Mejora de la capacidad antifúngica in vitro e in vivo de un

Anales de Biología 33: 67-77, 2011
ARTÍCULO
Mejora de la capacidad antifúngica in vitro e in vivo de un
combinado de antagonistas compatibles frente a Phytophthora capsici Leonian
Mohammed Ezziyyani1, Ahlem Hamdache2, Ana Requena3, Catalina Egea-Gilabert3, Maria Emilia Candela4, Laura
González-Ramiro4 & Maria Emilia Requena4
1 Université Hassan Premier Settat, Faculté Polydisciplinaire de Khouribga (FPK), Département de Biologie, El Hay El Jadid, El
Byout. BP.: 145. Office Chérifien des Phosphates (OCP). Khouribga principale, 25000. Maroc. E-mail: [email protected]
2 Université Abdelmalek Esaâdi, Faculté des Sciences, Département de Biologie, Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration
des Plantes, M’hannech II, BP 2121, 93002, Tétouan, Maroc.
3 Departamento de Ciencia y Tecnología Agraria, ETSIA, Universidad Politécnica de Cartagena, Paseo Alfonso XIII, 48; 30203.
Cartagena. España.
4 Departamento de Biología Vegetal (Fisiología Vegetal), Facultad de Biología, Universidad de Murcia. Campus de Espinardo.
30100 Espinardo, Murcia-España.
Resumen
Correspondencia
M.E. Candela
E-mail: [email protected]
TEL: (+34) 868 884943
FAX: (034) 868 883963
Recibido: 21 febrero 2011
Aceptado: 3 junio 2011
Publicado on-line: 29 junio 2011
Se estudió la capacidad antagónica de la combinación de dos microorganismos compatibles entre sí, la bacteria Burkholderia cepacia, y el hongo Trichoderma harzianum sobre el patógeno Phytophthora capsici, agente causal de la podredumbre de pimiento.
Se han realizado confrontaciones duales in vitro de los dos antagonistas frente al patógeno y entre ellos, en varios medios de cultivo,
temperaturas y pHs. Los antagonistas interfieren en la supervivencia y el desarrollo del patógeno P. capsici. B. cepacia produce antibiosis y T. harzianum ejerce competencia por espacio y nutrientes,
micoparasitismo y lisis enzimática. El medio Avena-vermiculita produce un óptimo de biomasa. La dosis óptima de los antagonistas
fueron 3.5×108 esporas/ml de T. harzianum y la 109 FCU/ml de B.
cepacia, en un rango de pH 3.5-5.6 y temperaturas entre 20-30 °C.
In vivo, el tratamiento con la combinación B. cepacia+T. harzianum+suelo de plantación, ha sido capaz de reducir hasta un 84%
la incidencia de la “tristeza” causada por el patógeno P. capsici en
plantas de pimiento.
Palabras clave: Compatibilidad, Biocontrol, Burkholderia cepacia,
Trichoderma harzianum, Pimiento.
Abstract
Improving the antioomycete capacity in vivo and in vitro of a
formula containing a combination of antagonists of Phytophthora
capsici Leonian
The effectiveness was tested of a formulate containing mycelia of
the fungus Trichoderma harzianum and colony of the bacterium
Burkholderia cepacia to inhibit the growth of the pathogenic
oomycete Phytophthora capsici, the causal agent of root rot in
pepper. The antagonists were evaluated in dual confrontations in
vitro in different culture media, temperatures and pH values. B.
cepacia producing antibiosis and T. harzianum microparasitism and
enzymatic lysis, while competing for space and nutrients. The
formulate uses a base of vermiculite and oats, and the optimal
68
M. Ezziyyani1 et al.
Anales de Biología 33, 2011
doses were 3.5×108 spores/ml of T. harzianum and 109 CFU/ml of
B. cepacia in a pH range of 3.5-5.6. Experiments were carried out
at 23-30 °C. In vivo, the use of a formulate with the combination B.
cepacia+T. harzianum reduced by up to 84% the incidence of root
rot caused by the P. capsici in pepper plants, and can be
considered an alternative to the use of chemical products such as
methyl bromide which are harmful to the environment and human
health.
Key words: Compatibility, Biological control, Burkholderia cepacia,
Trichoderma harzianum, Pepper.
Introducción
Se conocen numerosos grupos de bacterias y hongos con capacidad antagónica frente a otros microorganismos. Este antagonismo manifestado de
diferentes formas, como inhibidores del desarrollo
o incluso patógenos de las especies causantes de
enfermedades de plantas, pueden ser utilizadas, y
de hecho ya se utilizan algunas, para combatir enfermedades siempre que se pueda demostrar su no
patogenidad para la planta o incluso para el hombre o los animales. Entre los géneros clasificados
se encuentran las bacterias Pseudomonas Migula
y Bacillus Cohn (Elad & Baker 1985, Leeman et
al 1995, Kimer et al 1998, Loper & Henkels 1997,
Sid Ahmed et al 2003a, 2003b, Ezziyyani et al
2004).
El género Trichoderma Persoon posee buenas
cualidades para el control de enfermedades en
plantas causadas por patógenos fúngicos del suelo, principalmente de los géneros Phytophthora
De Bary, Rhizoctonia Kühn, Pythium Pringsheim,
y Fusarium Link ex Grey entre otros. Las especies
de Trichoderma actúan como hiperparásitos competitivos que producen metabolitos antifúngicos y
enzimas hidrolíticas a los que se les atribuyen los
cambios estructurales a nivel celular, tales como
vacuolización, granulación, desintegración del citoplasma y lisis celular, encontrados en los organismos con los que interactúa.
Las especies del género Trichoderma son los
antagonistas más utilizados para el control de enfermedades de plantas producidos por hongos, debido a su ubicuidad, a su facilidad para ser aisladas y cultivadas, a su crecimiento rápido en un
gran número de sustratos y a que no atacan a plantas superiores (Papavizas et al. 1982). Los mecanismos por los que las cepas del género Trichoderma desplazan al fitopatógeno son fundamentalmente de tres tipos. Competición directa por el es-
pacio o por los nutrientes (Belanger et al. 1995),
producción de metabolitos antibióticos, ya sean de
naturaleza volátil o no volátil (Sid Ahmed et al.
2000) y parasitismo directo de determinadas especies de Trichoderma sobre los hongos fitopatógenos (Yedidia et al. 1999, Ezziyyani et al. 2007).
De acuerdo con la bibliografía consultada y los
resultados obtenidos por nuestro grupo de investigación, para establecer un programa de control
biológico en cuanto a su relación con la temperatura, la humedad, nutrientes, pH, patógeno y antagonista, primero es preciso determinar in vitro los
requerimientos del sistema patógeno-antagonista
y antagonista-antagonista para establecer los factores óptimos a fin de considerarlos, para futuros
ensayos en invernaderos.
Por último la utilidad de estos resultados constituye la base primaria para el empleo de la combinación de antagonistas, que se han seleccionado
con diferentes potencialidades biológicas. Ello
nos facilitará el diseño de las estrategias futuras
de un control biológico eficaz del hongo patógeno
P. capsici del suelo y posiblemente su transferencia para ampliarlo al control de otros patógenos.
Material y métodos
Material vegetal
La variedad de pimiento (Capsicum annuum L.)
objeto de estudio fue California Wonder, muy sensible al ataque del hongo Phytophthora capsici
Leonian. La siembra se realizó con semillas desinfectadas en una disolución comercial de hipoclorito sódico al 2% (v/v) durante 5 minutos, se lavaron tres veces con agua destilada estéril, y se pusieron a germinar en bandejas alveolares de 48
senos (4x4 x14cm), conteniendo una mezcla de
turba, arena y vermiculita (3:1:1/2) esterilizada.
Las bandejas fueron instaladas, en un módulo del
Anales de Biología 33, 2011
Antifungicidad de B. cepacia+T. harzianum frente a P. capsici
invernadero de la Estación de Experimentación
Agrícola de la Universidad de Murcia (EEAUMU). Se mantuvieron en estas condiciones hasta
que desarrollaron la quinta o sexta hoja verdadera,
con lo que ya estaban dispuestos para el transplante a macetas o al suelo y la posterior inoculación
con P. capsici (Candela et al. 1995).
Material fúngico
Como patógeno se usó el oomiceto P. capsici, aislado 15, cepa extremadamente agresiva. El hongo
se mantuvo en PDA (patata-dextrosa-agar) de Difco. Para los ensayos de biocontrol el hongo se
cultivó también en el medio «vermiculita-PDB
(caldo patata- dextrosa)» que se obtiene de la siguiente manera: Adición de 200 ml de medio PDB
a un matraz Erlenmeyer de 1000 ml que contenía
150g de vermiculita, esterilizada previamente dos
veces a 121 ºC durante 30 min en dos días consecutivos. Esta mezcla se autoclavó, y en ella se
agregaron cuatro discos de 5mm de diámetro que
fueron cortados del margen de la colonia miceliana de P. capsici, crecida en medio PDA y transferidos asépticamente al matraz.
Éstos fueron incubados en estufa a 25 ºC durante tres semanas, tiempo suficiente para la formación de abundante inóculo. Para conseguir gran
cantidad de zoósporas se hizo crecer P. capsici en
PDB en la oscuridad y con agitación en matraces
de 250 ml a 25 ºC durante 15 días. Posteriormente
se separó y lavó el micelio, se introdujo de nuevo
en agua destilada y se mantuvo en agitación durante 5 ó 6 días más en los que se formaron y liberaron las esporas. Como antagonista se utilizó el
hongo Trichoderma harzianum Rifai, aislado
2413 de la Colección Española de Cultivos Tipo
(CECT) sita en Valencia (España), usado anteriormente por nosotros (Sid Ahmed et al. 2001, Ezziyyani et al. 2005) y conservado en medios PDA y
Avy-3.
La cepa bacteriana del complejo Burkholderia
cepacia (Palleroni & Holmes) Yabuuchi, aislado
322, se obtuvo de la Colección Española de Cultivos Tipo (Valencia, España). Esta bacteria se conserva en el laboratorio en medio NA (Agar nutritivo estándar II, Merk). Dependiendo del tipo de
ensayo a realizar la preparación de los inóculos y
las suspensiones bacterianas en medios sólidos y
líquidos para el tratamiento de las semillas y
como componentes extracelulares metabolitos an-
69
tifúngicos del filtrado de los cultivos de B. cepacia, se obtienen mediante tres procedimientos según (Ezziyyani et al. 2004).
Confrontación in vitro de cada antagonista
frente al patógeno P. capsici
Confrontación in vitro de cada antagonista frente
al patógeno P. capsici
Las acciones del antagonista se comprobaron, haciéndolo crecer en medios: PDA, Czapek-Agar,
(A-A) Agua-Agar al 2% y en medio PDA enriquecido con laminarina y glucosa (3:1, v/v). Los inóculos se obtuvieron de la colonia miceliana de P.
capsici, tomando discos de 5 mm de diámetro para
las confrontaciones, los discos de P. capsici se
siembran en placas Petri en los medios de cultivo
anteriores, y en puntos equidistantes respecto al
antagonista, mediante toques superficiales del medio de cultivo con una asa. Las placas se incuban
en estufa a varias temperaturas: 20º, 25º, 27º y
30 ºC. La interacción se observó cada tres días.
Confrontación in vitro de los antagonistas entre
ellos: B. cepacia frente T. harzinum
En los medios PDA, AA (agua-agar al 2%) y Czapek Agar, se siembra, en un extremo de la placa
Petri, un disco de 5 mm de diámetro de la colonia
miceliana crecidas en PDA de T. harzinum. Enfrente se inocula, mediante un toque superficial,
un alícuoto de la bacteria a ensayar. La comprobación de la acción simbiótica de B. cepacia, se obtendrá al cabo de dos días de cultivo en estufa a
20º, 25º, 27º, y 30 ºC al evaluar la compatibilidad
del crecimiento del micelio fúngico T. harzinum,
obtenido por acción de la bacteria.
Observaciones microscópicas
Las muestras analizadas mediante microscopia
electrónica de barrido proceden de la zona de interacción de las confrontaciones entre patógeno y B.
cepacia en el medio PDA. El procesamiento de las
muestras se hizo según el siguiente método: Se
prepararon cortes de agar de 2x2mm de la zona de
interacción entre el antagonista y P. capsici. Las
muestras se sumergieronen una solución acuosa
de agar al 1% y se prefijaron a 4 ºC durante dos
horas por inmersión en una disolución compuesta
por glutaraldehído (25%) al 3% en tampón cacodilato sódico (R 23/25, Prolabo) 0,1M a pH 7,2,
seguida de tres lavados con elmismo tampón durante 30 minutos en oscuridad. Se fijaron por in-
70
M. Ezziyyani1 et al.
mersión en tetróxido de osmio al 1% durante 2
horas a 4 ºC en la oscuridad. La deshidratación se
efectuó en etapas de 15 minutos con disoluciones
crecientes de etanol de 30%, 50% 70%, 90% y
100% y se secaron mediante el método del punto
crítico (etanol/CO2 líquido). Los cortes se montaron sobre un pedestal con pintura conductiva de
grafito y se cubrieron con oro por el método de
pulverización catódica o evaporación en sputtering. El examen se hizo con un microscopio electrónico de barrido Jeol T- 6.100.
Las muestras analizadas mediante microscopia
óptica proceden de la zona de interacción de las
confrontaciones entre P. capsici y T. harzianum en
el medio PDA sobre una porta de vidrio.
Preparación del inóculo de los antagonistas
Inóculo de T. harzianum
a) En frascos Erlenmeyer de 1000 ml que contenían una mezcla de 8 g de avena molida, 150 g de
vermiculita fina y 250 ml de agua destilada (medio Avy-3) y 5g de suelo de plantación.
b) En frascos conteniendo 300 g de vermiculita y
200 ml de medio PDB.
c) En frascos conteniendo 300 g de arena y
150 ml de medio Czapek liquido (Difco). Los
frascos se esterilizaron en autoclave a 121ºC durante 30 minutos dos veces en dos días consecutivos. Cuatro discos de 5 mm de diámetro cortados
del margen de la colonia miceliana crecida en medio PDA se transfirieron asépticamente a los frascos conteniendo la mezcla preparada. Los frascos
con avena, PDB y Czapek fueron incubados en
una estufa a 25 ºC durante, siete, quince días y
más de un mes respectivamente.
A
Inóculo de B. cepacia
Se utilizaron frascos Elenmeyer de 500 ml, conteniendo 150 ml de del medio NB (caldo nutritivo
de Difco) esterilizado en autoclave a 121 ºC durante 30 minutos. Este medio se inoculó con una
colonia aislada, tomada con un asa estéril de B.
cepacia crecida en NA. Los frascos se incubaron
con agitación a temperatura ambiente, en el laboratorio durante tres días. Las bacterias se recogieron en tubos estériles y se centrifugaron a
15.000 rpm durante 20 minutos. El precipitado se
resuspendió en 100ml de agua destilada estéril y
se transfirió a un Erlenmeyer de 1.000 ml conteniendo 5 g de suelo, 150 g de vermiculita fina empapada en 150 ml de NB esterilizado a 121ºC, 30
minutos, dos veces, dos días consecutivos. Finalmente se incubaron a 28 ºC en estufa durante 5
días.
Tratamiento in vivo del patógeno por cada
antagonista y con el combinado de
T. harzianum-B. cepacia crecidos en vermiculita
Se realizaron ensayos en suelos del campo de la
estación de Experimentación Agrícola de la Universidad de Murcia (EEA-UMU) para evaluar el
potencial de cada antagonista y el combinado en
el control del patógeno P. capsici.
En todos los ensayos 15 g del patógeno P. capsici
crecido en vermiculita-PDB se agregó directamente a las macetas con el fin de asegurarnos una
buena infección. La población inicial determinada
(NMP) oscila entre 1,2x106 ppg/g y 8,1x107
ppg/g.
Las plantas se cultivaron como hemos indicado
B
P. capsici (P.c)
Anales de Biología 33, 2011
C
B. cepacia (B.c)
T. harzianum (T.h)
Figura 1. Cultivos del patógeno y los antagonistas . A. Hongo patógeno: Phytophthora capsici en el medio PDB (Control) . B. Hongo
antagonista: Trichoderma harzianum en el medio PDB (Control) . C. Bacteria antagonista: Burkholderia cepacia en el medio NB (Control) .
Figure 1. Cultures of the pathogen and antagonists. A. Pathogenic fungus: Phytophthora capsici in PDB medium (Control) . B. Antagonist
fungus: Trichoderma harzianum in PDB medium (Control) . C. Antagonist bacteria: Burkholderia cepacia in NB medium (Control ).
Anales de Biología 33, 2011
Antifungicidad de B. cepacia+T. harzianum frente a P. capsici
anteriormente. El inóculo de los antagonistas utilizado fue el preparado en vermiculita, avena y
agua (Avy3) más suelo de plantación, con las concentraciones siguientes: 5, 10, 15 y 20 g/maceta.
De la mezcla inoculada se recogieron muestras de
100 g para hacer un recuento de la población inicial del antagonista, mediante diluciones decimales usando un detergente no iónico
Se prepararon hoyos distanciados 70cm por
40cm, en los que fue mezclada vermiculita inoculada previamente con cada antagonista e el combinado de los dos antagonistas a razón de
15 g/hoyo, y se rehízo el hoyo en el que se colocó
la planta. Pasados siete días del transplante se removió el suelo a nivel de la rizosfera, formando
un circulo alrededor de la planta, se infectaron las
plantas con P. capsici y se cubrió con el suelo. El
riego se hizo por goteo usando emisores autocompensativos de 4 l/ hora y la fertilización se realizó
cada tres semanas con un sistema de inyección de
fertilizante (NPK) mediante un tanque de abonado
(ATF0040, Novo Ris, Zaragoza, España) conectado a la red de riego. La lectura de los resultados se
hizo al final del segundo mes a partir del transplante tanto en plantas control como en las tratadas. La temperatura osciló entre 25º y 30 ºC. Cien
plantas fueron utilizadas por cada tratamiento y
los ensayos se repitieron tres veces.
Resultados y discusión
En las confrontaciones in vitro de B. cepacia
(Fig.1B) frente al patógeno P. capsici (Fig.1A), la
inhibición varía según el medio de cultivo, fue
efectiva en PDA (Fig. 2A) y muy débil en AA,
también influían la temperatura y el pH. En las
placas de cultivo in vitro en PDA, la zona de inhibición producida por B. cepacia frente al patógeno aumenta a medida que transcurre el tiempo,
acompañado de la destrucción del micelio fúngico
desarrollado hasta ese momento.
La viabilidad o muerte del patógeno, comprobadas por observaciones periódicas, mostraron
que se producía la detención de la expansión del
patógeno. Diversos autores han responsabilizado
de la inhibición y destrucción del micelio de hongos patógenos a la acción de uno o varios antibióticos producidos por bacterias (Elander et al.
1968, Rosales et al.1995, Kraus & Loper 1995,
De La Fuente et al. 2001). Estos autores trabajaron con varias cepas de Burkholderia cepacia (de-
71
nominada en este trabajo como Pseudomonas cepacia) y detectaron antibióticos como pirrolnitrina
y pioluteorina, con un amplio espectro antifúngico. La incidencia de la temperatura y el pH de incubación en la actividad antagónica del antagonista son factores a tener en cuenta. En los medios
Czapek y PDA la inhibición de P. capsici por B.
cepacia a partir de 25º, 27º y 30 ºC fue superior a
lo observado a 23 ºC. A pH 4,5, se observó una
notable reducción en la velocidad de crecimiento
y la densidad de la colonia de P. capsici.
En las interacciones entre B. cepacia y P. capsici observadas por microscopía electrónica de barrido, comprobamos que la alteración del crecimiento vegetativo del patógeno empieza a notarse
a partir del segundo día después de la confrontación. Las interacciones en la zona de inhibición se
muestran donde se observa deformación morfológica, desorganización (Fig. 3C) y formación de hipertrofias esféricas sobre las hifas de P. capsici La
desintegración de las paredes miceliares (Fig.
3D), da como resultado la destrucción total de la
colonia de P. capsici. Estos resultados demuestran
la particular habilidad parásita del antagonista que
finalmente es capaz de inhibir el crecimiento del
patógeno.
T. harzianum demostró un claro efecto antagónico contra P. capsici en los cultivos duales realizados previamente in vitro en Agar (Fig. 2B), sobre todo en medio PDA enriquecido con laminarina-glucosa (3:1v/v), aumentando su actividad antifúngica mediante la secreción del enzima hidrolítico (β-1,3-glucanasa) (Ezziyyani 2004) y posiblemente otros, sobrecreciendo y reduciendo totalmente la colonia del patógeno. La intensidad de
inhibición de P. capsici, por T. harzianum in vitro
varió según el medio de cultivo, la temperatura y
el pH. La inhibición fue intensa en PDA, mientras
que en el medio A-A, las interacciones fueron menos intensas o débiles. La zona de inhibición producida por T. harzianum, frente al patógeno, aumenta a medida que transcurre el tiempo, aumento
que va acompañado de la destrucción del micelio
fúngico desarrollado hasta ese momento. Lo que
se observa en primer lugar es una zona de inhibición progresiva, en parte por la mayor velocidad
de crecimiento de T. harzianum. Después aparece
un marcado efecto hiperparasítico, que se manifiesta por la inhibición del crecimiento micelial no
sólo por compartir el mismo sustrato sino también
porque T. harzianum produce antibióticos y enzi-
72
M. Ezziyyani1 et al.
Anales de Biología 33, 2011
Figura 2. Confrontación de P. capsici frente a los antagonistas y los antagonistas entre si. A. Inhibición del crecimiento vegetativo de P.
capsici en presencia de B. cepacia en el medio PDA. Antibiosis y destrucción de la colonia de P. capsici . B. Inhibición del crecimiento
vegetativo de P. capsici en presencia de T. harzianum en el medio PDA. T. harzianum forma una red micoparasítica provocando lisis y
desintegración de las hifas del patógeno. C. Confrontación de los antagonistas entre ellos: Compatibilidad total entre B. cepacia y T.
harzianum. D. Confrontación de los antagonistas y el patógeno: T. harzianum realiza hiperparasitismo, invadiendo totalmente la superficie de
la colonia de P. capsici esporulando sobre la misma (centro). Detención del crecimiento vegetativo del patógeno, los antagonistas juntos
ejerciendo una multiplicidad de modos de acción (micoparasitismo, antibiosis y lisis enzimática). y se aprecia una compatibilidad total entre
B. cepacia y T. harzianum.
Figure 2. Confrontation between P. capsici and antagonists and between the antagonists themselves. A. Inhibition of vegetative growth of P.
capsici in the presence of B. cepacia in PDA medium. Antibiosis and destruction of the colony of P. Capsici. B. Inhibition of vegetative
growth of P. capsici in the presence of T. harzianum in PDA medium. T. harzianum forms a microparasitic network that provokes the lysis
and disintegration of the pathogen’s hyphae. C. Confrontation between the antagonists: total compatibility between B. cepacia and T.
harzianum. D. Confrontation between antagonists and pathogen: T. harzianum provokes microparasitism, totally invading the surface of the
P. capsici colony, sporulating over the same (centre). Detention of vegetative growth of pathogen, antagonists showing multiple modes of
action (microparasitism, antibiosis and enzymatic lysis). Total compatibility between B. cepacia and T. harzianum.
Anales de Biología 33, 2011
Antifungicidad de B. cepacia+T. harzianum frente a P. capsici
73
T.h
P.c
A
B
B.c
P.c
P.c
C
P.c
D
Figura 3. A. Interacciones entre T. harzianum frente a P. capsici. Enrollamiento masivo de las hifas de T. harzianum, alrededor de las de P.
capsici. B. Interacciones entre T. harzianum frente a P. capsici. Aspecto del micoparasitismo ejercido por T. harzianum sobre P. capsici,
esporulando sobre el mismo. C. Zona de inhibición de la confrontación de B. cepacia y P. capsici. Antibiosis: desorganización y
desintegración de las hifas de P. capsici . D. Hipertrofia de las hifas de P. capsici. Adhesión, proliferación y formación de hipertrofias
esféricas sobre las hifas de P. capsici. Se aprecia una desintegración seguida de la destrucción total del micelio. MEB.
Figure 3. A. Interactions between T. harzianum and P. capsici. Massive rolling of hyphae of T. harzianum, around those of P. capsici. B.
Interactions between T. harzianum and P. capsici. Aspect of microparasitism exercised by T. harzianum on P. capsici, over which it
sporulates . C. Inhibition area of confrontation between B. cepacia and P. capsici. Antibiosis: disorganization and disintegration of hyphae of
P. capsici . D. Hypertrophy of hyphae of P. capsici. Adhesion, proliferation and formation of spherical hypertrophies over hyphae of P.
capsici. SEM.
mas: (β -1,3- glucanasa, quitinasa, proteasa y celulasa) degradadores de la pared celular que juegan un importante papel en el micoparasitismo.
Estos resultados están en consonancia con los obtenidos por otros autores (Wong 1992, Lorito et al.
1993, Herrera et al. 1999, Sid Ahmed et al. 2000).
Finalmente T. harzianum no sólo inhibe la expansión de P. capsici creciendo en su campo de acción, sino que a los siete días la colonia del patógeno P. capsici se quedó totalmente reducida en
comparación con el control, continuó creciendo
hasta invadir totalmente la superficie de la colonia
del hongo patógeno e incluso esporulando sobre el
mismo. Se puede analizar en preparaciones del
microscopio de transmisión y electrónica de barrido, donde se observan las hifas de T. harzianum
enrollando a las del patógeno (Fig. 3A) e impi-
diendo su crecimiento (Fig. 3B).
Nuestros resultados están de acuerdo con los publicados por otros autores (Elad et al. 1982, Bara et al.
2003) que usando laminarina como sustrato, en los
medios de cultivos para cepas de Trichoderma, obtuvieron un aumento de la actividad β-1,3-glucanasa
hasta del 67% y una mayor acción lítica sobre patógenos como Athelia rolfsii (Curzi) C.C. Tu & Kimbr
(=Sclerotinia rolfsii) y Rhizoctonia solani Kühn respectivamente En ensayos de antagonismo realizado
in vitro, Rey et al. (2002) realizaron transformaciones a partir de protoplastos con dos genes de glucanasas, bgn 16.2 y bgn 13.1. La cepa transformada
con genes de hidrolasas, muestra una capacidad antifúngica sobre el hongo patógeno R. solani superior a
la de la estirpe silvestre. Otros autores (Lahsen et al.
2001, Sousa et al. 2002), han clonado genes en cepas
de T. harzianum con alta expresión antifúngica para
74
M. Ezziyyani1 et al.
Phytophthora cinnamomi Rands y Rosellinia necatrix Berl. ex Prill.
En las confrontaciones de los antagonistas B.
cepacia y T. harzianum, realizadas en PDA nos
muestran que produjeron un porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR) del micelio T.
harzianum al 0%. El crecimiento de T. harzianum
se mantuvo aumentando hasta el cuarto día y continuaba creciendo hasta rodear totalmente la colonia de B. cepacia (Fig. 2C), lo cual es manifestación macroscópica y microscópica de su compatibilidad total. Tampoco se observó inhibición cultivando la bacteria en placas en medio NA aguaagar al 2% y Czapek las interacciones fueron nulas. Las observaciones macroscópicas muestran
que la colonia de T. harzianum frente a la bacteria
crece de una manera regular y al final del sexto
día el micelio rodea las bacterias mostrando una
compatibilidad entre ellos. El examen de la microscopia óptica mostró que las hifas de T. harzianum crecen uniformemente y no presentan ni deformaciones ni desorganización (Fig. 2D). La
temperatura no afectó la acción simbiótica entre
los tres antagonistas pasando de la temperatura
ambiente hasta 30 ºC. En cambio el pH 4,5 afectó
solamente a la velocidad del crecimiento vegetativo y la pigmentación del hongo T. harzianum del
color verde al blanco. Por ello, la relación que se
establece entre los dos antagonistas seleccionadas:
T. harzianum y B. cepacia, puede ser definido
como una simbiosis antagónica por lo que son
compatibles para ser usado juntos frente al patógeno P. capsici.
Evaluación del efecto de distintos tratamientos in vivo sobre la tristeza causada por P.
capsici
De los resultados obtenidos con los dos tipos
de inoculación con el patógeno, con zoosporas o
con vermiculita infectada, la mejor técnica de infección es la desarrollada por nosotros, con P. capsici crecido en vermiculita. Ello se debe a que la
vermiculita con PDB es un medio en el que el patógeno se encuentra en forma micelial y plena actividad virulenta, mientras que las zoosporas de P.
capsici, aunque se adicionen a la rizosfera de la
planta en condiciones fisiológicas óptimas de crecimiento en el laboratorio, el inóculo pierde agresividad, tal vez por factores ambientales o debido
al estrés sufrido al pasar las zoosporas de un sustrato reducido al suelo. El inoculo de los antago-
Anales de Biología 33, 2011
nistas utilizado para el tratamiento de las plantas
fue el preparado en medio Avy3 más suelo de
plantación, (Fig. 4), que resultó más económico,
fácil de preparar y usar, así como por su viabilidad, abundancia y rápido crecimiento. Pero sobre
todo, por su alto grado de inhibición contra el desarrollo de la podredumbre causada por P. capsici.
El biopreparado Avy3 más suelo de plantación, ha
sido el mejor al compararlo con vermiculita-PDB
(Ezziyyani et al. 2009). Ya que la adición de las
partículas del suelo de plantación tanto a la vermiculita como a los medios de cultivos líquidos ha
conseguido la adaptación de los antagonistas al
mismo y también para evitar el estrés de los microorganismos al pasarlos a los viveros, el preparado que los contenía fue diluida al 20% para que
estos estén mas adaptados y que sean competitivos.
El mejor resultado (Tabla 1) se consiguió usando B. cepacia a 1x109 UFC/ml y T. harzianum a
3.5×108 esporas/ml. En las plantas (NT&I) con P.
capsici la podredumbre de la raíz alcanzó 5,0 sobre la escala usada. El tratamiento de las plantas
con T. harzianum y B. cepacia (T&I), redujo la
enfermedad a 3.00 y 2.13, respectivamente, lo
cual equivale a una reducción del 51,59%. La má-
Tratamientos
Podredumbre causada
por P. capsici
Control: (NT&NI)
0.00 a
P. capsici: (NT&I)
5.00 c
B. cepacia: (T&NI)
0.00 a
T. harzianum : (T&NI)
0.00 a
T. harzianum + B. cepacia:
(T&NI)
0.00 a
T. harzianum + P. capsici: (T&I)
3.00 b
B. cepacia + P. capsici: (T&I)
2.13 a
T. harzianum + B. cepacia + P.
capsici: (T&I)
1.17 a
Tabla 1. Efecto del tratamiento in vivo con los antagonistas sobre
la podredumbre de la planta de pimiento causada por P. capsici.
Evaluación mediante una escala graduada de 0 (ningún síntoma) a
5 (planta muerta). Los valores de la podredumbre son las medias
por planta y tratamientos. (T=tratadas; NT=no tratadas;
I=Inoculadas; NI=no inoculadas). Las medias seguidas por las
mismas letras no son significativamente diferentes según el test
LSD, p= 0.05.
Table 1. Effect of in vivo treatment with the antagonists on rot in
the pepper plants caused by P. capsici. Evaluation on scale from 0
(no symptom) to 5 (plant death). The rot values are the means per
plant and treatment. (T=treated; NT=not treated; I=Inoculated;
NI=not inoculated). Means followed by the same letter are not
significantly different according to LSD test, p= 0.05.
Anales de Biología 33, 2011
Antifungicidad de B. cepacia+T. harzianum frente a P. capsici
75
Figura 4. Esquema y protocolo de la preparación del biopreparado de los antagonistas propuesta, por M. Ezziyyani, con él que se realiza el
tratamiento de las plántulas de pimiento “in vivo” .
Figure 4. Schema and protocol proposed by M. Ezziyyani for preparing the bio-preparation of both antagonists used to treat pepper seedlings
“in vivo” .
xima reducción de la enfermedad, a 1,17, se logró
cuando las raíces fueron tratadas con el combinado de los dos antagonistas (T. harzianum+B. cepacia+suelo de plantación), consiguiendo una reducción del 84%. El análisis de la varianza de clasificación de rangos múltiples (ANOVA) mostró
diferencias significativas para la interacción de
dos factores (tiempo de mortalidad y cepa antagónica). Lo mas llamativo fue la tardanza de la aparición de los síntomas del marchitamiento en las
plantas tratadas e inoculadas con el patógeno
(T&I), ya que incluso algunas plantas llegaron a
dar frutos.
El tratamiento de las plantas con Avy3 más
suelo de plantación, dio un buen resultado en la
reducción de la podredumbre, sin embargo los resultados de control del patógeno con el antagonista en plantas inoculadas con vermiculita-PDB y
arena-Czapek líquido, en suelo no han sido tan sa-
tisfactorios. Hecho que está de acuerdo con Sztejnberg et al. (1987), para quienes la incorporación
de T. harzianum al campo no fue efectiva probablemente por un inadecuada aplicación del antagonista ya que según (Ezziyyani et al. 2007) la
mejor técnica de tratamiento y/o infección con un
biopreparado es la desarrollada con base sólida.
Ello se debe a que la vermiculita con PDB o
NB es un medio en el que el antagonista se encuentra en forma micelial o colonial y en plena
actividad virulenta, mientras que las colonias de
B. cepacia y colonias de T. harzianum, aunque se
adicionen a la rizosfera de la planta en condiciones fisiológicas óptimas de crecimiento en el laboratorio, el inóculo pierde efectividad, tal vez por
factores bióticos y/o abióticos o debido al estrés
sufrido al pasar las suspensiones microbianas de
un sustrato reducido al suelo, por lo que estamos
de acuerdo con Szczech & Shoda (2006) en que
76
M. Ezziyyani1 et al.
el modo de aplicación de los microorganismos antagonistas al suelo es uno de los condicionantes
para la eficacia óptima del agente de biocontrol.
Y no estamos de acuerdo con Herrera López et
al. (1999), los cuales argumentan que el establecimiento y la reducción de población de T. harzianum en suelo puede deberse a que el antagonista
utiliza su energía en la producción de metabolitos
secundarios más que en su propia reproducción.
Bajo esas perspectivas se confirma lo observado
por otros autores (Sid Ahmed et al. 1999) respecto
a que la selección previa del antagonista mediante
cultivos duales es útil, pero no garantiza el buen
comportamiento de ésta en invernadero. El efecto
antagonista se ha visto reducido en nuestro experimento desde, prácticamente un 100% in vitro, a
entre 51%, 59% y 84% in vivo. Ante estos resultados pensamos que una buena estrategia para el futuro sería optimizar la formulación del biopreparado incorporando enmiendas orgánicas junto con
actuaciones físicas como la solarización, que conformen una completa lucha integrada y logren
inhibir el desarrollo del patógeno invasor. Actuaciones en este sentido están siendo probadas en
una investigación en curso de este equipo investigador.
Referencias
Bara F, Llima A, Ulhoa L & Cirano J. 2003. Purification
and characterization of an exo-β-1,3-glucanase produced by Trichoderma asperellum. FEMS Microbiology Letters 219: 81-85.
Belanger R, Dufuor N, Caron J & Benhamou N. 1995.
Chronological events associated with the antagonistic properties of Trichoderma harzianum against
Botrytis cinerea: Indirect evidence for sequential role
of antibiotics and parasitism. Biocontrol Science
Technology 5: 41-54.
Candela ME, Alcázar MD, Espín A, Egea-Gilabert C &
Almela L. 1995. Soluble phenolic acids in Capsicum
annuum stems infected with Phytophthora capsici.
Plant Pathology 44: 116-123.
De la Fuente L, Bajsa N, Bagnasco P, Quagliotto
L,Thomashow L & Arias A. 2001. Antibiotic production by Pseudomonas fluorescens isolated from forage legume rhizosphere. Journal of Applied Microbiology 90: 421-429.
Elad Y & Baker R. 1985. The role of competition for iron
and carbon in suppression of clamidospore germination of Fusarium spp. by Pseudomonas spp. Phytopathology 75: 1053.
Elad Y, Chet I & Henis Y. 1982. Degradation of plant
pathogenic fungi by Trichoderma harzianum. Canadian Journal of Microbiology 28: 719-725.
Anales de Biología 33, 2011
Elander RP, Mabe JA, Hamill RH & Gorman M. 1968.
Metabolism of tryptophans by Pseudomonas aureofaciens. Production of pyrrolnitrin by selected
Pseudomonas species. Applied Microbiology 16:
753-758.
Ezziyyani M, Pérez-Sánchez C, Requena ME, Sid Ahmed A. & Candela ME, 2004. Evaluación del biocontrol de Phytophthora capsici en pimiento (Capsicum
annuum L.) por tratamiento con Burkholderia cepacia. Anales de Biología 26: 61-68.
Ezziyyani M, Requena ME, Perez-Sanchez C & Candela ME, 2005. Efecto del sustrato y la temperatura en
el control biológico de Phytophthora capsici en pimiento (Capsicum annuum L.). Anal Biol. 27: 119126.
Ezziyyani M, Requena ME, Egea Gilabert C & Candela
ME, 2007. Biological Control of Phytophthora root
rot of pepper Using Trichoderma harzianum and
Streptomyces rochei in Combination Journal of
Phytopathology 155: 342-349.
Ezziyyani M, Requena ME, Egea Gilabert C, Lamarti A
& Candela ME. 2009. Biological control of Phytophthora capsici root rot of pepper (Capsicum annuum
L.) plants using Burkholderia cepacia and Trichoderma harzianum. Journal of Applied BioSciences.
13: 745-754.
Herrera-López J, Pérez-Jiménez M, Llobel A, MonteVázquez E & Zea-Bonilla T. 1999. Estudios in vivo
de Trichoderma como agente de biocontrol contra
Phytophthora cinnamomi y Rosellinia necatrix en
aguacate. Revista Chapingo Serie Horticultura 5:
261-265.
Kimer S, Hammer PE, Hill DS, Altmann A, Fischer I,
Weislo LJ, Lanahan M, Vanpee KH & Ligon JM.
1998. Functions encoded by pyrrolnitrin biosynthetic
genes from Pseudomonas fluorescens. Journal of
Bacteriology 180: 939-1943.
Kraus J & Loper JE. 1995. Characterization of genomic
required for production of antibiotic pyoluteorin by
the biological control agent Pseudomonas fluorescens Pf-5. Applied Environmental Microbiology 61:
849-854.
Lahsen HA, Soler A, Rey M, De la Cruz J, Monte E &
Llobell A. 2001. An antifungal Exo-a-glucanase
(AGN1) from the biocontrol fungus Trichoderma harzianum. Applied and Environmental Microbiology 67:
5833-5839
Leeman M, Van Pelt JA, DeOuden FM, Heinsbroek M &
Bakker PAHM. 1995. Induction of systemic resistance by Pseudomonas fluorescens in radish cultivars differing in susceptibility to Fusarium wilt, using a novel bioassay. European Journal of Plant
Pathology 101: 655-664.
Loper JE & Henkels MD. 1997. Availability of iron to
Pseudomonas fluorescens in rhizosphere and bulk
soil evaluated with an ice nucleation reporter gene.
Applied Environmental Microbiology 63: 99 105.
Lorito M, Harman GE, Hayes CK, Broadway RM,
Transmo A, Woo SL, Di Pietro A. 1993. Chitinolytic
enzymes produced by Trichoderma harzianum: antifungal activity of purified endochitinase and chitobiosidase. Phytopathology 83: 302-307.
Anales de Biología 33, 2011
Antifungicidad de B. cepacia+T. harzianum frente a P. capsici
Papavizas GC, Lewis JA & Abd-Elmoity TH. 1982. Evaluation of new biotypes of Trichoderma harzianum for
tolerance to Benomyl and enhanced biocontrol capabilities. Phytopathology 72: 126-132.
Papavizas GC & Lumsden RD. 1980. Biological control
of soil borne fungal propagules. Annual Review of
Phytopathology 18: 389-413.
Rey M, González L, Monte E & Llobell A, 2002. Genómica funcional de estirpes antagonistas del género
Trichoderma. León: Actas del XXV Congreso de la
SEBBM, España.
Rosales AM, Thomashow RJC & Mew TW. 1995. Isolation and identification of antifungal metabolites produced by rice-associated antagonistic Pseudomonas
spp. Phytopathology 85: 1028-1032
Sid Ahmed A, Ezziyyani M, Pérez Sánchez C. & Candela ME. 2003a. Effect of chitin on biological control
activity of Bacillus spp. and Trichoderma harzianum
against root rot disease in pepper (Capsicum annuum) plants. European Journal of Plant Pathology
109: 418-426.
Sid Ahmed A, Ezziyyani M, Egea Gilabert C & Candela
ME. 2003b. Selecting bacterial stains for use in the
biocontrol of diseases caused by Phytophthora capsici and Alternaria alternata in sweet pepper plants.
Biología Plantarum 47: 569-574.
Sid Ahmed A, Pérez Sánchez C & Candela ME, 2000.
Evaluation of induction of systemic resistance in
pepper plants (Capsicum annuum) to Phytophthora
capsici using Trichoderma harzianum and its relation
with capsidiol accumulation. European Journal of
77
Plant Pathology 106: 817-824.
Sid Ahmed A, Pérez-Sanchez C, Ezziyyani M & Candela
ME. 2001. Effect of Trichoderma harzianum treatments on systemic resistance in pepper plants (Capsicum annuum) to Phytophthora capsici and its relation with capsidiol accumulation. IOBC WPRS Bulletin 24: 265-269
Sid Ahmed A, Pérez-Sanchez C, Egea C & Candela ME.
1999. Evaluation of Trichoderma harzianum for controlling root rot caused by Phytophthora capsici in
pepper plants. Plant Pathology 48: 58-65.
Sousa S, Rey M, Monte E & Llobell A. 2002. Clonación
y análisis de los promotores de dos genes con alta
expresión en Trichoderma harzianum. León: Actas
del XXV Congreso de la SEBBM, España
Szczech M & Shoda M. 2006. The effect of mode of application of Bacillus subtilis RB14-C on its efficacy as
a biocontrol agent against Rhizoctonia solani. J
Phytopathol 154: 370-377.
Sztejnberg A, Freeman S, Chet I & Katan J. 1987. Control of Rosellinia necatrix in soil and apple orchard
by solarisation and Trichoderma harzianum. Plant
Disease 71: 365-369.
Wong, K.K.Y. & Saddler, J.N., 1992. Trichoderma xylanases, their properties and applications. Critical
Review in Biotechnology 12: 413-435.
Yedidia I, Benhamou N & Chet I. 1999. Induction of defence responses in cucumber plants (Cucumis sativus L.) by the biocontrol agent Trichoderma harzianum. Applied and Environmental Microbiology 65:
1061-1070.