Implantes de FibroquelMR aceleran la formación de hueso nuevo

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Rev Biomed 1997; 8:81-88.
Implantes de Fibroquel MR
aceleran la formación de hueso
nuevo en defectos óseos
inducidos experimentalmente en
cráneos de rata: un estudio
histológico.
Jesús Chimal-Monroy, Teresa Bravo-Ruiz, Fernando E. Krötzsch-Gómez, Lino Diaz de León.
Departamento de Biología Celular, Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. México D.F.
México.
RESUMEN.
Introducción. Los transplantes de hueso usualmente se aplican en defectos óseos. Sin embargo,
debido a problemas éticos, clínicos o
inmunológicos, es necesario el desarrollo apropiado de terapéuticas para inducir la reparación ósea.
En este estudio evaluamos el efecto del FibroquelMR
sobre la regeneración de hueso en defectos óseos
en cráneos de ratas adultas y se comparó con
colágena liofilizada como control. El FibroquelMR
es un biomaterial compuesto de colágena tipo I y
polivinilpirrolidona (PVP).
Resultados. Los mostraron que la formación de
hueso nuevo se llevó a cabo de una manera más
rápida con los implantes de FibroquelMR, que con
los de colágena. A los 5 días post operación, los
implantes de FibroquelMR presentaron trabéculas
óseas bien definidas, mientras que con los implantes de colágena, este proceso sólo se iniciaba. A
los 15 días post operación, los implantes de
FibroquelMR mostraron mejor osificación que los
implantes de colágena. Finalmente, a los 45 días
post operación la formación de hueso nuevo que
se llevo a cabo con FibroquelMR y colágena fue casi
idéntica.
Discusión. Se conoce bien la capacidad de
osteoconducción de las matrices colagénicas sobre
la regeneración ósea. Sin embargo, el FibroquelMR
estimula la regeneración ósea a niveles superiores
que los obtenidos con colágena. Esto sugiere que
el PVP puede modificar las propiedades
fisicoquímicas y biológicas de la colágena, lo que
favorecería la formación de una matriz con mejor
capacidad para la invasividad y migración de células
Solicitud de sobretiros: Dr. Lino Díaz de León Hernández. Departamento de Biología Celular. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. Ciudad
Universitaria, Apartado postal 70228 . C.P. 04510 México D.F. México. Tel. 622-3819. Fax 622-3897
Recibido el 18/Octubre/1996. Aceptado para publicación el 7/Febrero/1997.
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J Chimal-Monroy, T Bravo-Ruiz, FE Krötzsch-Gómez, L Díaz de León.
osteoprogenitoras. Con base en estos resultados,
sugerimos la aplicación terapéutica de los implantes
de FibroquelMR en la resolución de defectos óseos.
Palabras Clave: Regeneración ósea, defectos
óseos, biomateriales, colágena, matriz extracelular.
SUMMARY.
FibroquelMR implants accelerate new bone
formation of experimentally induced bone
defects in rat skull: a histological study.
Introduction. Bone grafts are usually applied to
bone defects. However, due to ethical, clinical, or
immunological problems suitable alternatives to
induce bone repair are required. The aim of this
work was to compare the effect of lyophilized
collagen and Fibroquel MR on bone defects
surgically created in the skull of adult male rats.
Results. Results showed that ossification
stimulated with FibroquelMR implants ocurred more
rapidly than with collagen implants. At 5 days
postsurgery, FibroquelMR implants presented wellformed bone trabeculae, while with collagen
implants, this process had just begun. At 15 days
postsurgery FibroquelMR implants showed better
ossification than collagen implants. Finally, by 45
days postsurgery new bone formation with collagen
and FibroquelMR implants was almost identical.
Discussion. The osteoconduction capacity of
collagenous matrices for bone regeneration is well
known, however, FibroquelMR enhances bone
regeneration to higher levels than collagen alone,
suggesting that PVP can modify the
physicochemical and biological properties of
collagen, allowing the formation of a better matrix
for the invasion and migration of osteoprogenitor
cells. On the basis of these results, we recommend
the therapeutical application of Fibroquel MR
implants on bone defects.
Key words: Bone regeneration, bone defects,
collagen, extracellular matrix, biomaterials.
Revista Biomédica
INTRODUCION.
Los transplantes óseos usualmente se aplican en defectos óseos, independientemente de que
sean autólogos, homólogos o heterólogos. Sin
embargo, debido a problemas éticos, clínicos o
inmunológicos, es necesario el desarrollo apropiado de terapéuticas para inducir la reparación ósea.
Urist (1) demostró que las biomatrices de huesos
desmineralizados tienen la capacidad de inducir la
formación de hueso nuevo en sitios ectópicos. El
aislamiento, la identificación y la clonación de los
componentes de la matriz ósea con potencial
osteoinductivo, han mostrado que pertenecen a la
superfamilia del TGF-b. Estos componentes llamados proteínas morfogéneticas de hueso (BMP),
implantados en sitios ectópicos inducen la formación de hueso, a través de los procesos que ocurren durante la osificación endocondral (2).
La capacidad de inducción de cartílago y
hueso en sitios ectópicos ha sugerido la aplicación
terapéutica de las BMP en la regeneración de hueso
en defectos óseos y en la reparación de fracturas.
Sin embargo, no obstante la aplicación terapéutica
de las BMP en ortopedia, se han desarrollado otras
alternativas terapéuticas. La hidroxiapatita es uno
de los biomateriales de mayor uso como material
de implantación en defectos óseos (3, 4). Aunque
debido a diferencias con las apatitas óseas su
aplicación en ortopedia se ha reducido en años
recientes. La coralina, obtenida de calcita de coral,
es otra hidroxiapatita que sirve para el tratamiento
de defectos óseos (5, 6). De igual forma la
hidroxiapatita se ha usado como un substrato
acarreador de la BMP-3 en la inducción del
fenotipo ostegénico en células mesenquimáticas (7,
8) o en la regeneración de defectos óseos en
calvaria (9) o en defectos en huesos de la mandíbula
(10). Por otro lado, la implantación de colchones
de colágena en defectos de huesos de mandíbula
de conejo mostraron una osificación más rápida
comparada con los controles (11), lo que sugiere
que los implantes a base de colágena permiten la
reparación de defectos óseos. Por otro lado,
Constantz y col (12) obtuvieron un biomaterial
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FibroquelMR en la formación de hueso nuevo.
compuesto a base de fosfatos y calcio inorgánico
y una solución de fosfato de sodio. Este biomaterial
se prepara como una pasta y se inyecta
quirúrgicamente en sitios de fracturas, se endurece
en pocos minutos permitiendo que los osteoblastos
crezcan e invadan esa pasta y la reemplacen por
hueso nuevo. Sin embargo, no se ha reportado su
uso en defectos óseos.
Recientemente, en nuestro laboratorio hemos
trabajado con un biomaterial llamado FibroquelMR
que consiste de colágena tipo I de cerdo y
polivinilpirrolidona (PVP). Este biomaterial se ha
usado para el tratamiento de cicatrices queloides e
hipertróficas, en donde actúa como un fibrolítico
al inhibir la expresión de moléculas de ELAM-1,
VCAM-1, TGF-ß y PDGF-AB (13; 14; KrötzschGómez et al., sometido a publicación in Wound
Repair and Regeneration). De igual manera el tratamiento de fracturas con FibroquelMR acelera el
proceso de la reparación de fracturas, al promover
el reemplazamiento del callo fibroso, por callo
cartilaginoso y éste por callo óseo en menos tiempo que los controles. Asimismo, este fenómeno se
ve asociado a un incremento en la producción de
la osteopontina y la osteonectina, moléculas de la
matriz ósea relacionadas con la formación y
mineralización del hueso (15, 16, Chimal-Monroy
y cols, manuscrito en preparación).
El objetivo del presente trabajo fue comparar el efecto de implantes de FibroquelMR y de
colágena en la regeneración ósea en defectos óseos
creados quirúrgicamente en los huesos parietales
de ratas adultas. Este modelo experimental se usó
porque los defectos óseos no se resuelven espontáneamente, por lo tanto, se podría evaluar la
funcionalidad de implantes de FibroquelMR y de
colágena en la regeneración ósea. Los resultados
demuestran que tanto los implantes del Fibroquel
MR
como de la colágena son capaces de permitir la
regeneración de los defectos óseos. Sin embargo,
la formación de hueso nuevo fue más rápida durante los primeros días de implantación del
FibroquelMR. Con base en los resultados obtenidos
en el presente estudio sugerimos que el FibroquelMR
participa como un substrato que favorece la migración de células que participan en la reparación
ósea, tales como las células de tejido de granulación y las células precursoras del linaje
osteogénico.
METODOLOGIA.
El FibroquelMR y la colágena fueron suministrados por Áspid S.A. de C.V. El FibroquelMR
es una esponja compuesta de colágena tipo I de
cerdo y polivinilpirrolidona (PVP) de bajo peso
molecular, esterilizado por radiación gamma.
Un total de 54 ratas Wistar de 200 g de peso
se usaron en el presente estudio. Después de
anestesiar a las ratas se crearon defectos circulares
de 5 mm de diámetro en ambos huesos parietales
con un taladro dental y solución salina fría. Los
defectos se hicieron sin afectar las meninges. En
el experimento A, 18 ratas fueron implantadas con
FibroquelMR en los defectos de los huesos derechos,
al tiempo que la colágena se implantó en el lado
derecho de otros 18 animales. Los defectos del lado
izquierdo sirvieron como controles y no fueron
llenados artificialmente. En el experimento B, otras
18 ratas fueron implantadas en los huesos
izquierdos con colágena liofilizada y con
FibroquelMR en los huesos derechos. Los animales
de ambos experimentos se sacrificaron por
duplicado a los días 1, 3, 5, 7, 10, 15, 30, 45 y 60
post implantación de la colágena y el FibroquelMR.
Las muestras de tejidos de las ratas del experimento
A se fijaron en 2.5% de paraformaldehido y
procesados para cortes en parafina. Los cortes se
tiñeron de acuerdo la tinción tricrómica de Masson.
Los huesos de las ratas del experimento B se
procesaron para microscopía de alta resolución,
los tejidos se incluyeron en resina epóxica y se
obtuvieron cortes semifinos para su tinción con
azul de Toluidina. La formación de hueso nuevo
se evaluó por invasión hacia el defecto de células
formadoras de hueso y por la formación de
trabéculas óseas.
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J Chimal-Monroy, T Bravo-Ruiz, FE Krötzsch-Gómez, L Díaz de León.
Para la electroforesis de la colágena, la
colágena más PVP y el FibroquelMR se cargaron
iguales cantidades de proteína en un gel de
poliacrilamida-SDS al 7.5% (17).
RESULTADOS.
La colágena y el FibroquelMR presentaron
diferentes geometrías en la matriz que se formó
después de ser liofilizados, donde la colágena
presentó una geometría más regular que el
FibroquelMR (fig. 1). El análisis electroforético
mostró un ligero cambio en las movilidades
relativas de los componentes colagénicos del
Fibroquel MR, ya que las cadenas a1 (I) y a2 (I)
migraron ligeramente más arriba que las mismas
cadenas de la colágena tipo I de cerdo (comparar
en la fig. 2 el carril 1 con el carril 3). Por otro
lado, la cantidad de proteína del FibroquelMR que
se resuelve en la electroforesis es distinta a la que
se resuelve con la colágena tipo I, ya que la misma
cantidad de proteína se cargó en el gel. Asimismo,
al mezclarse la colágena y el PVP sin ningún
tratamiento con radiación gama, no se observaron
cambios en las movilidades relativas y en la
cantidad de proteína resuelta en la electroforesis
en comparación con la colágena (comparar en la
fig. 2 el carril 1 con el carril 2).
Figura 2.- Electroforesis de proteínas al 7.5% de
poliacrilamida. En el carril 1 colágena, carril 2 colágena
más PVP y carril 3 FibroquelMR.
Las observaciones macroscópicas de los
defectos óseos, en las ratas controles, desde el día
1 al día 60 post operación, no revelaron evidencia
de regeneración ósea espontánea. Esto confirma
la validez del modelo para evaluar la regeneración
ósea como consecuencia de la acción de diferentes
biomateriales (fig. 3). De igual manera, observamos
que el proceso de regeneración ósea en los grupos
de experimentación A y B es idéntica en ambos
casos. La presencia del FibroquelMR en el hueso
Figura 1.- Observación microscópica de las esponjas de colágena y FibroquelMR. Amplificación 30X.
Revista Biomédica
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FibroquelMR en la formación de hueso nuevo.
Figura 3.- Representación esquemática del modelo experimental (A). Se hicieron defectos óseos de 5 mm en ambos
huesos parietales. Los defectos fueron llenados con Fibroquel MR en los huesos derechos y con colágena en los hueso
izquierdos (B) representa 1 día postoperación y (C) 15 días postoperación. La barra representa 5 mm.
derecho no afectó el desarrollo del hueso izquierdo
implantado con colágena del experimento B, o bien
con los controles en el experimento A. Se
observaron los mismos resultados con los implantes
de la colágena.Por lo que se describirán
indistintamente los resultados de los experimentos
A y B.
Todos los animales de los experimentos A y
B llevaron a cabo una regeneración ósea completa.
Sin embargo, basados en las observaciones
histológicas, encontramos diferencias significativas
en la velocidad de regeneración del hueso en ambos
tratamientos. En los animales de los experimentos
A y B se observó que desde los 5 hasta los 15 días
post operación el 100% de las ratas con defectos
óseos implantados con FibroquelMR presentaron
mejor grado de regeneración ósea que los animales
implantados con colágena (p £ 0.05). Asimismo, a
los 45 días post operación, en todos los defectos
óseos analizados por histología, encontramos que
el 100% de ambos tratamientos, en los dos
experimentos, presentan regeneración ósea
completa sin encontrar diferencias significativas
entre los tratamientos.
En los huesos parietales implantados con
colágena se observó la presencia de células
mesenquimáticas en la zona del defecto óseo, al
día 1 post operación (fig 4A). A los 5 días post
operación las primeras células osteoprogenitoras
Figura 4.- Regeneración ósea después de la implantación
de colágena a los días 1 (A), 5 (B), 15 (C) y 45 (D) post
operación. Cortes semifinos de 1 µm de grosor teñidos con
azul de Toluidina.
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J Chimal-Monroy, T Bravo-Ruiz, FE Krötzsch-Gómez, L Díaz de León.
se agregaron para formar las incipientes trabéculas
óseas y los vasos sanguíneos fueron evidentes (fig.
4B). A los 10 días post operación la presencia
de osteoblastos alrededor de las trabéculas
óseas fue más pronunciada y a los 15 días el
arreglo trabecular del hueso fue evidente y, los
espacios entre las trabéculas fueron llenados
por tejido conjuntivo y vasos sanguíneos (fig.
4C). Finalmente, a los 45 días post operación
la osificación se completó (fig. 4D).
Las ratas implantadas con el FibroquelMR
liofilizado mostraron, al día 1 post operación,
la presencia de células mesenquimáticas en
todas las zonas del defecto óseo (fig. 5A). A
los 5 días post operación (fig. 5B) la formación
de las trabéculas óseas fue mayor cuando se
compará con los implantes de colágena (fig.
4B), ya que estos últimos mostraron una
formación incipiente de las trabéculas óseas.
Al día 15 post operación las trabéculas óseas
mostraron menor tejido conjuntivo entre ellas
(fig. 5C). Al finalizar el período experimental
las histología del hueso en los implantes de
Fibroquel MR (fig. 5D) fue muy similar a la que
se obtuvo con los implantes de colágena
(comparar fig. 4D y D).
Figura 5.- Regeneración ósea después de la implantación
de FibroquelMR a los días 1 (A), 5 (B), 15 (C) y 45 (D) post
operación. Cortes semifinos de 1 µm de grosor teñidos con
azul de Toluidina.
Revista Biomédica
DISCUSION.
La regeneración es un proceso biológico
durante el cual ocurren una serie de procesos en
secuencia que dan lugar a la formación completa
de estructuras complejas (18). El término inducción
se refiere al proceso por el cual la ruta de desarrollo
de una población celular cambia en su dirección de
diferenciación por señales emitidas de otra población
(19, 20). Por consiguiente, la inducción de la
regeneración significa que diferentes señales
inductoras son capaces de organizar a una población
celular para formar estructuras complejas de manera
muy semejante a la estructura original como ocurre
durante el desarrollo embrionario. En el caso del
hueso, las señales particulares que participan en su
regeneración son las BMP, ya que estas moléculas
cuando son implantadas intramuscularmente dan
lugar a una secuencia de procesos biológicos, en
forma similar a como ocurre durante el desarrollo
embrionario, que culmina con la formación local de
hueso (1, 21).
Esos términos son importantes debido a que
la colágena y el FibroquelMR no son inductores de
la regeneración ósea, pues su implantación ectópica
no promueve la formación de hueso. Por lo tanto,
en este estudio la colágena y el FibroquelMR son
considerados como biomateriales con capacidad
osteoconductiva, esto es, son biomateriales que
permiten el establecimiento de todas las condiciones ambientales para la regeneración ósea, tales
como la presencia de una matriz extracelular adecuada que favorezca la invasión y migración de
células osteoprogenitoras que surgen de los márgenes de los defectos óseos.
En este estudio no se observaron diferencias significativas en el resultado final entre los
implantes de colágena y FibroquelMR, pues hubo
formación total de hueso con ambos tratamientos.
Sin embargo, en los primeros 15 días de la regeneración ósea , el FibroquelMR aceleró la formación de hueso en comparación con lo obtenido con
colágena (p £ 0.05). Estos resultados apoyan los
obtenidos con el FibroquelMR en la reparación de
fracturas, donde el biomaterial fue capaz de acele-
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FibroquelMR en la formación de hueso nuevo.
rar la consolidación ósea, al estimular la expresión
de moléculas que favorecen la osificación (15, 16,
Chimal-Monroy y col, manuscrito en preparación).
Es interesante hacer notar que la mezcla de
la colágena con un químico como el PVP provoca
una aceleración en la osificación en comparación
con la obtenida con la colágena sola. Lo que sugiere que los implantes de FibroquelMR podrían formar una matriz más adecuada que favorezca la invasión y migración de las células osteoprogenitoras,
que la obtenida con los implantes de colágena. Esta
diferencia podría deberse al entrecruzamiento de
la colágena con el PVP después de ser esterilizados con radiación gama. Aunque no tenemos evidencia de que los componentes del FibroquelMR se
entrecruzan entre ellos, hemos observado que algunas propiedades fisicoquímicas se modifican. Por
ejemplo, se sabe que la colágena forma un gel a
37°C. En cambio, el FibroquelMR en estado líquido, no es capaz de formar un gel a la misma temperatura. Por electroforesis de proteínas, observamos que las movilidades relativas y la cantidad de
proteína que entra al gel cambia en el FibroquelMR
y no en la mezcla de colágena con PVP sin irradiar. Esto sugiere que la presencia de PVP modifica las propiedades fisicoquímicas y biológicas de
la colágena, lo que podía generar que la geometría
de la matriz entre los implantes de colágena y
Fibroquel MR sea diferente, como se observa
macroscópicamente en los liofilizados de ambos
biomateriales. Esta sugerencia que se hace para el
FibroquelMR podría ser apoyada por Anselme y cols
(22), quienes demostraron que el entrecruzamiento entre la colágena y los glicosaminoglicanos 4sulfato de condroitina y sulfato de heparán muestra diferentes tendencias para calcificar en lugares
subcutáneos dependiendo del método de entrecruzamiento. Un pretratamiento de las esponjas de
colágena-glicosaminoglicanos con glutaraldehido
genera calcificación distrófica, mientras que el
método de acil azida incrementa la persistencia de
las esponjas in vivo hasta por 90 días sin generar
calcificación distrófica. De igual manera Ripamonti
y Reddi (9), reportaron que la geometría del
substrato tiene un efecto importante sobre la inducción ósea por las BMP. Ellos demostraron que
las BMP implantadas con hidroxiapatita con una
configuración discoidal permiten la expresión del
fenotipo osteogénico, mientras que no son capaces de hacerlo cuando se implantan con un
substrato de hidroxiapataita con igual tamaño en
los poros.
Con base en los resultados obtenidos de este
estudio y que la geometría de la matriz es un factor importante, sugerimos la aplicación terapéutica del FibroquelMR para el tratamiento de defectos
óseos.
AGRADECIMIENTOS.
Los autores agradecen a los Drs. León Cintra
McGlone y Agustín Galván por su ayuda en el
establecimiento del modelo experimental; la asistencia
técnica a la Dra. Margarita García Garduño y a Isabel PérezMonfort por su asistencia editorial. Este estudio fue
financiado parcialmente por Áspid. S.A. de C.V.
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