPA LIBRE DE VIRUS
En el caso de papa, como en todas las especies de propagación agámica, los virus tienen una particular
importancia por su acumulación en los materiales de propagación y su incidencia en los rendimientos. Se citan
en esta especie más de 20 virus que afectan el cultivo, pero solo 3 ó 4 son de significativa importancia en la
Argentina (PVY, PLRV, PVX y PVS).
La única herramienta disponible actualmente para obtener plantas libres de virus de manera eficiente y
confiable, es utilizando las técnicas de cultivo de tejidos in vitro.
DESCRIPCIÓN Y REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA
Luego de cosechados y suberificados, los tubérculos seleccionados de los cuales se desea extraer
meristemas son sometidos a tratamiento para romper dormición en el caso de que sea necesario.
Luego de transcurridos 15 días en una cámara de brotación a 20 °C aproximadamente, los tubérculos
desarrollan brotes de 1 cm. de longitud. En este momento se procede a cortarlos. Inmediatamente se los
desinfecta sumergiéndolos unos segundos en alcohol y luego en hipoclorito de sodio al 2% durante 10 - 15
minutos. El recipiente que contiene estos brotes es introducido bajo cámara de flujo laminar ya acondicionada
para trabajar. Una vez transcurrido el tiempo de desinfección los brotes son lavados por lo menos 3 veces con
agua destilada estéril para eliminar los restos de hipoclorito y colocados en una caja de Petri también estéril.
De aquí se van tomando los brotes para realizar la extracción de los meristemas. El trabajo se realiza bajo el
campo visual de una lupa binocular con luz puntiforme, utilizando herramientas tales como bisturíes, pinzas y
microcuchillas.
1.Extracción del meristema
Sobre papel estéril y con ayuda de una pinza que sostiene la base del brote se procede a cortar con un bisturí
las hojas y primordios exteriores, cuidando de no dañar el meristema apical y dejándolo limpio de tejidos
adyacentes.
Una vez descubierto el domo se lo extrae con 1-2 primordios foliares utilizando una microcuchilla. Por lo
general, el corte se realiza perpendicular al eje del meristema entre 0.1 y 0.2 mm por debajo de la superficie
del domo. El explanto adherido a la microcuchilla es transferido a un tubo con medio de cultivo. Es
conveniente depositarlo con el ápice hacia arriba para facilitar el crecimiento armónico del tejido.
Inmediatamente después se tapa el tubo con polietileno termocontráctil que permite el intercambio gaseoso
con el ambiente.
2.Incubación
Los tubos sembrados se incuban en cámara de cría a 25 ± 2 °C con 70% de Humedad Relativa. La luz es
suministrada con tubos fluorescentes usándose una intensidad de 2000 lux y un fotoperíodo de 16 horas.
3.Desarrollo del cultivo
En el transcurso del proceso de desarrollo se pueden realizar 3-4 repiques o subcultivos de los explantos en el
mismo medio, con una frecuencia variable entre 1 y 2 semanas. Se efectúan lecturas periódicas para observar
el desarrollo y descartar tubos contaminados y meristemas muertos o que al cabo de cierto tiempo no hayan
experimentado ningún crecimiento. A los 75-80 días se obtienen las primeras plántulas completas. Estos
explantos, que por lo general poseen 4-5 nudos, son micropropagados en un medio adecuado.
4. Evaluación de sanidad: método de detección de virosis de papa
Con 1 ó 2 de las plantas obtenidas en estas primeras micropropagaciones se inicia el control sanitario
mediante la aplicación del test ELISA, hospedantes diferenciales y, eventualmente, microscopía electrónica
para detectar PLRV, PVY, PVX y PVS. Los mericlones que dan reacción negativa en estas pruebas se
continúan multiplicando “in vitro”, realizándose por lo menos 2 o 3 controles más sobre los mismos.
Por otro lado, algunas microplantas de estos materiales son transferidas a tierra con el fin de que desarrollen
plantas de mayor porte con lo que se facilita la multiplicación de eventuales partículas de virus remanentes
que no fueron detectadas en el material in vitro. De esta forma quedarán en evidencia al realizarse nuevos
controles.
Los controles de sanidad se llevan a cabo durante por lo menos un año antes de destinar los materiales
definitivamente libres de virus a la multiplicación masiva para su utilización en la producción de minitubérculos.
PRODUCCCIÓN DE AJO LIBRE DE VIRUS
El ajo, en Argentina, es una hortaliza cuyo cultivo sostiene importantes economías regionales. Su producción
no sólo satisface las necesidades del mercado interno por su consumo en fresco o industrial, sino que gran
parte de ella se exporta. El destino final del producto depende principalmente de la calidad obtenida. Dicha
calidad, fundametalmente la sanitaria, se responde directamente a la del material utilizado para la
implementación del cultivo.
Entre los problemas sanitarios, las virosis constituyeron uno de los más difíciles de resolver. Sin embargo, el
desarrollo de esquemas de producción masiva de ajo libre de virus ha permitido superar en gran parte este
inconveniente. Este esquema se inicia con la selección del material teniendo en cuenta cualidades
morfológicas y/o fisiológicas deseadas. Estos bulbos son identificados y cada bulbillo que lo compone es
preparado para el proceso de extracción del meristema. Se elimina gran parte de la hoja de reserva y queda
así listo para ser esterilizado y llevado a cámara de flujo laminar donde se extraerá el explanto
correspondiente.
1. Extracción del meristema
Los trabajos de introducción de los explantos (meristema con 1-2 primordios foliares) se realizan en los meses
de verano aplicándose la misma técnica descripta para papa.
2. Incubación
Los tubos sembrados se incuban de igual manera que los meristemas de papa pero, en general, a una
temperatura dos o tres grados menor.
3. Desarrollo del cultivo
Al cabo de 3-4 meses aproximadamente, entre el 50 y 80% de los meristemas ha desarrollado microplantas
completas. En algunos tipos clonales, como Colorados y Blancos, se efectúan dos o tres micropropagaciones
antes de someter a las microplantas a un proceso de rusticación. Luego las mismas son transplantadas en
macetas y colocadas en invernáculo o jaula antiáfidos para su crecimiento.
Luego de 5-6 meses de cultivo, las plantas producen minibulbillos, generalmente uno. Sin embargo, en
algunos casos se obtienen 2-3 por planta. Estos minibulbillos se multiplican nuevamente en invernáculo
antiáfidos con los controles de sanidad correspondientes. Recién al cabo de 2 ciclos se puede asumir
definitivamente que los materiales que dan reacción negativa a las pruebas sanitarias están libres de virus.
Los minibulbillos que se cosechan en este ciclo están en condiciones de ser multiplicados a campo en zonas
aisladas de cultivos comerciales, tratando de preservar el estado sanitario original.
4. Evaluación de sanidad: método de detección de virosis de ajo
Las evaluaciones de sanidad se inician en la etapa de producción "in vitro" en aquellos casos que permiten la
micropropagación de los materiales introducidos, y se continúa en la etapa de producción en invernáculo o
jaula antiáfido. Ellas incluyen observaciones visuales de síntomas, pruebas serológicas como ELISA,
transmisión mecánica a un hospedante indicador y, eventualmente, microscopía electrónica.
La prueba ELISA se utiliza para detectar la presencia de virus pertenecientes al género Potyvirus en general o
a entidades individuales de dicho género como el Onion yellow dwarf virus y el Leek yellow stripe virus. Para
los Carlavirus como el Shallot latent virus y el Garlic common latent virus también se utiliza la prueba ELISA,
mientras que para un Carlavirus común en los cultivos comerciales de Córdoba aún no identificado, se usa
transmisión mecánica al hospedante indicador Chenopodium murale.
La reacción positiva en el hospedante indicador consiste en el desarrollo de lesiones locales cloróticas en las
hojas, visibles a partir del noveno día, que luego se tornan necróticas.
La comprobación de la presencia de virus pertenecientes al género Potyvirus se realiza mediante la prueba
serológica ELISA indirecto con antisuero monoclonal para Potyvirus, ya que esta técnica detecta a todos los
miembros de este grupo.
Para la evaluación de los materiales respecto al LYSV, OYDV, SLV y GCLV se desarrolla la técnica DASELISA, con antisueros monoclonales o policlonales según el caso.