Proliferación de linfocitos
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CURSO BÁSICO DE CITOMETRÍA DE FLUJO GRUPO RIOPLATENSE DE CITOMETRIA DE FLUJO (GRCF) 22 al 26 de Septiembre, 2014 CITOMETRíA DE FLUJO Aplicaciones en investigación Dra. Carolina JANCIC Laboratorio de Inmunidad Innata IMEX - CONICET, Academia Nacional de Medicina Buenos Aires Citometría de Flujo en Investigación • Fenotipo y detección de antígenos celulares: de superficie y citosólicos. • Ensayos de viabilidad celular: apoptosis y necrosis. • Monitoreo del ciclo celular. • Proliferación celular in vitro e in vivo. • Conjugados celulares. • Determinación de asociaciones moleculares (FRET). • Fagocitosis – Endocitosis. • Flujos citoplasmáticos de Calcio. • Producción de metabolitos del oxígeno (superóxido, peróxido y ON). Citometría de flujo en Investigación • Cambios de pH intracelular. • Actividad de proteasas: degradación de proteínas. • Expresión de proteínas de membrana en fagosomas. • Caracterización de vías de señalización. • Identificación de genes reporteros. • Estudio de microvesículas. • Evaluación de los cambios en el potencial de membrana plasmática. • Cross-match. • Y más… Más en detalle: • Flujos citoplasmáticos de Calcio. • Proliferación celular in vitro e in vivo. • Fagocitosis – Endocitosis. • Maduración de fagosomas: degradación de proteínas, pH, etc. • Estrés oxidativo: producción de IROs. • Apoptosis y necrosis. • Genes reporteros. • Conjugados celulares y asociaciones moleculares (FRET). • Potencial de membrana plasmática. MOVILIZACION DE CALCIO Movilización de Calcio El análisis de los transientes de calcio por citometría de flujo: • Provee información de células individuales. • Permite identificar una respuesta particular en una población heterogénea. • Analiza células vivas. Colorantes utilizados para la detección de calcio intracelular por citometría de flujo Colorante Excitación (nm) Emisión (nm) LASER indo-1 346 390/520 UV 5-W argón UV helio-cadmio fura red 488 660 argón fluo-3 488 530 argón fluo-3/fura red 488 530/660 argón Marcación de células con Fluo-3 Fluo-3 AM Hay que evitar el exceso de marca ya que: 1) disminuye la sensibilidad y 2) puede resultar en compartimentalización del colorante Fluo-3 AM Clivaje por esterasas citoplasmáticas Fluo-3 Forma sensible a la unión con el calcio •Fluo-3 AM: acetoximetil éster (AM) del Fluo-3 Movilización de Calcio Adquisición de las muestras Escala lineal: • para intervalos regulares • apropiada para señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000) Escala logarítmica: • para intervalos crecientes • cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000) EJEMPLOS: Neutrófilos estimulados con fMLP PMN PMN fMLP 10-7 M Linfocitos fMLP 10-9 M FL1 fMLP 10-7 M Tiempo (segundos) EJEMPLOS: Linfocitos B activados por entrecruzamiento de la Ig de superficie Anti-ratón (Fab´2) FL1 Anti-IgM (Fab´2) Tiempo (segundos) PROLIFERACION CELULAR Proliferación linfocitaria Los linfocitos proliferan activamente en respuesta a estímulos Linfocitos T/B Proliferación linfocitaria Activación policlonal y antígeno especifica de linfocitos Estímulos más frecuentes: 1) policlonales: mitógenos (PHA, ConA, PWM) anticuerpos anti-CD3 PMA + ionomicina LPS 2) específicos: antígenos (toxoide tetánico, hemaglutinina, etc) Métodos para medir proliferación celular 1. Aumento del número celular. 2. Incorporación al ADN de timidina marcada con tritio. 3. Incorporación al DNA de Br-deoxi-uridina y marcación con un anticuerpo anti-BrdU 4. Marcación con CFSE y seguimiento por citometría de flujo N° de células CFSE Proliferación Marcación con CFSE Fluorescencia CFSE Marcación con CFSE: análisis de datos autofluorescencia generaciones control sin estimular N° de células 7654321 Fluorescencia CFSE EJEMPLO Interacción celular y proliferación en un modelo murino Citometría de flujo Video-microscopía wt Rac1/2 KO Benvenuti, F. et al. Science (2004), 305:1150-3 EJEMPLO, doble marcación PBMC => sorting de CD4+CD25- y CD4+CD25+, estimulación con anti-CD3/CD28 durante 7días CD4+CD25- CD4+CD25+ Ensayos in vivo Estudio de la respuesta inmune Estudio de la migración celular marcación de linfocitos T marcación de células dendríticas u otras EJEMPLO: respuesta antígeno específica Respuesta inmune in vivo contra OVA OVA (popliteo) wt B6 BSA (popliteo) ganglio no drenate n1 60,7% 8,6% 12,5% n2 56,9% 6,6% 6,9% i.v.= 2x10e6 OT2-CFSE footpad= 50 µl de microsesferas 16 h CD69 CD69 ganglio popliteo : CFSE EJEMPLO: respuesta antígeno específica Transferencia de células dendríticas ganglio popliteo n 1: OVA CD + OVA: 15’ pulse & 4h > lavar & marcar con CMTMR n 2: OVA i.v.= 2x10e6 OT2-CFSE footpad= 1x10e6 OVA-CD o péptido control ganglio no drenante 54% 7% 58% 5% 45% 16% 16 h n 3: peptide CD69 visualizacion de CD CD69 Ganglio popliteo CFSE EJEMPLO: estudio de la migración celular Migración de células dendríticas a órganos linfáticos wt Ly5.1 i.v. o s.c.= CD inmaduras Ly5.2+ 20 h Bazo y ganglios popliteos: visualización de CD por marcación Ly5.2 Mittelbrunn, M. et al. Blood (2009), 113:75-84 ENDOCITOSIS- FAGOCITOSIS Captura de antígenos ANTIGENOS PARTICULADOS ANTIGENOS SOLUBLES microesferas de latex fluorescentes dextrán fluorescente EJEMPLO Fagocitosis y endocitosis en células dendríticas Microsesfera fluorescentes FITC Eventos (nº de células) Dextrán-FITC Intensidad de fluorescencia – dextrán-FITC + dextrán-FITC 4°C + dextrán-FITC 37°C % de fagocitosis FluoProbe 647 15 10 5 0 400 200 100 Dilución de beads (1/dilution) EJEMPLO Fagocitosis y endocitosis en células dendríticas Microsesfera fluorescentes FITC Eventos (nº de células) Dextrán-FITC Intensidad de fluorescencia – dextrán-FITC + dextrán-FITC 4°C + dextrán-FITC 37°C % de fagocitosis FluoProbe 647 15 10 5 0 400 200 100 Dilución de beads (1/dilution) EJEMPLO Fagocitosis de bacterias Bacterias fluorescentes + PBMC leucocitos n° de células bacterias-FITC 10 min 0°C o 37°C bacterias Fluorescencia IP quenching (azul tripan o cristal violeta) fijar teñir DNA FL1 lavar y lisar GR MADURACION DE FAGOSOMAS Maduración de fagosomas VIA ENDOCITICA FAGOCITOSIS vesículas cubiertas de clatrina vesículas endocíticas endosomas tempranos MVB endosomas tardíos lisosomas ER F-actin microtubulos calcio Vieira et al. Maduración de fagosomas • degradación de proteínas • expresión de proteínas en fagosomas • pH fagosomal Degradación de proteínas Estudio de la actividad de proteasas por citometría de flujo Metodología y análisis de datos CD + microesferas cubiertas de OVA + NH4Cl Fagosomas lisis 4 horas a 37°C Marcación y análisis por citometría de flujo Intensidad de fluorescencia OVA degrada OVA no degrada control negativo – NH4Cl OVA – NH4Cl OVA + NH4Cl EJEMPLO Degradación de proteínas en células dendríticas Eventos (nº de fagosomas) 2 horas 4 horas Intensidad de fluorescencia Incremento en la degradación Basal 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 2 4 Tiempo (horas) Expresión de proteínas en fagosomas Estudio de la expresión de marcadores lisosomales/fagosomales Metodología y análisis de datos 20’ pulse & 30’ incubación a 37ºC Incubación de CD con microesferas Purificación de fagosomas Fagosomas Marcación y análisis por citometría de flujo Intensidad de fluorescencia EJEMPLO Expresión de Lamp2 en fagosomas de células dendríticas Citometría de flujo KO Basal Mocroscopía electrónica wt 15 min 200nm Eventos (n° de fagosomas) 1 hora KO Lamp2 por µm de membrana fagosomal wt 12 9 6 3 0 2 horas Expresión de Lamp2 ** 15 wt KO pH fagosomal Estudio del pH fagosomal por citometría de flujo FITC (sensible al pH) FluoProbe 647 (insensible al pH) Gate en células conteniendo una sóla bead: Fagosomas Fagocitosis & Citometría de flujo FluoProbe 647 R2 FITC baja IFM bajo pH FITC alta IFM alto pH EJEMPLO pH fagosomal en células dendríticas y macrófagos pH en fagosomas pH en el tiempo 20’ pulse + 30’ incubación a 37ºC 8 DC Raw 264.7 Eventos (nº de fagosomas) 8 DC Mac 7 pH pH 7.5 7 6 6.5 6 Mac DC 5 10 FITC bajo pH alto pH 60 120 180 Tiempo (minutos) pH citoplasmático Colorantes utilizados pKa Excitación (nm) Emisión (nm) Fluorescein diacetate (FDA) 6.3 436/495 525 Carboxyfluorescein diacetate (COFDA) 6.4 441/488 535 Bis-carboxyethyl-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF AM) 6.98 439/490 520/620 535 488 Hydroxycoumarin (4-methylumbelliferone) (4-MU) 7.8 430/470 450/560 350 350 Diacetoxy-dicyanobezene (ADB) 8.0 425/540 350 Carboxy SNARF-1 acetoxymethyl ester 7.5 575/670 514 o 530 Colorante pH citoplasmático Consideraciones importantes durante el estudio del pH intracelular: Células Jurkat + SNARF-1, en presencia de nigericina a diferentes pH • Curva de calibración: células tratadas con nigericina (ionóforo: pH externo = pH interno). • Adquisición con amplificación lineal. Excitación a 514nm Ratio 670/575 • Trabajar con la relación entre IFM de emisión a dos longitudes de onda => nos independizamos de variaciones en la carga del colorante en células de diferentes tamaños. Espectro de emisión de SNARF-1 a diferentes pH Cambios en fluorescencia en respuesta a nigericina. Células CCRF-CEM+SNARF-1 ESTRÉS OXIDATIVO Fagocitosis y destrucción de microorganismos Función desempeñada principalmente por los neutrófilos Mecanismos de destrucción de microorganismos Mecanismos microbicidas que no involucran al oxígeno (oxígeno-independientes) Mecanismos microbicidas que involucran la producción de intermediarios reactivos del oxígeno (oxígeno-dependientes) Mecanismos O2 dependiente NADPH oxidasa bacteria membrana plasmática neutrófilo 4e- NOX2 4e- 4O2 4O2- H+ K+ citosol 2O2 pH Cl- 2H2O2 MPO HOCl + HO- Adaptado a partir de Roos et al. Science pH 4H+ catalase H2O + O2 fusión de gránulo y fagosoma Colorantes utilizados para evaluar IRO Colorante Excitación (nm) Emisión (nm) H2O2: Dichlorofluorescin diacetate 488 525 Dehydrorhodamine 488 525 O2-: hydroethidine 488 590 EJEMPLO: estrés oxidativo en neutrófilos Producción de IRO en neutrófilos Metodología Análisis de datos Incubación de PMN con DHR (5 min a 37ºC) paciente + PMA Análisis por citometría de flujo n° de células Lavado y estímulo con PMA Intensidad de fluorescencia Control dador sano + PMA paciente + PMA APOPTOSIS Alteraciones morfológicas en células apoptóticas CARACTERISTICAS DE LA APOPTOSIS: • No hay pérdida de integridad de membrana ni se altera la permeabilidad. • Hay cambios en la distribución de fosfolípidos: Flip-Flop y Zeiosis. Flip-Flop Zeiosis • Disminución en el tamaño celular. • Condensación de la cromatina. EJEMPLO: neutrófilos apoptóticos Microscopía de fluorescencia: Tinción: naranja de acridina – bromuro de etidio células viables células apoptóticas Vía de las caspasas Receptor de muerte, ej: Fas/CD95 y TNFR (vía extrínseca) pro-caspasa 8 caspasa 8 activa pro-caspasa 9 Proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-XI, Mcl-1, Bfl-1/A, Bcl-W, Bcl-G Poteínas proapoptóticas Bax, Bak, Bad, Bid, Bik, Bok, Bim, Bcl-XS, Bcl-B, etc caspasa 9 activa caspasa 3, 6, 7 citocromo c • Reorganización del citoesqueleto • Exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática • Ruptura del DNA Herramientas para el estudio de la apoptosis por citometría de flujo • Cambios en el FSC-SSC • Cambios mitocondriales: TMR (tetrametilrodamina). Apoptosis muy temprana • • • • • Niveles de moléculas pro-apoptóticas o anti-apoptóticas => con anticuerpos monoclonales Nivel de caspasas activas => anticuerpos monoclonales Detección de fosfatidilserina en la membrana plasmática. Apoptosis temprana => Annexina V conjugada. Fragmentación del ADN. Apoptosis tardía => Ioduro de Propidio (PI) / Incorporación de análogos de nucleótidos a los extremos 3’ OH terminal catalizado por TdT exógena, biotinilados o detectados con anticuerpos monoclonales (Técnica de TUNEL) Estudiar receptores de muerte en la superficie celular => Fas (CD95),TNFR1 y otros. Apoptosis por activación. EJEMPLO: apoptosis temprana y tardía Inducción de apoptosis: Células B en medio de cultivo 1% de SBF Células Jurkat + anti-FAS EJEMPLO: expresión de Bcl-2 en LLC Bcl-2: marcación intracitoplasmática Bcl-2 alto Control negativo Bcl-2 bajo LLC viables n° de células LLC apoptóticas fluorescencia GENES REPORTEROS Transfección de células y genes reporteros CARACTERISTICAS DE LOS VECTORES DE EXPRESION Vectores de origen eucariota aptos para la replicación en células de mamíferos. Codifican un gen reportero en general GFP. Permiten generar proteínas de fusión dada la estructura de los plásmidos. Selección de transfectantes estables (resistencia a neomicina). Permiten estudios de expresión, localización y dinámica celular. Nueva generación adaptados para obtener máxima expresión en células de mamífero. Transfección de células y genes reporteros DESCRIPCION DE LOS VECTORES DE EXPRESION EJEMPLOS: pmaxFP-Green, pmaxFP-Red, pmaxFP-Yellow • Señal de poliadenilación de SV40 • Origen de replicación de SV40 • Gen de resistencia a kanamicina/neomicina • Promotor de CMV • Gen GFP células transfectadas con GFP Transfección de células y genes reporteros Procedimiento experimental para la transfección de células cultivo celular TRANSFECCION células + ADN/siARN selección y cultivo EJEMPLO: transfección de PBMC 1. Transfección de células con un vector codificando GFP. 2. 24 horas post-transfección se analizaron las células por citometría de flujo. A: gate de linfocitos B: a partir de (A) gate en anti-CD3 C: exclusión de células muertas en CD3+ control GFP D y E: expresión de GFP en células T vivas EJEMPLO: animales transgénicos Proteínas de fusión en modelos murinos MHC II-GFP LB Rab27a-EGFP CD INTERACCIONES CELULARES Determinación de asociaciones moleculares FRET: “fluorescence resonance energy transfer” Fundamento: El espectro de emisión y absorción de los colorantes usados están superpuestos. La energía emitida tras la excitación de la proteína fluorescente dadora puede directamente excitar a la proteína fluorescente receptora sólo cuando ambas están lo suficientemente cerca. Por lo tanto uno de los fluoróforos será excitado como consecuencia de la excitación previa del otro. FRET permite distinguir células fusionadas de las agregadas. Sólo las células fusionadas muestran FRET. FRET: Espectros de excitación y emisión Dador y aceptor: Transferencia de la energía de superposición de espectros resonancia FRET intramolecular APLICACIONES: algunos ejemplos 1- Cambios conformacionales 2- Hidrólisis de proteínas 3- Interacciones ligando-receptor 4- Fusión de vesículas o células dador aceptor EJEMPLO: fusión celular Análisis de la fusión celular mediada por las proteínas de la envoltura del HIV Análisis de la fusión celular Fluorescencia roja Células multinucleadas o sincicios Fluorescencia verde Sincicios (flechas) producidos in vitro por la fusión entre células linfoides humanas CD4+ y células que expresan las proteínas de fusión del VIH (células Env+). Rojo: células CD4+ no fusionadas Verde: células Env+ no fusionadas Azul: sincicios Huerta et al. J Virol. Methods (2003), 138:17-23 EJEMPLO: fusión celular Análisis de la fusión celular mediada por las proteínas de la envoltura del HIV Cocultivos de células CD4+ marcadas con DiI y células Env+ marcadas con DiO DiI-CD4+ y DiO-Env+ 30ug/ml anti-CD4 mutación en gp41 fusión IFM rojo 14% 1,6% 0,4% agregados SSC-H IFM verde FSC-H Huerta et al. J Virol. Methods (2003), 138:17-23 Determinación de asociaciones moleculares Conjugados celulares Fundamento: Los espectros de emisión de los colorantes utilizados para marcar los diferentes tipos celulares deben estar separados. Es una metodología rápida y confiable para evaluar interacciones celulares. Permite analizar gran número de células en corto tiempo a diferencia de la microscopía. CD y LT APC LT EJEMPLO: agregados celulares Formación de conjugados entre NK efetoras y células blanco Tiempo: 0 min Tiempo: 10 min a 37ºC Fluorescencia roja: células YTS (línea celular NK) marcadas con PKH26 Fluorescencia verde: células blanco marcadas con PKH67 Burshtyn et al. Current Biology (2000), 10:777-780 EJEMPLO: agregados celulares Formación de conjugados entre NK efetoras y células blanco NK target IP (FL2) Ioduro de propidio (VIABILIDAD) MitoTracker (EFECTORAS: NK) Ioduro de propidio (FL2) Marcación y citometría de flujo: MitoTracker green FM (FL1) MitoTracker (FL1) MitoTracker: marca mitocondrias en células vivas EJEMPLO, “RFADCC: Rapid Fluorescent ADCC” Detección de anticuerpos anti-HIV CB PKH26 gp140 PBMC PBMC plasma HIV+ PBMC PBMC lisis Gate en PKH26+ Análisis de CFSE PBMC: células efectoras CB: células blanco Gomez-Roman, et al. J Immunol Methods (2006), 308:53-67 EJEMPLO: Expresión de CD107a en NK Activación y degranulación de células NK Metodología y análisis de datos NK+ K562 (1:1) + anti-CD107a Ejemplo 1 1 h a 37°C monensina y/o brefeldina 5 h a 37ºc Marcación: anti-CD56 anti-CD3 citoquinas NK: células efectoras K562: células blanco Ejemplo 2 control gp140 Chung, AW. et al. J Immunol (2009), 182:1202-10 POTENCIAL DE MEMBRANA Potencial de membrana oxonol (-) cyanina (+) - - + - - - + + + + + - Hiperpolarización (Valinomicina) + + estado normal - + cyanina (+) + + - oxonol (-) Despolarización (Gramicidina) Colorantes utilizados para estudiar el potencial de membrana + - EJEMPLO: cambios en potencial de membrana Despolarización e hiperpolarización en células CCRF-CEM DEPOLARIZACION HIPERPOLARIZACION Despolarización de PMN (cyanina) luego del tratamiento con PMA GRACIAS
