Técnicas Indice de materias

Técnicas
Indice de materias
• Introducción a los cultivos celulares.
8 Introducción histórica.
8 Conceptos actuales de cultivo celular.
8 Tipos de cultivos de tejidos.
8 Biología de la célula en cultivo.
• El medio de cultivo.
8 El sustrato de cultivo.
8 La fase gaseosa.
9 Oxígeno.
9 Dióxido de carbono.
8 Propiedades físicas.
9 pH y capacidad tamponadora.
9 Osmolaridad
9 Temperatura
9 Viscosidad
9 Tensión superficial
8 Condiciones fisiológicas.
• Las contaminaciones.
8 Contaminación bacteriana y por levaduras.
8 Contaminación por micoplasmas.
8 Contaminación por virus.
• Técnicas de contaje celular.
• Métodos de disgregación celular.
8 Mecánicos.
8 Químicos.
8 Enzimáticos.
• El laboratorio de cultivo celular.
8 Cabinas de flujo laminar.
8 Incubadores.
8 Incubador de CO2.
8 Incubadores tipo "roller".
8 Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido.
8 Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido).
8 Equipo de esterilización.
9 Equipo de filtración.
9 Autoclave.
9 Mechero Bunsen
8 Otros instrumentos.
9 Centrífugas.
9 Contador electrónico de células ("cell counter").
9 Equipo de purificación de agua.
9 Pipeteadores
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Introducción a los cultivos celulares.
Introducción histórica.
El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX como una continuación de las técnicas de la
embriología. Wilhem Roux mantuvo en el año 1885 células de embrión de pollo en solución salina durante unos días. El
zoólogo americano R.G. Harrison es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales, en 1907.
Harrison fue el primer autor que empleó técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de
médula espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableció que el
axón se formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusión de una cadena de células. El cultivo se realizaba
en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cámara sellada.
La primera limitación para el establecimiento de cultivos era lograr un medio nutritivo adecuado. Burrows (1910) empleó
plasma de pollo para nutrir los explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se reveló mucho mejor que los
anteriormente probados, lo que le permitió observar el crecimiento del tejido nervioso, corazón y piel.
Burrows y Carrel realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de células de mamífero, y consiguieron mantener
explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias, así como en el crecimiento de tumores sólidos.
Demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar mediante subcultivo. Los medios empleados fueron plasma
suplementado con extractos de embrión.
Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para disociar las células de embriones de
pollo, estableciendo el primer cultivo celular. Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los
cultivos celulares es la aparición de múltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron numerosos métodos de
manipulación en condiciones de asepsia que aún hoy día se utilizan.
En 1913 Carrel demostró la posibilidad de mantener en cultivo células extraídas de un animal, embrión de pollo, durante un
periodo de tiempo superior al de la vida de éste. Mantuvo en cultivo células de pollo durante 34 años (Sharp, 1977). Gran
parte del éxito en el mantenimiento de los cultivos se debió al desarrollo del denominado frasco de Carrel.
• Entre los años 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtención de cultivos y de mantenimiento de las
condiciones estériles, pero sin grandes avances. A partir de los años 40, con el aislamiento de los primeros antibióticos, se
desarrollaron numerosas aplicaciones de entre las que podemos destacar :
• 1948 Earle y col. (Sanford, Earle y Likely, 1948) aislaron células de la línea celular L y mostraron que eran capaces de
formar clones en el cultivo de tejidos. Demostraron que para que una célula llegue a dividirse necesita ser alimentada con
los nutrientes correctos.
• 1952. Gry y col. (Grey, Coffman y Kubicek, 1952) establecen la primera línea celular continua, las actualmente bien
conocidas células HeLa. El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo, extracto de
embrión bovino y suero de cordón umbilical humano.
• 1954 Rita Levi-montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en
tejidos en cultivo (Levi-Montalcini y Calissano, 1979). Este trabajo supuso el Premio Nóbel para Levi-Montalcini en 1986.
• 1955 Eagle (Eagle, 1955) realiza la primera investigación sistemática de los requerimientos nutritivos de las células en
cultivo. Describe que las necesidades del cultivo de soluciones corporales complejas (sueros,... ) pueden ser satisfechas
por tan poco como el 1% de suero de caballo dializado en un medio definido de pequeñas moléculas (aminoácidos,
azúcares, ...)
• 1961 Hayflick y Moorhead usaron por primera vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de
fibroblastos. Pudieron mantener estos cultivos durante unos 12 pases, pero no consiguieron establecer líneas estables.
• 1965 Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener algunas células de mamífero en cultivo
indefinidamente (Ham, 1965).
• 1969 Augusti-Tocco y Sato establecen la primera línea celular estable de neuroblastoma aislando clones que establecían
procesos nerviosos y que eran eléctricamente excitables (Augusti-Tocco y Sato, 1969). Se empiezan a establecer las
primeras líneas celulares diferenciadas.
• 1975 Kohler y Milstein establecen la primera línea celular productora de anticuerpos monoclonales (Koehler y Milstein,
1975). El establecimiento de la tecnología de obtención de anticuerpos monoclonales les valió el Premio Nóbel.
• 1976 Sato y col. publicaron sus trabajos en los que demuestran que las diferentes líneas celulares requieren mezclas
distintas de hormonas y factores de crecimiento para crecer en medios libres de suero. (Sato y col., 1982).
En los últimos años la aplicación de la tecnología del cultivo celular ha permitido grandes avances en la comprensión de los
mecanismos implicados en los procesos intracelulares e intercelulares con el establecimiento de co-cultivos,...
A pesar de que el primer animal del que se establecieron cultivos celulares era un anfibio, poiquilotermo, rápidamente el
interés se centró en el cultivo de células de animales homeotermos, especialmente humanas, por su gran interés médico.
Sin embargo en los últimos años, y especialmente debido a la problemática del control de plagas e infecciones en agricultura
y piscicultura, se ha desarrollado notablemente el establecimiento de líneas celulares de poiquilotermos e invertebrados.
Conceptos actuales de cultivo celular.
Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células 'in vitro',
manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Dependiendo del grado de preservación de la
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estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: de órganos,
explantes, primarios o secundarios,...
Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenómeno
celular.
• Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como por ej. transcripción de DNA,
síntesis de proteínas, metabolismo energético...
• Flujo intracelular. Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los diferentes procesos fisiológicos, como
por ej. ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA: núcleocitoplasma, movimiento de proteínas,...
• Ecología celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su
diferenciación..., como por ej. estudio de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformación celular
(inducidas por virus o agentes químicos), cinética de la población celular,...
• Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por
adhesión, interacciones célula-célula.
Como ejemplo de áreas de investigación fuertemente dependientes de las técnicas de cultivo celular son:
• Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas antivirales,...
• Investigación del Cáncer
• Inmunología. Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos
monoclonales, así como en el análisis de la genética de la célula somática.
• Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares: interferón, insulina, hormona de crecimiento,...
• Estudios de interacción y señalización celular, en la diferenciación y en el desarrollo. Comprende el estudio de los
receptores y de las vías de translocación de la señal.
• Aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo en medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a
partir de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,...
• Aplicaciones médicas: mantenimiento y producción de tejidos para transplante.
• Aplicaciones industriales y agronómicas: producción por reproducción "in vitro" de clones de plantas de interés
comercial,...
Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, pero al mismo tiempo tienen unas desventajas que hay que
tener en consideración. Como ventajas podemos citar:
• Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio:
físico-químicos (pH, temperatura, presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión superficial...), y fisiológicos (hormonas,
factores de crecimiento, densidad celular,...). Esto es cierto completamente sólo para algunas líneas celulares para las que
se han definido los denominados medios definidos. Un medio definido es aquel en el que se conocen todos y cada uno de
los componentes que lo forman, y la concentración exacta en que se encuentran. Establecer un medio definido supone
conocer con precisión las necesidades nutritivas de las células en cuestión. Sin embargo en muchas líneas no se han
llegado a establecer medios definidos. En estos casos se trata de medios que se suplementan con soluciones complejas
(suero, extractos de embrión, etc...) en los que se encuentran factores hormonales y nutritivos imprescindibles para el
mantenimiento del cultivo pero cuya naturaleza se desconoce. Estas soluciones complejas están sujetas a variación de lote
a lote.
• Caracterización y homogeneidad de la muestra. Las células en cultivo de una línea celular (cultivo primario propagado), o
de una línea continua son homogéneas, con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener con facilidad un
número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras
inherente asociado al uso de animales de experimentación.
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• Economía. Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en volúmenes reducidos, y
con un acceso directo de las células a la droga las concentraciones requeridas son mucho más bajas que en animal
completo. Es diferente el coste de investigación de un nuevo fármaco para la empresa farmacéutica que está
desarrollando moléculas si ha de sintetizar de cada una de las que ha de probar en cantidades del orden del gramo (para
el estudio en animales) a que baste con pocos miligramos.
• Motivaciones éticas. La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles de animales de
experimentación. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo' pero es una alternativa válida en
muchas situaciones. Incluso un cultivo celular primario permite realizar experimentos que suponen el sacrificio de uno o
pocos animales, pero con ellos se pueden ensayar un número de condiciones experimentales que pueden suponer si el
estudio se hace con animales de experimentación el sacrificio de decenas o cientos.
En cuanto a las desventajas del cultivo celular:
• Técnica sensible. El crecimiento de las células animales es mucho más lento que el de los contaminantes más habituales
(hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...) y además dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces
de crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto supone la
necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental
requerido como del personal cualificado para su manipulación.
• Cantidad y costo. El costo de producción de 1 gr de tejido en cultivo es más de 10 veces superior al obtenido en el animal.
Asimismo existe una limitación de producción, que es del orden de 10 gr de células en un laboratorio normal, y que para
ser superior a 100 gr requiere instalaciones de tipo industrial.
• Inestabilidad. Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotación cromosómica
aneuploide. La población celular puede variar su composición si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer
con una tasa ligeramente superior, es decir podemos encontrar diferencias significativas en la línea celular de una
generación a la siguiente. La única manera de evitarlo es emplear líneas estables que se resiembran a partir de un stock
congelado cada determinado tiempo, o después de un determinado número de generaciones.
• Validez del modelo “in vitro”. Cuando nos referimos a un cultivo celular nos estamos refiriendo exactamente a un
disgregado celular de un tejido de origen y que se diferencia de éste en que:
8 se ha perdido la organización espacial tridimensional propia del tejido.
8 se han perdido las interacciones heterotípicas, entre los distintos tipos celulares, y entre las células y la matriz
extracelular. Es de destacar que los avances más excitantes en la función celular proceden del reconocimiento de la
importancia de las interacciones específicas de las células con otras células o con el sustrato.
8 carece de los componentes sistémicos de regulación, implicados en la regulación de la homeostasis 'in vivo',
especialmente los sistemas nervioso y endocrino.
Cuando se establece el cultivo, las células se desdiferencian, y entre otras cosas se hacen móviles e inician su proliferación.
Esta desdiferenciación puede, en algunos casos ser revertida por procedimientos de diferenciación inducida por hormonas,
confluencia, inductores químicos (ésteres de forbol,...) pero no está claro si el estado rediferenciado es equivalente al estado
de diferenciación 'in vivo'.
Por todo lo anterior hemos de ser precavidos en cuanto a la validez de los resultados obtenidos “in vitro” respecto a lo que
pueda observarse “in vivo”. Sin embargo actualmente se están realizando gran cantidad de estudios de validación de
modelos “in vitro” dentro del desarrollo de los métodos alternativos a la experimentación animal, por ejemplo por ECVAM
(European Center for Validation of Alternative Methods), ALTWEB (Colección de recursos para el desarrollo de métodos
alternativos a la experimentación animal en web de la Universidad John Hopkins, USA), Invittox (Colección de protocolos “in
vitro”), Invitroderm (Alternativas a los ensayos de irritación dérmica en animales), etc.
Tipos de cultivos de tejidos.
Se podría hablar de tres tipos de cultivos:
• Cultivo de órganos. Implica que la arquitectura característica del tejido “in vivo” se mantiene al menos en parte. Para
ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que
mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares
diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el
crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. La
imposibilidad de propagar obliga a partir en cada nuevo experimento de nuevo material animal lo que conlleva una
elevada heterogeneidad.
• Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las
células de la periferia del explante.
• Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se
puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su
propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica
negativa se pierde la heterogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el
cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento.
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En la actualidad los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la posibilidad de propagación, así como
por las ventajas en la cuantificación, caracterización y repetitibilidad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de
interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con importantes éxitos.
Biología de la célula en cultivo.
En el proceso de establecimiento de un cultivo celular se seleccionan las células que crecerán según numerosos criterios. Así
solo formarán el cultivo aquellas células que sean por una parte capaces de superar el proceso de disgregación, y por otra
capaces de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensión.
El crecimiento en monocapa significa que las células se adherirán al sustrato y en esa forma inician la proliferación. Muchas
líneas celulares son anclaje dependientes, es decir no inician la proliferación hasta que se han adherido al sustrato. Este es
el modo normal de proliferación de la mayor parte de las células, con excepción de las células hematopoyéticas maduras. El
crecimiento en suspensión es propio de aquellas células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato,
independientes de anclaje, y es propio de las células hematopoyéticas, algunas líneas celulares transformadas y de células
procedentes de tumores. Es de destacar que en todo tejido existe una fracción o tipo celular que es capaz de crecer en
suspensión. A pesar de que su origen no está claro se cree que se trata de células cepa ("stem cells") indiferenciadas.
Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva selección: aumentan en número aquellas células que tienen una
mayor tasa de crecimiento. En el momento en que se alcanza la confluencia las células, en general, detienen su crecimiento,
aunque pueden existir tipos celulares, neoplásicos, que sigan duplicándose y que desplacen a los otros del cultivo.
Así pues se ha de entender el cultivo como un ente dinámico en el que las proporciones relativas de los diferentes elementos
que lo forman varían en el tiempo en función de la presión selectiva a la que estén sometidos.
Una vez se alcanza la confluencia en el cultivo es cuando muchas líneas celulares expresan sus aspectos más característicos.
Es en este estado cuando el parecido morfológico y fisiológico es mayor al modelo celular de origen. Es también el momento
en el que se detiene el crecimiento y se hace necesario dividir, replaquear o propagar las células.
Es una observación generalizada que después del tercer replaqueo el cultivo se estabiliza y homogeneiza: el tipo celular de
mayor tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo desplazando a los otros tipos celulares. En general, si no se
establecen condiciones selectivas las células del tejido conjuntivo, especialmente fibroblastos, serán las seleccionadas
finalmente. Para evitar que las células más especializadas del cultivo se vean desplazadas de éste por los fibroblastos y otras
células de rápido crecimiento se han establecido protocolos detallados de medios selectivos.
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Evolución de una línea celular hipotética. Comportamiento a lo largo de las semanas.
En el momento en que las células comienzan a dividirse en la placa su número se incrementa, hasta ocupar todo el espacio.
En ese momento es necesario tomar algunas y resembrar en una nueva placa. En el caso de células en cultivo primario el
factor de dilución de un pase al siguiente suele ser de 1/2 a 1/5 pero no superior. En el caso de líneas celulares establecidas
la dilución puede ser tan elevada como 1/100 o 1/1000, siendo la habitual 1/10. El caso más extremo serían los procesos de
clonaje en los que se siembran en pocillos (multiwell de 96 pocillos) 1 única célula.
El crecimiento de las células en cultivo primario prosigue a lo largo de una serie de generaciones o pases característicos de
cada tipo celular y condiciones de cultivo. Así los hepatocitos de adultos no se establecen más que como cultivo primario
mientras que las células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases, y los
fibroblastos dérmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin embargo al final todas ellas entran en una fase de
senescencia, con acumulación de numerosas anormalidades, perdida de funciones especializadas, etc... que conducen a la
muerte del cultivo.
Sólo ocasionalmente un cultivo primario se mantiene durante más
generaciones de las esperadas. Es debido a la aparición en el cultivo de
células inmortales. Estas células forman líneas estables o cultivos celulares
permanentes. La razón de la inmortalización de estas células es en la
mayor parte de los casos desconocida pero se incrementa la frecuencia de
inmortalización mediante infecciones virales, tratamientos con mutágenos,
etc... por lo que deben estar relacionadas con la pérdida, espontánea o
inducida por el tratamiento, de las vías de control celular. Se hipotetiza
que la capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como
línea estable está relacionado directamente con su variabilidad genética.
Así líneas celulares que nunca se establecen como estables se mantienen
euploides como es el caso de fibroblastos humanos (Hayflick y Moorhead,
1961), fibroblastos de pollo (Hay y Strehler, 1967), y la glia humana
(Pontén y Westermarck, 1980) mientras que otras líneas frecuentemente
se convierten en aneuploides y se transforman en líneas celulares
continuas con
mayor frecuencia, como es el caso de las células
epidérmicas (Green y col., 1979; Thomas J., 1979).
Comparación del número de cromosomas
por célula en una línea primaria glial y una
línea estable de melanoma.
Existen diferencias muy importantes entre una línea celular continua y una línea primaria o un cultivo primario. En la tabla
siguiente se recogen las propiedades diferenciales de las líneas finitas y continuas.
Ploidía
Transformación
Tumorogenicidad
Dependencia de anclaje
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Finita
Continua
Diploide / Euploide
Heteroploide / Aneuploide
Normal
Transformada
No-tumorogénica
Tumorogénica
Si
No
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Inhibición por contacto
Si
No
Limitación de crecimiento por densidad
Si
No
Cíclico
Posible mantenerlas
quiescentes
Elevados
Bajos
Baja
Elevada
Pueden expresar
marcadores específicos
Cromosomales,
enzimáticos... se pierden
Se mantienen
Se suelen perder
Baja (24 a 96 h tiempo de
replicación)
Rápida (12 a 24 h)
Bajo (<106 células/mL;
Alto (>106 células/mL;
Mantenimiento
Requerimientos de suero
Eficiencia de clonaje
Marcadores
Funciones especializadas
Tasa de crecimiento
Rendimiento en cultivo
5
2
<10 células/cm )
>105 células/cm2)
Algunas definiciones que son importantes son:
• Cultivo primario. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano. Las células mantienen la viabilidad un periodo de
tiempo limitado y no se reproducen en cultivo. En general en cultivo presentan una reducción en el número total de
células vivas a lo largo del tiempo. Ejemplos: hepatocitos obtenidos de hígado adulto, neuronas, etc...
• Línea primaria. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de tiempo limitado pero
con reproducción de las células en el cultivo. Ejemplos: fibroblastos dérmicos, queratinocitos, células endoteliales de aorta
bovina (BAEC), células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC), etc...
• Línea celular continua. Cultivo que se establece a partir de un tejido u órgano, en muchos casos de un tumor, y que se
mantiene en cultivo un tiempo ilimitado. Se trata de células “inmortales”.
El cultivo de las células no presenta las mismas dificultades independientemente del tipo de célula de que se trate. Hay
grandes diferencias que se relacionan fundamentalmente con el grado de diferenciación del tipo celular. Así pues en general
se puede establecer como norma que una línea celular será tanto más fácil de establecer o cultivar cuanto más
indiferenciada sea, con las excepciones de las líneas tumorales de células diferenciadas.
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Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las células pierden algunas de sus propiedades
diferenciadas, entre ellas la característica incapacidad de dividirse, y se convierten en células que mantienen tan solo
algunas de las propiedades que las caracterizaban. Esta pérdida de propiedades puede ser debida a desdiferenciación o
desadaptación. La primera implica una pérdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular ( por ejemplo un
hepatocito en cultivo pierde sus enzimas característicos (arginasa, aminotransferasas,...) no puede almacenar glucógeno ni
sintetizar las proteínas del suero...), mientras que la segunda implica que la característica especializada perdida no es
irreversible sino consecuencia de la pérdida de la señal (por ejemplo externa, hormonal, nerviosa, ...) y que basta con
recuperarla para que se reexprese (por ejemplo Michalopoulos y col. (Michalopoulos y Pitot, 1975; Sattler y col., 1978) han
demostrado que los hepatocitos de rata pueden reexpresar tirosina aminotransferasa en presencia de ciertas hormonas
(insulina e hidrocortisona) cuando crecen sobre una matriz de colágeno).
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El medio de cultivo
El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones
orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre
soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará
formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células, las condiciones físico-químicas y
fisiológicas del medio, la naturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación, especialmente la
humedad y la temperatura.
• El sustrato de cultivo. La mayor parte de las líneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte más o
menos sólido. El crecimiento en suspensión está usualmente restringido a algunas líneas celulares especialmente de
células hematopoyéticas y tumores ascíticos. Según si la línea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice
que es dependiente (adhesión) o independiente (suspensión) de anclaje:
8 La mayor parte de las células que se mantienen en cultivo proceden de disgregación tisular o de tumores formados por
células adheridas y mantienen esa característica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse.
8 Los cultivos en suspensión suelen coincidir con los de aquellas células que “in vivo” son circulantes, en general células
sanguíneas. El gran interés que tiene el cultivo de células sanguíneas (linfocitos) ha extendido notablemente la
caracterización de los cultivos en suspensión. El cultivo de células en suspensión tiene algunas ventajas: mayor facilidad
de manipulación y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separación del sustrato mediante por
ej. tripsinización, posibilidad de cultivo en mayor escala pues sólo dependen de la accesibilidad del medio y de los gases
pero no de la superficie del recipiente, etc... y algunas desventajas: son cultivos homogéneos en los que se pierden las
interacciones (espaciales, de adhesión, etc...).
Los tipos de sustrato más empleados en la actualidad son los siguientes:
8 Vidrio. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y
esterilización. Asimismo es especialmente útil para su posterior observación al microscopio por su calidad óptica.
8 Plástico desechable. Muy empleado en la actualidad como material desechable estéril por irradiación. El plástico más
empleado es el poliestireno, de buena calidad óptica. Debido a que este plástico es hidrofóbico requiere un tratamiento
mediante irradiación-gamma, químico, o mediante descargas eléctricas que produzca una superficie hidrofílica. El
tratamiento es característico de los diferentes suministradores, y por ello los productos varían en calidad de uno a otro.
Aunque para la mayor parte de los usos rutinarios no es necesario, es recomendable probar muestras de distintos
orígenes y medir la eficacia de plaqueo y las tasas de crecimiento para maximizarlas especialmente en aquellas líneas
celulares de crecimiento difícil. Otros plásticos que se emplean son polivinil-cloruro, policarbonato (PVC),
politetrafluoretileno (teflón, PTFE), thermanox (TPX).
8 Actualmente es de gran interés, especialmente para el cultivo de células epiteliales polarizadas, el uso de membranas
plásticas porosas. Un ejemplo de este tipo de cámara se representa en la figura.
8 Microsoportes ("microcarriers"). Se trata de soportes plásticos (poliestireno), de sephadex o poliacrilamida en forma de
pequeñas bolas ("beads") a las que se unen las células dependientes de anclaje. Estas bolas con las células adheridas se
mantienen en suspensión.
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8 Otros sustratos artificiales. Se han desarrollado técnicas para crecer células de glia en sustratos metálicos, de paladio
(Westermark, 1978) o en discos de acero (Birnie y Simmons, 1967).
8 Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las células en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha
sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colágeno o fibronectina liberada por
las células, o bien sobre superficies recubiertas de proteínas de matriz extracelular (fibronectina, colágeno, vitronectina,
Matrigel, etc...). Así, se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ng/mL) añadido al medio, o con
colágeno. El tratamiento con colágeno desnaturalizado aumenta la adhesión de muchos tipos celulares, y especialmente
de las células epiteliales.
Muchos resultados parecen indicar que el tratamiento de las superficies con compuestos biológicamente activos pueden
inducir alteraciones específicas de la adhesión o el comportamiento celular. Se han descrito métodos para la
reconstitución de membranas basales con la finalidad de optimizar las condiciones de diferenciación celular (Reid y
Rojkind, 1979). Estos resultados refuerzan la noción cada vez más extendida de que las interacciones célula-matriz
extracelular son determinantes en la regulación de la proliferación y la diferenciación.
Otros tratamientos que se han usado han sido: gelatina (músculo), poli-D-lisina (algunos teratomas de ratón).
8 "Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus
características diferenciadas precisan de suplementos específicos. Una manera de obtener estos suplementos es la de
hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. Estas monocapas previas se esterilizan o se
inhibe su crecimiento (normalmente por irradiación X o gamma). Este efecto podría ser debido a dos posibilidades:
suplementación del medio, o modificación del sustrato. Una de las monocapas más empleadas son los fibroblastos de
ratón 3T3 irradiados.
8 Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las células penetran, estableciendo una distribución tridimensional:
geles de colágeno (Douglas y col., 1980), esponja de celulosa sola (Leighton y col., 1951), o recubierta de colágeno
(Leighton y col., 1968), o "gelfoam". En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera
análoga a como lo hacen en el tejido de origen: células epiteliales de mama se organizan en disposición tubular,
mientras que las células del carcinoma de mama lo hacen de una forma mucho más desordenada (Yang y col., 1981).
8 Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesión celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel
(metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersión de las
células derivadas de una originaria, por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus.
8 Interfases líquido-gel o líquido-líquido. Se han observado en algunas situaciones proliferación celular y adhesión a las
interfases líquido-líquido o líquido-gel, a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos (Rosenberg, 1965).
8 Haces microcapilares permeables (“hollow fiber”). Son cámaras de crecimiento de células formadas por un recipiente
cilíndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares plásticos permeables adecuados para
que las células se adhieran. Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio. Este
dispositivo ofrece una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio
del medio.
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Tal como se ha descrito previamente, el material más utilizado como sustrato es el plástico desechable, en forma de
diferentes tipos de recipientes. Los más comunes son:
8 placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaños: 3,5, 6,0 y 10 cm de diámetro son las más empleadas cuando se
trata de crecer las células para usar directamente en experimentos. No es recomendable, por su escasa estanqueidad,
emplearlas para el mantenimiento de líneas.
8 multiplacas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos.
8 frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaños, son recomendables para el
mantenimiento de las líneas y la producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión.
8 "roller bottles". Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se incuban en los incubadores
dotados de "roller". Existen variantes con una gran superficie de adhesión (espirales de plástico...) y que se destinan a
la producción de gran número de células.
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Incubador tipo “roller”
“Roller bottles”
• La fase gaseosa. Los componentes más significativos de la fase gaseosa son el oxígeno y el dióxido de carbono:
8 Oxígeno. Las necesidades de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares es cubierta con la tensión
atmosférica, aunque existen cultivos, especialmente los cultivos de órganos que requieren una tensión de oxígeno
superior (del 95%) posiblemente debido a la geometría del órgano y a las dificultades de difusión del gas en su interior.
Se ha propuesto (McKeehan y col., 1976) que los requerimientos de selenio en el medio podrían ser debidos a su papel
en la detoxificación de radicales de oxígeno, especialmente en los medios sin proteínas séricas.
8 Dióxido de carbono. El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO2
disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3-. Las reacciones que tienen lugar en el medio son:
⎯⎯→
⎯⎯→
H2O + CO2 ←⎯⎯ H2CO3 ←⎯⎯ H+ + HCO3−
[
⎯⎯→
NaHCO3 ←⎯⎯ Na+ + HCO3−
[
El incremento de la concentración de ión bicarbonato desplaza la ecuación [1] hacia la izquierda, de modo que el pH se
establezca en 7,4. Se puede emplear asimismo otra base, por ejemplo NaOH, siendo la ecuación:
⎯⎯→
⎯⎯→
NaOH + H2CO3 ←⎯⎯ NaHCO3 + H2O ←⎯⎯ Na+ + HCO3− + H2O
De modo que para establecer un pH determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato
sódico y la tensión de CO2. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2 para
alcanzar el pH correcto. Sin embargo, se emplean otras sustancias tamponadoras en la formulación de muchos medios
en la actualidad, lo que permite una estabilidad superior del pH en el medio, así como una mayor capacidad
tamponadora (los denominados Good's buffers: HEPES, Tricina,.. (Good et al., 1966)). Aunque aparentemente podría
ser posible prescindir del bicarbonato en la formulación del medio, esto se ha revelado falso, debido probablemente a
que la ausencia de bicarbonato sódico desplazaría la ecuación [1] hacia la derecha, de modo que tendería a desaparecer
el CO2 disuelto y eventualmente el ión bicarbonato, ambos aparentemente necesarios para el crecimiento celular (Itagaki
y Kimura, 1974).
Una alternativa es la suplementación del medio con piruvato. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su
producción de CO2 endógeno, haciéndolas independientes de la aportación de CO2 exógeno.
En resumen, los cultivos crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmósfera de CO2, cuya
concentración esté en equilibrio con el bicarbonato sódico en el medio. A concentraciones celulares muy reducidas (por
ej. durante el clonaje) es necesario añadir CO2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados. Cuando la concentración
celular es más elevada puede no ser necesario añadir CO2 a frascos cerrados, pero si en frascos abiertos. En los casos
en los que la densidad celular sea elevada, con mucha producción de ácido es recomendable, por la elevada producción
de CO2 endógeno, mantener abierto el recipiente de modo que se pueda eliminar el exceso. En estos casos es
especialmente recomendable suplementar el medio con HEPES para asegurar un correcto control del pH del medio.
• Propiedades físicas. Las características del medio son: pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad y tensión superficial.
8 pH y capacidad tamponadora. El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7,4 aunque existen
pequeñas variaciones: algunas líneas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7,4 y 7,7 y células transformadas lo
hacen en el margen de pH de 7,0 a 7,4 (Eagle, 1973), células epidérmicas pueden ser mantenidas a pH 5,5 (Eisinger y
col., 1979).
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[
El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7,4, naranja a pH 7,0, amarillo a pH
6,5, azul-rojo a pH 7,6 y púrpura a pH 7,8. El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios
bruscos de pH. La solución tamponadora más empleada sigue siendo el tampón bicarbonato, que equilibra el CO2
atmosférico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a: su bajo coste, baja toxicidad, y beneficios
nutricionales para el cultivo. HEPES es la solución tamponadora de elección por su elevada capacidad tamponadora en el
rango 7,2 a 7,6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM. Cuando se usa conjuntamente con CO2 externo, debe
estar a concentración doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado (ver figura 3.3).
8 Osmolaridad. Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien
en el rango de 260 a 320 mOsm/kg, con pequeñas variaciones dependiendo de la especie considerada. Es recomendable
emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el periodo de incubación,
especialmente en incubadores sin control de la humedad ambiente.
La osmolaridad se controla mediante la determinación del punto de congelación o la elevación de la presión de vapor.
Hay que tener en cuenta que la adición de HEPES, de drogas disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior
pueden afectar fuertemente a la osmolaridad del medio.
8 Temperatura. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, de ahí la importancia de un
buen control de ésta en la incubación. Influye asimismo en el pH del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el
pH del medio 0,2 unidades por debajo del óptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso
suero, dejar equilibrar en la estufa y después ajustar el pH, antes de añadirlo al cultivo.
8 Viscosidad. La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca
influencia sobre el crecimiento. Sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo (menor daño a
más viscosidad) y en la tripsinización. Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero,
añadiendo al medio carboximetil-celulosa o polivinilpirrolidona (Birch y Pitch, 1971).
8 Tensión superficial. La tensión superficial se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de
espumas en los cultivos en suspensión donde se burbujea CO2. En estos casos es recomendable emplear un agente
antiespumante de silicona pues en éstos casos se produce un aumento de la desnaturalización de proteínas y se
incrementa el riesgo de contaminación si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo.
• Condiciones fisiológicas. Hacen referencia a la composición del medio. Ya se indicó que la principal dificultad para el
establecimiento de las líneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al
medio "natural" como extractos embrionarios, hidrolizados de proteína o sueros. Un primer grupo de medios tales como el
medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, 1955, 1959) y el más complejo 199 de Morgan y col. (Morgan y col., 1950) o CMRL
1066 de Parker y col. (1950) eran medios definidos pero que precisaban de un suplemento de suero entre el 5 y el 20%.
A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios más complejos como NCTC
109 (Evans y col, 1956), 135 (Evans y Bryant, 1965), MB572/1 (Waymouth, 1959), Ham F10 y F12 (Ham, 1963, 1965),
serie de los MCDB (Ham y McKeehan, 1978) y los medios de Sato suplementados con hormonas (Barnes y Sato, 1980).
La aproximación recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12,
suplementado con elevada concentración de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero
hasta poderla reducir o suprimir. Después de años de investigación en la composición de los medios la elección de éstos
sigue siendo empírica.
Los principales medios empleados y sus aplicaciones son:
8 Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con sólo los aminoácidos esenciales. Se necesita siempre la
suplementación con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratón y células HeLa.
8 Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso más corriente, contiene más aminoácidos y en mayor
concentración que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adición de suero (10%).
8 RPMI 1640. Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión. Tiene un
amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados.
8 Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentración de aminoácidos y vitaminas que el
BME. Se usa para la selección de hibridomas suplementado con HAT o HT.
8 Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina
bovina, transferrina, selenito, et... Es muy útil para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. También sirve para
otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones.
8 McCoy 5A. Medio diseñado para el crecimiento para el crecimiento de líneas celulares diploides tanto de rata como
humanas.
8 Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivo de virus.
8 Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de líneas celulares humanas, debe ser suplementado con proteínas y hormonas.
Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es útil para el cultivo de células amnióticas.
8 Medio F-12 de Ham. Útil para el crecimiento de líneas celulares son suplementos proteínicos. Combinado con IMDM es
un medio que se usa como libre de suero.
8 Medio 199. Muy usado para el cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías.
Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos:
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8 Soluciones salinas equilibradas (BSS). Una solución salina equilibrada es una mezcla de sales inorgánicas, incluyendo
usualmente bicarbonato sódico, y suplementada con glucosa. Se usan para diluir medios más completos, como medio de
disección o lavado, o para incubaciones cortas que requieren un medio isotónico no completo nutricionalmente. Su
elección dependerá de:
9 la tensión de CO2. La concentración de bicarbonato deberá permitir el equilibrio a pH 7,54 a 36,5ºC. Así BSS-Eagle
es más usada para 5% CO2 y BSS-Hank (HBSS) es usado a la tensión atmosférica normal.
9 su uso en la disgregación de tejidos o monocapas. En ese caso deberán carecer de Ca2+ y Mg2+. Son recomendables
los medios de Moscona, CMF, o PBS de Dulbeco o Vogt (PBSA).
9 su uso para el cultivo en suspensión o de células en monocapa. Es recomendable el uso de MEM(S), variante de
MEM sin Ca2+ que reduce la agregación celular y la adherencia.
Debido a su escasa capacidad tamponadora se recomienda suplementarlo con HEPES para pH en el rango 7,2 a 7,8 y
Tricina en el rango 7,4 a 8,0.
8 Aminoácidos. Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Asimismo se suplementa con
otros aminoácidos, pues los requerimientos pueden variar de una célula a otra. Un suplemento común es el de
glutamina, a 2 mM final, aunque hay algunas líneas celulares pueden usar el glutamato. La glutamina es inestable en el
medio, y se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100×) que se mantiene congelado, no más de 1
semana antes de añadir el medio al cultivo (conservando a 4ºC).
8 Vitaminas. El medio MEM sólo suplementa con vitaminas del grupo B, siendo los demás grupos aportado por el
suplemento de suero. En medios más definidos se suplementan todas las vitaminas. La limitación de vitaminas se
manifiesta en la supervivencia de las células y en la reducción de la tasa de crecimiento más que en la densidad celular.
8 Glucosa. Es la fuente de energía en muchos medios. Metabolizada preferentemente vía glucólisis hacia piruvato que
puede ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO2. La acumulación de ácido
láctico en el medio propio de células embrionarias y transformadas parece indicar un funcionamiento diferente del ciclo
de Krebs en estas células respecto al modelo in vivo. En estos casos la mayor parte del CO2 parece proceder de un uso
de la glutamina/glutamato.
8 Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular. Dependiendo del medio, éste incluye en su formulación
nucleósidos, intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato, lípidos,... La adición de piruvato en el medio permite al cultivo
incrementar su producción endógena de CO2 haciéndole independiente de la aportación exógena de éste. El medio de
Leibovitz L15 contiene una concentración superior de piruvato y no contiene bicarbonato sódico, y no requiere aporte de
CO2 en la fase gas.
8 Hormonas y factores de crecimiento (suero). En los medios no definidos suele aportarlos el suero. Los tipos de suero
empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo ("horse
serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS). El más usado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino
fetal es usado en líneas más exigentes, y el suero humano en líneas humanas. La utilización de suero es problemática
pues:
9 a pesar de que la composición del suero es conocida, existen gran cantidad de componentes presentes en
cantidades variables en éste que pueden influir notablemente en el cultivo (hormonas, factores de crecimiento...)
9 el suero varía de lote a lote, y cada uno se puede emplear como máximo 1 año, probablemente deteriorándose a lo
largo de ese tiempo, a pesar del almacenamiento a baja temperatura.
9 cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos.
9 si se cultivan varios tipos celulares cada uno puede requerir un lote diferente, lo que complica el almacenamiento e
incrementa los costes.
9 crea una dependencia importante de un suministro que no siempre puede mantenerse con la periodicidad y calidad
requerida.
9 si se han de purificar productos del medio de cultivo la presencia de los componentes del suero dificulta
notablemente estos procesos.
9 el suero está contaminado con desgraciadamente demasiada frecuencia por virus y micoplasmas, lo que representa
un grave peligro para el cultivo.
9 algunos factores séricos como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) estimula la proliferación de fibroblastos,
lo que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados.
En conjunto supone un gran inconveniente para la estandarización de protocolos experimentales y de producción. Por
ello se realizan importantes esfuerzos para la definición de medios definidos para el crecimiento celular. Esto, además de
la reproducibilidad buscada, permite establecer medios selectivos en los que crezca el tipo celular deseado. Tienen como
desventaja la gran cantidad de esfuerzo necesario para su definición, así como que en muchos casos el crecimiento de
las células en estos medios es menor, las líneas finitas permanecen viables menos generaciones, así como el hecho
probable de que la adaptación del cultivo al medio libre de suero supone un tipo de selección per se.
Para conseguir reemplazar el suero completamente de un medio será necesario reemplazar:
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9 los factores de adhesión como la fibronectina. Células crecidas en medios libres de suero requieren el suplemento de
fibronectina (25-50 μg/mL) o laminina (1-5 μg/mL) en el medio, o bien el tratamiento de las placas con poli-lisina (1
mg/mL) antes de la siembra.
9 inhibidores de proteasas. Después de la tripsinización de un cultivo el exceso de actividad tríptica se inhibe por la
adición de suero al medio. En ausencia de éste deben usarse inhibidores de proteasas como el inhibidor de tripsina
de soja.
9 hormonas. El complemento hormonal dependerá especialmente del tipo celular, tales como hormona de crecimiento,
T3, hidrocortisona, dexametasona, FSH, ...
9 factores de crecimiento peptídico. En la actualidad se han identificado algunos polipéptidos de actividad mitogénica:
FGF ("Fibroblast Growth Factor"), EGF ("Epidermal Growth Factor"), PDGF ("Platelet Derived Growth Factor") y MSA,
y con un rango amplio de actividad. Asimismo se han aislado otros factores con mayor especificidad de acción.
9 nutrientes: Fe, Cu, Se, y otros minerales, a pesar de que los fundamentos de su función son desconocidos en
muchos casos.
9 proteínas y poliaminas. La inclusión de albúmina bovina añade indefinición al medio, por ello se recomienda el uso
de BSA libre de ácidos grasos (usualmente a 1-10 mg/mL). Transferrina (10 ng/mL) se requiere como portador de
Fe, y se cree que puede tener actividad mitogénica. Putrescina se usa a alrededor de 100 nM.
A fin de reemplazar el suero se han desarrollado una serie de sustitutos comerciales como son SerXtend (NEN), Ventrex
(Ventrex Lab Ltd.), Nu-serum (Collaborative Res.), ...
8 Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos). A fin de evitar el crecimiento de
contaminantes en el cultivo se suele suplementar éste con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción. La
adición de antibióticos ha de ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo.
Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o más antibióticos. Las mezclas de uso más común son:
9 Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 μg/mL). Combinación anti-microbiana.
9 Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 μg/mL) / Fungizona. Combinación anti-microbiana y anti-fúngica.
9 Gentamicina (50 μg/mL). Anti-microbiana, conviene ir alternándola con la penicilina-estreptomicina.
9 Anfotericina-B (2,5 μg/mL). Antifúngico y antilevaduras. Se han observado algunos efectos secundarios sobre el
crecimiento de células de médula ósea humana en cultivo.
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Las contaminaciones.
Uno de los problemas más frecuentes en el cultivo de tejidos en general es el de las contaminaciones. Las células eucariotas
en cultivo crecen lentamente, con tiempos de duplicación superiores en muchos casos a las 24 h. Sin embargo, tanto las
bacterias como las levaduras tienen una tasa de crecimiento superior. Si se da el caso de una contaminación por estos
organismos pueden provocar la muerte del cultivo en poco tiempo. Para evitarlo se utilizan una serie de técnicas de trabajo
que suponen la máxima asepsia, así como la esterilización del material y el trabajo en ambientes estériles (cabina de flujo
laminar). Asimismo se utilizan cócteles de sustancias antimicrobianas y antifúngicas en el medio aunque en multitud de
ocasiones no es posible usarlas o bien no son suficientes para prevenir la aparición de microorganismos.
Los tipos de contaminaciones más frecuentes son por bacterias, por hongos y levaduras, por micoplasmas y por virus:
• Contaminación bacteriana y por levaduras. Los medios de cultivo proporcionan un medio ideal para el crecimiento de
los contaminantes microbianos, y los procedimientos habituales de manipulación (abertura de recipientes, pipeteado,...)
son susceptibles de provocar contaminación por bacterias. Los antibióticos, añadidos en los cultivos a corto plazo de forma
habitual no son recomendables en los cultivos a largo plazo. Para evitar las contaminaciones por bacterias es necesario
extremar las condiciones de esterilidad y realizar una serie de controles sobre las soluciones y recipientes a usar. Así es
recomendable comprobar el estado de contaminación de cualquier tipo celular antes de introducirlo en las salas donde se
trabaja con otros tipos celulares...
Los controles de esterilidad están diseñados para detectar no aquellos contaminantes de crecimiento rápido y que
producen cambios notables en el medio de cultivo pues estos se detectan fácilmente incubando alícuotas de medio en la
estufa durante 24 o 48 h, sino aquellos otros de crecimiento lento y que no se producen cambios apreciables en el cultivo.
No existe un test único capaz de detectar todos los contaminantes.
La fuente más frecuente de contaminación es la atmósfera. Las precauciones a tomar serán:
8 trabajo en ambiente estéril, en una cabina de flujo laminar o en el área de influencia de un mechero bunsen.
8 usar pipeteadores automáticos y pipetas automáticas. Si no se dispone de estos nunca pipetear directamente con la
boca sino mediante un tubo de goma y intercalando algodón en la boca de la pipeta.
8 mantener los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible.
8 todas las botellas de medio y de soluciones atemperadas en un baño deben secarse cuidadosamente antes de usarlas.
8 ante cualquier duda limpiar con alcohol 70% o flamear el material que pueda estar contaminado si no es reemplazable,
o reemplazarlo si es posible.
8 si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han de tomar muestras para su análisis conviene
hacerlo en ambiente estéril y después limpiar cuidadosamente el área de trabajo y conectar la iluminación UV.
De todas formas no es fácil reducir a una lista las precauciones a tomar y la única forma de aprender es practicar bajo
supervisión.
• Contaminación por micoplasmas. Los micoplasmas son células procariotas pequeñas (0,3 a 0,5 μm de diámetro) que
pueden formar pequeñas colonias similares a las que forma el agente productor de la pleuroneumonía bovina (de ahí su
nombre de "pleuropneumonia-like organisms", PPLO). No poseen pared celular y por ello sólo son capaces de crecer en
ciertos medios. Existen varios grupos serológicos de micoplasmas de dos géneros (Mycoplasma y Acholeplasma). Los
contaminantes responsables de las infecciones de los cultivos celulares proceden mayoritariamente de 4 especies: M.orale
(humano), M.hyorhinis (cerdo), M.arginini (bovino) y A.laidlawii (bovino y también de roedores).
Los cultivos primarios suelen estar libres de micoplasmas, pero muchas de las líneas celulares continuas están infectadas.
La contaminación suele proceder de suero animal contaminado con A.laidlawii y M.arginini o de la tripsina de cerdo
contaminada con M.hyorhinis. A pesar de que M.hominis, M.pharyngis y M.salivarum se pueden aislar de la boca y la
garganta humana, la mayor fuente de contaminación procede del uso de cultivos contaminados. Se citan datos de que
alrededor del 50 al 95% de las células utilizadas actualmente están contaminadas con micoplasmas.
Dado que la contaminación con micoplasmas no es tan evidente como la contaminación por bacterias o levaduras es
importante por una parte tener en cuenta el posible efecto de los micoplasmas sobre el cultivo, y realizar controles
periódicos de su presencia.
Los efectos dependen de la especie implicada. Así las especies M.gallisepticum y M.mycoides son patógenos pero son poco
frecuentes. Otras especies no producen la muerte celular pero retardan el crecimiento celular. Así por ejemplo M.hominis
parece retardar el crecimiento del cultivo pues consume toda la arginina presente debido a su elevada actividad arginina
deaminasa, mientras que A.laidlawii destruye rápidamente los desoxirribonucleótidos, y en un cultivo infectado es
realmente difícil realizar medidas de incorporación de timidina tritiada pues ésta es rápidamente convertida a timina.
Los requerimientos de los micoplasmas son complejos y sólo crecen en medios donde hay células en crecimiento. Parece
que requieren los productos de degradación de ADN celular, pues los nucleósidos son factores de crecimiento esencial
para los micoplasmas.
Una observación cuidadosa de las células en cultivo puede dar un primer aviso de la presencia de micoplasmas: aparición
de gránulos oscuros en el citoplasma. A continuación se detallan algunas de las técnicas usadas en la actualidad para la
detección de los micoplasmas:
8 Tinción con orceína (Fogh y Fogh, 1968).
9 sembrar las células sobre cubreobjetos de modo que no hayan alcanzado la confluencia en 24 h.
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9 sumergir el cubreobjetos en una placa de Petri con 3 mL de citrato sódico 0,6% y añadir lentamente 1 mL de agua.
Dejar 10 min y añadir lentamente 4 mL de fijador de Carnoy (1:3 acético:etanol). Sacar todo el líquido y reemplazar
por 2 mL de fijador de Carnoy.
9 dejar fijar durante 10 min. Dejar secar.
9 teñir 10 min con orceína, y lavar 3 veces con etanol absoluto.
9 montar en DPX, observar con el microscopio de contraste de fase. Las células contaminadas muestran los
micoplasmas preferentemente en el borde celular y en los espacios intracelulares.
8 Autoradiografía de cultivos incubados con timidina tritiada. Un cultivo contaminado muestra señal autoradiográfica fuera
del núcleo por efecto de la degradación de la timidina a timina propia de muchos micoplasmas.
8 Tinción fluorescente con Hoechst 33258, 33217 o DAPI. Esta técnica detecta el DNA de los micoplasmas pues el
colorante (Hoechst 33258 o 33532, o el DAPI) se une específicamente al DNA. Se emplea la misma técnica de tinción
que para la tinción nuclear.
Cultivo negativo a micoplasmas (ATCC)
Cultivo positivo a micoplasmas (ATCC)
8 Test de crecimiento para micoplasmas. El efecto letal de la contaminación por micoplasmas sobre el cultivo puede
acentuarse mediante la adición al medio de 6-metilpurina desoxirribonucleósido (6-MPDR). Todos los micoplasmas
presentan gran actividad del enzima adenosina fosforilasa, capaz de convertir 6-MPDR (no tóxico) en 6-metil purina y 6
metil-purina ribonucleósido, ambos tóxicos para las células de mamífero (McGarrity y Carson, 1982).
Existen sistemas de cultivo de micoplasmas de gran sensibilidad que permiten detectar la presencia de pequeñas
cantidades de contaminante. Es el caso del Método directo de cultivo que propone ATCC en su servicio de detección de
micoplasmas. Este cultivo sin embargo tiene como gran limitación los 28 días que precisa.
8 Sonda DNA para micoplasma. Es una sonda de DNA tritiada capaz de reconocer el RNA ribosomal de micoplasma en
cultivos celulares. Es muy sensible, pero aún cuesta 10 veces más que el ensayo de Hoechst. Supone obtener un lisado
celular al que se añade la sonda de DNA, se hibrida a 72ºC durante 1 h, se precipita y se lava el híbrido DNA/RNA y se
cuenta la cantidad de radiactividad retenida.
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8 Detección de micoplasmas mediante PCR. Se han propuesto diversos métodos para la detección de micoplasmas
mediante PCR, y se han comercializado kits,
como el producido por la ATCC que permite
detectar 5 especies de micoplasmas responsables
del 95% de las contaminaciones. En el
laboratorio se emplea un método de detección
mediante PCR que se basa en el descrito por
Wong-Lee y Lovett (1998). Empleando una sola
pareja de cebadores correspondientes al RNA 16s
de 8 especies de micoplasma (M.hyorhinis,
M.arginini,
M.pneumoniae,
M.fermentans,
M.orale, M.pirum, Acholeplasma laidlawii y
Spiroplasma mirum).
Protocolo:
9 Secuencias de los cebadores:
ª Mico1: GGC GAA TGG GTG AGT AAC
ACG
ª Mico2 : CGG ATA ACG CTT GCG AC TAT
G
9 Concentración de trabajo de los cebadores
10 pmol/μL
9 Condiciones de PCR: 95ºC 1 min, (95ºC 1
min, 55ºC 1 min, 72ºC 1,30 min) 35 ciclos,
4ºC mantenido
9 Tamaño esperado 0,5 kb
Para la eliminación de los micoplasmas, en general se recomienda, si el cultivo es reemplazable, eliminarlo, esterilizar todo
y volver a empezar. Sólo cuando el cultivo es irreemplazable o importante se recomienda proceder a su eliminación en el
cultivo. Para ello hay varias posibilidades:
8 Tratamientos antibióticos. Se ha descrito que la kanamicina (0,1 mg/mL) previene el crecimiento del micoplasma (Fogh
y Hacker, 1960), así como la tylocina (6,0 μg/mL). Asimismo son efectivos contra micoplasmas las quinolonas, como
ciprofloxacina (Schmitt y col., 1988), y MRA. Las quinolonas inhiben la DNA girasa procariota.
8 Tratamientos con sueros inmunes. El tratamiento del cultivo con sueros anti-micoplasmas se ha revelado como efectivo,
pero costoso.
8 Pase por un animal. En el caso de cultivos de líneas tumorales se ha revelado como especialmente útil la inoculación a
un animal de experimentación y la recuperación posterior. El sistema inmune del animal limpia el cultivo de
micoplasmas.
• Contaminación por virus. La contaminación viral es un problema grave pues su prevención y eliminación es realmente
difícil. Desde que se descubrió que el suero bovino podía ser una fuente importante de contaminación por diferentes virus
(herpesvirus y virus parainfluenza-3) los sueros son controlados rutinariamente, aunque la validez de estos ensayos es
limitada. Por ello la única alternativa es el uso de medios libres de suero.
Los virus pueden tener un efecto citopático marcado, pero los más peligrosos son aquellos que crecen a baja tasa o en
unas pocas células tan sólo. Así, en células de individuos con linfoma de Burkitt, producido por EBV (Epstein-Barr virus),
no muestran señales de EBV en cultivo hasta varios pases, cuando solo unas pocas células muestran inmunofluorecencia
positiva (Henle y Henle, 1966). La manera más eficaz de detectar la infección por virus es infectar un animal sensible y
seguir la aparición de efectos citopáticos.
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Técnicas de contaje celular
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido.
Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que
son viables.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje
celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la cámara de Neubauer, hasta equipos automáticos de contaje
celular como el "Cell Coulter".
El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una
partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio. Una pequeña abertura entre los
electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las partículas que se encuentran en suspensión. Cuando una
partícula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de
voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula. Controlando la cantidad de la suspensión que
circula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir varios miles de
partículas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de
contaje celular, por ej. la cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que
se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan un volumen conocido
(x microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la
densidad de partículas en la suspensión de origen.
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de
campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una
depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un
diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 ×
3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0,25 mm. Así pues el
área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión
central del cubreobjetos está hundida 0,1 mm respecto a la superficie, de forma
que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0,1
milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de
0,1 milímetro cúbico, es decir 0,1 microlitro.
Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células
entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será:
Concentración en la suspensión (células/mL) = 10.000 ⋅
x
4
En la imagen se puede observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como
una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0,25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un
microscopio invertido de contraste de fases.
Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen se puede
observar una cámara de Neubauer doble:
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Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul
tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues las células
que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar células blancas, por exclusión, a
células viables es un error pues por este método se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión, determinando
como inviables sólo aquellas con la membrana rota. En la imagen se han representado células vivas como puntos blancos y
células muertas (teñidas con azul tripán) como puntos azules. Corresponde a una de las áreas de contaje de la cámara de
Neubauer (1 mm2).
Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio.
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Métodos de disgregación de células en placa
La disociación tisular y el subcultivo celular representan dos aplicaciones en las que es necesario separar las células entre sí
y de un sustrato manteniendo la viabilidad celular. Para conseguirlo es necesario romper la malla de proteínas que forman la
matriz extracelular que las mantiene unidas mediante procesos que separen las moléculas proteicas de la matriz extracelular
(por ej. secuestrando los iones calcio que permiten la unión), o bien rompiendo proteolíticamente (mediante la acción de
proteasas) las mismas proteínas.
Generalmente los métodos empleados se pueden clasificar en tres categorías:
• Mecánicos (por ejemplo cortar, picar, cribar, rascar, etc...). En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos
de rascado (“scrapping”) de la placa para arrancar las células adheridas.
• Químicos. Generalmente se trata de la adición de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes
quelantes de estos iones. En cualquier caso se reduce la concentración de los iones que estabilizan las uniones de las
proteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares.
• Enzimáticos. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa, dispasa,
tripsina, elastasa, papaína, pronasa, hialuronidasa, etc...)
Sin embargo en la práctica se suelen emplear técnicas que combinan dos o tres métodos. La elección de uno u otro
procedimiento dependerá fundamentalmente de la naturaleza y cantidad de tejido o cultivo disponible y del uso previsto de
las células obtenidas. A continuación se muestra una clasificación de métodos de disgregación celular clasificados según una
severidad creciente:
• Agitación (sacudidas a la placa).
Se separan las células que están en mitosis y las adheridas
ligeramente.
• Tripsina (0,01-0,5%) en PBS, 5 a 15 min, 37ºC.
La mayoría de las líneas celulares.
• Prelavado con PBS, Tripsina 0,25% en PBS, 37ºC.
Algunas líneas celulares que se adhieren fuertemente, y
muchas líneas celulares a pases bajos.
• Prelavado con EDTA 1mM, Tripsina 0,25 % en PBS, 37ºC.
Algunas células en pases bajos fuertemente adheridas.
• Dos lavados con EDTA 1mM, dejando en EDTA 1 mM, 1
mL/5 cm2
Células epiteliales, aunque algunas pueden ser sensibles a
EDTA
• Prelavado con EDTA, Tripsina 0,25% con EDTA
Células fuertemente adheridas, especialmente epiteliales y
algunas tumorales. Hay que tener presente la posible
toxicidad del EDTA.
• Prelavado con EDTA 1mM, Tripsina 0,25% y colagenasa
200 U/mL en PBS o EDTA/PBS
Cultivos gruesos formados por múltiples capas de células,
especialmente en cultivos productores de colágeno.
• Rascar (“scrapping”)
Todos los cultivos, aunque puede producir daño mecánico y
usualmente no produce una buena suspensión celular.
• Añadir dispasa (0,1-1 mg/mL) o pronasa (0,1-1 mg/mL) al
medio hasta que las células desadhieran.
Suspenderá la mayor parte de las células, pero requiere la
centrifugación de la suspensión para eliminar el enzima no
inactivado por el suero. Puede ser dañino para algunas
células.
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El laboratorio de cultivo celular.
La característica principal que define al laboratorio de cultivo celular es el mantenimiento de la asepsia. La tasa de
crecimiento de las células en cultivo es muy inferior al de los contaminantes habituales: hongos, levaduras, bacterias y
micoplasmas, y por ello para el mantenimiento del cultivo será vital evitar la aparición en éste de cualquier microorganismo
indeseado.
El área de trabajo para realizar cultivos debe instalarse en una parte del laboratorio tranquila, alejada de las vías de paso y a
ser posible dedicada exclusivamente al cultivo de células. La solución ideal es disponer de una habitación aislada.
Las aparición de cabinas de flujo laminar redujo las necesidades de aislamiento del área de trabajo pero aún así es
recomendable mantener un gradiente de esterilidad, desde el medio exterior o laboratorio general al interior de las cabinas
de flujo donde se manipularán los cultivos y del incubador donde se mantendrán.
Las necesidades de asepsia dependen del tipo de material que se va a procesar en el laboratorio. Esto define dos tipos de
contención y de área de trabajo diferentes:
• el laboratorio de cultivo de tejidos general, para la manipulación de cultivos no patógenos se instalará preferentemente en
una sala aislada y a la cual se le suministrará aire filtrado (normalmente mediante un equipo de filtración y regulador de la
temperatura). Esto produce un aumento de presión atmosférica en el interior del laboratorio (típicamente entre 15 y 20
mm de Hg) que impide la entrada de aire no filtrado al área limpia.
• el laboratorio de cultivo con patógenos supone un nivel de contención superior. A fin de evitar la salida accidental de éstos
agentes se filtra el aire que sale de la sala, generando un déficit de presión en el interior de ésta. El aire sale siempre
estéril.
En el laboratorio de cultivo celular propiamente dicho se encuentran los siguientes tipos de instrumentos:
• Las cabinas de flujo laminar. Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles
contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico
que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o
en la pared frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del 99.999% retiene las partículas por debajo de un cierto
calibre que es en general de 0,2μm. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas
partículas contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad
constante del aire, como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas,
generadores de intensas corrientes de convección.
Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se diseñan con diferentes propósitos:
8 Protección personal: protección del personal de los posibles agentes dañinos del interior de la cabina.
8 Protección del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes
exteriores o de la contaminación cruzada con otros productos o cultivos situados en la misma cabina.
8 Protección medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes.
Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena protección del producto, pero no son
adecuadas para el trabajo con materiales peligrosos o con algún tipo de riesgo pues el operador queda completamente
expuesto. En las cabinas de flujo vertical, más sofisticadas, se segura una buena protección del producto, y, dependiendo
de su diseño se puede asegurar una protección total del operador. Son por ello más adecuadas para el trabajo con
agentes peligrosos.
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Cabina de flujo laminar horizontal
Cabina de flujo laminar vertical
Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en el diseño de la cabina se trata de
cabinas de clase I, II o III.
8 Cabina de clase I. Se trata de una unidad de contención parcial adecuada para la manipulación de agentes de bajo
riesgo, donde existe una necesidad de protección del operario y del medio pero no del producto. Este es el tipo de
cabinas normalmente denominadas "de gases", y no son de uso común en el laboratorio de cultivo de tejidos.
8 Cabina de clase II. Este tipo de cabinas protegen el producto, al personal y al medio ambiente. En general las cabinas
de clase II se describen como un equipo de protección con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar
estable en el interior, con una filtración HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtración HEPA del aire
exhausto (de salida al medio). Los sucesivos diseños que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten
clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases:
9 Tipo A. En este tipo el 30% del aire es eliminado en cada ciclo y el 70% es recircularizado. El escape al medio de los
agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal.
9 Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general y en ella se recirculariza sólo el 30% del aire en
cada ciclo, eliminándose el 70% del aire restante.
9 Tipo 100% exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100% del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos
que puedan retener los posibles agentes peligrosos. Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en
laboratorios de toxicología en los que se requieren áreas de contención limpias y eliminación del aire posiblemente
contaminado.
Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la protección del usuario, superior en el caso del
tipo A, y a la eliminación de la cabina de posibles contaminaciones de tipo aerosol, no retenibles por el filtro HEPA. La
tipo A, que es la más adecuada para el trabajo con agentes patógenos particulados (filtrables) es la menos adecuada
para el trabajo con vapores o aerosoles peligrosos.
Asimismo se ha de tener en cuenta que el funcionamiento correcto para la protección del producto y del personal
depende de una correcta calibración del instrumento, especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire
en el sistema y de flujo vertical. El punto de calibración o ajuste es dependiente del instrumento y debe ser realizado por
personal especializado cada 6 a 9 meses de funcionamiento para asegurar la protección al usuario.
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8 Cabina de clase III. Se trata de una cabina de seguridad, estanca, para el trabajo con agentes biológicos de alto riesgo.
Permite mantener al agente patógeno en un ambiente completamente estanco. Permiten controlar tanto los
contaminantes particulados como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas de filtración y disolución de
éstos.
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• Incubadores. Se trata de equipos comunes a la mayor parte de los laboratorios de biología (estufas, baños
termostatizados,...) con la excepción del incubador de CO2, y del incubador con "roller". Las células en cultivo son capaces
de soportar sin daños importantes variaciones de temperatura, siempre que sean por debajo de la temperatura corporal
del animal del que proceden. Así pues las células humanas soportan incubaciones a 4ºC durante días y pueden ser
congeladas a -196ºC durante años (con sustancias preservantes). Sin embargo no sobreviven más de unas pocas horas a
variaciones de 2ºC por encima de 37ºC. Las células procedentes de animales poiquilotermos soportan mejor un amplio
rango de temperaturas de incubación.
Las células de homeotermo suelen crecer bien entre 33ºC y 37ºC, pero en ese margen presentan importantes variaciones
en su tasa de crecimiento. En un incubador de células es por tanto más importante la consistencia de la temperatura
(invariabilidad durante prolongados periodos de tiempo, con oscilaciones inferiores a 0,5ºC) que su precisión a fin de
mantener a las células en condiciones en las que las tasas de crecimiento sean constantes. Por ello se deben usar
incubadores con movimiento de aire forzado en el interior, y colocar los contenedores de células sobre estanterías
agujereadas y nunca sobre el fondo o las paredes del incubador.
Las necesidades de asepsia en el incubador son considerablemente menores que en el área de trabajo (cabina de flujo
laminar) pero sin embargo es muy recomendable mantener una estricta limpieza, desinfección periódica del incubador, y
especialmente no introducir, o eliminarlos inmediatamente, cultivos contaminados en el incubador.
Para determinar el número y tipo de los incubadores requeridos se tendrá en cuenta:
9 el tipo de cultivos a realizar: primarios o de líneas celulares estables. Es conveniente no cultivar en el mismo
incubador cultivos primarios con líneas celulares estables, pues los primeros son una importante fuente de
contaminación.
9 la especie y el tipo de células a cultivar. Es importante la determinación exacta de la temperatura de incubación para
la que se tendrá en cuenta la temperatura corporal del animal del que proceden las células, así como cualquier
variación regional de temperatura (la piel suele tener una temperatura inferior). Algunos autores sugieren incorporar
asimismo un factor de seguridad a la temperatura de incubación. Por ejemplo para la incubación de células humanas
sugieren el cultivo a 36.5 ºC, cercano al valor de la temperatura corporal pero un poco inferior para mayor
seguridad. Esto es en la actualidad innecesario en los incubadores modernos, capaces de regular la temperatura de
incubación con gran precisión. Así pues serán necesarios tantos incubadores como diferentes temperaturas de
incubación se precisen.
• Incubador de CO2. El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una tensión controlada de CO2 y
adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO2. Un incubador moderno dispone de:
8 dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad que desconecta la función en caso de anomalía.
La estabilidad de la temperatura es una característica esencial del incubador, y por ello suelen estar equipados con
camisas de agua ('water jacketed') que incrementan notablemente la inercia térmica. Como consecuencia la
estabilización de un incubador puede tardar varios días.
8 dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2, en la proporción deseada, entre el 4 y el 7%. El CO2 de elevada
pureza se suministra en botellas presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyección. El control de la mezcla se
realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA ("infra-red gas analyzer"). En incubadores modernos este
dispositivo analiza constantemente el porcentaje de CO2 presente en la cámara de incubación, y realiza las correcciones
necesarias. Un problema usual del dispositivo de medida de CO2 es la pérdida de calibración que se produce
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periódicamente. Para evitarlo algunos fabricantes dotan al sistema de un mecanismo de autocalibración periódica
(basado en la toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor determinado de CO2).
8 dispositivo de control de la humedad ambiente. Para mantener el cultivo se requiere una humedad ambiente elevada, a
fin de reducir la evaporación de agua del medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se consigue
mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Este recurso es peligroso pues son una fuente importante de
contaminaciones al convertirse a los pocos días en caldos de cultivo. En los instrumentos más modernos se dispone de
dispositivos que controlan la humedad atmosférica, inyectando agua estéril y filtrada.
8 dispositivo de recircularización de aire. Es importante una recirculación del aire en el interior del incubador, a fin de
homogeneizar la temperatura en su interior. Si además en el circuito de circulación de aire se intercala un filtro HEPA se
consiguen eliminar las posibles partículas contaminantes, y se asegura la esterilidad del ambiente.
Las condiciones del cultivo (temperatura, humedad atmosférica y niveles de CO2) son características de cada línea celular.
El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al
5%.
• Incubadores tipo "roller". Se trata de un incubador o estufa, en el interior del cual se ha instalado un "rotor" de baja
velocidad. Se utiliza para mantener cultivos en botellas cerradas (no requieren CO2). La finalidad es disponer de una gran
superficie para la adhesión de las células. En estos instrumentos se incuban las células en el interior de “roller bottles”,
botellas con una gran superficie de crecimiento.
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Incubador tipo “roller”
“Roller bottles”
• Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido. El control morfológico del
cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho de que las muestras a observar se encuentren en
recipientes de un cierto grosor (más de 3 cm en el caso de frascos de Roux de 250 mL) hace que un microscopio
convencional no sea adecuado (por su pequeña distancia frontal), por lo que se han desarrollado microscopios de diseño
original, en los cuales la fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un
microscopio óptico convencional.
La segunda característica que condiciona el instrumento óptico es su ausencia de color, es decir se trata de muestras vivas
y con poco contraste. El microscopio se equipa con el dispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del
condensador y placa de fases entre las lentes del objetivo). De esta forma el contraste de la imagen aumenta y la calidad
obtenida es muy superior.
Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captación de imágenes, fotográfico o de video acoplado al
microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos.
• Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido). Es recomendable que los congeladores y la
instalación de criogenia estén en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y
compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio.
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Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas, para lo que se requiere:
8 neveras (4ºC) para el almacenamiento de medios, PBS, ...
8 congeladores de -20ºC para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas
(tripsina, colagenasa,...).
8 congeladores de -80ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,...)
y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitógenos, inductores,...).
8 unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196ºC), para el almacenamiento de las líneas celulares.
• Equipo de esterilización: autoclave y equipo de filtración. La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se
extiende no sólo al medio en que se realiza el trabajo sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el cultivo,
a los medios líquidos o sólidos, y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en algún momento de su
manipulación (pipetas, puntas de pipeta automática, pinzas, tubos, material variado de vidrio...). Para esterilizar todo este
material, de variada naturaleza se emplean una serie de métodos: irradiación con radiación gamma o rayos X,
esterilización por gas, autoclavado, filtración,... En el laboratorio general de cultivo de tejidos se suele disponer de: equipo
de filtración y autoclave. La esterilización por gas, y la irradiación son técnicas propias de grandes instalaciones, por
ejemplo hospitalarias o industriales.
8 Equipos de filtración. En la actualidad se dispone de unidades de filtración estéril muy recomendables para el trabajo
rutinario. Sin embargo, su elevado coste por unidad hace que en muchos casos aún se empleen unidades reutilizables.
Estos equipos de filtración constan o bien de una fuente de vacío conectada a un kitasato dotado de una unidad de
filtración esterilizada por autoclavado, o bien de una bomba peristáltica que fuerza el flujo de solución a través de una
unidad de filtración hermética. En ambos casos la esterilización se produce al atravesar la solución un filtro de poro 0.22
μm.
8 Autoclave. Un autoclave es un instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. La
esterilización se realiza habitualmente a 121ºC, 1 atmósfera de sobrepresión durante un tiempo superior a 20 min. Un
autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presión, y
en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el material sólido (material de vidrio, instrumentos
quirúrgicos, tubos,...).
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8 Mechero Bunsen.
• Otros instrumentos. Además del equipo antes citado el laboratorio de cultivo de tejidos deberá estar equipado con otros
instrumentos que, o bien no son imprescindibles para un laboratorio de tamaño pequeño (por ej. el contador electrónico
de células), o bien son instrumentos que forman parte de un laboratorio de uso más general (centrífugas, equipo de
purificación de agua, balanzas, pH-metro, pipeteadores...).
8 Centrífugas. En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrífuga refrigerada, preferentemente
con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño volumen (1 a 2 mL) a botellas de gran capacidad (250 a 500
mL). Normalmente, para la mayor parte de las aplicaciones bastará con un instrumento que desarrolle hasta 2000 × g.
La centrífuga se ha de instalar dentro de lo posible alejada de las cabinas de flujo laminar, para evitar las turbulencias
de aire que genera.
8 Contador electrónico de células ("cell counter"). Un contador electrónico de células es un instrumento capaz de contar y
medir partículas en suspensión. Este instrumento fue comercializado por Coulter Electronics, y a pesar que
posteriormente se han desarrollado métodos alternativos es aún hoy en día el mecanismo más empleado.
El sistema está formado por los siguientes elementos:
9 dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio que se introduce en la suspensión de partículas
a contar, y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensión. El tubo con el orificio está
conectado a un manómetro de mercurio y a una bomba. El manómetro controla mediante el desplazamiento del
mercurio la conexión y desconexión de los electrodos.
9 un amplificador electrónico de la señal, un analizador de altura de los pulsos, y una escala, conectados a los
electrodos.
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Cuando la válvula que controla el manómetro se abre 0.5 mL de la suspensión entran en el interior del tubo por el
pequeño orificio. Durante ese tiempo los electrodos están conectados y registran y transmiten al equipo de amplificación
y análisis de la señal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una célula atraviesa el orificio se
produce una variación de la resistencia proporcional al tamaño. Estos datos se registran y se analizan.
8 Equipo de purificación de agua. Es de gran importancia en la preparación de los medios, de los aditivos, o en cualquier
solución que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan
provocar alguna alteración al cultivo. Por ello se utiliza siempre agua de la máxima calidad (tipo MilliQ) obtenida
mediante equipos de doble destilación o de intercambio iónico y filtración. Es muy importante la eliminación de
apirógenos, y restos de materia orgánica.
8 Pipeteadores. Se trata de dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos. Los de uso común en el
laboratorio como las pipetas automáticas y las pipetas, pero con la salvedad del uso de bombas acopladas a la pipeta,
manuales o eléctricas que permiten la aspiración mecánica del fluido. Importante para mantener la asepsia y al mismo
tiempo para la protección del operador. El aire bombeado es filtrado previamente.
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