Universidad de Chile Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Escuela de Graduados DT-diaforasa impide la formación de oligómeros de α-sinucleína inducida por aminocromo Tesis para optar al grado de Doctor en Bioquímica de Sergio Patricio Cárdenas Muñoz. Director de Tesis: Dr. Juan Ernesto Segura Aguilar Santiago, Chile 2008 ÍNDICE Indice 2 Indice de figuras 4 Lista de abreviaturas 6 Resumen 8 Abstrac 9 Introducción 10 Enfermedad de Párkinson 10 Oxidación de dopamina 10 DT-diaforasa 14 α-Sinucleína 15 Hipótesis 19 Objetivo general 19 Objetivos específicos 19 Materiales y métodos 20 Reactivos 20 Reactivos de biología molecular 22 Enzimas, anticuerpos y reactivos relevantes 22 Expresión y purificación de α-sinucleína recombinante 23 Preparación de bacterias competentes 24 Transformación de bacterias 24 Reacción de polimerización en cadena (PCR) 25 Inducción de la expresión y purificación de α-sinucleína 25 SDS-PAGE 28 Western blot 28 Tinción con plata 29 Tinción con azul de coomasie 29 Síntesis y purificación de aminocromo en resina Sephadex G-2580 29 Síntesis y purificación de aminocromo en resina CM-Sephadex C50-120 30 1 30 H-NMR 2 Determinación de la actividad de DT-diaforasa sobre aminocromo puro 31 Determinación de concentración de proteínas por método 31 Bradford Ensayos de agregación 32 Dicroísmo circular 32 Fluorescencia de tioflavina T 33 Microscopía electrónica de transmisión 33 Cinética de unión de aminocromo con α-sinucleína 33 Resultados 35 Expresión y purificación de α-sinucleína humana recombinante 35 Síntesis y purificación de aminocromo 41 Inducción de la agregación de α-sinucleína durante la oxidación 53 de dopamina catalizada por tirosinasa Agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo 56 Efecto de la reducción de aminocromo con un electrón en la agregación de α-sinucleína 69 Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de α-sinucleína 78 inducida por aminocromo Discusión 86 Expresión y purificación de α-sinucleína recombinante humana 86 Síntesis de aminocromo 88 Inducción de agregación de α-sinucleína por aminocromo 90 Efecto de la reducción de aminocromo con un electrón sobre la agregación de α-sinucleína Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación 96 de α-sinucleína inducida por aminocromo 98 Proyecciones 100 Conclusiones 104 Mecanismo propuesto 105 Bibliografía 106 3 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Etapas de la oxidación de la dopamina hasta 11 aminocromo y neuromelanina Figura 2. Ciclo rédox del aminocromo durante su reducción con un 12 electrón. Figura 3. Esquema de expresión y purificación de α-sinucleína 27 humana recombinante en bacterias en tratamiento sin hervido de muestras. Figura 4. Determinación de expresión y pureza de α-sinucleína 38 humana recombinante de bacterias de expresión BL21(DE3)pLysS pRK172/α-syn en tratamiento sin hervido de proteínas. Figura 5. Esquema de expresión y purificación de α-sinucleína 39 humana recombinante en bacterias en tratamiento con hervido de muestras Figura 6. Determinación de expresión y pureza de α-sinucleína 40 humana recombinante de bacterias de expresión BL21(DE3)pLysS pRK172/α-syn en tratamiento con hervido de proteínas. Figura 7. Determinación de aparición de aminocromo por 47 oxidación de dopamina a distintos pH y distintos tiempos. Figura 8. Separación de aminocromo por columna de exclusión 48 por tamaño a pH 6,0. Figura 9. Espectros de absorción de eluidos derivados de la 49 oxidación de la dopamina. Figura 10. Espectro H-NMR de eluido que contiene aminocromo 50 en D2O. Figura 11. Separación de aminocromo por columna de excusión 51 por tamaño a pH 7,5. Figura 12. Separación de aminocromo en columna de intercambio 52 catiónico. Figura 13. Determinación de α-sinucleína en presencia de por 55 dopamina y tirosinasa Figura 14. Agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo 63 4 purificado. de 64 Figura 16. Determinación de la cinética de fibrilación de α- 65 Figura 15. Determinación por microscopía electrónica estructuras globulares inducidas por aminocromo. sinucleína en presencia y ausencia de aminocromo. Figura 17. Determinación de la estructura secundaria de α- 66 sinucleína en presencia y ausencia de aminocromo. Figura 18. Inhibición de fibrilación e inducción de oligómeros de α- 67 sinucleína por aminocromo. Figura 19. Determinación de la agregación α-sinucleína a 68 polímeros de bajo peso molecular por aminocromo. Figura 20. Efecto de la citocromo C reductasa sobre la agregación 73 de α-sinucleína inducida por la dopamina al oxidarse con tirosinasa. Figura 21. Efecto del citocromo C reductasa sobre la agregación 74 de α-sinucleína inducida por aminocromo. Figura 22. Efecto de la citocromo C reductasa sobre los cambios en la velocidad de fibrilación de α-sinucleína 75 que ejerce el aminocromo, medidos por fluorescencia de tioflavina T. Figura 23. Efecto de la citocromo C reductasa en los cambios 76 conformacionales de la α-sinucleína inducidos por el aminocromo. Figura 24. Determinación de la disminución de los oligómeros de 77 α-sinucleína por la reducción de aminocromo con un electrón. Figura 25. Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de α- 82 sinucleína inducida por aminocromo. Figura 26. Efecto de la DT-diaforasa sobre los cambios en la 83 velocidad de fibrilación de α-sinucleína que ejerce el aminocromo, medidos por fluorescencia de tioflavina T. Figura 27. Efecto de la DT-diaforasa en los cambios 84 conformacionales de la α-sinucleína inducidos por el aminocromo. Figura 28. Determinación de oligómeros de α-sinucleína en la 85 incubación de α-sinucleína con aminocromo al reducirse por la DTdiaforasa. 5 ÍNDICE DE ABREVIATURAS ARE: elementos de respuesta antioxidante BSA: Albúmina de suero de bovino BCIP: 5-5bromo-4-cloro-3-indolil fosfato DAT: Transportador de dopamina dATP: Desoxiadenosina trifosfato dCTP: Desoxicitosina trifosfato dGTP: Desoxiguanosina trifosfato DTT: Ditiotreitol dTTP: Desoxitimidina trifosfato D2O: Óxido de deuterio EP: Enfermedad de Parkinson EROs: Especies reactivas de oxígeno gr: Gramos hrs: horas Hz: Hertz IPTG: Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosa kDa: kilodalton LB: Medio Luria-Bertoni M: Molar MES: Ácido morfolinoetano sulfónico min: Minutos ml: mililitros NADH: Nicotinamida dinucleótido reducida NADPH: Nicotinamida dinucleótido fosfato reducida NBT: Azul de nitro tetrazolio ng: nanogramos nm: nanometro nM: nanomolar nmoles: nanomoles O.N.: Toda la noche P.A.: Grado para análisis 6 PCR: Reacción de polimerización en cadena ppm: partes por millón rpm: revoluciones por minuto SDS: dodecil sulfato de sodio SDS-PAGE: Gel de electroforesis de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio seg: segundos SOD: Superóxido dismutasa TCA: Ácido Tricloroacético TEMED: N,N,N´,N´-Di(dimetilamino)etano TioT: tioflavina T tris: tris-(hidroximetil)-aminometano USA: Estados unidos de américa VMAT: Transportador vescicular de monoaminas xg: por gravedad λ: Longitud de onda µg: microgramos µl: microlitros µM: Micromolar µmoles: micromoles 7 RESUMEN La agregación de α-sinucleína se ha relacionado por varios autores con la enfermedad de parkinson. Recientemente, se ha evidenciado por estudios in vitro que la dopamina al oxidarse induce la agregación de α-sinucleína a estructuras protofibrilares neurotóxicas, inhibiendo la formación de fibras de αsinucleína, mecanismo que se ha relacionado con la detoxificación de las protofibras. Antecedentes sugieren que es el aminocromo, un derivado de la oxidación de la dopamina, el responsable de estas acciones. Sin embargo, todos los experimentos con aminocromo han sido realizados en presencia de dopamina y agentes oxidantes. En esta tesis se intentó demostrar por estudios in vitro que: (i) El aminocromo puro puede inducir la agregación de α-sinucleína a protofibras, inhibiendo la formación de fibras. (ii) La reducción de este aminocromo por la enzima DT-diaforasa es un mecanismo protector que previene la formación de protofibras de α-sinucleína. En esta tesis se desarrolló un método nuevo para purificar aminocromo usando cromatografía de intercambio iónico. Para demostrar que el aminocromo fue separado de dopamina y agentes oxidantes, usamos espectroscopía UV-visible y 1H-NMR. El aminocromo se incubó con αsinucleína en distintas condiciones, observando: (i) agregación de α-sinucleína a estructuras oligoméricas (precursoras de protofibras) por Western blot, microscopía electrónica y dicroísmo circular y (ii) inhibición de fibrilación de αsinucleína, determinado por fluorescencia con tioflavina T, dicroísmo circular y microscopía electrónica. Finalmente, se incubó aminocromo y α-sinucleína en presencia de DT-diaforasa y se observó inhibición de la agregación de αsinucleína tanto a oligómeros como a fibras. Esta inhibición de la agregación de α-sinucleína fue determinado por Western blot, microscopía electrónica, fluorescencia con tioflavina T y dicroísmo circular. Además, se demostró que al reducir aminocromo con un electrón por otra flavoenzima solo se disminuyó levemente la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo. 8 ABSTRACT The aggregation of α-synuclein have been related with Parkinson´s disease for many scientifics. Recently, many in vitro studies have produced evidences that the oxidation of dopamine induces the aggregation of αsynuclein to neurotoxic protofibers and inhibits the fibrilization α-synuclein, mechanisms which prevent the protofibrils formation. There are antecedents sugesting that aminochrome, a product derived of the oxidation of dopamine, is the responsible of this process. However, all the experiments with aminochrome have been performed in the presence of dopamine and oxidizing agents. The aim of this thesis was to demostrate with in vitro studies that: (i) The aminochrome can induce the aggregation of α-synuclein to protofibers, inhibiting the fibrils formation. (ii) The reduction of aminochrome by DT-diaphorase is a protective mechanism to the formation of protofibers of α-synuclein. In this thesis was developed a new method to purify aminochrome by using ionic interchange chromatography. To demostrate that the aminochrome was separated from dopamine and oxiding agents, we used UV-visible spectroscopy and H-NMR. The aminochore was incubated with α-synuclein in different 1 conditions, detecting: (i) aggregation of α-synuclein to oligomers (precursors of the protofibrils) for Western blot, electronic microscopy and circular dicroism and (ii) inhibition of α-synuclein fibrilization detected with tioflavine T fluorescence, circular dicroism and electronic microscopy. Finally, α-synuclein and pure aminochrome was incubated with DT-diaphorase, showing that the aggregation of α-synuclein to both, protofibers and fibrils was inhibited determined by Western blot, tioflavine T fluorescence, circular dicroism and electronic microscopy. Moreover, it was observed that the reduction of aminochrome with one electron only decrease the aggregation of α-synuclein induced for aminochrome. 9 INTRODUCCIÓN La enfermedad de Parkinson La enfermedad de Parkinson (EP), también conocida como Parkinson Idiopático, es una enfermedad neurodegenerativa que afecta cerca del 2% de la población sobre los 65 años (Lucking et al., 2000). Sintomáticamente, esta enfermedad se caracteriza por: (i) temblor en extremidades durante el reposo; (ii) bradikinesia; (iii) rigidez muscular, lo que conlleva dificultades al caminar, escribir, hablar y perdida de expresión facial; (iv) flexión postural. La descripción de la enfermedad se remonta al año 1817 por James Parkinson, sin embargo, aún se desconoce el origen de la enfermedad (Siegal et al., 1999). Fisiopatológicamente, esta enfermedad se caracteriza por la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la vía nigro-estriatal y por la aparición de inclusiones proteicas dentro de estas neuronas, conocidas como cuerpos de Lewy. Si bien, se ha observando que para el desarrollo de esta enfermedad influyen factores genéticos, medioambientales y toxinas endógenas (Stanley, 2003), aún no se logra identificar el factor gatillante de ésta. Se ha aceptado que el estrés oxidativo es un factor común involucrado directamente en los procesos neurodegenerativos (Krostrzewa y Segura-Aguilar, 2002; Jenner, 1998). Para explicar la especificidad en la neurodegeneración dopaminérgica, se han buscado mecanismos que puedan inducir estrés oxidativo específicamente en estas células. Curiosamente, la oxidación de su neurotransmisor dopamina es un mecanismo específico de estas células, capaz de generar gran cantidad de radicales libres y especies reactivas del oxígeno (EROs). Oxidación de dopamina El neurotransmisor dopamina es una catecolamina que a pH 7,4 y 37ºC puede ser oxidada por oxígeno a través de una serie de pasos hasta aminocromo, una quinona descrita como precursora del pigmento neuromelanina (Zecca et al., 2001). Las etapas de la oxidación de la dopamina son: (i) oxidación de dopamina a dopamina-o-quinona. Esta reacción puede ser 10 catalizada por metales como manganeso (Segura-Aguilar y Lind, 1989) o hierro (Linert et al, 1996), enzimas como tirosinasa (Del Mármol y Beermann, 1996; Cavalieri et al., 2002), prostaglandina H sintetasa (Hasting, 1995); (ii) La cadena alifática se cicla espontáneamente en condiciones fisiológicas, transformando su amina primaria a amina secundaria. La molécula formada se llama leucoaminocromo; (iii) oxidación espontánea del leucoaminocromo hasta aminocromo (Mason, 1948). Cada etapa, se representa en la figura 1 neuromelanina Peroxidasas H2 O2 polimerización Dopamina-osemiquinona ciclado Dopamina Dopamina-o-Quinona I oxidación Leukoaminocromo II aminocromo III Figura 1. Etapas de la oxidación de la dopamina hasta aminocromo y neuromelanina En las neuronas dopaminérgicas la oxidación de dopamina esta muy controlada, ya que se cuentan con una serie de mecanismos para evitarla: (i) Una vez sintetizada o recaptada, esta catecolamina es rápidamente almacenada en las vesículas dopaminérgicas que mantienen un pH ácido, evitando su oxidación al incorporar un H+ en las moléculas de dopamina. Estas vesículas tienen el transportador vesicular de monoamínas (VMAT) que transporta dopamina hacia el interior de la vesícula con gran eficiencia, de manera de prevenir los aumentos de dopamina libre citoplasmática (Sulzer et al., 2000); (ii) La dopamina puede ser metabolizada por la enzima monoaminooxidasa A (MAO A), la cual es una enzima mitocondrial y puede explicar en gran parte la disminución en los niveles de la dopamina no almacenada en vesículas (Siegal et al., 1999); (iii) La dopamina en el espacio extracelular puede ser metabolizada por la enzima catecol-o-metil transferasa (COMT) catabolizando rápidamente la dopamina que difunde fuera del espacio sináptico a 3-metoxitiramina (3-MT). (iv) conjugación de dopamina-o-quinona y 11 aminocromo con glutatión, catalizado por glutatión transferasa-M2-2 (GST-M22) y glutatión transferasa-M1-1 (GST-M1-1), generando una molécula muy estable aun en presencia de moléculas oxidantes biológicas como radical superóxido y peróxido de oxígeno (Baez et al., 1997; Segura-Aguilar et al., 1997). La sustancia nigra debe su nombre al color oscuro de esta zona debido a la presencia de neuromelanina, la cual se concentra dentro de las neuronas dopaminérgicas. La neuromelanina es un pigmento oscuro generado por la polimerización de especies derivadas de la oxidación de la dopamina, como el aminocromo (Sulzer et al., 2000). Esto evidencia que en estas neuronas, la dopamina se oxida a pesar de los mecanismos descritos anteriormente. Este pigmento aparece desde los 3 años de edad y aumenta constantemente durante la vida, lo que nos sugiere una constante oxidación de dopamina desde los primeros años de vida. Tal como se describió anteriormente, la oxidación de la dopamina genera especies reactivas, pero hay un segundo evento que es capaz de generar grandes cantidades de EROs a partir de una pequeña cantidad de sustrato. Este evento es la reducción del aminocromo con un electrón a leucoaminocromo-o-semiquinona. Esta reducción, puede ser catalizada por una serie de flavoenzimas reductasas presentes en las neuronas dopaminérgicas, como citocromo C reductasa, citocromo P450 reductasa y otras flavoenzimas (figura 2). Este leucoaminocromo-o-semiquinona, es un radical libre tan reactivo en presencia de oxígeno, que no se ha podido mantener estable para su análisis. (Baez et al., 1995; Segura-Aguilar et al., 1989; Segura-Aguilar et al., 1998). Tal como se muestra en la figura 2, esta semiquinona puede volver a oxidarse en presencia de oxígeno, generando el radical superóxido en un ciclo rédox que solo termina al depletarse los niveles de NADH/NADPH y oxígeno (Baez et al., 1995; Segura-Aguilar et al., 1998). NAD(P)H Aminocromo O2.- Flavoenzimas reductasas NAD(P)+ O2 Leucoaminocromo -o- semiquinona 12 pequeñas cantidades de su aminocromo, ciclo rédox puede FiguraA2.partir Ciclo de rédox del aminocromo durante reducción coneste un electrón. ser capaz de: (i) liberar grandes cantidades del radical superóxido, lo que implica un aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno. Si este peróxido reacciona con hierro se induce la generación del radical hidroxilo, radical muy reactivo y responsable de daño oxidativo en proteínas, lípidos y oligonucleótidos. La sustancia nigra contiene una alta concentración de hierro comparado con otras regiones cerebrales y aumenta con la edad hasta 10 veces en las últimas décadas de la vida (Zecca et al., 2001). Mas aún, se encuentra aumentado en cerebros post-mortem de pacientes con EP (Sofic et al., 1989; Oakley et al., 2007; Gerlach et al., 1994); (ii) provocar una disminución en los niveles de NADPH, lo que puede generar una gran déficit en los mecanismos de biosíntesis celular. Además, el NADPH es esencial para la regeneración de glutatión reducido, molécula pilar en mecanismos antioxidantes celulares (Berg et al., 2002); y (iii) provocar una disminución en los niveles de NADH y oxígeno, lo que conlleva a un déficit energético por la disminución en la síntesis de ATP (Graumann et al., 2002). A la fecha, varios autores han mostrado evidencias del aumento de EROs, inducción de daño oxidativo y muerte celular al promover la oxidación de la dopamina en células. Al incubar células con D-anfetamina y metanfetamina, drogas que inducen un aumento citoplasmático y extracelular de dopamina (Sulzer et a, 1995), se indujo un aumento intracelular de EROs observando daño oxidativo en proteínas, vacuolización de organelos intracelulares, degeneración de neuritas y muerte celular (Cubells et al., 1994; Lotharius y O´Malley, 2001; LaVoie y Hasting, 1999; Ricaurte et al., 1984; Sonsalla et al., 1996). Además, se demostró que algunos de estos eventos pueden ser evitados al depletar la dopamina de estas células previo a la incubación con Danfetamina y metanfetamina (Lotharius y O´Malley, 2001). Por otro lado, se observó que la inducción de EROs y muerte celular mediada por 1-methyl 4phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), un inhibidor del complejo I mitocondrial, se potencia por dopamina (Lotharius y O´Malley, 2000). 13 DT-diaforasa La DT-diaforasa (E.C.1.6.99.2, NAD(P)H quinona oxidoreductasa; NQO1), es la única flavoenzima capaz de reducir quinonas con 2 electrones. Esta enzima, utiliza indistintamente NADPH o NADH como cofactor y es inhibida específicamente por dicumarol (Hosoda et al., 1974). Esta enzima posee el 97% de la actividad reductasa total de neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra de cerebro de rata (Schultzberg et al., 1998; Segura-Aguilar et al., 1989). Se ha sugerido que la DT-diaforasa es una enzima protectora frente a la toxicidad de la oxidación de la dopamina en neuronas dopaminérgicas, debido a su capacidad para reducir aminocromo. Varios estudios apoyan esta idea: (i) La toxicidad del cobre en células derivadas de sustancia nigra de rata es dependiente de la inhibición de la actividad de la DT-diaforasa (Paris et al., 2001); (ii) el efecto citotóxico del inhibidor específico de la MAO-A, amiflamina, aumenta 2,4 veces en presencia del inhibidor específico de la DT-diaforasa, dicumarol (Hurtado-Guzmán et al., 2002); (iii) la toxicidad del salsolinol en cultivo de células derivadas de sustancia nigra de rata aumentó 2,5 veces en presencia de dicumarol. (Martinez-Alvarado et al., 2001); (iv) solo administración de manganeso junto a dicumarol en el haz nigro-estriatal de cerebro de rata produce una conducta rotacional contralateral en la rata estimulada con apomorfina, de igual manera que lo observado en ratas lesionadas unilateralmente con hidroxidopamina. Estas mismas ratas mostraron una rotación ipsilateral al ser estimuladas con d-amfetamina (Segura-Aguilar et al., 2002); (v) se observó que un 10 % de pacientes con EP en china presentaba el polimorfismo C609T de la DT-diaforasa, presentándolo como un factor de riesgo para desarrollar EP (Jiang et al., 2004); (vi) el hierro y dopamina en presencia de dicumarol, induce una neurodegeneración mayor al 50 % sobre células derivadas de hipotalamo de rata (Paris et al., 2005) ; (vii) la exposición de células derivadas de sustancia nigra de rata con dopamina y reserpina, a concentraciones capaces de inhibir VMAT y dicumarol, inducen una muerte mayor que cuando se incubó dopamina junto reserpina a concentraciones que 14 solo inhibieron el transportador VMAT ya que reserpina demostró ser un inhibidor de la DT-diaforasa (Ki= 34 µM) (Fuentes et al., 2007). α-Sinucleína y EP Otra característica de la EP es la aparición de grandes estructuras eosinófilas compuestas de proteínas dentro de las neuronas dopaminérgicas llamadas cuerpos de Lewy. Los cuerpos de Lewy son inclusiones esféricas de 8-30 µmetros de diámetro de ubicación perinuclear, compuestas por varios tipos de proteínas como proteínas del citoesqueleto, del sistema ubiquitin-proteásico y de shock térmico. El mayor componente de los cuerpos de Lewy son homopolímeros fibrilares de una proteína citoplasmática llamada α-sinucleína. La α-sinucleína tiene importancia en los estudios sobre el mecanismo de generación de la EP, debido a los siguientes antecedentes: (i) polímeros fibrilares de α-sinucleína son el principal componente de los cuerpos de Lewy (Spillantini et al.,1998); (ii) se ha observado que los polimorfismos A53T, A30P y E46K en la α-sinucleína causan una forma autosómica dominante de EP familiar de desarrollo temprano (Polimeropoulos et al., 1997; Krüger et al., 1998; Zarranz et al., 2003); y (iii) una porción de la α-sinucleína (residuos 61-95), conocido como el componente no-Aβ de la placa (NAC), fue identificado como un componente de la fracción insoluble del homogenizado de un cerebro con enfermedad de Alzheimer (Masliah et al., 1996) . La α-sinucleína es una proteína citoplasmática de 140 aminoácidos con expresión ubicua en todo el sistema nervioso central. Se ubica principalmente en los terminales presinápticos (revisado en Lücking y Brice, 2000). Esta proteína monomérica se encuentra normalmente unida a membrana con una conformación preferentemente de hélice-α (Elezier et al., 2001) ó en el citoplasma con conformación de ovillo al azar (Weinreb et al., 1996). Aún se desconoce la función de esta proteína, pero se ha asociado con la regulación de la liberación de dopamina al espacio sináptico provocada por estímulos nerviosos (Abeliovich et al., 2000) y con una función relacionada con la regulación de la plasticidad neuronal (George et al., 1995; Petersen et al., 1999; Hsu et al., 1998; Bayer et al., 1999; Seo et al., 2002). Bajo ciertas condiciones, 15 como aumento en la temperatura, aumento de la concentración de α-sinucleína, disminución del pH, presencia de solventes orgánicos, estrés oxidativo, presencia de metales como hierro y cobre, presencia de toxinas exógenas como MPTP y rotenona ó factores genéticos como los polimorfismos en la αsinucleína, se induce la agregación de la α-sinucleína hasta estructuras fibrilares tipo amiloides, las cuales son muy similares a las observadas como componente de los cuerpos de Lewy (Uversky et al., 2001a; Hashimoto et al., 1998; Giasson et al., 1999; Munishkina et al., 2003, Souza et al., 2000; Hashimoto et al., 1999; Uversky et al., 2001b y 2001c; Giasson et al., 2000; Conway et al., 2000b; Paik et al,1999; Vila et al., 2000; Betarbet et al., 2000). Estas estructuras están compuestas de muchas unidades proteicas que adquieren conformación sábana-β plisada y de esta manera pueden formar fibras de 50-700 nanometros (nm) de largo y entre 5-15 nm de diámetro (Conway et al., 2000b; Spillantini et al., 1998). Se ha evidenciado ampliamente que agregados de α-sinucleína son altamente tóxicos para la neurona y que la agregación de la α-sinucleína está relacionada con neurodegeneración y el desarrollo de problemas motores en modelos animales. La expresión de α-sinucleína humana en ratones transgénicos indujo la aparición de inclusiones que contenían α-sinucleína. Estas inclusiones provocaron una disminución en la cantidad de terminales dopaminérgicos en el núcleo estriado y déficit motor en ratones (Masliah et al., 2000; Lee et al., 2002). La expresión de α-sinucleína humana en Drosófilas indujo la aparición de inclusiones proteicas citoplasmáticas compuestas de fibras similares a los cuerpos de Lewy. En estas moscas se observó degeneración específica de neuronas dopaminérgicas, un mecanismo dependiente de la edad, y problemas motores (Feany and Bender, 2000). Ratas que expresaron α-sinucleína humana, tanto la forma nativa como las variantes A30P y A53T, mostraron degeneración específica de neuronas dopaminérgicas y una aparición de inclusiones no fibrilares de α-sinucleína (LoBianco et al., 2002). Se ha observado que agregados de α-sinucleína interfieren con la actividad mitocondrial, incrementando la producción de radicales libres y 16 disminuyendo la cantidad de ATP disponible. Esto fue observado en cultivos celulares humanos (Sherer et al., 2002) y murinos (Hsu et al., 2000), y se observó muerte celular en cultivos celulares derivados de humanos, SH-SY5Y (El-Agnaf et al., 1998). Sin embargo, las evidencias sugieren que los agregados de α-sinucleína que inducen toxicidad no son las fibras, sino unas estructuras oligoméricas posiblemente precursoras de las fibras llamadas protofibras (Spillantini et al., 1998; Conway et al., 2001b). Se sugirió que la formación de fibras, y luego de cuerpos de Lewy, es un mecanismo protector de la célula para detoxificarla de los oligómeros, ó protofibras de α-sinucleína (Olanow et al., 2004). Tompkins y Hills propusieron que las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra que contienen cuerpos de Lewy son menos vulnerables a la apoptosis que las neuronas dopaminérgicas sin cuerpos de Lewy (Tompkins y Hills, 1997). De hecho, se han descrito pacientes con EP sin presencia de cuerpos de Lewy. Dentro de este grupo se encuentran los pacientes con EP familiar por polimorfismo en el gen de la parkina (Mori et al., 1998). Los cuerpos de Lewy podrían corresponder a una estructura celular protectora llamada agresoma (Tanaka et al., 2004). Existe gran similitud entre los cuerpos de Lewy y los agresomas con respecto a organización, contenido proteico y localización intracelular (Lee y Lee, 2002; Fabunmi et al., 2000). Los agresomas tienen como función eliminar proteínas citoplasmáticas mal empaquetadas o polimerizadas que no pueden ser degradadas por el sistema ubiquitin-proteásico (Johnston et al., 1998). Por lo tanto, la toxicidad estaría relacionada con la formación de oligómeros o protofibras de α-sinucleína y la fibrilación de α-sinucleína, de esta manera la formación de los cuerpos de Lewy sería un mecanismo protector. Aún no esta muy claro el mecanismo tóxico de los oligómeros sobre la célula. Se ha descrito que los oligómeros de α-sinucleína pueden agregarse entre sí y formar estructuras tipo anillo, lo que no se ha observado para la forma monomérica ó fibrilar. Estas estructuras de anillo pueden incorporarse en las membrana y formar poros (Volles et al., 2001; Volles y Lansbury, 2002; Ding et al., 2002) e incluso romper paredes de organelos celulares (Gosavi et al., 2002). Si esto ocurriera en mitocondrias y vesículas dopaminérgicas se podría explicar 17 el daño mitocondrial y estrés oxidativo observado en la EP, ya que la perforación de las vesículas dopaminérgicas liberarían gran cantidad de dopamina al citoplasma provocando así un gran evento oxidativo, tal como ya se describió anteriormente. Se ha observado que ciertas modificaciones oxidativas en la α-sinucleína monomérica, como oxidaciones en las metioninas (Uversky et al., 2002) ó nitración de tirosinas (Uversky et al., 2005), inducen la agregación de α- sinucleína hasta oligómeros estabilizados de α-sinucleína, previniendo la formación de fibras. (Fink, 2006). Este mismo fenómeno ocurre con la forma A30P de α-sinucleína sin necesidad de modificación oxidativa (Conway et al., 2000a). En el año 2001, Lansbury y colaboradores demostraron que la dopamina induce la agregación de α-sinucleína a oligómeros estables, que no forman fibras, en un mecanismo que fue inhibido por antioxidantes (Conway et al., 2001). Esto sugirió que fue una molécula derivada de la oxidación de la dopamina la que indujo esta agregación. En publicaciones recientes, se ha visto que el aminocromo en presencia de dopamina y agentes oxidantes induce la formación de oligómeros de α-sinucleína (Norris et al., 2005; Cappai et al., 2005). Estos antecedentes, nos llevaron a proponer que la reducción de aminocromo con un electrón puede aumentar la formación de oligómeros estabilizados de αsinucleína, y que la DT-diaforasa puede prevenir esta formación de oligómeros. 18 HIPÓTESIS La DT-diaforasa inhibe in vitro la agregación de α-sinucleína inducida durante el metabolismo reductor de aminocromo con un electrón. OBJETIVO GENERAL Demostrar por estudios in vitro, que la reducción de aminocromo con un electrón aumenta la agregación de α-sinucleína observada durante la oxidación de la dopamina y luego demostrar que la DT-diaforasa es capaz de prevenir esta agregación de α-sinucleína. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Obtener α-sinucleína humana recombinante. 2. Preparar y purificar aminocromo. 3. Comprobar por estudios in vitro, que el aminocromo puro es capaz de inducir la agregación de α-sinucleína humana estabilizando la estructura oligomérica e inhibiendo la fibrilación de α-sinucleína. 4. Comprobar por estudios in vitro, que la reducción de aminocromo con un electrón aumenta la capacidad del aminocromo de inducir la agregación de α-sinucleína. 5. Demostrar por estudios in vitro, que la DT-diaforasa disminuye la agregación de α-sinucleína inducida por la reducción de aminocromo con un electrón. 19 MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos Reactivo Proveedor Triptona-peptona Difco (Kansas city, Missouri, USA) Agar Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA) Extracto de levadura Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA) Glicerol Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA) Metanol (P.A.) Merck (Darmstadt, Alemania) Etanol (P.A.) Merck (Darmstadt, Alemania) Metanol (Grado técnico) TCL (Santiago, Chile) Etanol (Grado técnico) TCL (Santiago, Chile) Isopropanol (P.A.) Merck (Darmstadt, Alemania) Cloruro de sodio Merck (Darmstadt, Alemania) Hidróxido de sodio Merck (Darmstadt, Alemania) Ácido clorhídrico Merck (Darmstadt, Alemania) Persulfato de amonio Merck (Darmstadt, Alemania) Ácido acético glacial Merck (Darmstadt, Alemania) Cloruro de calcio, Merck (Darmstadt, Alemania) Ácido nítrico Merck (Darmstadt, Alemania) Ácido tricloroacético Merck (Darmstadt, Alemania) Carbonato de sodio Winkler (Santiago, Chile) Tween 20 Winkler (Santiago, Chile) Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosa Winkler (Santiago, Chile) (IPTG) Tampón Tris-base Winkler (Santiago, Chile) Sulfato amonio Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Tampón MES Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Glicina Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Resinas Sephadex G25-80 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) 20 Resina CM Sephadex c-50-120 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Resina DEAE Sephadex a-50-120 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) ácido sulfosalicílico Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Formaldehído Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Ponceaou S Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Dicumarol Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) ácido etilendiaminotetraacético Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) (EDTA) D2O Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Albúmina de suero de bovino (BSA) Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Acrilamida Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA) bis-acrilamida Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA) TEMED Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA) coomasie brilliant blue G-250 Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA) membrana de nitrocelulosa de 0,2 Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA) µm de poro Trans-Blot coomasie brilliant blue R250 Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA) azul de bromofenol J.T. Baker (Pillipsburg, USA) dicromato de potasio J.T. Baker (Pillipsburg, USA) Nitrato de plata TCL (Santiago, Chile) Ampicilina USbiological (Swampscott, USA) Cloranfenicol (Inyectable) Laboratorio Chile (Santiago, Chile) leche descremada calcio plus Svelty de Nestle chile SA. (Santiago, Chile) ácido fosfórico Mallinckodt Baker S.A. (Xalostoc, Estado de México, México) 21 Reactivos de biología molecular dATP,dTTP, dGTP y dATP Promega Inc. (Madison, WI, USA) Taq polimerasa Promega Inc. (Madison, WI, USA) agarosa Invitrogen corp. (California, USA) bacterias DH5α Invitrogen corp. (California, USA) Plasmidio BL21(DE3)pLys S Invitrogen corp. (California, USA) TM kit UltraClean Mini Plasmid MoBio Lab. Inc., (Solana Beach, USA) prep Ditiotreitol (DTT) Fisher Chemical (Pittsburg, PA, USA) Dodecil sulfato de sodio (SDS) Qbiogen Inc. (Irvine, CA, USA) Tampón Tris Winkler (Santiago, Chile) Oligonucleótidos partidores de Centro de síntesis y análisis de biomoléculas PCR TAG Copenhagen A/S Symbion, Fruebjergvej 3 DK-2100 Copenhagen, Dinamarca BCIP/NBT Zimed Laboratories Inc (Sn. Francisco, CA, USA) Anticuerpos, enzimas y reactivos relevantes Nombre Reactivo Proveedor Número catalogo citocromo C C-2506 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) Nicotinamida adenina N-4505 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) dopamina CH-9470 Fluka Biochemica (Buchs, Swizerland) menadiona M-5625 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) anticuerpo policlonal anti PC325 Oncogene Res. Prod. (San Diego, dinucleótido (NADH) α-sinucleína preparada USA) 22 en cobayo anticuerpo policlonal anti SC-7012 α/β-Synuclein humana Santa Cruz Biotechnology Inc. Biotechnology Inc. (California, USA) preparada en cabra IgG anti-goat-AP SC-2351 Santa Cruz (California, USA) IgG anti-guinea pig-AP A5062 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) citocromo C reductasa C-3381 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) S-4761 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) catalasa C-9322 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) tirosinasa T-3824- Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA) tipo I superóxido dismutasa (SOD) 50kU α-sinucleína humana 575001 Calbiochem (La jolla, CA, USA) recombinante DT-diaforasa Extraida de citosol de hígado de rata y purificada por el Dr. Segura-Aguilar según se describe en Beyer et al, 1996 Expresión y purificación de α-sinucleína humana recombinante Para la expresión de α-sinucleína recombinante, se ocupó el plasmidio de expresión en bacterias pRK172/α-syn wt donado generosamente por el Dr. Ischiropoulos (Centro Médico de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, USA). Para el clonamiento y amplificación de este plasmidio, se ocuparon bacterias DH5α. La expresión de la proteína recombinante se realizó en bacterias BL21(DE3)pLysS, las que incluyen un plasmidio para expresión de lisosima el 23 cual sirve para disminuir la concentración de α-sinucleína en la bacteria y así evitar su agregación por alta concentración. Preparación de bacterias competentes Se sembró bacterias DH5α en placas con agar-LB (1,5 % Agar, 1 % triptona peptona, 0,5 % extracto de levadura, 1 % NaCl. Todo ajustado a pH 7,0 con NaOH) ó bacterias BL21(DE3)pLysS en placas de agar-LB con 35 µM/ml de cloranfenicol y se dejó crecer por 16-20 Horas (hrs). Se picaron colonias al azar, transfiriendo cada una a 100 ml de medio LB (1 % Triptona peptona, 0,5 % Extracto de levadura, 1 % NaCl; todo ajustado a pH 7,0 con NaOH). Se crecieron por 3 hrs. a 37 ºC con agitación fuerte y se centrifugaron a 2000 xg. por 10 minutos (min) a 4 ºC. Se extrajeron completamente los sobrenadantes y cada precipitado se lavó con 10 ml de solución 0,1 M CaCl2 frío. Se centrifugaron a 1400 xg por 10 min. a 4 ºC eliminando completamente los sobrenadantes. Los precipitados se resuspendieron en 4 ml de CaCl2 frío y se mantuvieron por 24 hrs. a 4 ºC para la transformación de bacterias. Transformación de bacterias Se transfirió 200 µl de bacteria competente en un tubo estéril y se agregó 50 ng de plasmidio. Se incubó en hielo por 30 min, luego en un baño a 42 ºC por 90 segundos (seg) y finalmente se trasladó al hielo, manteniéndolo por 2 min. Se agregó 800 µl de medio LB y se incubó por 45 min a 37 ºC. Las bacterias transformadas se sembraron en placas de Agar-LB con antibiótico (para DH5α pRK172/α-syn, 100 µg/ml Ampicilina; para BL21(DE3) pLysS, pRK172/α-syn, 100 µg/ml Ampicilina + 35 µg/ml cloranfenicol). Se dejó crecer por 16-20 hrs y se picaron 10 colonias al azar por placa. Cada colonia picada se creció por separado en 10 ml de medio LB con el antibiótico respectivo, por toda la noche (O.N.) a 37 ºC con agitación fuerte. El plasmidio de cada cultivo se extrajo con el kit de extracción plasmidial UltraCleanTM Mini Plasmid prep, según las instrucciones del proveedor. Una alícuota de cada colonia cultivada fue almacenada a –80 ºC en medio LB-glicerol al 15% (15% Glicerol, 1 % triptona peptona, 0,5 % extracto de levadura, 1 % NaCl. Todo ajustado a pH 7,0 con 24 NaOH). La presencia del plasmidio con inserto en las colonias seleccionadas se confirmó realizando una reacción de PCR con partidores específicos para αsinucleína humana. Reacción de polimerización en cadena (PCR) Cada reacción de PCR se realizó mezclando 1x de tampón de taq polimerasa comercial, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada uno de los deoxinucleótidos (dTTP, dGTP, dCTP, dATP), 0,4 µM de cada partidor específico, 1 U de Taq polimerasa (Promega, Madison, USA) y 300 ng de plasmidio templado, según instrucciones del proveedor de la enzima taq polimerasa. Cada mezcla de reacción contenida en tubos para PCR, se puso en un equipo termociclador Techgene modelo ftgene5d (Techne Inc, Burlington, USA) para correr el programa de PCR descrito a continuación. Se inició con una denaturación por 5 min a 95 ºC, luego con 30 ciclos de amplificación que incluyen: 30 seg a 95 ºC, 30 seg. a 57 ºC y 1 min a 72 ºC, y se terminó con 10 min a 72 ºC. Los partidores específicos que se usaron fueron Ha-syn F: 5´AGGACTTTCAAAGGCCAAGG-3´ y Ha-syn R: 5´- TCCTCCAACATTTGTCACTTGC3´. Este juego de partidores sirve para transcribir un fragmento de 186 pb correspondiente a los nucleótidos 441-627 del mensajero para α-sinucleína Humana (número de acceso NM_000345 de la base de datos Blast) y fueron diseñados en nuestro laboratorio usando el programa Gene Runner (Hastings software Inc., New York, USA). Inducción de la expresión y purificación de α-sinucleína recombinante humana La inducción de la expresión y purificación de α-sinucleína recombinante humana se realizó en varias etapas, tal como se describe a continuación y se representa en el esquema 3: (i) Los clones BL21(DE3) pLysS, pRK172/α-syn wt se cultivaron en 10 ml de medio LB a 37 ºC O.N. con agitación fuerte. Se subcultivaron en 500 ml de medio LB creciendo por 4 hrs a 37 ºC con agitación fuerte hasta una densidad óptica de 0,4. Para inducir la expresión se agregó isopropyl-beta-D-tiogalactopiranosa (IPTG) hasta una concentración de 0,5 mM y se incubó durante la noche a 30 ºC con agitación fuerte; (ii) Se centrifugó por 25 5 min a 2000 xg a 4 ºC, eliminando el medio LB. Se resuspendió el precipitado en 50 ml de 25 mM Tris-HCl pH 8,0. Se volvió a centrifugar por 5 min a 20000 xg a 4 ºC y el precipitado se resuspendió en 5 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50mM NaCl, 5% glicerol; (iii) La suspensión bacteriana se congeló sumergiéndola en nitrógeno líquido y luego se descongeló sumergiéndola en un baño de agua a 70ºC. Este paso se repitió 3 veces. Se agregó 1,5 mg de lisozima y se incubó por 20 min a la temperatura del medio ambiente (no controlada); (iv) Se agregó sulfato de amonio al 30% de saturación y se centrifugó a 20000 xg por 20 min. a 4 ºC conservando el sobrenadante (sobrenadante I); (v) Al sobrenadante I, se agregó sulfato de amonio hasta lograr un 50% de saturación. Se centrifugó a 20000 xg por 20 min a 4 ºC, conservando el precipitado (precipitado II); (vi) El precipitado II se resuspendió en tampón 25 mM Tris-HCl pH 8. Se paso por una columna con 30 x 0,7 cm de resina Sephadex G-25-80, conservando solo las fracciones de elución que absorbieron a 280 nm de longitud de onda (eluidos G-25); (vii) Estos eluidos se juntaron y se cargaron en una columna con 15 ml resina DEAE Sephadex A50120 previamente equilibrada en 25 mM tampón Tris-HCl pH 8,0. Se recuperó cada eluido determinando la presencia de proteínas con el reactivo de Bradford. Solo eluyó la proteína con tampón 50 mM Tris-HCl pH 8,0 + 500 mM NaCl. Se identificó la presencia de α-sinucleína por Western blot incubado con anticuerpo policlonal anti-α-sinucleína y la pureza por geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) al 10%, teñidos con azul de coomasie y/ó tinción con plata. La concentración de α-sinucleína se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm considerando ε280nm = 5600 M-1 cm-1(Hoyer et al, 2002). 26 BL21(DE3)pLysS pRK172/α-syn wt (densidad optica de 0,4) i 0,5mM de IPTG . O.N. horas a 30ºC con agitación Centrifugación 2000 xg ii precipitado de bacterias 25 mM Tris pH 7,5; 50 mM NaCl; 5% glicerol Resuspendido bacteriano Congelado(N2 liq)/ descongelado (70º) 300 µg/ml lisozima iii Lisis bacteriana Sulfato de amonio 30% saturación iv Sobrenadante I Precipitado I Sulfato de amonio 50% saturación v Sobrenadante II Precipitado II 25 mM Tris pH 8 Resuspendido I vi Paso por columna con Sephadex G-26-80 Eluido G-25 Separación por columna con DEAE-Sephadex A-50-120 vii Eluido DEAE A-50 27 Figura 3. Esquema de expresión y purificación de α-sinucleína humana recombinante en bacterias. SDS-PAGE Se ocuparon geles de poliacrilamida en condiciones desnaturantes (SDSPAGE) a distintas concentraciones, según el experimento. SDS-PAGE como gel separador 10-12 % de acrilamida/bis-acrilamida (de proporción 29:1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,1 % dodecil sulfato de sodio (SDS), 0,1 % persulfato de amonio, 0,04 % TEMED) y como gel concentrador 5 % acrilamida/bis-acrilamida ( de proporción 29:1), 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1 % SDS, 0,1 % persulfato de amonio, 0,1 % TEMED). Las muestras proteicas se incubaron en un baño de agua caliente a 100 ºC por 5 min. con tampón desnaturante (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM ditiotreitol (DTT), 2 % SDS, 0,1 % azul de bromofenol, 10 % glicerol) y se cargaron en gel SDS-PAGE previamente montado en un equipo de electroforesis con tampón de corrida (25 mM Tris-HCl pH 8,3, 250 mM glicina, 0,1 % SDS). Se corrió por 20 min a 50 volt y luego 60 min a 100 Volt. Western blot Luego de la electroforesis, el gel SDS-PAGE se montó sobre una membrana de nitrocelulosa de 0,2 µm de poro, dentro de un equipo de electro transferencia. Se transfirió en solución de transferencia (39 mM glicina, 48 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,037 % SDS, 20 % metanol) a 300 mA por 1 hr Luego de la electro transferencia, la membrana se bloqueó con 0,5 % leche descremada Svelty en TBS-Tween (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,025 % Tween 20) por 4 hrs Se incubó con anticuerpo policlonal de coballo anti α-sinucleína o anticuerpo de cabra anti α/β-Sinucleína toda la noche con agitación suave a la temperatura del ambiente del laboratorio y se lavó con TBS-Tween por 5 min 2 veces. Se lavó con TBS (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl ) por 5 min. Se incubó con anticuerpo secundario acoplado a fosfatasa alcalina. Se lavó 3 veces con TBS por 5 min cada lavado y finalmente se incubó cada membrana con 5 ml de solución de BCIP/NBT, preparada según indicaciones del proveedor. 28 Tinción plata Las proteínas se fijaron incubando el gel SDS-PAGE en 136 mM de ácido sulfosalicílico, 0,7 M TCA y 30 % metanol por 60 minutos. El gel se lavó 3 veces en 10 % etanol, 5 % ácido acético por 5 minutos cada lavado. Se incubó en 3,4 mM de K2Cr2O7; 3,2 mM HNO3 por 5 min en oscuridad. Se lavó 3 veces con agua por 1 min cada lavado. Se incubó por 25 minutos en 120 mM de AgNO3 en oscuridad. Se lavó 3 veces con agua por 1 min cada lavado. Se incubó por 10-20 min en 280 mM de Na2CO3 en 0,05% de formaldehído. Se detuvo la reacción con 1% de ácido acético. Tinción con azul de Coomasie. El gel SDS-PAGE con las proteínas separadas se sumergió en solución de coomasie (0,25 % de azul brillante de Coomasie R250; 10 % ácido acético; 45 % metanol) por 4 hrs a temperatura ambiente. La solución de Coomasie se recuperó y se agregó al gel solución de desteñido de tinción de coomasie (10 % ácido acético; 45 % metanol). Se incubó por 5 hrs a temperatura ambiente con dos cambios de solución de desteñido entre medio. Síntesis y Purificación de aminocromo en resina Sephadex G-25-80 Se incubó 0,5 µmoles de dopamina y 1 ng de tirosinasa en 0,1 ml de 25 mM MES pH 6,0 por 10 min a 25 ºC. Para purificar el aminocromo formado, se cargó la solución de incubación en una columna con 6 x 0,4 cm de resina Sephadex G-25-80 el cual se eluyó con 3 ml de tampón 25 mM MES pH 6,0. El eluido de la columna fue recuperado en alícuotas de 100 µl. Cada alícuota fue monitoreada espectrofotométricamente por absorbancia a 280 nm, 478 nm y 600 nm de longitud de onda (λ). El aminocromo se recuperó puro entre 7001100 µl de eluido. La determinación de la presencia y pureza de aminocromo fue determinada por espectroscopia UV-visible y 1H-NMR. La determinación de la concentración de aminocromo fue determinada espectroscópicamente usando el valor de 3058 M-1cm-1 como coeficiente de extinción molar a 478 nm de λ (Segura-Aguilar et al, 1989) 29 Síntesis y Purificación de aminocromo en resina CM-Sephadex C-50-120 Se incubó 7,5 µmoles de dopamina y 15 ng de tirosinasa en 1,5 ml de 25 mM MES pH 6,0 por 10 min a 25 ºC. Para purificar el aminocromo formado, se cargó la solución de incubación en una columna con 17 x 0,7 cm de resina CMSephadex C-50-120 el cual se eluyó primero con 13 ml de tampón 25 mM MES pH 6,0 y luego con 10 ml de tampón 25 mM MES pH 6,0, 300 mM NaCl. El eluido de la columna fue recuperado en alícuotas de 500 µl. Cada alícuota fue monitoreada espectrofotométricamente por absorbancia a 280 nm, 478 nm y 600 nm de longitud de onda. El aminocromo se recuperó puro entre 5-7 ml de eluido con 25 mM MES pH 6,0; la dopamina se recuperó solo después de 5 ml de 25 mM MES pH 6,0, 300 mM NaCl. La determinación de la presencia y pureza de aminocromo fue determinada por espectroscopia UV-visible y 1 H- NMR. H-NMR Se hidrató y equilibró resina Sephadex G-25-80 con oxido de deuterio. Se incubó 5 µmoles de dopamina y 10 ng de tirosinasa en 1 ml de óxido de deuterio por 15 min a 25 ºC. Se cargó la solución de incubación en una columna con 6 x 0,4 cm de resina Sephadex G-25-80 equilibrada en oxido de deuterio. La columna se eluyó con oxido de deuterio. Cada alícuota fue monitoreada espectrofotométricamente por absorbancia a 478 nm de longitud de onda. Se recuperó la alícuota que absorbió a 478 nm de λ y se comprobó su espectro de absorción con picos a 220, 295 y 478 nm. Se almacenó en hielo e inmediatamente se transportó en un envase térmicamente aislado para su determinación por resonancia magnética nuclear de protones. Los espectros de 1H-NMR fueron realizados usando instrumento z- gradient Bruker Avance 400 instrument, operándolo a 400 MHz con supresión de la señal de agua. El programa de pulso fue zg-30 y la duración de el experimento fue de 300 minutos. La obtención y análisis de los espectros de 1HNMR, fueron realizados por el Dr. Patricio Iturriaga (Departamento de Química, facultad de Ciencias. Universidad de Chile) 30 Determinación de actividad reductasa de DT-diaforasa sobre aminocromo puro Para determinar parámetros cinéticos, se incubó 0,3-6 µg/ml de DTdiaforasa con 250 µM NADH, 5-50 µM de aminocromo, en presencia o ausencia de 10 µM de dicumarol, en 25 mM de Tris-HCl pH 7,5. La reacción se realizó en el siguiente orden. Se preparó dentro de una cubeta plástica para absorción UV-visible el medio de reacción: NADH y tampón en presencia o ausencia de dicumarol y se midió esta solución como blanco de absorción. Luego se agregó el aminocromo y se comenzó a medir las absorciones a 478 nm y 600 nm cada 0,5 seg por un tiempo de 90 seg en el equipo espectroscópico UV-visible Agilent 8453. A los 15-20 seg se agregó la DTdiaforasa y se determinó la disminución en la absorbancia a 478 nm de λ (aminocromo absorve a 478 nm de λ). Cada valor de absorción a 478 nm se transformó a concentración de aminocromo usando el coeficiente de extinción molar de 3058 M-1 . cm-1. Las velocidades iniciales correspondieron a las pendientes de los primeros puntos de las curvas dibujadas al graficar concentración de aminocromo versus tiempo. Se consideró un aumento en la absorbancia a 600 nm como polimerización de aminocromo a neuromelanina (Riley P.A., 1997; Linert et al., 1996). Las constantes catalíticas para la DTdiaforasa sobre el aminocromo se obtuvieron del gráfico Lineweaver-burk, graficando los recíprocos de las velocidades iniciales versus los recíprocos de las concentraciones de aminocromo. Los ensayos enzimáticos se realizaron manteniendo todos los reactivos, menos enzima y aminocromo, a 37 ºC, hasta la medición. Determinación de concentración de proteína por método Bradford Se preparó una curva de calibración con 1-500 µg/ml de albúmina de suero de bovino (BSA) en agua. Se mezcló 200 µl de cada solución de BSA con 800 µl de solución de Bradford (0,01 % coomasie brilliant blue G-250, 8,5% ácido fosfórico, 5 % etanol). Se incubó 2 min y se midió la absorbancia en espectroscopio UV-visible Agilent 8453 a 595 nm. Se graficó concentración 31 versus absorbancia a 595nm generando la curva estándar. Se tomó una alícuota de 20 µl de DT-diaforasa y se diluyó hasta 200 µl con agua. Se agregó 800 µl de solución de Bradford. Se incubó a temperatura ambiente por 2 min y se midió absorbancia a 595 nm, interpolando el valor de absorbancia en la curva de calibración, considerando el factor de dilución de la DT-diaforasa. Ensayos de agregación Condiciones de incubación que no inducen fibrilación de α-sinucleína sola (incubación por horas sin agitación y baja concentración de α-sinucleína): 5-10 µM α-sinucleína humana recombinante fue incubada en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 por 4 hrs a 37ºC sin agitación en presencia o ausencia de: (i)100 µM de dopamina y 10 ng/ml de tirosinasa; (ii) 10 µM de aminocromo; (iii) 250 mM de NADH; (iv) 2,5 µg/ml de DT-diaforasa y/ó (v) 50 µg/ml NADH citocromo C reductasa. Además, algunos ensayos incluyeron 25 ng/ml de superóxido dismutasa y 25 ng/ml de catalasa. La determinación de agregación por se realizó por Western blot. Para ensayos de microscopía electrónica con baja concentración de aminocromo y sin agitación, se incubó 30 µM de α-sinucleína en presencia o ausencia de: (i) 10 µM de aminocromo, (ii) 500 µM NADH, (iii) 10 µg/ml de citocromo C reductasa y/ó (iv) 5 µg/ml de DT-diaforasa en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 por 5 días a 37ºC sin agitación. Condiciones extremas que inducen fibrilación de α-sinucleína sola ( con agitación y alta concentración): 100 µM α-sinucleína humana recombinante, fue incubada en 20 mM MES pH 6,5, 100 mM NaCl por 4 días a 37 ºC con agitación fija de 200 rpm en presencia o ausencia de: (i) 100µM de aminocromo, (ii) 500 mM de NADH, (iii)100 ng/ml de DT-diaforasa y/ó (iv) 10 µg/ml NADH citocromo C reductasa, realizando determinación de agregación por Western blot, microscopía electrónica, dicroísmo circular y fluorescencia de Tioflavina T. Dicroísmo circular 32 A partir de cada medio de incubación de los ensayos de agregación, se tomó una alícuota que se diluyó hasta un volumen de 200 µl en MES 20 mM pH 6,5, logrando una solución de 5 µM de α-sinucleína. Las mediciones se realizaron a 25ºC en una cubeta de cuarzo de 0,1 cm en un espectro polarímetro Jasc0 J-810. La tabla de datos fue transferida al programa Sigmaplot 8.02 para graficar y analizar los resultados. Fluorescencia de tioflavina T A partir de cada medio de incubación de los ensayos de agregación, se tomó una alícuota que se diluyó formando una solución de medición de 0,25 µM de α-sinucleína, 5µM de tioflavina T (TioT) 50 mM MES pH 6,5. La fluorescencia de TioT fue medida en un equipo Cary eclipse Varian inmediatamente después de formar la solución de medición. La mezcla se excitó a 446 nm de longitud de onda y se obtuvo la fluorescencia entre 460-600 nm. A cada muestra, se determinó la intensidad de la fluorescencia de TioT a 480 nm. Los datos fueron procesados y analizados usando el programa sigmaplot 8.02. Microscopía electrónica de transmisión. Grillas de cobre de 300-mesh, previamente cubiertas con Formvar fueron invertidas sobre una gota de 10 µl del medio de incubación de α-sinucleína por 1 min. El exceso de líquido se extrajo con papel filtro, las grillas fueron invertidas en una solución acuosa de acetato de uranilo al 2 % por 5 min. El exceso de solución se extrajo con papel filtro y se dejó secar a temperatura ambiente por 15 min. Las grillas fueron examinadas a 80 kvolt y campos visuales representativos fueron fotografiados a 30000 x y 33000 x de amplificación en un microscopio electrónico de transmisión EM900 Cinética de unión aminocromo con α-sinucleína Se prepararon soluciones de 15 µM de aminocromo en 25 mM tris pH 7,5. Se determinó absorvancia a 478 nm de λ. Se agregó 0, 5, 10 ó 15 µM de αsinucleína en experimentos por triplicado y se midió la absorvancia cada 30 min 33 por un plazo de 2 hrs. Se transformó cada absorvancia obtenida a la concentración de aminocromo correspondiente, con el coeficiente de extinción molar. Se determinó la velocidad de disminución de aminocromo por minuto a cada concentración de α-sinucleína. Se graficó las velocidades de desaparición de aminocromo por tiempo (µM/min) en relación a las cantidades de αsinucleína usadas. Se comprobó que la relación fue lineal con un R= 0,993. De esta manera se obtuvo la velocidad de desaparición de aminocromo por tiempo por miligramo de α-sinucleína (nmoles de aminocromo/min/mg de α-sinucleína) 34 RESULTADOS Objetivo específico 1. Obtener α-sinucleína humana recombinante. Expresión y purificación de α-sinucleína humana recombinante El primer objetivo de esta tesis fue la obtención de α-sinucleína humana recombinante pura y con una concentración adecuada para los ensayos a realizar durante la tesis. Se escogió la expresión de proteína recombinante en bacteria por costos, factibilidad de implementación en el laboratorio y debido a que la α-sinucleína humana no es glicosilada en condiciones fisiológicas. Como vector de expresión en células procariontes, se usó el plasmidio pRK172/α-syn WT, el cual ya tiene incorporada la secuencia completa de la proteína α-sinucleína humana. La bacteria para expresar la proteína fue la BL21(DE3)pLysS, la cual posee un plasmidio de baja expresión de lisozima. La función de este plasmidio es la de disminuir el nivel de expresión de la proteína que se necesita expresar. La α-sinucleína ha demostrado ser una proteína que puede agregarse al aumentar su concentración, por lo cual se optó por no inducir una expresión muy alta de esta proteína en la bacteria. Para expresar y purificar la α-sinucleína, se usó la técnica descrita por Conway et al. (2000) modificada según se describe en materiales y métodos (figura 3). En la figura 4 A se observa la carga de alícuotas de las fracciones 5 a 11 provenientes de la última etapa de purificación de la α-sinucleína en un gel SDS-PAGE al 12%, teñido con azul de Coomasie. Ni las fracciones anteriores ni las posteriores mostraron presencia de proteínas. En esta figura se observó que en todos los eluidos hay gran cantidad de bandas de proteínas de distintos tamaños, lo que nos demostró una falencia que nuestra técnica de purificación. El Western blot de la figura 4 B nos mostró bandas de proteínas de alrededor de 18 kDa reconocidos por anticuerpo anti-α-sinucleína. Por la marca y tamaño en el gel, fueron identificados como monómeros de α-sinucleína. La figura 4 nos demostró que con nuestra técnica de purificación, obtuvimos fracciones ricas 35 en α-sinucleína pero no puras. A continuación se modificó este protocolo de purificación, incorporando una etapa de hervido del extracto de proteínas totales de la lisis bacteriana por 25 min. La figura 5, nos muestra el protocolo de expresión y purificación de α-sinucleína recombinante humana modificado, el cual incluye la etapa de hervido del extracto proteico de bacterias (Etapa IIIb en figura 5). La figura 6 A, corresponde al gel SDS-PAGE teñido con azul de coomasie, que muestra alícuotas de las diferentes etapas de purificación de αsinucleína que incluye hervido de muestras. Esta figura nos muestra que luego del hervido del extracto de proteínas, se logró eliminar la mayor parte de las proteínas contaminantes en la purificación de la α-sinucleína (comparar carril 1 del 2). La precipitación con sales (etapas IV y V) permitió concentrar la αsinucleína (carril 3). La resina Sephadex G25-80 desalinizó las proteínas (carril 4) y la resina de intercambio aniónico completó la purificación de la αsinucleína (carril 5). La tabla 6 B, muestra la absorción espectrofotométrica a 260 y 280 nm de λ de cada solución obtenida luego de distintas etapas de la purificación de la α-sinucleína y que corresponden a las mismas soluciones que se analizaron por SDS-PAGE de la figura 6 A. En esta tabla, la razón de absorbancias a 260 nm con 280 nm nos sirvió para determinar la disminución de oligonucleótidos. Como puede observarse en la tabla, las distintas etapas de purificación fueron eliminando paulatinamente la contaminación con oligonucleótidos y solo luego de la última etapa de purificación, se logró eliminar completamente la presencia de estos. También se determinó la pureza de las proteínas en un gel de electroforesis de poliacrilamida al 12% en condiciones desnaturantes resuelto por tinción con plata (figura 6 C). En este gel se comparó la proteína recombinante purificada por nosotros, con una comercial. Luego de la última etapa de purificación, se obtuvieron 2 fracciones desde la columna con DEAE Sephadex a-50-120 que contenían α-sinucleína. Las denominamos fracciones 500-I y 500-II. En el gel de la figura 6 C, se cargó 2, 4 y 6 µl de la fracción 500-I en los carriles 1, 2 y 3 respectivamente; se cargó 2, 4 y 6 µl de la fracción 500-II en los carriles 4, 5 y 6 respectivamente; y 2 y 4 µg de una α-sinucleína comercial en los carriles 7 y 8 respectivamente. Las 36 bandas de la proteína purificada por nosotros muestran la misma migración que la α-sinucleína comercial. El gel muestra la aparición de una banda única, del tamaño descrito para monómeros de α-sinucleína y no aparece otra banda, aún cargando mas cantidad de proteína. La intensidad de las bandas de la proteína comercial observadas en figura 6 C fueron similares al de la proteína que nosotros obtuvimos, lo que nos sugirió que las concentraciónes de ambas proteínas fueron similares (1 µg/µl o 68µM). La determinación de la concentración se realizó espectrofotométricamente midiendo la absorción a 280 nm de longitud de onda, tomando en cuenta el coeficiente de extinción molar 5600 M-1 cm-1 (Hoyer et al., 2002). Con nuestra purificación, se logró una cantidad de 3 ml de una solución de 60-70 µM de α-sinucleína partiendo de 500 ml de bacteria BL21(DE3)pLysS; pRK172/α-syn en medio Luria-Bertonni inducida con 0,5 mM de IPTG. 37 A kDa kDa 202 71 41,8 71 202 30,6 41,8 30,6 17,8 17,8 6,9 6,9 5 6 7 8 9 10 11 B 5 6 7 8 9 10 11 Figura 4. Determinación de expresión y pureza de α-sinucleína humana recombinante de bacterias de expresión BL21(DE3)pLysS pRK172/α α-syn en tratamiento sin hervido de proteínas. Fracciones consecutivas de la purificación de α-sinucleína según esquema de la figura 3 luego de pasar por una columna con resina DEAE-Sephadex A-50-120. (A) Gel SDS-PAGE al 10% teñido con azul de coomasie, que muestra las fracciones 5-11 obtenidas de la columna. (B) Membrana con proteínas electrotransferidas del SDS-PAGE de la figura 4 A y tratada con anticuerpo policlonal anti-α-sinucleína. 38 BL21(DE3)pLysS pRK172/α-syn wt (densidad óptica de 0,4) 0,5mM de IPTG. 4 horas a 37ºC con agitación I Centrifugación 2000 xg precipitado de bacterias II 25 mM Tris pH 7,5; 50 mM NaCl; 5% glicerol Resuspendido bacteriano Congelado (N2 liq)/ descongelado (70º) III 300 µg/ml lisozima Lisis bacteriana Hervido por 25minutos en baño de agua caliente IIIb Sobrenadante 0 Sobrenadante I IV V Precipitado II Sulfato de amonio 50% saturación Sulfato de amonio 30% saturación Sobrenadante II Precipitado I Eliminación 25 mM Tris pH 8 VI Resuspendidos I Paso por columna con Sephadex G-26-80 Eluido G-25 Separación por columna con DEAE-Sephadex A-50-120 VII Eluido DEAE A-50 Figura 5. Esquema de expresión y purificación de α-sinucleína humana recombinante en bacterias. Esta figura muestra el esquema purificación de α-sinucleína recombinante que incluye la etapa de hervido (IIIB). Las demás etapas de la purificación son similares a las descritas en materiales y métodos. 39 A B 190 120 85 60 2 3 4 5 50 40 25 20 260nm/280nm Abs<260nm> Abs<280nm> 2,3007 0,53309 0,23171 1,5357 0,17904 0,11659 1,32 0,22107 0,16747 0,77825 1,54E-02 1,97E-02 15,10 1 2 3 4 5 C 190 120 85 60 50 40 25 15 10 1 2 3 4 5 6 7 Figura 6. Determinación de expresión y pureza de α-sinucleína humana recombinante de bacterias de expresión BL21(DE3)pLysS pRK172/α α-syn en tratamiento con hervido de proteínas. (A) Gel SDS-PAGE al 10 % teñido con azul de coomasie que muestra proteínas totales de alícuotas de las diferentes etapas de purificación de α-sinucleína humana recombinante esquematizadas en figura 5. (1) Extracto de lisis bacteriana: Extracto total de las bacterias luego de la lisis (etapa III). (2) Sobrenadante 0: Extracto de lisis bacteriana hervido por 25 minutos en baño de agua caliente (etapa IIIb). (3) Precipitado II: Sobrenadante 0 purificado por precipitación con sulfato de amonio al 30 % y luego precipitado con sulfato de amonio al 50 %. (4) Eluido G-25: Precipitado II que se pasó por columna con resina Sephadex G-25-80, rescatando las fracciones que absorbieron a 280 nm de λ. (5) Eluido DEAE A-50: El eluido G25 se cargó y purificó en columna con resina DEAE-Sephadex A-50-120. (B) Tabla que muestra las absorbancias a 260nm y 280 nm de λ de los extractos observados en la figura 3 A cargados en carriles 2, 3, 4 y 5. (C) carga de alícuotas de 2, 4 y 6 µl de la fracción 500-I (carriles 1-3), de 2,4 y 6µl de la fracción 500-II (carriles 4-6) y de 2 y 4 µl de una α-sinucleína comercial de concentración 1 mg/ml (68 µM) (carriles 7 y 8) en un gel SDS-PAGE al 12 %, tenido con tinción de plata. 40 Objetivo específico 2. Preparar y purificar aminocromo. Síntesis y purificación de aminocromo Para el desarrollo de esta tesis, fue necesario el trabajo con aminocromo puro, sin embargo, por su inestabilidad no es un reactivo comercial y no existe ninguna técnica descrita a la fecha para su síntesis y purificación. Por lo anterior, fue necesario diseñar y montar una técnica para la síntesis y purificación de aminocromo. El primer paso fue buscar una condición en que se pueda estabilizar el aminocromo, aumentando el tiempo de polimerización. Se incubó 5 mM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa a distintos pH, a temperatura ambiente por hasta 4 hrs y se determinó espectroscópicamente la presencia de aminocromo por absorción a 478 nm de λ (Segura-Aguilar J. et al, 1998) y de melanina determinada por absorción a 600 nm (Riley P.A., 1997; Linert et al, 1996). La figura 7, nos muestra los espectros de absorción en un rango entre 400-800 nm de λ de las soluciones de dopamina y tirosinasa incubadas por (i) 10 min; (ii) 60 min y (iii) 240 min a distintos pH: línea negra, 50 mM de tampón acetato pH 4,0; línea roja, 50 mM tampón acetato pH 5,0; línea azul, 20 mM MES pH 6,0; línea celeste, 25 mM Tris-HCl pH 7,0 y línea morada, 25 mM TrisHCl pH 8,0. La figura 7 A nos muestra que con 10 min de incubación a pH 4,0, apareció un pico bajo los 400 nm, lo que puede significar que la dopamina fue oxidada hasta dopamina-o-quinona (Segura-Aguilar y Lind, 1989), pero no hubo formación de aminocromo. En cambio a pH 5,0, se observó una señal de aminocromo algo distorsionada a los 400 nm de λ, lo que indica que apareció una señal de dopamina-o-quinona, pero enmascarada por la señal de aminocromo. A pH 6,0 sólo apareció una señal de aminocromo, bastante mayor que la señal a pH 5,0. A pH 7,0 la señal de aminocromo es levemente mayor que la señal a pH 6,0, pero apareció un pico alrededor de los 430 nm de λ, y además, se observó un aumento en las absorbancias a 600 nm de λ lo que nos sugirió la polimerización del aminocromo. A pH 8,0 no se apreció señal de aminocromo, sino una gran absorción en todo el espectro visible, típico de la melanina (Riley P.A., 1997; Linert et al, 1996). Luego de 1 hr, la incubación a 41 pH 4,0 mostró una leve señal de aminocromo y desapareció la señal de dopamina-o-quinona. A pH 5,0, se observó una señal de aminocromo de similar intensidad que a los 10 min y sin presencia de la señal de dopamina-o-quinona ni de melanina, lo que nos indica que a este pH el aminocromo demoró mas en generarse pero fue estable por al menos 1 hr A pH 6,0 se observó una señal de aminocromo mucho mayor que a pH 5,0 y de similar intensidad que a 10 min. Se observó un leve aumento a 600 nm de λ. Las incubaciones a pH 7,0 y 8,0 mostraron un espectro típico de melanina, aunque a pH 7,0 aún apareció la señal de aminocromo. Luego de 4 hrs de incubación a pH 4,0 y 5,0, las señales de aminocromo mantienen la misma intensidad que con 1 hr de incubación y no se observa aparición de melanina. A pH 6,0, la señal correspondiente a aminocromo mantuvo la misma intensidad que luego de 10 y 60 min de incubación, la que es mayor a lo observado a pH 4,0 y 5,0, pero luego de 4 hrs de incubación, comenzó a aparecer melanina. A pH 7,0 y 8,0, no se observó señal de aminocromo, solo espectro correspondiente a melanina. Por los resultados obtenidos, se decidió realizar la oxidación de dopamina por tirosinasa a pH 6,0, ya que a este pH la reacción es rápida con alto rendimiento y el aminocromo es estable por al menos 4 hrs. El siguiente paso fue separar el aminocromo de la tirosinasa y la melanina. Como la resina Sephadex G-25-80 se utiliza para separar proteínas de sales por el retardo que sufre las moléculas de bajo tamaño, se propuso que esta resina podría ser útil para separar el aminocromo y dopamina de moléculas de mayor tamaño como la tirosinasa y el pigmento de melanina. Se realizó una separación en esta columna tal como se describe en materiales y métodos. Para seguir la separación, cada eluido fue medido espectroscópicamente, determinando la absorbancia a 280 nm, 478 nm y 600 nm de λ (la absorbancia a 280 nm nos mostraría la aparición de la tirosinasa, dopamina y de melanina; la absorbancia a 478 nm nos mostraría la aparición de aminocromo; la absorbancia a 600 nm nos mostraría la aparición de melanina). Como se puede observar en la figura 8 A, entre 300-500 µl de elución apareció una pequeña señal de absorción a 280 nm, que no absorbió ni a 478 nm ni a 600 nm (señal I). Entre los 800–1100 µl de elución apareció una 42 gran señal a 280 nm que se complementó con una señal a 478 nm (Señal II). Entre los 1100-1300 µl de elución, apareció una señal que absorbió a 280 nm, 478 nm y 600 nm en igual magnitud (Señal III). Finalmente sobre los 2100 µl de elución, se observó una absorción solo a 280 nm (señal IV). Por el bajo retardo, se pensó que la señal I podría corresponder a los eluidos que contenían la tirosinasa. Para corroborar esto, se agregó 500 nanomoles (nmoles) de dopamina a la fracción que eluyó entre 400-500 µl, la cual mostró la mayor intensidad de la señal I. Se incubó por 10 min a 25 ºC y se midió la absorción a 478 nm de λ. Tal como se aprecia en la tabla 8 B, la dopamina se oxidó a aminocromo. Como contraparte, la adición de 500 nmoles de dopamina a la fracción que eluyó entre 600-700 µl y que no absorvió a 280 nm de λ, no mostró aparición de señal a 478 nm de λ luego de 10 min de incubación. Esto nos corroboró que la señal I contenía tirosinasa. La señal II por su absorción a 280 nm y 478 nm podría corresponder a aminocromo en presencia o ausencia de dopamina. La señal IV, indicó la presencia de una sustancia que solo absorbió a 280 nm de λ y que se encontraba en gran cantidad, por el hecho de observarse en un gran volumen de elusión. Por lo anterior, se pensó que esta señal podría corresponder a la dopamina. Para corroborar esto, se agregó 1 ng de tirosinasa a la fracción que eluyó entre 2200-2300 µl que mostró la señal IV y se incubó por 10 min. Tal como se muestra en la tabla 8 B, esta solución mostró un aumento en la absorción a 478 nm indicando que hubo oxidación de dopamina a aminocromo. Como contraparte, la incorporación de tirosinasa a la fracción que eluyó entre 1700-1800 µl (antes de la aparición de la señal IV), no mostró un aumento de absorbancia a 478 nm luego de 10 min de incubación. La señal III, muestra una absorción a 280 nm, 478 nm y 600 nm de λ de similar intensidad, lo que nos indicó la presencia de melanina. Todo lo anterior nos hizo pensar que la señal II correspondió a eluidos con aminocromo libre de dopamina, tirosinasa y melanina. Se tomó una alícuota de la fracción con señal II y se determinó su espectro electromagnético en la región UV-visible, realizándole un barrido de absorbancias entre 200-800 nm de λ. La figura 9 A, muestra este espectro, en 43 donde se observaron 3 picos claramente identificables a 220 nm, 297 nm y 477 nm de λ. Para determinar si este espectro puede corresponder a una mezcla de aminocromo con dopamina, se determinaron y graficaron los espectros de dopamina sola, alícuota de la fracción de II de la separación y una mezcla de ambas en la figura 9 B. El espectro de 100 µM de dopamina pura mostró una absorbancia a 220 nm y 280 nm pero no a 297 nm y 478 nm (espectro azul, figura 6 B). La alícuota de la fracción II mostró el espectro rozado de la figura 9 B con los picos ya descritos anteriormente. La mezcla de una alícuota de la fracción II y dopamina, mostró un espectro que es la combinación de los 2 espectros de las soluciones por separado. Se aumento la señal a 220 nm, pero las señales a 297 nm y 478 nm de longitud de onda de la fracción II sola no se vieron modificadas. Por parte de la dopamina la señal fue a 280 nm, pudiendo diferenciarse claramente de la señal a 295 nm. Por lo tanto, la fracción II no contiene dopamina pues esta sería identificada claramente. A continuación, se realizó un espectro de resonancia nuclear de 1 protones ( H-NMR) a una alícuota de una fracción de separación que presentó un espectro UV-visible con los picos a 220 nm, 295 nm y 478 nm de λ tal como se observó en figura 9 A. La alícuota medida, se obtuvo de una purificación de aminocromo preparado y purificado íntegramente en óxido de deuterio, tal como se describe en materiales y métodos. La figura 10 muestra el espectro de 1 H-NMR con y señales claras. Las resonancias a 6,41 y 5,57 ppm indicaron protones de una orto-quinona. La señal a 6,41 ppm con una integración ≅ 1 corresponde al hidrógeno marcado como H-4 el cual muestra un inusual acoplamiento a largo rango con los protones del grupo marcado H-3 (J4 = 2,57 Hz) probablemente por la perdida de aromaticidad en una orto-quinona (con respecto al anillo bencénico). La señal a 5,57 ppm con una integración ≅ 1, es un singulete que corresponde al hidrógeno marcado como H-7. El hidrógeno de la amina secundaria no existiría porque probablemente se habría cambiado por deuterio. El anillo pirrolidina tiene dos grupos metileno resonantes, el H-2 (3,81 ppm; J3 = 5,18 Hz) con integración ≅ 2 el cual exhibe un triplete mostrando el acoplamiento con los hidrógenos H-3 y los hidrógenos del metileno H-3 muestran una señal con una integración ≅ 2 que corresponde a un multiplete 44 con 2 sistemas de acoplamiento diferentes con J3 = 5,19 Hz and J4 = 2.55 Hz, un acoplamiento vecino con el metileno H-2 y un acoplamiento a largo rango con el hidrógeno H-4. Por lo tanto, las mediciones con 1H-NMR demostraron que la fracción de la separación de aminocromo que presenta un espectro de absorvancia con picos de absorción a 220, 295 y 478 nm de λ, contenía aminocromo puro. Debido a la separación lograda entre aminocromo y dopamina a través de una resina de exclusión por tamaño, sugerimos que la diferencia en la migración se debió a diferencia en las propiedades polares entre ambas moléculas. Estas diferencias polares podrían generar esferas de hidratación de diferentes diámetros que explicarían las distintas migraciones. Para corroborar que es esta diferencia en las polaridades las que influyeron en la distintas migraciones, se realizó una separación de dopamina incubada con tirosinasa por resina Sephadex G-25-80 pero a un pH mas alcalino, pH 7,5. Tal como se observa en la figura 11, apareció una señal I a los 300 µl de elusión. Esta señal correspondió a la migración de tirosinasa, lo que se determinó por su propiedad para oxidar dopamina adicionada a esta fracción. Apareció una señal II de un pico a 478 nm a los 900 µl de elusión, sin embargo el pico a 280, se obtuvo a los 1000 µl de elusión. Al realizar una medición por espectroscopia UV-visible, se observó que correspondió a una mezcla de dopamina y aminocromo. La señal III que apareció desde los 1000 µl de elusión, correspondió a melanina por la alta polimerización a este pH. Con la técnica de purificación de aminocromo por columnas con Sephadex G-25-80, se logró una máxima concentración de 80 µM. Esta concentración nos permitió realizar algunos ensayos, sin embargo, para ciertos experimentos la concentración de trabajo fue de 100 µM. Por lo anterior, fue imprescindible mejorar la técnica para aumentar la concentración. Debido a la diferencia entre los comportamientos polares observados entre dopamina y aminocromo a pH 6,0, propusimos que se podía mejorar la separación ocupando una columna de intercambio iónico. Se oxidó dopamina con tirosinasa y se paso este medio de incubación por una columna con resina CMSephadex C-50-120 tal como se describe en materiales y métodos. Como se 45 observa en la figura 12, aparecieron 5 fracciones con sustancias que absorbieron en el rango de 280 nm de λ. La tirosinasa eluyó rápidamente (señal I) lo que se comprobó al agregar dopamina a una alícuota del eluido que dio señal I y luego de 10 min, observar aumento de la absorbancia a 478 nm de λ (no mostrado). A los 3 ml de elusión apareció una señal con absorción a 280, 478 y 600 nm de λ que correspondió a melanina (señal II). Entre los 5-8 ml de elución con 25 mM MES pH 6 sin NaCl, se obtuvo una gran señal a 280 y a 478 nm de λ (señal III). Un barrido de absorbancias entre 200-800 nm de λ de los eluidos que mostraron la señal III, con el espectro característico del aminocromo puro. Solo después de aumentar la fuerza iónica, agregando a la fase móvil 300mM NaCl, apareció una señal con solo absorción a 280 nm de λ (señal V). El eluido que mostró señal V presentó aumento de absorción a 478 nm de λ solo al incubar por 10 min con tirosinasa, lo que nos indicó que correspondió a dopamina. La señal IV indica el punto donde se comenzó a eluir con 20 mM MES pH 6 + 300 mM NaCl. Mediante esta técnica, se logró una máxima concentración de 260 µM de aminocromo puro. 46 A 0.7 Absorbance (AU) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 350 400 450 500 550 600 650 Wavelength (nm) 400 450 500 550 600 650 Wavelength (nm) 0.9 B 0.8 Absorbance (AU) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 350 C 0.8 Absorbance (AU) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 350 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) Figura 7. Determinación de aparición de aminocromo por oxidación de dopamina a distintos pH y distintos tiempos. Espectros de absorción entre 380-800 nm de λ luego de incubación de 5 mM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa a distintos pH: pH 4,0, curvas negras; pH 5,0, curvas rojas; pH 6,0, curvas azules; pH 7,0, curvas celestes y pH 8,0, curvas violetas. (A) Incubación por 10 min, (B) por 1 hr y (C) por 4 hrs. 47 A II 0 ,6 280 nm 478 nm 600 nm 0 ,5 I Absorbancia 0 ,4 III IV 0 ,3 0 ,2 0 ,1 0 ,0 -0 ,1 0 5 10 15 20 25 30 35 v o lu m e n d e e lu id o ( x 1 0 0 µ l) B Fracción 400-500 µl Fracción 400-500 µl + 5mM DA Fracción 600-700 µl Fracción 600-700 µl + 5 mM DA Fracción 2200-2300 µl Fracción 2200-2300 µl + 10 ng/ml tir Fracción 1700-1800 µl Fracción 1700-1800 µl + 10 ng/ml tir Abs<280nm> Abs<478nm> Abs<600nm> 0,11972 4,37E-02 3,60E-02 0,519 6,53E-02 0,68969 5,36E-02 6,26E-02 3,71E-02 0,68605 5,68E-02 2,64E-02 8,50E-03 9,63E-03 5,95E-02 0,13522 5,61E-02 8,14E-03 3,49E-03 6,78E-04 4,29E-03 2,32E-02 8,48E-03 3,72E-03 Figura 8. Separación de aminocromo por columna de exclusión por tamaño a pH 6,0. (A) Separación de un incubado de 5 mM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa en 25 mM MES pH 6,0 por 10 minutos en una columna con resina sephadex G-25-80. Se determinó aparición de distintas especies por la medición de absorbancia a 280 nm, 478 nm y 600 nm, graficando cada punto a través del programa Sigma Plot. Las señales I, II, III y IV, corresponde a la aparición de distintas especies de la incubación. (B) Tabla que muestra la formación de aminocromo por aumento de absorción a 280 nm y 478 nm pero no a 600 nm, luego de agregar tirosinasa o dopamina a distintas fracciones de la separación mostrada en 7 A. 48 A 1 ,0 Absorbancia 220 0 ,5 297 477 0 ,0 200 300 400 600 700 800 L o n g it u d d e o n d a ( n m ) 1,2 B 500 1 Absorbancia 0,8 DA Amino 0,6 DA+amino 0,4 0,2 0 190 -0,2 290 390 490 590 690 Longitud de onda (nm) Figura 9. Espectros de absorción de eluidos derivados de la oxidación de la dopamina. (A) Espectro de absorción entre 200-800 nm de λ de la fracción II de la separación de dopamina incubada con tirosinasa, por resina Sephadex G-25. (B) comparación de los espectros de absorbancia de la dopamina (línea azul), de la fracción II (línea verde) y el espectro de dopamina junto a la fracción II (línea rosada). 49 Figura 10. Espectro H-NMR de eluido que contiene aminocromo en D2O. Espectro H-NMR de una alícuota de la fracción II de la separación de dopamina incubada con tirosinasa, por resina Sephadex G-25 realizada en óxido de deuterio. (A) Región de alto campo donde aparecen los protones aromáticos (protones 4 y 7 de la molécula de aminocromo representada en la figura). (B) Región de bajo campo, donde aparecen los protones alifáticos (protones 2 y 3 de la molécula de aminocromo. 50 0,70 Absorvancia (nm) 0,60 280 nm 478 nm 0,50 600 nm 0,40 II 0,30 III I 0,20 0,10 0,00 0 5 10 15 20 Volumen de eluido (x 100 ul) Figura 11. Separación de aminocromo por columna de excusión por tamaño a pH 7,5. Separación de un incubado de 5 mM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa en 25 mM tris-HCl pH 7,5 por 5 minutos en una columna con resina sephadex G-25-80. Se determinó aparición de distintas especies por la medición de absorbancia a 280 nm, 478 nm y 600 nm, graficando cada punto a través del programa Sigma Plot. Las señales I, II y III, corresponde a la aparición de distintas especies de la incubación. 51 T a m p ó n d e e lu c ió n + 3 0 0 m M d e N a C l III V 1 ,2 280 nm 478 nm 600 nm 1 ,0 0 ,8 Absorbancia I II IV 0 ,6 0 ,4 0 ,2 0 ,0 - 0 ,2 0 5 10 15 20 25 v o lu m e n d e e lu id o ( m l) Figura 12. Separación de aminocromo en columna de intercambio catiónico. Separación de un incubado de 5 mM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa en 25mM MES pH 6,0 por 10 minutos en una columna con resina de intercambio catiónico CM-Sephadex C-50-120. Los primeros 14 ml fueron eluidos con 25 mM MES pH 6,0 y los 11 ml restantes con 25mM MES pH 6,0 + 300mM NaCl. La aparición de las distintas especies fue determinada por absorción a 280 nm, 478 nm y 600 nm de λ, graficando cada punto a través del programa Sigma Plot. Las señales I, II, III, IV y V, marcan aparición de diferentes especies. 52 Objetivo específico 3. Comprobar por estudios in vitro, que el aminocromo puro es capaz de inducir la agregación de α-sinucleína humana estabilizando la estructura oligomérica e inhibiendo la fibrilación de αsinucleína. Inducción de la agregación de α-sinucleína durante la oxidación de dopamina catalizada por tirosinasa Lansbury y colaboradores (Conway et al. 2001) sugirieron que la dopamina al oxidarse induce la agregación de α-sinucleína, discutiendo que la molécula responsable podría ser el aminocromo. Sin embargo, estos resultados los obtuvieron incubando 180 µM de α-sinucleína con 180 µM de dopamina por 24 hrs. con agitación. Bajo estas condiciones, la α-sinucleína polimeriza hasta formar fibras, sin necesidad de la presencia de otro compuesto. La dopamina al oxidarse previno la formación de fibras de α-sinucleína, sin embargo no fueron muy claros los resultados que sugerirían que la dopamina al oxidarse indujo la agregación de α-sinucleína. Nosotros intentamos probar que la dopamina al oxidarse induce la polimerización de α-sinucleína y luego quisimos demostrar que es el aminocromo la molécula responsable. Se planteó un modelo de estudio in vitro, donde no haya polimerización espontánea de α-sinucleína sola y que solo la incubación con dopamina al oxidarse induce la agregación de α-sinucleína. Para lograr estas condiciones, se incubó α-sinucleína en bajas concentraciones en presencia ó ausencia de dopamina y un catalizador que induce la oxidación de ésta. La figura 13 A nos muestra el resultado de un Western blot para anticuerpo específico anti-αsinucleína. Para este Western blot se cargaron alícuotas que contuvieron 500 ng de α-sinucleína por bolsillo, de las 4 condiciones descritas a continuación: (1) 5 µM de α-sinucleína sola, incubada a 37ºC, a pH 7,5 por 4 hrs sin agitación. Solo se observó una banda única de aproximadamente 18 kDa correspondiente al monómero de α-sinucleína; (2) 5 µM de α-sinucleína con 100 µM de dopamina incubada a 37ºC, a pH 7,5 por 4 hrs sin agitación. No se observó diferencias con la incubación de α-sinucleína sola; (3) 5 µM de α53 sinucleína con 100 µM de dopamina y 10 ng/ml de tirosinasa incubada a 37 ºC, a pH 7,5 por 4 hrs sin agitación. En esta condición se observó una disminución significativa de la banda correspondiente al monómero de α-sinucleína, lo que se cuantificó en el gráfico 13 B. También se pudo apreciar, sólo en esta condición, la aparición de una señal α-sinucleína positiva de alto peso molecular (que no fue capaz de entrar en el gel separador de un SDS-PAGE al 12%); (4) 5 µM de α-sinucleína con 10 ng/ml de tirosinasa incubada a 37ºC, a pH 7,5 por 4 hrs. sin agitación. La tirosinasa por si sola no fue capaz de inducir la disminución de α-sinucleína monomérica, mostrando una señal igual a lo observado con α-sinucleína sola. El gráfico de la figura 13 B, corresponde a la cuantificación de la banda monomérica de tres Western blot diferentes de las condiciones descritas para la figura 13 A. Este gráfico comprueba que solo la incubación de α-sinucleína con dopamina y tirosinasa induce la desaparición del monómero de α-sinucleína. Al no ver claramente la aparición de bandas correspondientes a polímeros de α-sinucleína, se aumentó la concentración de α-sinucleína en la reacción a 10 µM y la carga de α-sinucleína en el gel SDSPAGE a 2 µg por bolsillo. La figura 13 C corresponde a un Western blot para αsinucleína donde se comparó la incubación de: (1) 10 µM de α-sinucleína sola a 37ºC, pH 7,5 por 4 hrs sin agitación y (2) 10 µM de α-sinucleína con 100 µM de dopamina y 10 ng/ml de tirosinasa a 37 ºC, pH 7,5 por 4 hrs sin agitación. Al igual que en la figura 13 A, la α-sinucleína sola mostró una única banda correspondiente al monómero de α-sinucleína. Sin embargo, la presencia de dopamina y tirosinasa, indujo la aparición de un bandeo α-sinucleína positivo de entre 40-200 kDa que correspondieron a polímeros de α-sinucleína. El gráfico 13 D muestra la cuantificación de la señal α-sinucleína positiva entre 40-200 kDa observada en la figura 13 C, de tres experimentos diferentes. Este gráfico confirma la aparición de polímeros de α-sinucleína por dopamina cuando se incuba junto a tirosinasa. 54 B A 6000 kDa 202 5000 Límite gel separador y gel concentrador 4000 pixeles 71 41,8 30,6 3000 2000 ** 1000 17,8 0 1 2 3 1 4 C 2 3 4 D kDa *** 20000 202 71 Pixeles 15000 41,8 30,6 10000 5000 17,8 0 1 2 1 2 Figura 13. Determinación de α-sinucleína en presencia de por dopamina y tirosinasa (A) Western blot incubado con anticuerpo anti-α-sinucleína en que se cargaron alícuotas de incubación de: (1) α-sinucleína sola; (2) α-sinucleína y dopamina; (3) α-sinucleína, dopamina y tirosinasa; y (4) α-sinucleína y tirosinasa. La banda de ≅18 kDa corresponde a monómeros de α-sinucleína, y la señal sobre los 200 kDa, correspondería a polímeros de αsinucleína de alto peso molecular que no alcanzaron a entrar al gel separador (línea fragmentada indica límite entre gel concentrador y gel separador). (B) Gráfico que representa la cuantificación de las bandas monoméricas de α-sinucleína para cada condición mostrada en la figura 13 A. Cada barra representa los pixeles totales cuantificados de 3 geles diferentes con el programa Scion Image. **= p< 0,01. ANOVA, Test Tukey. (C) Western blot incubado con anticuerpo anti-α/β-sinucleína de alícuotas de la incubación de: (1) α-sinucleína sola y (2) αsinucleína, dopamina y tirosinasa. La banda de ≅ 18 kDa corresponde a monómeros de αsinucleína, y la señal entre 42-202 kDa, corresponden a agregados de α-sinucleína correspondientes a trímeros hasta polímeros de sobre 10 unidades. (D) Gráfico que representa la cuantificación de la señal entre 42-202 kDa de la figura 13 C. Cada banda representa los pixeles totales cuantificados tres experimentos diferentes con el programa Scion Image. *** = p< 0,005. Test Student. 55 agregación de α-sinucleína Inducida por aminocromo Luego de haber confirmado que la dopamina al oxidarse con tirosinasa indujo de agregación de α-sinucleína, quisimos comprobar si el aminocromo puede inducir la agregación de α-sinucleína. Para esto, se incubó 10 µM de αsinucleína en presencia y ausencia de 10 µM de aminocromo puro en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 por 4 hrs a 37ºC sin agitación, luego se determinó la agregación de α-sinucleína por la técnica de Western blot, incubado con anticuerpo anti-α-sinucleína. El Western blot de la figura 14 corresponde a la incubación de (1) α-sinucleína sola y (2) α-sinucleína junto a aminocromo. En este Western blot se observó que al incubar α-sinucleína sola, sólo apareció una banda monomérica de α-sinucleína. En comparación, en presencia de aminocromo apareció un bandeo que corresponde a estructuras de 40-200 kDa, que son específicos para α-sinucleína. Este bandeo es similar al que apareció en la incubación de α-sinucleína con dopamina y tirosinasa. También se puede observar, que apareció una señal en el área correspondiente al gel concentrador, que podría corresponder a estructuras poliméricas de alto peso molecular que no son capaces de entrar al gel separador. Debido a que Conway et al. (2001) describe que la dopamina al oxidarse indujo protofibras de α-sinucleína, se quiso observar la morfología de los agregados inducidos por aminocromo por microscopía electrónica. Para lo anterior, se aumentó la concentración de α-sinucleína en la incubación a 30 µM, que fue una concentración que definimos como adecuada para visualizar estructuras en el microscopio electrónico. Se incubó 30 µM de α-sinucleína en presencia y ausencia de 10 µM de aminocromo purificado, en 25 mM de trisHCl pH 7,5 por 5 días a 37 ºC sin agitación. Se incubaron grillas con membrana de Formvar con gotas de la incubación de α-sinucleína sola ó α-sinucleína con aminocromo y se observó cada incubación por microscopía electrónica con la técnica de tinción negativa. La figura 15 muestra fotografías representativas de las dos condiciones en estudio, tomadas con aumento de 30000 x. La figura 15 A, muestra una fotografía de la incubación de α-sinucleína sola y la figura 15 B 56 corresponde a una ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 15 A. Tal como nos muestran estas fotografías, la incubación de αsinucleína sola no indujo la aparición de estructuras que pudieran ser vistos por microscopía electrónica con la técnica de tinción negativa. Las pocas estructuras que se observaron (flechas punteadas figura 15 A) son estructuras amorfas, electronicamente densas que también aparecieron en controles negativos (sin α-sinucleína). La figura 15 C, muestra una fotografía de la incubación de α-sinucleína con aminocromo y la figura 15 D corresponde a una ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 15 C. El análisis de las grillas incubadas con el medio de incubación de α-sinucleína con aminocromo, evidenció dos tipos de estructuras diferentes. Un tipo de estructura son cuerpos amorfos o globulares, electrónicamente densos y de distinto tamaño que varían entre 250 nm de diámetro hasta 3 µm de largo (flechas gruesas blancas). Estas estructuras también aparecieron en un medio de incubación de dopamina con tirosinasa sin α-sinucleína y pensamos que puede corresponder a melanina, pero no se trabajó en su identificación. Un segundo tipo de estructuras, son globulares y no son electrónicamente densas, por lo que solo se pudieron ver por tinción negativa, es decir, solo se aprecia el borde negro de las estructuras que da la tinción con acetato de uranilo. Por la amplificación de la figura 15 C, podemos observar la forma globular de estas estructuras de entre 15-25 nm de diámetro (flechas negras en figura 15 D) similares a estructuras descritas como oligómeros de α-sinucleína (Lee y Lee, 2002; Conway et al., 2000a). Como se ha descrito que la oxidación de dopamina inhibe la formación de fibras de α-sinucleína (Conway et al., 2001), quisimos determinar si el aminocromo es capaz de inhibir la formación de fibras de α-sinucleína. Se incubó 100 µM de α-sinucleína en 20 mM MES pH 6,5; 100 mM NaCl por 4 días a 37 ºC con agitación constante a 200 rpm (Rasia et al., 2005), lo que induce la formación de fibras de α-sinucleína y se observó el efecto que produjo la incorporación de 100 µM de aminocromo sobre: (i) la formación de fibras tipo amiloide, determinado por fluorescencia de TioT; (ii) cambio de 57 estructura secundaria de la α-sinucleína, determinado por dicroísmo circular; (iii) la formación de fibras y cuerpos fibrilares, determinados visualmente por microscopía electrónica. La figura 16 nos muestra la cinética de la formación de fibras tipo amiloides de α-sinucleína incubada en dos condiciones diferentes, determinada por aumento en la fluorescencia de TioT. La curva con puntos negros muestra la cinética de fibrilación de α-sinucleína sola y la curva con puntos blancos muestra la cinética de fibrilación de α-sinucleína incubada con aminocromo. La incubación de α-sinucleína sola bajo las condiciones experimentales descritas, indujo la aparición y aumento de fibras en una cinética muy rápida, con un tiempo medio de 25,6 ± 1,3 hrs y un máximo en la cantidad de fibras tipo amiloide antes de 2 días. En comparación, al incubar α-sinucleína con aminocromo la velocidad de fibrilación disminuyó, mostrando un tiempo medio de fibrilación de 37 ± 4,3 hrs, alcanzando el máximo de fibrilación casi a las 80 hrs. de incubación. Se determinó el cambio de estructura secundaria de la α-sinucleína a través de la técnica de dicroísmo circular. En la figura 17 se muestran los espectros representativos de un experimento hecho por triplicado para cada condición. Se tomaron alícuotas a distintos tiempos de incubación (24, 48 y 72 hrs) de los medios de incubación de 100 µM de α-sinucleína en presencia o ausencia 100 µM de aminocromo. La figura 17 A, nos muestra los espectros obtenidos del medio de incubación de α-sinucleína sola. El espectro negro nos mostró que con 24 hrs de agitación de 100 µM de α-sinucleína sola a 37 ºC no se produjo un cambio aparente en la estructura secundaria de la proteína, manteniéndose ésta en estructura de ovillo al azar (observado por la gran señal negativa de absorvancia a los 200 nm de longitud de onda), tal como esta descrita para los monómeros de α-sinucleína (Conway et al., 2000a). El espectro rojo, nos mostró que 48 hrs de agitación de 100 µM de α-sinucleína sola a 37 ºC es suficiente para inducir un cambio conformacional de la proteína a sábana-β, tal como se aprecia por el cambio del mínimo de elipticidad desde 200 a 220 y por la forma del espectro observado (Conway et al., 2000b). El 58 espectro verde, es el espectro de la α-sinucleína sola incubada por 72 hrs y nos indicó que luego del cambio conformacional a 48 hrs, las estructura sábana-β se mantiene estable por sobre 72 hrs La figura 17 B, nos muestra los espectros obtenidos del medio de incubación de 100 µM de α-sinucleína con 100 µM de aminocromo puro. El espectro negro, nos indicó que luego de 24 hrs de incubación aún no hay cambio conformacional de la α-sinucleína, tal como se observó cuando se incubó sola. El espectro rojo, nos mostró que hay cierta aparición de estructura sábana-β, pero es menor a la observada en la incubación de α-sinucleína sola a las 48 hrs Esto se demostró por el grado de torsión de la luz a 220 nm de λ, donde en la incubación de α-sinucleína sola es de aproximadamente –3,5 miligrados y en la incubación de α-sinucleína con aminocromo es de aproximadamente -2,5 miligrados. A diferencia del espectro de α-sinucleína sola, el espectro de la incubación de α-sinucleína con aminocromo no es típico de estructura sábana-β ya que el mínimo de torsión no fue a 220 nm, sino cerca de los 205 nm de λ. Sin embargo, se observó una disminución bastante marcada de la estructura ovillo al azar, pero sin que toda esta estructura haya adquirido estructura sabana-β y menos hélice-α. El espectro verde, nos indicó que la incubación de α-sinucleína con aminocromo por 72 hrs indujo una mayor transformación a sábana-β que a las 48 hrs, corroborando los datos anteriores de la capacidad del aminocromo para disminuir la velocidad de fibrilación de α-sinucleína, pero ya no se observa estructura ovillo al azar, sin embargo, el espectro tampoco mostró una forma típica para sábana-β, hélice-α u ovillo al azar. La figura 18 muestra fotografías representativas de alícuotas de los mismos medios de incubación de α-sinucleína sola y α-sinucleína con aminocromo incubados por 48 hrs, usados para determinación de estructura secundaria con dicroismo circular y de fibrilación con TioT. En la figura 18 A vemos una fotografía tomada con aumento de 33000 x de un medio de incubación de α-sinucleína sola. La figura 18 B corresponde a la ampliación de el área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 18 A. Bajo las condiciones descritas, la incubación de α-sinucleína sola generó gran cantidad 59 de fibras de 10-15 nm de ancho no electrónicamente densas, por lo que solo se observaró por la delimitación de las estructuras con la tinción de acetato de uranilo (flechas negras en figura 18 B). Estas fibras aparecieron asociadas entre sí en una forma muy densa y no ordenada que generó estructuras amorfas de entre 0,5-15 µm de longitud (flecha blanca en figura 18 A). Las fibras observadas son muy similares a las fibras descritas para α-sinucleína (Conway et Al., 2000b; Spillantini et al., 1998). Esta incubación de α-sinucleína sola no generó otro tipo de estructura. La figura 18 C muestra una fotografía representativa tomada con aumento de 33000 x del medio de incubación de αsinucleína con aminocromo. La figura 18 D corresponde a una ampliación de una fotografía de la incubación de α-sinucleína con aminocromo. La incubación de α-sinucleína con aminocromo disminuyó notoriamente la cantidad de fibras, lo que se aprecia en la disminución del tamaño y de la cantidad de las estructuras compuestas de fibras agrupadas (flechas gruesas y blancas de la figura 18 C). Las estructuras fibrilares mas grandes no superaron los 0,4 µm de diámetro. Además de la disminución en la cantidad de fibras, se observó la aparición de pequeñas estructuras globulares, que no eran electrónicamente densas y por lo tanto solo observadas con tinción negativa. Estas estructuras se encontraron distribuidas por toda la grilla de observación microscópica de manera homogénea, en todas las grillas observadas para esta condición. La figura 18 D muestra la ampliación de estas estructuras globulares. Estas corresponden a estructuras globulares de entre 15-25 nm (flechas negras de figura 18 D), similares a lo observado en la incubación por 5 días sin agitación (figura 15 C y D) y a las descritas previamente (Conway et al., 2000a; Lee y Lee, 2002). Las observaciones por microscopía electrónica recién descritas fueron realizadas luego de incubación por 48 hrs, por lo que nos quedó la duda si las pequeñas estructuras globulares son una estructura alternativa a la fibra ó son precursoras de estas. Como previamente se observó, la agregación de αsinucleína inducida por aminocromo comenzó con la formación de polímeros de bajo peso molecular (40-200 kDa) y luego de 48 hrs se obtuvo estructuras globulares de 15-25 nm de diámetro. Por lo tanto, se supuso que si estas 60 estructuras globulares son el precursor de las fibras, entonces tendríamos una agregación secuencial que comienza con la aparición de polímeros de 40-200 kDa, luego continua con la aparición de estructuras globulares de 15-25 µm de diámetro con características de pre-fibra y finaliza en la formación de fibras. De esta forma, mientras aparecen estructuras de gran tamaño, las estructuras de bajo peso molecular deberían ir disminuyendo gradualmente. Por lo tanto, realizamos western blot para detectar α-sinucleína a tiempos distintos de incubación de α-sinucleína con aminocromo. A mayor tiempo de incubación los agregados de bajo peso molecular deberían disminuir y los polímeros de alto peso molecular aumentar. La figura 19 nos muestra el resultado de Western blots para la incubación por 48 y 102 hrs de (1) 100 µM de α-sinucleína sola ó (2) 100 µM de α-sinucleína junto a 100 µM de aminocromo en 20 mM MES pH 6,5; 100 mM NaCl a 37 ºC con agitación constante a 200 rpm. La incubación de α-sinucleína sola por 48 hrs que se muestra en la figura 19 A, no mostró aparición de polímeros α-sinucleína positivos de 40-200 kDa., aunque si se observaron estructuras de alto peso molecular que no entraron al gel separador. La incubación de α-sinucleína sola por 102 hrs que se observa en la figura 19 B, tampoco mostró polímeros de α-sinucleína de 40-200 kDa. Además, los polímeros de alto peso molecular desaparecieron. Al incubar αsinucleína con aminocromo por 48 hrs, apareció una señal difusa correspondiendo a polímeros de α-sinucleína de entre 40 hasta sobre los 190 kDa, señal que es mucho mas fuerte alrededor de los 190 kDa. También apareció una señal que corresponde a polímeros de alto peso molecular (flecha negra continua) similar a lo ocurrido con α-sinucleína sola, pero además pudimos ver un precipitado en el bolsillo de carga reconocido con anticuerpo anti α/β-sinucleína (flecha blanca y gruesa). Al incubar α-sinucleína con aminocromo por 102 hrs, se mantuvo la presencia de polímeros α-sinucleína positivos de entre 40 hasta sobre los 190 kDa, de los polímeros de alto peso molecular presentes en el gel concentrador (flecha negra continua) y de la marca del precipitado α-sinucleína positivo sobre el bolsillo, pero fuera del gel (flecha blanca y gruesa). Las figuras 19 B y 19 D, corresponden a gráficos que 61 muestran la cuantificación de la marca de entre 40-200 kDa para α-sinucleína en presencia o ausencia de aminocromo de tres experimentos distintos cada gráfico. El gráfico de la figura 19 B, corresponde a la cuantificación de la incubación por 48 hrs y la figura 19 D la incubación por 102 hrs Estos gráficos claramente comprueban que incluso luego de la incubación por 102 hrs de αsinucleína con aminocromo, hay un marcado aumento de los polímeros de 40200 kDa en comparación con lo observado en la incubación de α-sinucleína sola. 62 A B 40000 kDa 202 ** Límite entre gel separador y concentrador 71 41,8 30,6 Pixeles 30000 20000 10000 17,8 6,9 0 1 2 1 2 Figura 14. Agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo purificado. (A) Western blot incubado con anticuerpo anti-α/β-sinucleína de los incubados de: (1) α-sinucleína sola y (2) α-sinucleína y aminocromo. La línea fragmentada indica el límite entre el gel separador y el gel concentrador. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de los pixeles totales de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos diferentes, de las condiciones mostradas en la figura 14A. ** = p< 0,01. Test Student. 63 A B C D Figura 15. Determinación por microscopía electrónica de estructuras globulares inducidas por aminocromo. (A) fotografía representativa con aumento de 30000 x de la incubación por 5 días sin agitación de α-sinucleína sola. Flechas negras indican estructuras amorfas que también se observaron en controles sin α-sinucleína. (B) Ampliación del cuadro negro dentro de la figura 15 A. Barra = 0,25 µm. (C) fotografía representativa con aumento de 30000 x de la incubación por 5 días sin agitación de α-sinucleína con aminocromo. Flechas blancas indican estructuras electrónicamente densas de diferentes tamaños que también fueron observados en la incubación de dopamina y tirosinasa sin α-sinucleína. (D) Ampliación del cuadro negro dentro de la figura 15 C. Las flechas negras indican estructuras globulares de 15-25 nm de diámetro, observadas solo con tinción negativa. Barras inferiores = 0,25 µm. 64 Un idades arbitrarias de fluorescencia de TioT 180 160 alfa-Sinucleina alfa-Sinucleina + Aminocromo 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 0 20 40 60 80 100 120 Tiempo (Horas) Figura 16. Determinación de la cinética de fibrilación de α-sinucleína en presencia y ausencia de aminocromo. Aumento en la fluorescencia de tioflavina T a 480 nm de longitud de onda que representa la formación de fibras tipo amiloide, a medida que aumenta el tiempo de incubación de α-sinucleína en dos condiciones diferentes. La curva con puntos negros muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína sola y la curva roja muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína junto a aminocromo. Cada curva fue realizada incluyendo los datos de tres incubaciones separadas para cada condición. 65 alfa-sinucleina sola B 2 2 0 0 elipticidad (mgrados) Elipticidad (mgrados) A -2 -4 24Hrs 48 Hrs 72 Hrs -6 -2 -4 24 Hrs 48 Hrs 72 Hrs -6 -8 -8 190 200 210 220 230 240 Longitud de onda (nm) 250 260 270 190 200 210 220 230 240 250 260 270 Longitud de onda (nm) Figura 17. Determinación de la estructura secundaria de α-sinucleína en presencia y ausencia de aminocromo. Cada gráfico muestra los espectros obtenidos por dicroísmo circular de la α-sinucleína incubada por 24, 48 y 72 hrs en presencia o ausencia de aminocromo. (A) Espectros de dicroísmo circular de α-sinucleína sola incubada por 24 hrs (curva negra), 48 hrs (curva roja) y 72 hrs (curva verde). (B) Espectros de dicroísmo circular de α-sinucleína incubada con aminocromo por 24 hrs (curva negra), 48 hrs (curva roja) y 72 hrs (curva verde). 66 A B C D Figura 18. Inhibición de fibrilación e inducción de oligómeros de α-sinucleína por aminocromo. (A) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de α-sinucleína sola luego de 48 hrs de incubación con agitación. La flecha blanca indica la gran estructura oscura, compuesta de fibras agregadas en forma densa. (B) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 18 A Las flechas negras induzcan algunas fibras individuales de las que esta formada la estructura de la figura 18 A. (C) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de αsinucleína con aminocromo, luego de 48 hrs de incubación con agitación. Las flechas blancas indican estructuras similares a las observadas en la incubación de α-sinucleína sola, pero de mucho menor tamaño. (D) Ampliación de una fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de αsinucleína con aminocromo luego de 48 hrs de incubación con agitación. Las flechas negras indican pequeñas estructuras globulares de entre 15-25 nm de diámetro y que no se observaron en la incubación de α-sinucleína sola. Las barras inferiores representan 0,57 µmetros. 67 A B Gel separador kDa ** 190 Límite gel concentrador 120 85 60 40 25 15 1 1 2 C 2 D Gel separador kDa * Límite gel concentrador 190 120 85 60 40 25 15 1 2 1 2 Figura 19. Determinación de la agregación α-sinucleína a polímeros de bajo peso molecular por aminocromo. (A) Western blot incubado con anticuerpos específicos para α/β-sinucleína de la incubación por 48 hrs con agitación constante de α-sinucleína en ausencia y presencia de aminocromo. La flecha y línea discontinua marcan el límite entre el gel concentrador y separador. La flecha continua indica presencia de estructuras α-sinucleína positivas, de alto peso molecular que no pudieron entrar al gel separador. La flecha blanca indica un precipitado α/βsinucleína positivo en el bolsillo de carga. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos diferentes, de las condiciones mostradas en la figura 16 A. (C) Western blot incubado con anticuerpos específicos para α/β-sinucleína de la incubación por 102 hrs con agitación constante de α-sinucleína en presencia o ausencia de aminocromo. La flecha y línea discontinua marcan el límite entre el gel concentrador y separador. La flecha continua indica presencia de estructuras α-sinucleína de alto peso molecular que no entraron en el gel separador. La flecha blanca indica un precipitado α/β-sinucleína positivo en el bolsillo de carga. (D) Gráfico que muestra la cuantificación de los pixeles totales de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos diferentes, de las condiciones mostradas en la figura 16 C. La medición de los pixeles totales fue realizado con el programa Scion Image. * = p< 0,05; ** = p< 0,01. Test Student. 68 Objetivo 4. Comprobar por estudios in vitro, que la reducción de aminocromo con un electrón aumenta la capacidad del aminocromo de inducir la agregación de α-sinucleína. Efecto de la reducción de aminocromo con un electrón en la agregación de α-sinucleína El cuarto objetivo de esta tesis fue determinar si la reducción de aminocromo con un electrón, lo que conlleva a la aparición del radical leucoaminocromo-o-semiquinona (Baez et al., 1995; Segura-Aguilar et al., 1998), aumenta la capacidad del aminocromo de inducir la agregación de αsinucleína. Para reducir el aminocromo con un electrón, se usó la enzima NADH citocromo C reductasa en presencia de NADH. Hasta el momento, la reducción de aminocromo con un electrón solo se ha realizado incubando dopamina con un catalizador de la oxidación junto a una flavoenzima reductasa y NADH o NADPH, por lo tanto, nosotros aplicamos este modelo al ensayo de agregación de α-sinucleína. Se incubó 10 µM de α-sinucleína, 100 µM de dopamina, 10 ng/ml de tirosinasa en presencia o ausencia de 250 µM NADH y 50 µg/ml de citocromo C reductasa en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 por 4 hrs a 37 ºC sin agitación. En la figura 20 pudimos observar la aparición agregados de αsinucleína de entre 40-200 KD inducidos por dopamina al oxidarse con tirosinasa (carril 2), sin embargo, contrario a lo que se pensaba la presencia de citocromo C reductasa previno la agregación de α-sinucleína (carril 3). El carril 5 muestra el efecto que ejerció la incubación de 25 ng/ml de SOD y 25 ng/ml de catalasa junto a α-sinucleína, dopamina, tirosinasa, NADH y citocromo C reductasa. Se observó la misma disminución en la agregación de α-sinucleína (comparar carriles 3 y 5). Es interesante observar que la presencia de SOD y catalasa aumentó la agregación de α-sinucleína que indujo la dopamina al oxidarse (comparar carriles 2 y 4), pero la incubación de α-sinucleína con SOD y catalasa en ausencia de dopamina y tirosinasa no indujo agregación (comparar carriles 4 y 8). 69 El siguiente paso fue determinar si la reducción del aminocromo con un electrón inhibe la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo, al igual que lo observado en la incubación de dopamina y tirosinasa. Se incubó 10 µM de α-sinucleína, 10 µM aminocromo en presencia o ausencia de 250 µM NADH y 50 µg/ml de citocromo C reductasa en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 por 4 hrs a 37 ºC sin agitación. Los resultados de cada incubación se muestran en la figura 21. Al igual que lo ocurrido en la incubación de α-sinucleína con dopamina y tirosinasa, la citocromo C reductasa inhibió la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo puro (carriles 2 y 3). Luego, 25 ng/ml de SOD y 25 ng/ml de catalasa no fueron capaces de revertir el efecto de la citocromo C reductasa sobre la agregación de α-sinucleína (carril 5 al compararlo con carril 3), confirmando lo observado con dopamina y tirosinasa en la figura 20. Finalmente, también se observó que la adición de SOD y catalasa al medio con α-sinucleína y aminocromo, aumentó significativamente la agregación de αsinucleína. A continuación se quiso determinar el efecto que tiene la citocromo C reductasa sobre la inhibición en la formación de fibras de α-sinucleína inducida por aminocromo por aminocromo. Para esto, se incubó 100 µM de α-sinucleína y 100 µM de Aminocromo en presencia o ausencia de 500 µM de NADH y 10 µg/ml de citocromo C reductasa en 20 mM MES pH 6; 100 µM NaCl por 4 días a 37 ºC con agitación a 200 rpm. La figura 22, nos muestra el aumento en la fluorescencia de TioT medido a 480 nm de λ versus tiempo de incubación en horas. Tal como se vio anteriormente, el aminocromo aumenta el tiempo medio de fibrilación de la α-sinucleína sola de 25,3 ± 1,6 hrs a 37 ± 4,3 hrs La citocromo C reductasa no logra revertir este efecto del aminocromo, con un tiempo medio de 33 ± 4,4 hrs y una cinética muy parecida a la observada para α-sinucleína con aminocromo. La figura 23 A, B y C muestran el cambió de estructura secundaria determinada por la técnica de dicroísmo circular a distintos tiempos: (A) 24 hrs; (B) 48 hrs y (C) 72 hrs. Las condiciones evaluadas a estos tres tiempos fueron: (i) espectro negro, 100 µM de α-sinucleína sola; (ii) Espectro rojo, 100 µM de α70 sinucleína con 100 µM de aminocromo y (iii) Espectro verde,100 µM αsinucleína, 100 µM de aminocromo, 500 µM NADH y 10 µg/ml de citocromo C reductasa. Todas las condiciones incubadas en 20 mM MES pH 6,5; 100 mM NaCl a 37ºC con agitación constante a 200 rpm. A las 24 hrs ninguna condición mostró un cambio de estructura secundaria, manteniéndose las tres con configuración de ovillo al azar. Tal como se observa en la figura 23 B, a las 48 hrs la incubación de α-sinucleína sola mostró un completo cambio conformacional de ovillo al azar a sábana-β lo que disminuyó en presencia de aminocromo, sin embargo, la reducción de aminocromo con un electrón por la citocromo C reductasa inhibió casi completamente el cambio de estructura secundaria de la α-sinucleína de ovillo al azar a sábana-β, observándose un espectro similar a lo observado a las 24 hrs. Como se observa en la figura 23 C, luego de 72 hrs de incubación se observó que: (i) La α-sinucleína sola mostró un espectro típico de estructura sábana-β; (ii) la incubación de αsinucleína en presencia de aminocromo dio un espectro que indica que no hay transformación preferentemente a sabana-β, aunque se observa desaparición total de estructura ovillo al azar. (iii) la presencia de citocromo C reductasa y NADH junto a α-sinucleína y aminocromo previno en parte la desaparición de estructura de ovillo al azar y provocó una disminución en la estructura sábanaβ. Para poder observar los cambios de estructura secundaria que ocurrieron con el tiempo en la incubación de α-sinucleína, aminocromo, citocromo C reductasa y NADH, se compuso la figura 23 D. Esta figura muestra los espectros a 24 (línea negra), 48 (línea roja) y 72 hrs (línea verde), observándose que con el tiempo fue disminuyendo en parte la estructura ovillo al azar, y hubo un aumento discreto de estructura sábana-β. Los mismos medios de incubación analizados por dicroismo circular y fluorescencia con TioT fueron analizados por microscopía electrónica usando la técnica de tinción negativa. La figura 24 A corresponde a una fotografía representativa del medio de incubación de α-sinucleína con aminocromo, tomada con aumento de 33000 x. Como ya se vio anteriormente, la incubación de α-sinucleína con aminocromo generó algunas estructuras compuestas 71 exclusivamente por fibras. Estas estructuras fueron similares a las observadas en la incubación de α-sinucleína sola, pero de mucho menor tamaño (0,5-1,5 µm de diámetro) y menos densas (flechas blancas gruesas en figura 24 A). También aparecieron estructuras globulares de 15-25 nm de diámetro solo observadas por contraste con tinción negativa, tal como se observa en la figura 24 A indicada con las flechas negras y en la figura 24 B, que es una ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 24 A. La figura 24 C, muestra una fotografía representativa del medio de incubación de α-sinucleína y aminocromo en presencia de citocromo C reductasa y NADH, tomada con aumento de 33000 x. En esta incubación, aparecieron estructuras compuestas solo de fibras, similares a las observadas con α-sinucleína y aminocromo, pero de mayor tamaño (1,5-3 µm de diámetro) (flecha blanca y gruesa en figura 24 C). También se observó la presencia de las estructuras globulares de 15-25 nm solo observadas con tinción negativa, similares a las observadas en la incubación de α-sinucleína con aminocromo pero en menor cantidad, (estructuras indicadas por flechas negras en figura 24 C y en 24 D que es una ampliación de área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 24 C). 72 A 202 133 71 41,8 30,8 17,8 6,9 1 2 3 4 B 60000 6 7 8 9 ++ ++ 50000 40000 pixeles 5 ** ** 30000 20000 10000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura 20. Efecto de la citocromo C reductasa sobre la agregación de α-sinucleína inducida por la dopamina al oxidarse con tirosinasa. (A) Western blot incubado con anticuerpo anti α/β-sinucleína para la incubación por 4 hrs sin agitación de las siguientes condiciones: (1) α-sinucleína sola; (2) α-sinucleína + dopamina + tirosinasa; (3) α-sinucleína + dopamina + tirosinasa + citocromo C reductasa + NADH; (4) α-sinucleína + dopamina + tirosinasa + SOD + catalasa; (5) α-sinucleína + dopamina + tirosinasa + citocromo C reductasa + NADH + SOD + catalasa; (6) α-sinucleína + dopamina; (7) α-sinucleína + tirosinasa; (8) α-sinucleína + citocromo C reductasa + NADH; (9) α-sinucleína + SOD + catalasa. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de las bandas entre 42202 kDa de tres experimentos diferentes, de las condiciones mostradas en la figura 20 A con el programa Scion Image. ** p< 0,01 al comparar con carril 1; ++ p<0,01 . ANOVA, Test Tukey. 73 B A kDa 202 133 71 ++ ++ ++ 14000 ** 12000 10000 pixeles 41,8 30,8 8000 ** 6000 4000 17,8 * 2000 6,9 0 1 2 3 4 5 1 2 * 3 4 5 Figura 21. Efecto del citocromo C reductasa sobre la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo. (A) Western blot incubado con anticuerpo anti-α/β-sinucleína para incubaciones por 4 horas sin agitación de las siguientes condiciones: (1) α-sinucleína sola. (2) α-sinucleína + aminocromo. (3) α-sinucleína + aminocromo + NADH + citocromo C reductasa. (4) αsinucleína +aminocromo + SOD + catalasa. (5) α-sinucleína + aminocromo + NADH + citocromo C reductasa + SOD + catalasa. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos distintos de las diferentes condiciones mostradas en la figura 21 A. La cuantificación de pixeles totales fue realizado con el programa Scion Image. ** p< 0,01 al comparar con carril 1; ++ p< 0,01. ANOVA, Test de Tukey. 74 Unidades arbitrarias de fluorescencia 180 160 s in u c le in a s o la s in u c le in a + a m in o c r o m o s in u c le in a + a m in o c r o m o + r e d u c t a s a 140 120 100 80 60 40 20 0 -2 0 0 20 40 60 80 100 120 T ie m p o ( H r s . ) 22.-Efecto de la citocromo C reductasa sobre los cambios en la velocidad de fibrilación de α-sinucleína que ejerce el aminocromo, medidos por fluorescencia de tioflavina T. Aumento en la fluorescencia de TioT a 480 nm de longitud de onda que representa la formación de fibras tipo amiloide, a medida que aumenta el tiempo de incubación de α-sinucleína en tres condiciones diferentes. Los círculos negros muestran la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína sola. Los círculos blancos muestra la cinética de formación de fibras por incubación de αsinucleína con aminocromo. Los triángulos negros muestran la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y citocromo C reductasa. Cada curva se realizo considerando la cinética de tres experimentos diferentes. 75 A B 2 2 1 0 Elipticidad (mgrados) Elipticidad (mgrados) 0 -2 -4 α−sinucleina sola α-sinucleina + am inocrom o α-sinucleina+am inocrom o+cit C red. -6 -1 -2 -3 -4 α−sinucleina a-sinucleina+aminocrom o α-sinucleina+am inocrom o+ cit C red -5 -8 -6 190 200 210 220 230 240 250 260 270 190 200 210 220 230 240 250 260 270 Longitud de onda (nm ) Longitud de onda (nm) C D 2 2 0 Elipticidad (mgrados) Elipticidad (mgrados) 0 -2 -4 α-sinucleina α-sinucleina+aminocromo α-sinucleina+aminocromo+cit C red -2 -4 24 Hrs 48 Hrs 72 Hrs -6 -6 -8 190 200 210 220 230 240 Longitud de onda (nm) 250 260 270 190 200 210 220 230 240 250 260 270 Longitud de onda (nm) Figura 23. Efecto de la citocromo C reductasa en los cambios conformacionales de la α-sinucleína inducidos por el aminocromo. (A) Espectros de dicroísmo circular tomados a 24 hrs. (B) Espectros de dicroísmo circular tomados a 48 hrs. (C) Espectros de dicroísmo circular tomados a 72 hrs. Las condiciones determinadas en los espectros de dicroísmo circular fueron: α-sinucleína sola (espectro negro); α-sinucleína con aminocromo (espectro rojo); α-sinucleína y aminocromo en presencia de NADH y citocromo C reductasa (espectro verde). (D) Espectros de α-sinucleína incubada con aminocromo, NADH y citocromo C reductasa a 24 hrs (espectro negro), 48 hrs (espectro rojo), 72 hrs (espectro verde). 76 A B C D Figura 24. Determinación de la disminución de los oligómeros de α-sinucleína por la reducción de aminocromo con un electrón. (A) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de 48 hrs con agitación de α-sinucleína con aminocromo. Las flechas negras indican las estructuras oligoméricas de α-sinucleína que son ampliadas en la figura 24 B. (B) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 24 A. Las flechas negras indican las estructuras globulares de 15-25 µm de diámetro observadas solo por tinción negativa que también se señalan en la figura 24 A. (C) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación por 48 hrs con agitación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y citocromo C reductasa. La flecha blanca indica una estructura fibrilar similar a lo observado en la incubación de α-sinucleína sola y α-sinucleína con aminocromo, pero de mayor tamaño que las observadas con α-sinucleína y aminocromo y menor que las observadas con α-sinucleína sola. Las flechas negras indican estructuras globulares de α-sinucleína que son ampliadas en 24 D. (D) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 24 A. Las flechas negras indican pequeñas estructuras globulares de entre 15-25 nm de diámetro que también se señalan en la figura 24 C. Las barras al inferior de cada figura corresponden a 0,59 µmetros. 77 Objetivo 5. Demostrar por estudios in vitro, que la DT-diaforasa disminuye la agregación de α-sinucleína inducida por la reducción de aminocromo con un electrón. Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo El último objetivo de la tesis fue demostrar que la DT-diaforasa inhibe in vitro la agregación de α-sinucleína a oligómeros, que debía ser inducida por aminocromo al reducirse con un electrón. Sin embargo, nuestros resultados indicaron que la reducción de aminocromo con un electrón previene esta agregación y demostramos que el aminocromo sin reducirse, es capaz de inducir esta agregación. Por lo tanto, quisimos determinar si la DT-diaforasa es capaz de inhibir la agregación inducida por aminocromo solo in vitro. La DT-diaforasa reduce al aminocromo con dos electrones, sin embargo, no hay datos previos sobre la reducción de aminocromo puro por esta enzima. Se determinó los parámetros cinéticos de la DT-diaforasa sobre el aminocromo puro. Para esto, se determinó la cinética de desaparición de aminocromo por la DT-diaforasa. La desaparición de aminocromo fue determinado a 37 ºC y pH 7,5 por la disminución de la absorción a 478 nm de λ en una reacción que fue completamente inhibida por dicumarol. Bajo estas condiciones, se determinó que la Km fue de 95 µM y la actividad de 49 µmoles de aminocromo/min/mg de DT-diaforasa. Se determinó el efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de αsinucleína inducida por aminocromo. Para esto, se incubó 10 µM α-sinucleína con 10 µM aminocromo en presencia y ausencia de 250 µM NADH y 2,5 µg/ml DT-diaforasa, todo incubado en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 a 37 ºC por 4 hrs y sin agitación. Además, se determinó el efecto de SOD y catalasa sobre esta incubación, ya que se ha descrito que estas enzimas potencian la acción protectora de la DT-diaforasa. La figura 25 corresponde a un Western blot incubado con anticuerpo anti α/β-sinucleína y muestra en el carril 2, cómo el aminocromo indujo la agregación de α-sinucleína a estructuras de 40-200 kDa. 78 El carril 1 corresponde a la incubación de α-sinucleína sola. En el carril 3, se observa como la DT-diaforasa inhibió completamente la aparición de polímeros de α-sinucleína de 40-200 kDa inducidos por aminocromo. La figura 25 B, corresponde a la cuantificación de los polímeros de α-sinucleína de 40-200 kDa en cada condición mostrada en el Western blot de la figura 25 A, de tres experimentos hechos por separado. En esta figura se demuestra que la inhibición de la formación de los polímeros de α-sinucleína de 40-200 kDa, por la presencia de DT-diaforasa, es muy significativa. En este ensayo no se vio un aporte de las enzimas SOD y catalasa sobre la inhibición de los polímeros de 40-200 kDa de α-sinucleína (carril 4). Se quiso ver el efecto de la DT-diaforasa sobre la disminución de la fibrilación de α-sinucleína que induce el aminocromo. Para esto se incubó 100 µM de α-sinucleína y 100 µM de aminocromo en presencia o ausencia de 500 µM de NADH y 100 ng/ml de DT-diaforasa. La incubación en 20 mM MES pH 6,5; 100 µM NaCl, por 4 días a 37ºC con agitación a 200 rpm. La figura 26 muestra la cinética de fibrilación de α-sinucleína bajo las siguientes condiciones: (i) círculos negros, cinética de fibrilación de la incubación de αsinucleína sola; (ii) círculos blancos, cinética de fibrilación de la incubación de α-sinucleína con aminocromo; (iii) triángulos invertidos negros, cinética de fibrilación de la incubación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y DT-diaforasa. La formación de fibras fue determinada por aumento de la fluorescencia de TioT a 480 nm de λ. Tal como se analizó anteriormente, el aminocromo aumentó el tiempo medio de fibrilación de α-sinucleína de 25,3 ± 1,3 hrs hasta 37 ± 4,3 hrs La reducción de aminocromo por DT-diaforasa inhibió completamente la formación de fibras de α-sinucleína, observándose que no hubo aumento de fluorescencia de TioT, es decir, no hubo formación de fibras tipo amiloides. Para comprobar este efecto, se midió el cambio de conformación a través de la técnica de dicroísmo circular. La figura 27 muestra el cambió de estructura secundaria a distintos tiempos: figura 27 A, 24 hrs; 24 B, 48 hrs; y 24 C, 72 hrs para la incubación de: (i) espectro negro, 100 µM de α-sinucleína sola; (ii) espectro rojo, 100 µM de α-sinucleína con 100 µM de 79 aminocromo y (iii) espectro verde,100 µM α-sinucleína, 100 µM de aminocromo, 500 µM NADH y 100 ng/ml de citocromo C reductasa. Cada condición incubada en 20 mM MES pH 6,5; 100 mM NaCl a 37 ºC con agitación constante a 200 rpm. Al igual que lo observado anteriormente, 24 hrs de incubación con agitación no fueron suficientes para generar cambio de estructura secundaria de la α-sinucleína desde ovillo al azar, en ninguna condición. 48 hrs de incubación de α-sinucleína sola fueron suficientes para inducir el cambio de estructura desde ovillo al azar hasta sábana-β, en cambio en la incubación de α-sinucleína con aminocromo la desaparición de la estructura ovillo al azar y la aparición de estructura sábana-β es mucho menor que con α-sinucleína sola. La presencia de DT-diaforasa en la incubación por 48 hrs inhibió completamente cambio de estructura secundaria, manteniéndose toda la α-sinucleína con conformación de ovillo al azar. Luego de 72 hrs de incubación, la incubación de α-sinucleína sola mostró un espectro típico de estructura preferentemente sábana-β y La incubación de α-sinucleína y aminocromo mostró un espectro que indicó la desaparición de proteína con estructura de ovillo al azar, aunque no un cambio completo a estructura sábana-β. La incubación de α-sinucleína junto a aminocromo, NADH, y DTdiaforasa por 72 hrs aún no muestran ningún cambio en la estructura secundaria, manteniéndose en forma de ovillo al azar. Para observar esto con mejor detalle se compuso la figura 27 D, donde se incluyeron los espectros generados por dicroismo circular de la α-sinucleína en presencia de aminocromo, NADH y DT-diaforasa por 24 hrs (línea negra), por 48 hrs (línea roja) y 72 hrs (línea verde). Al comparar los tres espectros, vemos que no hay diferencias entre ellos con un espectro típico de ovillo al azar, es decir, la αsinucleína en forma monomérica. Finalmente, se quiso observar el efecto de la DT-diaforasa y NADH en las estructuras poliméricas que se inducen por incubación de α-sinucleína junto a aminocromo. Se tomó una alícuota de las incubaciones por 48 hrs de αsinucleína con aminocromo y α-sinucleína, aminocromo, NADH y DT-diaforasa, usadas para el estudio por dicroismo circular y TioT. Con estas se incubó una 80 grilla con una membrana de Formvar, que luego se tiño con acetato de uranilo. Finalmente estas grillas fueron observadas por microscopía electrónica. La observación de estas grillas nos evidenció que la presencia de DT-diaforasa y NADH en la incubación de α-sinucleína y aminocromo inhibió completamente la aparición de estructuras fibrilares y casi completamente la aparición de las estructuras globulares 15-25 µm de diámetro no electrónicamente densas. La figura 28 muestra fotografías representativas que confirman este hecho. En la figura 28 A, se muestra una fotografía tomada con un aumento de 33000 x, donde se observan las estructuras globulares de 15-25 µm de diámetro no electrónicamente densas (flechas negras), las cuales están distribuidas homogéneamente y en las grillas observadas para la incubación de αsinucleína y aminocromo. La figura 28 B es una ampliación de la figura 28 A, donde se aprecian con más claridad estas estructuras, donde se indican con flechas las mismas estructuras señaladas en la figura 28 A. La figura 28 C es una fotografía de una membrana de Formvar incubada con una alícuota de la incubación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y DT-diaforasa. En esta, se observa una membrana bastante limpia, sin estructuras fibrilares ni globulares lo que se confirma al ampliar la fotografía en la figura 28 D y observar que las marcas observadas en la figura 28 C y marcadas con flechas punteadas, solo corresponden a estructuras amorfas no relacionadas a estructuras observadas previamente para polímeros de α-sinucleína. 81 A B kDa ** 12000 202 10000 71 Pixeles 8000 40,4 31,3 6000 4000 17,8 2000 6,9 0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Figura 25. Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo. (A) Western blot incubado con anticuerpo anti-α/β-sinucleína para incubaciones por 4 horas sin agitación de: (1) α-sinucleína sola; (2) α-sinucleína + aminocromo; (3) α-sinucleína + aminocromo + NADH + DT-diaforasa; (4) sinucleína + NADH + DTdiaforasa + SOD + catalasa; (5) α-sinucleína + SOD + catalasa. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos distintos de las distintas condiciones mostradas en la figura 25 A. La cuantificación de pixeles totales fue realizado con el programa Scion Image. (** = p< 0,01. ANOVA; Test Tukey-Kramer) 82 Unidades Arbitrarias de fluorescencia 180 160 α−sinucleina sola α−sinucleina + aminocromo α−sinucleina + aminocromo + DT-diaforasasa 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 0 20 40 60 80 100 120 Tiempo (Hrs) Figura 26. Efecto de la DT-diaforasa sobre los cambios en la velocidad de fibrilación de α-sinucleína que ejerce el aminocromo, medidos por fluorescencia de tioflavina T. Aumento en la fluorescencia de TioT a 480 nm de longitud de onda que representa la formación de fibras tipo amiloide, a medida que aumenta el tiempo de incubación de αsinucleína en tres condiciones diferentes. La curva negra muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína sola. La curva roja muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína junto aminocromo. La curva verde muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína con aminocromo, en presencia de NADH y DT-diaforasa. Cada curva se realizo considerando la cinética de tres experimentos diferentes. 83 B 2 2 0 0 Elipticidad (mgrados) Elipticidad (mgrados) A -2 -4 α-sinucleina sola α-sinucleina+am inocrom o α-sinucleina+am inocrom o+DT-diaforasa -6 -8 -2 -4 α -s in uc le in a α -s in uc le in a + am in oc rom o α -s in uc le in a + a m in o cro m o + D T -d ia fora s a -6 -8 -10 190 200 210 220 230 240 250 260 -10 270 190 20 0 21 0 Longitud de onda (nm) 22 0 23 0 2 40 2 50 26 0 27 0 L o n g itu d d e o n d a (n m ) D C 2 2 0 Elipticidad (mgrados) Elipticidad (mgrados) 0 -2 -4 α-sinucleina sola α-sinucleina + am inocrom o α-sinucleina+aminocrom o+DT-diaforasa -6 -2 -4 -6 24 hrs 48 hrs 72 hrs -8 -10 -8 190 200 210 220 230 240 Longitud de onda (nm) 250 260 270 190 200 210 220 230 240 250 260 270 Longitud de onda (nm) Figura 27. Efecto de la DT-diaforasa en los cambios conformacionales de la α-sinucleína inducidos por el aminocromo. (A) Espectros de dicroismo circular tomados a 24 hrs. (B) Espectros de dicroismo circular tomados a 48 hrs. (C) Espectros de dicroismo circular tomados a 72 hrs. Las condiciones determinadas en los espectros (A)-(C) de dicroísmo circular fueron: α-sinucleína sola (espectro negro); α-sinucleína con aminocromo (espectro rojo); α-sinucleína y aminocromo en presencia de NADH y DT-diaforasa (espectro verde). (D) Espectros de α-sinucleína incubada con aminocromo, NADH y DT-diaforasa a 24 horas (espectro negro), 48 horas (espectro rojo), 72 horas (espectro verde). 84 A B C D Figura 28. Determinación de oligómeros de α-sinucleína en la incubación de αsinucleína con aminocromo al reducirse por la DT-diaforasa. (A) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de 48 hrs con agitación de α-sinucleína con aminocromo. Las flechas negras indican las estructuras oligoméricas de α-sinucleína que son ampliadas en la figura 28 B. (B) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 28 A. Las flechas negras indican las estructuras globulares de 15-25 µm de diámetro observadas solo por tinción negativa también indicadas en la figura 28 A. (C) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación por 48 horas con agitación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y DTdiaforasa. Las flechas negras indican marcas electrónicamente densas y pequeñas que son ampliadas en 28 D. D) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 28C. Las flechas negras indican marcas electrónicamente densas, amorfas y que no corresponden a ningún tipo de estructura descrita anteriormente para αsinucleína. Las barras inferiores corresponden a 0,59 µmetros. 85 DISCUSIÓN Expresión y purificación de α-sinucleína recombinante humana El primer objetivo de esta tesis fue la obtención de α-sinucleína humana recombinante, en forma monomérica y pura. Sin embargo, muchos son los factores que pueden inducir la agregación de esta proteína y la concentración es uno de ellos (Hashimoto et al., 1998). En este respecto, se definió un protocolo de expresión y purificación de α-sinucleína recombinante que siguió ciertas consideraciones para evitar la agregación de esta proteína, tanto dentro de la bacteria como al momento de extraerla: (i) Se uso la bacteria de expresión BL21(DE3)pLys S, la cual es una bacteria que mantuvo una expresión baja de α-sinucleína; (ii) se comenzó con una baja inducción de la expresión con sólo 0,5 mM IPTG por 3 hrs a 30 ºC (Sambrook, Fritsch y Maniatis, ed. 1989; Manual técnico pET system); (iii) Al ser una proteína que en forma monomérica y libre en el citoplasma tiene conformación de ovillo al azar, no requiere de un mayor cuidado al momento de su extracción, sin embargo, la presencia de detergentes o solventes orgánicos es otro factor que induce la agregación de α-sinucleína (Munishkina et al., 2003; Necula et al., 2003), así que se probó la extracción de proteínas por sonicación y por la técnica de descongelado/congelado en nitrógeno líquido. Se probó la inducción de la expresión de α-sinucleína con distintas concentraciones de IPTG, observando que bajo concentraciones de 0,5 mM de IPTG disminuyó mucho la expresión de la α-sinucleína. Por otro lado, concentraciones mayores a 0,5 mM de IPTG no mostraron diferencias en los niveles de expresión de la proteína, probablemente debido al plasmidio pLysS que mantiene una baja expresión de la proteína de interés. En relación a la purificación de la α-sinucleína, se probó la lisis bacteriana por sonicación y congelado/descongelado. Entre estas técnicas no se observó ninguna diferencia en la cantidad de α-sinucleína obtenida, sin embargo, la técnica de sonicación nos generó una gran contaminación con oligonucleótidos que disminuyó notoriamente con la técnica de congelado/descongelado. 86 Tal como se observa en la figura 4, el protocolo (figura 3) no logró una purificación adecuada de la α-sinucleína. Por esto, se modificó este protocolo adicionándole una etapa de hervido del extracto total de la bacteria, tal como se observa en el esquema de la figura 5. Luego del hervido del extracto bacteriano, se eliminó la mayor parte de la proteína contaminante, pero como se observa en la tabla de la figura 6 B, aún hay presencia de oligonucleótidos. Estos fueron determinados por absorción a 260 nm, observando la razón 260/280 nm de λ. Solo después de pasar la muestra a través de la resina de intercambio aniónico DEAE-Sephadex A-50-120, se observó una razón menor a 1 (0,78), es decir, disminución de la absorción a 260 nm lo que indicó disminución en la presencia de oligonucleótidos. La pureza de la α-sinucleína fue demostrada por geles SDS-PAGE teñidos con azul de coomasie y por tinción de plata. La muestra también fue reconocida por anticuerpo anti-α-sinucleína. Hay varias técnicas descritas para purificación de α-sinucleína donde no se hierven las muestras, pero se requiere un equipo HPLC y columnas especiales de intercambio iónico. En cambio, nuestra técnica no requirió el uso de equipo cromatográfico y tiene ventajas por su simpleza. Este protocolo de purificación, logró una concentración de α-sinucleína de 60-80 µM, sin embargo se puede aumentar la concentración con modificaciones en el protocolo descrito. Se probaron varias modificaciones al protocolo definido, siguiendo sugerencias del Dr. Claudio Fernández (IBR, Rosario, Argentina). Se aumentó el tiempo de incubación con IPTG a 16 hrs a 37 ºC, aumentando el rendimiento del método sin observar presencia de polímeros de α-sinucleína en los extractos celulares. El laboratorio del Dr. Claudio Fernández usa bacterias de alta expresión sin observar polimerización de α-sinucleína. Por lo anterior, es recomendable, para aumentar la expresión de la α-sinucleína, el uso de bacterias sin plasmidios que reduzcan expresión, como la BL21(DE3). Finalmente, se puede aumentar la concentración complementando la purificación con una diálisis, tal como se describe en Hoyer et al. (2002). 87 Síntesis y purificación de aminocromo. A la fecha ya han aparecido 5 trabajos que demuestran que un derivado de la oxidación de la dopamina induce agregación de α-sinucleína, estabilizando la estructura oligomérica y desestabilizando la estructura fibrilar (Conway et al., 2001; Li et al, 2004; Cappai et al., 2005; Norris et al., 2005; Follmer et al., 2007). En casi todos estos trabajos se asume que este derivado de la oxidación de la dopamina es el aminocromo, debido a que el aminocromo es el último metabolito de la cascada de reacciones que sufre la oxidación de la dopamina. Los ensayos que muestra Norris et al. (2005) se realizaron en un medio rico en aminocromo, determinado cromatográficamente, pero sin eliminar los excedentes de dopamina ni del agente oxidante que el usó. Para comprobar que el aminocromo induce la agregación de α-sinucleína y determinar el efecto de la reducción del aminocromo con uno o dos electrones sobre la esta agregación, fue clave la obtención de aminocromo puro. A la fecha no existen protocolos descritos para la obtención de aminocromo puro, debido a su inestabilidad, rápida polimerización a melanina (Solano et al., 2000), y a lo difícil que resulta separar el aminocromo de la dopamina y de otros derivados de la oxidación de la dopamina y catalizadores de la oxidación de la dopamina. En esta tesis pudimos establecer un método sencillo y rápido para obtener aminocromo puro y estable. El primer paso fue estabilizar el aminocromo, es decir, evitar que polimerizara a melanina. Para lo anterior, se probó la oxidación de dopamina catalizada por tirosinasa a distintos pH, y se observó que entre pH 5,0 y pH 7,0 hubo una aparición de aminocromo con solo 10 min de incubación de dopamina con tirosinasa a temperatura ambiente, sin embargo, a pH 7,0 este aminocromo polimerizó a melanina luego de 1 hr de incubación a 4 ºC. En cambio a pH 6,0 se mantuvo sin polimerizar al menos por 4 hrs a 4 ºC. Estos estudios fueron hechos con aminocromo en presencia de tirosinasa, dopamina no oxidada y posiblemente otros derivados de la oxidación de la dopamina que no se determinaron. Sin embargo, luego de haber purificado aminocromo se determinó su estabilidad por sobre 6 hrs a 4 ºC y por sobre 3 hrs a 25 ºC lo que sugirió que la incubación de aminocromo puro es mas estable que en presencia 88 de dopamina, tirosinasa y otros posibles metabolitos de la oxidación de la dopamina. Luego de oxidar aminocromo con tirosinasa a pH 6,0, se quiso separar el aminocromo. Por la diferencia de los tamaños entre aminocromo, tirosinasa y melanina, se intento la separación a través de resina de exclusión por tamaño Sephadex G-25-80. Tal como se pensó, se logró una buena separación entre estas especies, pero mas aún, se logró una marcada separación entre el aminocromo y la dopamina, los cuales tienen pesos moleculares similares. Esta separación se confirmó por espectroscopia UV-visible. Tal como se observa en la figura 9 B, los espectros de aminocromo y dopamina son muy diferentes y se puede determinar claramente la presencia de dopamina en una solución de aminocromo, así el espectro mostrado en la figura 9 A nos evidenció la obtención de un eluido con aminocromo en ausencia de dopamina. En esta tesis pudimos determinar entonces el espectro de absorción de aminocromo puro, el cual consta de tres picos: a 220nm, a 295nm y 478 nm de λ, lo que recientemente fue confirmado por otro autor (Bisaglia et al., 2007). La purificación de aminocromo se comprobó por 1 H-NMR, técnica que nos demostró que se pudo separar el aminocromo de dopamina, tirosinasa, melanina y cualquier otro derivado de la oxidación de dopamina. La separación lograda entre aminocromo y dopamina por resina de exclusión por tamaño fue completamente inesperada. La diferencia en los pesos moleculares de estas moléculas es de 3 gr/mol, esto es, la dopamina tiene 3 átomos de hidrógeno más que el aminocromo. Esta diferencia en masa no puede explicar la diferencia en la migración a través de la resina. Una explicación de este hecho, es que a pH 6,0 el aminocromo y la dopamina tengan diferencias en sus propiedades iónicas y que el aminocromo adquiera una esfera de hidratación que aumente su tamaño, incluso por sobre el tamaño de pigmento de melanina. Esto, debido a que tal como se observa en la figura 8 A, el aminocromo migró antes que el pigmento de melanina. El hecho de que a pH 7,5 cambie la migración de la dopamina por una resina de exclusión por tamaño, nos confirma el hecho de que las propiedades iónicas de estas moléculas están afectando su migración y por lo tanto su tamaño. 89 Debido a las diferentes propiedades polares entre el aminocromo y dopamina, se supuso que una resina de intercambio iónico podría mejorar la separación entre estas moléculas a pH 6,0. Esto se confirmó al realizar la separación en una resina de intercambio catiónico CM-Sephadex C-50-120. De hecho, el aminocromo sufrió cierto retardo al pasar por esta resina indicando la existencia de una interacción muy débil, pero la dopamina quedó completamente retenida en la columna y no migró hasta que se aumentó la fuerza iónica de la fase móvil con la adición de 300 mM de NaCl. La purificación de aminocromo con una columna de 23 x 0,7 cm llena de resina Sephadex G-25-80, nos permitió la obtención de hasta 1 ml de aminocromo de 80 µM, en una separación que tomó cerca de 2 hrs. La purificación de aminocromo en columnas con 5 ml de resina CM-Sephadex C50-120, logró mas de 3 ml de aminocromo de 250 µM de concentración en no mas de 30 min. La concentración siempre fue determinada espectroscópicamente usando el valor de 3058 M-1 cm-1 como coeficiente de extinción molar a 478 nm de λ (Segura-Aguilar et al., 1989). Inducción de agregación de α-sinucleína por aminocromo. En el año 2001, Lansbury y colaboradores (Conway et al., 2001) publicaron que la dopamina, al oxidarse induce la agregación de α-sinucleína en estructuras protofibrilares y de esta manera previene la estructura fibrilar. A pesar de tratarse solo de estudios in vitro, esta publicación despertó un gran interés científico ya que se relacionó la oxidación de dopamina con la formación de protofibras de α-sinucleína. Varios autores han corroborado lo observado por Lansbury y colaboradores y han sugerido que es el aminocromo el responsable (Li et al., 2004; Cappai et al., 2005; Norris et al., 2005; Follmer et al., 2007; Bisaglia et al., 2007). Sin embargo, aún nadie ha logrado demostrar que fue el aminocromo el responsable, ya que estos experimentos se realizaron con dopamina sola ó dopamina en presencia de un oxidante. Para terminar con esa incertidumbre, nosotros quisimos comprobar por estudios in vitro, que el aminocromo es capaz de inducir agregación de una manera similar a lo observado con dopamina al oxidarse. Como control positivo, se indujo 90 agregación de α-sinucleína con dopamina en presencia de tirosinasa como catalizador de la oxidación de dopamina y se determinó agregación por Western blot. Se observó que en presencia de dopamina y tirosinasa, hubo desaparición del monómero de α-sinucleína y aparición de polímeros α-sinucleína positivos. Solo 4 hrs de incubación a 37 ºC y sin agitación fueron suficientes para inducir agregación de α-sinucleína, de manera muy similar a lo visto por Cappai et al. (2005) aunque ellos incubaron con agitación. También pudimos observar la aparición de una señal de alto peso molecular, reconocida específicamente con anticuerpo anti-α-sinucleína. Esta señal apareció sobre el límite entre el gel separador y el concentrador, indicando un polímero de α-sinucleína que fue capaz de entrar en el gel concentrador al 5 %, pero no fue capaz de entrar al gel separador al 10 %. Previamente se han descrito estructuras poliméricas de α-sinucleína llamadas oligómeros de α-sinucleína, las cuales están compuestos por 25 unidades de α-sinucleína (≅ 450 kDa) (Norris et al., 2005). Posiblemente, estas señales en el gel concentrador puedan indicar la presencia de este tipo de estructuras. Una vez determinadas las condiciones experimentales para ver agregación de α-sinucleína inducida por dopamina al oxidarse, realizamos el experimento con aminocromo purificado. Tal como se observó en la figura 11, el aminocromo purificado indujo la agregación de α-sinucleína a polímeros de entre 40-200 kDa, al igual que lo observado con dopamina y tirosinasa y tal como lo describió Cappai et al. (2005). A diferencia de lo observado a la fecha, la agregación de α-sinucleína a las 4 hrs solo requirió de 10 µM de aminocromo (una concentración 10-20 veces menor) y en una incubación sin agitación. Lo anterior demuestra la gran capacidad del aminocromo para inducir agregación de α-sinucleína. Para poder identificar el tipo de estructura poliméricas de αsinucleína que induce la incubación con aminocromo, se incubó α-sinucleína con aminocromo por 5 días a 37 ºC sin agitación y se realizaron observaciones con microscopio electrónico. El aminocromo indujo la aparición de 2 tipos de estructuras, la primera electrónicamente densa, amorfa, de 50-100 nm o en cuerpos de sobre 1 µm de diámetro. Estas estructuras nunca se han descrito 91 para polímeros de α-sinucleína, principalmente porque los polímeros de αsinucleína no forma estructuras electrónicamente densas, por lo que solo pueden ser apreciadas por tinción negativa. Estas estructuras también fueron observadas por nosotros al incubar por 5 días 100 µM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa sin α-sinucleína. Lo anterior nos dio evidencia de que estas estructuras no corresponden a polímeros de α-sinucleína, sino posiblemente a melanina. Un segundo tipo de estructuras correspondió a estructuras globulares, que solo se observaron por contraste con tinción negativa y de 1525 nm de diámetro. Estas estructuras fueron muy similares a los oligómeros de α-sinucleína descritos por Lee y Lee (2002) y los oligómeros estabilizados de αsinucleína inducidos por dopamina, descritos por Norris (Norris et al., 2005). Por otro lado, estas estructuras fueron de un tamaño menor que lo descrito recientemente por Follmer et al. (2007). Sin embargo, los oligómeros que observó Follmer aparecieron luego de la incubación de 50 µM de α-sinucleína con 50 µM de dopamina por 2-3 días con agitación. Además, los oligómeros observados por Follmer se desarmaron en presencia de alta presión a oligómeros de un tamaño similar a lo que nosotros observamos. Tal como demostró Lee y Lee (2002), estos oligómeros pequeños son de rápida aparición y no son dependientes de aminocromo, ya que se han visto en cultivos celulares incubados con rotenona y en incubaciones de α-sinucleína mutante A30P, aunque estos últimos de un tamaño algo menor (Conway et al., 2000a). Otro aspecto interesante de estos oligómeros es su gran estabilidad, lo que sugiere que son polímeros unidos por enlace covalente tal como sugiere Follmer et al. (2007). Las estructuras que fueron inducidas por aminocromo encajan con todos estos antecedentes, ya que son estructuras globulares de 15-25 µm de diámetro vistos por tinción negativa. Los polímeros de 40-200 kDa que posiblemente son los precursores de los oligómeros, demostraron ser muy estables ya que no desaparecen en condiciones desnaturantes de un SDSPAGE. Como se ha sugerido ampliamente, estos oligómeros pueden agregarse entre sí con uniones débiles para formar estructuras mayores de distintas formas (anillos, glóbulos o fibras gruesas y cortas) que fueron descritas como 92 protofibras (Conway et al., 2000a; Conway et al., 2000b; Cole et al., 2005; Lee and Lee, 2002; Ding et al., 2002; Follmer et al., 2007). Se ha descrito que dopamina al oxidarse no solo induce la agregación de α-sinucleína en oligómeros, sino que inhibe la formación de fibras (Conway et al., 2001). Incluso se ha descrito que la dopamina al oxidarse es capaz de desarmar las fibras apareciendo oligómeros de α-sinucleína (Lee y Lee, 2002). Para demostrar que esto es cierto para el aminocromo, se incubó 100 µM de αsinucleína incubada a pH 6,5 y 100 mM de NaCl, por hasta 5 días con agitación constante a 37 ºC, en presencia y ausencia de aminocromo purificado. Luego a esta incubación realizamos los ensayos de: (i) fluorescencia de Tioflavina T, que determina estructura fibrilar tipo amiloide; (ii) dicroísmo circular, que determina estructura sabana-β características de fibras de α-sinucleína; (iii) microscopía electrónica, para observar la forma de las estructuras poliméricas generadas. Todos estos ensayos nos confirmaron que el aminocromo inhibió la formación de fibras y que la agregación a oligómeros estabilizados no conlleva el cambio de conformación a sabana-β, aunque si hay una desaparición de la conformación de estructura de ovillo al azar, mecanismo ya observado previamente (Li et al., 2004; Cappai et al., 2005; Norris et al., 2005). Sin embargo, pudimos observar que a las 72 hrs de incubación de 100 µM de αsinucleína con 100 µM de aminocromo, hay aparición de estructura fibrilar con un tiempo medio de fibrilación de casi 40 hrs, aunque es escasa. Esto a diferencia de resultados previos donde incluso luego de 6 días de incubación de 14 µM de α-sinucleína con 200 µM de dopamina aún no aparecieron fibras (Cappai et al., 2005) ó la observación de que la incubación de 50 µM de αsinucleína con 50 µM de dopamina indujo la generación de fibras solo luego de 18 días de incubación (Follmer et al., 2007). En este último caso, hay que tener presente que bajo sus condiciones de trabajo, ellos solo logran la fibrilación de α-sinucleína luego de 6-7 días de incubación de α-sinucleína incubada sola. En comparación, nosotros observamos la fibrilación a las 30 hrs de incubación de α-sinucleína sola, con un tiempo medio de fibrilación de 25,6 ±1,3 hrs. Probablemente al considerar estas diferencias experimentales, podríamos decir 93 que nuestros resultados fueron consecuentes con los de Follmer et al. En el caso del grupo de Cappai, ellos no observaron presencia de fibras en la incubación de α-sinucleína con dopamina. Sin embargo, este grupo incubó αsinucleína con dopamina 14 veces mas concentrada que en nuestras condiciones, donde se incubó α-sinucleína con aminocromo en una relación 1:1. Otro aspecto que hay que destacar, es que en nuestro caso se uso aminocromo puro, el cual comienza a polimerizar a melanina luego de 2 hrs a pH 7,5, en cambio la dopamina genera aminocromo mientras se oxida y por lo tanto, por un lapso de tiempo mucho mayor. En conclusión, el grupo de Cappai mantuvo una mayor presencia de aminocromo que en nuestro caso. En nuestro caso la α-sinucleína fue expuesta al aminocromo puro al comienzo de la incubación, lo que fue suficiente para desencadenar un mecanismo de nucleación que generó los oligómeros observados. Después de algunas horas, la α-sinucleína que no interactuó con aminocromo pudo polimerizar a fibras. Interesantemente, los oligómeros de α-sinucleína observados por incubación de 100 µM de α-sinucleína con 100 µM de aminocromo por 5 días con agitación, fueron iguales a los observados por incubación de 30 µM de αsinucleína con solo 10 µM de aminocromo por 5 días sin agitación. Esto significa que la formación de estas estructuras es muy eficiente y solo basta una baja concentración de aminocromo para formarse. Cuando se compara la formación de estas estructuras globulares con la fibrilación de α-sinucleína, es evidente la diferencia en la eficiencia con que se forman ambas estructuras. Para formar fibras no basta la sola presencia de α-sinucleína, sino que hay que agitar por 2 días a 37ºC, por otro lado, las estructuras globulares necesitan una concentración mucho menor de α-sinucleína y no se necesita forzar el sistema para que estas se formen. Otro aspecto interesante para estas estructuras es su estabilidad, ni siquiera las condiciones extremas de alta concentración de αsinucleína con agitación constante a 200 rpm pudieron impedir su formación. Esto confirmó lo sugerido previamente (Li et al., 2004; Cappai et al., 2005; Norris et al., 2005; Follmer et al., 2007), de que la incubación de aminocromo 94 con α-sinucleína indujo la agregación de la α-sinucleína en estructuras estables que no forman fibras. La observación microscópica de oligómeros en la figura 18 se realizó a las 48 horas de incubación, sin embargo, el máximo en cantidad de fibras tipo amiloide detectada por fluorescencia de la incubación de α-sinucleína con aminocromo ocurrió sobre las 70 hrs. Existe la posibilidad de que estos oligómeros fueran estructuras precursoras de las fibras y no estructuras alternativas a ellas. Para responder a esta pregunta se determinó la diferencia en la polimerización de α-sinucleína al incubarla sola o en presencia de 100 µM de aminocromo por 48 y 102 hrs a 37º C con agitación constante de 200 rpm. La diferencia de polimerización se observa claramente en los Western blot de la figura 19. Se observó que la incubación de α-sinucleína sola por 48 hrs., no mostró la aparición de señales entre 40-200 kDa, a pesar de que en estas condiciones se haya observado gran cantidad de fibras por microscopía. Por otro lado, la incubación de α-sinucleína con aminocromo por 48 hrs, que indujo la formación de oligómeros, mostró en el gel la aparición de estructuras de entre 40-200 kDa α-sinucleína positivos. Esto demostró que la aparición de estas estructuras de 40-200 kDa, son precursores de oligómeros y no de fibras. Luego de 102 hrs de incubación de α-sinucleína con aminocromo, aún aparece una gran señal entre 40-200 kDa, lo que nos confirma que el aminocromo induce la formación de agregados de α-sinucleína alternativos y no precursores de las fibras. En conclusión, nuestros resultados sugieren que en condiciones in vitro, el aminocromo es capaz de inducir la agregación de α-sinucleína incluso a bajas concentraciones de ambos. Tal como se describió previamente, una molécula derivada de la oxidación de la dopamina se une a la α-sinucleína entre los aminoácidos 123-129, lo que conlleva a la polimerización (Norris et al., 2005). Por lo tanto, sugerimos que este es el mecanismo del aminocromo. La primera etapa de esta agregación genera la formación polímeros de bajo número de monómeros de α-sinucleína como dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. (polímeros de 40-200 kDa). Luego por unión covalente, la formación de 95 polímeros de unas 25 unidades de α-sinucleína con una forma globular de entre 15-25 nm de diámetro, denominadas oligómeros de α-sinucleína (Norris et al., 2005). Estos oligómeros, no pueden unirse para formar fibras de α-sinucleína. La unión de estos oligómeros entre si por fuerzas intermoleculares, generarían estructuras de distintas formas, conocidas como protofibras Efecto de la reducción de aminocromo con un electrón sobre la agregación de α-sinucleína. Un mecanismo que puede explicar la toxicidad de la oxidación de la dopamina, es la reducción de aminocromo con un electrón lo cual genera una semiquinona muy reactiva llamada leucoaminocromo-o-semiquinona. Por tal motivo, se esperaba que la reducción de aminocromo con un electrón aumentaría la agregación de α-sinucleína a oligómeros, en comparación a lo observado en la incubación de α-sinucleína con aminocromo solo. Sorprendentemente, los resultados mostraron lo contrario, se observó que la citocromo C reductasa junto a NADH disminuyó el proceso de agregación de αsinucleína inducido por aminocromo. Por estudios de Western blot, observamos que la citocromo C reductasa y NADH inhibió la agregación de α-sinucleína a polímeros de 40-200 kDa que se indujo por aminocromo puro. Además, pudimos observar por microscopía electrónica que la presencia de citocromo C reductasa y NADH indujo una disminución en los oligómeros de α-sinucleína en comparación con la incubación de α-sinucleína con solo aminocromo puro. Finalmente, se pudo apreciar por dicroísmo circular una disminución en la desaparición de estructura de ovillo al azar, es decir, disminuyó la desaparición del monómero de α-sinucleína por la presencia de citocromo C reductasa y NADH. En relación a la disminución de la fibrilación de α-sinucleína inducido por aminocromo, no se obtuvieron resultados muy claros. Por un lado, la cinética de fibrilación para la incubación de α-sinucleína y aminocromo en presencia o ausencia de citocromo C reductasa y NADH fue similar, con un tiempo medio de fibrilación de 37 ± 4,3 hrs y 33 ± 4,4 hrs respectivamente. Sin embargo, por dicroismo circular se observó una menor formación de estructura sábana-β, lo 96 que significa una menor presencia de fibras, aunque esto no pudo ser corroborado por microscopía electrónica. Previamente fue descrito que las enzimas superoxido dismutasa (SOD) y catalasa aumentan la autooxidación del leucoaminocromo-o-semiquinona hasta aminocromo (Baez et al., 1995), estimulando aún mas la generación del ciclo rédox del leucoaminocromo-o-semiquinona, lo que aumentaría la presencia de radicales libres. Se quiso saber si el aumento en la posibilidad de desarrollo de este ciclo rédox afectaría la agregación de α-sinucleína. Los resultados observados en las figuras 20 y 21 muestran que la presencia de la SOD y catalasa en el medio de incubación de α-sinucleína con aminocromo o dopamina junto a tirosinasa además de citocromo C reductasa, no provocó ningún cambio apreciable en relación con la ausencia de SOD y catalasa. Esto demuestra que el ciclo rédox del leucoaminocromo-o-semiquinona, y por lo tanto, el aumento en las especies reactivas del oxígeno que se generan en este ciclo rédox, no afectó a la agregación de la α-sinucleína a polímeros de 40-200 kDa. Como se vio anteriormente, la generación de polímeros de 40-200 kDa sería un mecanismo de la generación de oligómeros estables de α-sinucleína y no de fibras, lo que nos sugiere que las especies reactivas del oxígeno derivadas del ciclo rédox del leucoaminocromo-o-semiquinona no inducen la agregación a oligómeros de α-sinucleína, aunque se ha descrito que las especies reactivas del oxígeno inducen la fibrilación de ésta (Hashimoto et al., 1999). Por otro lado, la incubación α-sinucleína y aminocromo puro en presencia de SOD y catalasa indujo una mayor agregación de α-sinucleína a polímeros de 40-200 kDa que en ausencia de estas enzimas. En la incubación de α-sinucleína con dopamina y tirosinasa se observó una tendencia a este aumento, aunque no fue significativo. Una explicación a este hecho, es que tal como se observó anteriormente la aparición de polímeros de 40-200 kDa es un evento relacionado con la formación de oligómeros de α-sinucleína y no de fibras. Como la SOD y catalasa son enzimas que disminuyen la presencia EROs, se sugiere que la presencia de SOD y catalasa en la incubación de α- 97 sinucleína con aminocromo y posiblemente de α-sinucleína con dopamina y tirosinasa, disminuye la presencia de EROs presentes en esta incubación. Estas EROs derivadas de la oxidación de la dopamina o de una reacción entre aminocromo y oxígeno del medio, causarían una agregación de α-sinucleína a fibras (Hashimoto et al., 1999), lo que no genera polímeros de 40-200 kDa de αsinucleína observados por Western blot. Por lo tanto, la presencia de SOD y catalasa inhiben la formación de fibras por EROs y dejan en el medio más αsinucleína monomérica disponible para su agregación a oligómeros estables de α-sinucleína, lo que se observa en la aparición temprana (solo 4 horas de incubación) de polímeros de 40-200 kDa de α-sinucleína. En conclusión, la presencia de citocromo C reductasa y NADH que induce la reducción de aminocromo con un electrón, disminuye la agregación de α-sinucleína a oligómeros estables de α-sinucleína. Esto se explica por la disminución del aminocromo del medio de incubación, sugiriendo que es el aminocromo la molécula que interacciona con la α-sinucleína en incubaciones in vitro. Esto le da al aminocromo un posible papel tóxico y de esta manera, la toxicidad de la oxidación de la dopamina en el citoplasma no solo estaría dado por la reducción del aminocromo con un electrón, sino que también a la presencia de aminocromo. Claramente este es un ensayo in vitro, y faltan estudios in vivo para evidenciar lo anterior. Recientemente apareció un trabajo respaldando el planteamiento del papel tóxico del aminocromo, indicando que el aminocromo es una molécula capaz de inhibir el complejo proteosomal de un lisado de reticulocito de conejo (Zafar et al., 2006). Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo El último objetivo de esta tesis fue demostrar que la DT-diaforasa inhibe la agregación de α-sinucleína inducida por el aminocromo al reducirse con un electrón en ensayos in vitro. Sin embargo, nuestros resultados demostraron que la reducción de aminocromo con un electrón disminuye la agregación de αsinucleína a oligómeros y que es el aminocromo el que induce esta agregación. 98 La DT-diaforasa es la única enzima capaz de reducir aminocromo con dos electrones logrando así disminuir la cantidad de aminocromo del medio pero sin la formación de radicales como el leucoaminocromo-o-semiquinona. La incubación de DT-diaforasa y NADH junto a α-sinucleína y aminocromo, por 4 hrs sin agitación, inhibió completamente la agregación de αsinucleína a polímeros de 40-200 kDa. En los estudios realizados con incubación de varios días con agitación, la DT-diaforasa inhibió casi completamente la aparición de oligómeros de α-sinucleína lo que se observó por microscopía electrónica e inhibió completamente el cambio de estructura de ovillo al azar por hasta 72 hrs, lo que se observó por dicroísmo circular. La inhibición por la DT-diaforasa de la agregación de α-sinucleína a oligómeros, que es inducida por aminocromo, fue de acuerdo a lo esperado por el hecho de que la DT-diaforasa disminuye la cantidad de aminocromo del medio. Esta disminución fue muy rápida, dando una actividad reductora de aminocromo de 49 µmoles de aminocromo/min/mg de DT-diaforasa. Cuando se realizó un ensayo de unión de aminocromo a α-sinucleína, se obtuvo una velocidad de unión de 0,56 nmoles de aminocromo/min/mg α-sinucleína. Lo anterior explica el porque la DT-diaforasa inhibe la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo. Por antecedentes previos (Norris et al., 2005), pensamos que la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo dependería de la unión del aminocromo a la proteína. Como la velocidad de unión α-sinucleínaaminocromo es muchas veces menor que la velocidad de reducción del aminocromo por DT-diaforasa, no ocurriría agregación de α-sinucleína a polímeros de 40-200 kDa ni a oligómeros estables porque no habría unión de αsinucleína con aminocromo. La presencia de DT-diaforasa y NADH en la incubación de α-sinucleína y aminocromo bajo las condiciones usadas en este estudio, también inhibió completamente la fibrilación de α-sinucleína. Esto fue observado por los estudios de fluorescencia de TioT, dicroismo circular y microscopía electrónica. Como el aminocromo inhibió la fibrilación de α-sinucleína, se esperaba que la DT-diaforasa mostrara fibrilación de α-sinucleína similar a lo observado con α99 sinucleína sola. Una explicación a este fenómeno es que la fibrilación de αsinucleína en las condiciones in vitro usadas por nosotros depende de la presencia de oxígeno o EROs en el medio de incubación. Esta explicación es muy coherente ya que tal como describió Hashimoto et al. (1999), la presencia de especies reactivas del oxígeno inducen la fibrilación de α-sinucleína. La DTdaforasa reduce el aminocromo, pero en presencia de oxígeno hay una reoxidación hasta aminocromo. De esta forma, la DT-diaforasa genera un ciclo rédox que disminuye los niveles de oxígeno del medio (Segura-Aguilar and Lind, 1989). Los ensayos de fibrilación se realizaron en frascos sellados herméticamente para evitar infección bacteriana, por lo tanto, no hubo reoxigenación posibilitando la disminución de la concentración de oxígeno y EROs en el medio de incubación, lo que pudo impedir la fibrilación de αsinucleína. Otra explicación puede ser que por la alta sensibilidad de este ensayo de fibrilación de α-sinucleína, un cambio en la cantidad de proteínas totales del medio podría afectar la cinética de fibrilación. En los ensayos con DT-diaforasa, agregamos 5 µg/ml de DT-diaforasa, sin embargo, los ensayos con citocromo C reductasa incluyeron 10 µg/ml de citocromo C reductasa. Como los ensayos de α-sinucleína, aminocromo y citocromo C reductasa no mostraron una inhibición en la fibrilación de α-sinucleína mayor a lo observado con α-sinucleína y aminocromo solo, descartamos que la inhibición en la fibrilación observada por DT-diaforasa se deba a la presencia de la proteína DT-diaforasa. Proyecciones La agregación de α-sinucleína ha demostrado ser un evento patológico, gatillado por una serie de factores genéticos, oxidantes y metales entre otros. El primer evento para la toxicidad de los agregados de α-sinucleína, parece ser la polimerización a oligómeros de α-sinucleína (revisado en Fink, 2006) Estos oligómeros parecen ser los precursores de las protofibras, estructuras que han demostrado ser altamente tóxicas para las neuronas induciendo daño mitocondrial, fragmentación de membranas de organelos (Gosavi et al., 2001) y 100 depolarización neuronal (Furukawa et al., 2006). Un mecanismo protector de las neuronas frente a proteínas mal ensambladas es el agresomal. Este mecanismo consiste en el reclutamiento de las proteínas mal ensambladas ó agregadas, atracción de estas proteínas al espacio perinuclear lo que se lleva a cabo por microtúbulos y acumulación de estas en estructuras llamadas agresomas. Estos agresomas son grandes cuerpos compuestos de fibras de proteínas, que incluyen proteínas del citoesqueleto y del sistema ubiquitinproteosomal y se ubican en el perímetro nuclear de las neuronas (Olanow et al., 2004; Tanaka et al., 2004). Se ha demostrado que la formación de agregados fibrilares en células depende de los microtúbulos (Lee y Lee, 2002), por lo tanto, los cuerpos de Lewy podrían ser agresomas. En esta tesis demostramos que in vitro el aminocromo es capaz de inducir la agregación de α-sinucleína en estas estructuras oligoméricas. Esta oligomerización demostró ser espontánea a pH 7,5 y 37 ºC, necesitando bajas concentraciones de α-sinucleína y aminocromo. La α-sinucleína es una proteína que se encuentra concentrada en los terminales sinápticos, unida a membrana de vesículas e incluso interaccionando con los transportadores de dopamina (DAT) (Lee et al., 2001; Wersinger y sidhu, 2005). Estos transportadores permiten la recaptación de dopamina del espacio sináptico pudiendo también transportar aminocromo (Paris et al., 2005). El hecho de que α-sinucleína y aminocromo estén co-localizados, aumenta la posibilidad de interacción y agregación de α-sinucleína. Esta interacción es posible y no es necesaria la reducción con un electrón para que esta agregación ocurra. Todos los mecanismos tóxicos que son atribuidos a las protofibras, se han descrito para protofibras hechas de α-sinucleína sola y no inducidos por la dopamina al oxidarse. Sin embargo, recientemente apareció un estudio que demuestran que la toxicidad de α-sinucleína mutante A53T, depende de la presencia de dopamina (Zhao et al., 2007). También se observó que en células SH-SY5Y que sobreexpresaban α-sinucleína mutante A53T, la dopamina disminuyó la formación de grandes estructuras α-sinucleína positivas tipo cuerpos de Lewy, pero indujo la aparición de polímeros de α-sinucleína de 40-200 kDa. En estos 101 estudios, sin embargo, no se observó un aumento de la neurodegeneración por dopamina (Mazzulli et al., 2006). Además de la posible toxicidad de las protofibras de α-sinucleínaaminocromo, se ha demostrado que la presencia de α-sinucleína es esencial en varios mecanismos en las células dopaminérgicas. Se ha demostrado que la αsinucleína puede regular la tirosina hidroxilasa (TH), disminuyendo la síntesis de dopamina (Perez et al., 2002; Peng et al., 2005; kaushik et al., 2007). Además, la α-sinucleína disminuye la presencia de DAT en la membrana sináptica, induciendo la internalización de DAT y de esta forma disminuyendo la recaptación de dopamina (Adamczyk et al., 2006). Se demostró que al bloquear la internalización de DAT inducida por α-sinucleína, aumentó la recaptación de dopamina induciéndose estrés oxidativo y muerte celular (Wersinger y sidhu, 2005). De esta manera, la disminución de α-sinucleína que podría ocurrir por la agregación inducida por aminocromo, induciría el aumento de la dopamina citoplasmática con la consecuente oxidación a aminocromo. Se ha observado que la α-sinucleína activa a la proteína fosfatasa 2A (Peng et al., 2005), la cual se ha sugerido como inhibidora de apoptosis en un modelo de Alzheimer (Hsu et al., 2007). La α-sinucleína también tiene un papel como regulador en la expresión varios genes (Miller et al., 2007). Uno de ellos es DJ-1 (Colapinto et al., 2006), cuya proteína ha demostrado ser antioxidante (Taira et al., 2004) y protectora frente a sustancias agresoras neuronales como 6 OHDA y MPTP (Paterna et al., 2007; Inden et al., 2006). También se ha relacionado DJ-1 con el aumento en la expresión de proteínas reguladas por elementos de respuesta antioxidante (ARE), donde una de estas proteínas es la DT-diaforasa cuya expresión disminuyó marcadamente al inhibir la expresión de DJ-1 (Clements et al., 2006). Por lo tanto, la disminución de α-sinucleína podría afectar el nivel de la expresión de varios genes, varios de ellos relacionados con el sistema antioxidante celular. De esta manera, pequeños cambios en la concentración de α-sinucleína pueden inducir efectos tóxicos por aumento de dopamina citoplasmática, disminución del sistema antioxidante e incluso apoptosis. La disminución de α-sinucleína podría entonces iniciar un ciclo toxico que induciría 102 el aumento de la dopamina y luego el aumento del aminocromo, una disminución de la concentración de DT-diaforasa y otras moléculas protectoras como glutatión reducido gatillando la muerte celular. En esta tesis se demostró por estudios in vitro, que la DT-diaforasa puede inhibir la formación de oligómeros de α-sinucleína inducidos por aminocromo. Nuestros estudios proveen las bases para la determinación de la DT-diaforasa como parte del mecanismo protector neuronal frente a la toxicidad de la oxidación de la dopamina. De hecho la DT-diaforasa es una enzima citoplasmática inducible, con ARE en sus promotores al igual que varias otras enzimas antioxidantes y protectoras celulares, como SOD, glutatión Stransferasa y Nrf-2. Lo que sugiere a la DT-diaforasa como una enzima protectora frente a eventos oxidantes en la célula. Nuestros estudios, presentan las primeras evidencias de que la DT-diaforasa ejerce un papel vital en la protección contra formación de oligómeros estables de α-sinucleína y protofibras inducidas por aminocromo. 103 CONCLUSIONES • La cromatografía de intercambio iónico separa aminocromo de dopamina, agentes oxidantes y otros derivados de la oxidación de la dopamina. • El aminocromo purificado se mantiene en forma estable por mas de 4 hrs. a 4 ºC en MES pH 6,0. • En condiciones in vitro, el aminocromo induce la agregación de αsinucleína a oligómeros de α-sinucleína. • Previo a la formación de oligómeros de α-sinucleína aparecen polímeros de bajo peso molecular compuesto por tres a mas de trece unidades monoméricas de α-sinucleína. • En condiciones in vitro, el aminocromo disminuye la fibrilación de αsinucleína. • La fibrilación de α-sinucleína ocurre por un mecanismo diferente que la formación de oligómeros de α-sinucleína, por ejemplo, no requiere la aparición previa de polímeros de entre tres hasta mas de trece unidades de α-sinucleína como sucede con la oligomerización. • La reducción de aminocromo con un electrón disminuye la oligomerización de α-sinucleína, pero sin inhibir la fibrilación. • La DT-diaforasa inhibe la oligomerización de α-sinucleína inducida por aminocromo y la fibrilación de α-sinucleína en ensayos in vitro. 104 MECANISMO PROPUESTO Neuromelanina Flavoenzimas reductasas NADH/ NADPH NAD+/ NADP+ Oxidación Dopamina Dopamina-o-Quinona Leukoaminocromo -o- semiquinona aminocromo NAD(P)+ NAD(P)H DT-diaforasa Oligómeros α-sinucleína O2 O2 - . EROs Fibras Figura 29. Mecanismo propuesto para la inducción de la oligomerización de α-sinucleína por aminocromo y la inhibición de esta por la DT- diaforasa. 105 BIBLIOGRAFÍA • Abeliovich A., Schmitz Y., Fariñas I., Choi-Lundberg D., Ho D., Castillo P., Shinsky N., Verdugo J., Armanini M., Ryan A., Hynes M., Phillips H., Sulzer D. and Rosenthal A. Mice Lacking α-Synuclein Display Functional Deficits in the Nigrostriatal Dopamine System. Neuron 25; 239-252. (2000). • Adamczyk A., Kazmierczak A. and Strosznajder J.B. Alpha-synuclein and its neurotoxic fragment inhibit dopamine uptake into rat striatal synaptosomes. Relationship to nitric oxide. Neurochem. Int. 49; 407412. (2006) • Arriagada C., Paris I., Sánchez de las matas M.J., Martinez-alvarado P., Cardenas S., Castañeda P., Graumann R., Perez-Pastene C., Olea-azar C., Couve E., Herrero M.T., Caviedes P. and Segura-Aguilar J. 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