-Métodos para la caracterización fisiológica en diferentes niveles de regulación:... Transcriptoma, Proteoma, Metaboloma y Fluxoma. Introducción a Metabolómica y Fluxómica. PROGRAMA

PROGRAMA
Módulo teórico
-Métodos para la caracterización fisiológica en diferentes niveles de regulación: Genoma,
Transcriptoma, Proteoma, Metaboloma y Fluxoma. Introducción a Metabolómica y Fluxómica.
-Metabolismo Central: Metabolismo energético, aporte de precursores para biomasa,
anabolismo, catabolismo, anaplerosis, Coordinación de reacciones metabólicas
-Modelos para analizar reacciones celulares: estequiometría de reacciones celulares,
velocidades de reacción, Balance de masa.
-Métodos para cuantificación de flujos metabólicos: análisis de flujos metabólicos, Análisis de
balance de flujos, Análisis de vías metabólicas (modos elementales), nociones de MS y NMR en
medidas de marcado, Experimentos con trazadores.
-Aplicaciones: Producción de biocombustibles de segunda generación. Síntesis de
biomateriales, biopolímeros, etc.
Módulo práctico
Los prácticos se desarrollarán durante las dos semanas de curso (48 horas) e incluirán sesiones
de trabajo en laboratorio y análisis de datos in silico.
Se estudiará la producción de un biopolímero de interés (polihidroxibutirato) empleando 13Cglucosa (U y marcada en posición 1) como fuente de carbono para el cultivo de un
microorganismo. Se determinarán distintos parámetros del cultivo y posteriormente se
analizará el perfil de marcado de aminoácidos proteinogénicos en el GC-MS (IIBCE). Los datos
generados serán analizados mediante el software FIAT -Flux (Zamboni et al., 2005) para el
correspondiente análisis de flujos metabólicos y METATOOL para el análisis de modos
elementales de flujos. Se discutirán los resultados obtenidos.
También se incluirán sesiones prácticas para el análisis in silico de los datos generados a partir
del estudio de la producción de bioetanol por Saccharomyces cerevisiae empleando glucosa y
xilosa como fuentes de carbono. Históricamente, S. cerevisiae ha sido ampliamente utilizado
para la producción de alcohol a partir de glucosa. La producción industrial actual se basa en
cultivos como la caña de azúcar, el almidón de maíz y otros, que también se utilizan para la
alimentación y forraje. La competencia por estos commodities promueve la suba de precios de
los alimentos y el combustible. Los compuestos químicos usados para producir etanol son
azúcares, en general hexosas, presentes como tal en los vegetales, como disacáridos o en
forma de almidón. Estos cultivos generan grandes cantidades de residuos, incluyendo material
lignocelulósico. Dado que la lignocelulosa contiene glucosa (en celulosa y hemicelulosa), xilosa
(más abundante en hemicelulosa) y arabinosa, se han investigado distintas estrategias dirigidas
a consumir estos azúcares para generar el llamado bioetanol de segunda generación. S.
cerevisiae no fermenta xilosa, aunque otras levaduras tienen la capacidad de fermentar los
azúcares de pentosa en etanol.
La vía de metabolización de xilosa en Scheffersomyces stipitis (anteriormente Pichia stipitis)
incluye una xilosa reductasa (XR) (transforma xilosa en xilitol) y una xilitol deshidrogenasa
(XDH) (transforma el xilitol en xilulosa). S cerevisiae tiene estas enzimas, pero muestra un
metabolismo mínimo de xilosa, produciendo principalmente xilitol (Van Vleet y Jeffries 2009).
En S. cerevisiae, la xilosa reductasa (XR) y la xilitol deshidrogenasa (XDH) propias muestran
preferencia por la producción de xilitol a partir de xilosa debido a su especificidad por el
cofactor (Jeffries2006 ). La enzima XR de S. cerevisiae codificada por el gen GRE3, tiene una
fuerte preferencia por NADPH como cofactor, mientras que el gen XYL2 que codifica XDH de S.
cerevisiae, tiene una fuerte preferencia por NAD+ como cofactor (Jeffries 2006). Este proceso
da lugar a una disminución gradual de la reserva de NADPH, que resulta en la acumulación de
xilitol. El gen XYL1 de S. stipitis, que codifica para la XR, tiene especificidad doble y puede
utilizar ya sea NADH o NADPH, permitiendo la reposición del NADH posteriormente. Esta
descripción del primer paso del metabolismo de xilosa por distintas levaduras nos permite
visualizar las distintas consideraciones que se deben tener en cuenta al pretender optimizar la
producción de un producto. El AFM de S. cerevisiae ha sido ampliamente descrito por distintos
investigadores (Pitkänen et al. 2003; Da Silva y Srikrishnan 2012) y la discusión de los
resultados se tratará en el módulo práctico.
-Da Silva N. A., and Srikrishnan, S.. 2012. Introduction and expression of genes for metabolic
engineering applications in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 12:197-214. DOI:
http://10.1111/j-1567-1346.2011.00769.x
-Jeffries, T.W. 2006. Engineering Yeasts for Xylose Metabolism. Current Opinion in
Biotechnology 17 (3) (June): 320–6. doi:10.1016/j.copbio.2006.05.008.
-Pitkänen, J., Aristidou, A., Salusjärvi, L., Ruohonen, L., and Penttiläetabolic, L. 2003. Metabolic
flux analysis of xylose metabolism in recombinant Saccharomyces cerevisiae using continuous
culture.Metabolic Engineering. 5(1): 16-31. -Van Vleet,
J.H., and Jeffries, T.W. 2009. Yeast Metabolic Engineering for Hemicellulosic Ethanol
Production. Current Opinion in Biotechnology 20 (3) (June): 300–6.
doi:10.1016/j.copbio.2009.06.001. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19545992
-Zamboni, N., Fischer, E., and Sauer, U. 2005 FiatFlux – a software for metabolic flux analysis
from 13C-glucose Experiments. BMC Bioinformatics.6:209
(http://www.biomedcentral.com/1471-2105/6/209)
CRONOGRAMA
Día
Fecha
Horario
Tema de la clase
Profesor
Teórico /
Práctico
1
13/04
8:30-9:30
Presentación del curso, entrega
de material, mecanismo de
evaluación, organización general
Silvia Batista
T
Max Chavarría
T
Introducción al ensayo
experimental: Producción de
PHA:
Preparación de inóculos de H.
seropedicae en medio rico
Ana Inés Catalán/Ana
Karen Malán/Silvia
Batista
P
9:30-12:30
Metabolismo Central:
Metabolismo energético, aporte
de precursores para biomasa,
anabolismo, catabolismo,
anaplerosis, Coordinación de
reacciones metabólicas.
Pablo Nikel
T
14:0018:00
Subcultivo de inóculos en medios
definidos LGI con la fuente
carbonada en estudio.
Preparación de matraces para el
cultivo en batch
Ana Inés Catalán/Ana
Karen Malán/Silvia
Batista
P
15/04
8:00-9:00
Cultivo en batch en medio LGI en
condiciones de ensayo,
empleando glucosa (sin marcar, Ana Inés Catalán/Ana
U-marcada y marcada en
Karen Malán/Silvia
posición 1) Inicio de extracción de
Batista
muestras para determinaciones
analíticas
P
3
15/04
Modelos para analizar reacciones
celulares: estequiometría de
9:30-12:30
José Gregorio Cabrera
reacciones celulares, velocidades
de reacción. Balance de masa.
T
3
15/04
1
1
2
2
3
4
13/04
9:45-12:45
13/04
14:0018:00
14/04
14/04
16/04
16/04
13:0021:00
Métodos para la caracterización
fisiológica en diferentes niveles
de regulación: Genoma,
Transcriptoma, Proteoma,
Metaboloma y Fluxoma.
Introducción a Metabolómica y
Fluxómica.
Extracción de muestras a cada
hora para determinaciones
analíticas
Modelos para analizar reacciones
celulares: estequiometría de
reacciones celulares, velocidades
de reacción. Balance de masa.
9:30-12:30
(continuación)
13:30-
Procesamiento de muestras para
Ana Inés Catalán/Ana
Karen Malán/Silvia
Batista
P
Pablo Nikel / Luis
Acerenza
T
Ana Inés Catalán/Ana
P
4
19:00
5
17/04
5
17/04
6
6
7
7
20/04
20/04
21/04
21/04
8
22/04
8
22/04
9
23/04
9
23/04
10
24/04
análisis (sobrenadante, biomasa,
PHB, determinación de
aminoácidos proteinogénicos)
Métodos para cuantificación de
flujos metabólicos: análisis de
flujos metabólicos. Análisis de
9:00-12:30
balance de flujos. Análisis de vías
metabólicas (modos
elementales).
13:3019:00
Determinación de metabolitos
excretados y fuente C en
sobrenadante
Análisis de flujos con isótopos
marcados. Nociones de MS y
9:00-12:30
NMR en medidas de marcado,
Experimentos con trazadores.
14:0019:00
Determinación GC-MS aas.
proteinogénicos
Aplicaciones: Producción de
biocombustibles de segunda
9:30-12:30 generación. Síntesis de
biomateriales, biopolímeros, etc.
14:0019:00
Análisis y procesamiento de
datos
Aplicaciones: Producción de
biocombustibles de segunda
9:30-12:30 generación. Síntesis de
biomateriales, biopolímeros, etc.
14:0019:00
Seminario
Aplicaciones: Producción de
biocombustibles de segunda
9:30-12:30 generación. Síntesis de
biomateriales, biopolímeros, etc.
14:0019:00
Seminario/ Análisis in silico (S.
cereviciae)
Presentación de líneas de trabajo
8:30-12:30 de estudiantes y posibles
aplicaciones del curso
Karen Malán/Verónica
Saravia/Raúl Platero
Luis Acerenza
T
Ana Inés
Catalán/Verónica
Saravia
P
Max Chavarría/José
Gregorio Cabrera
T
Ana Inés Catalán/
Manuel Minteguiaga/A.
Karen Malán/Raúl
Platero
P
Luiziana Ferreira
T
Ana I. Catalán/K.
Malán/M.
Minteguiaga(Raúl
Platero
P
Pablo Nikel
T
Gregorio
Cabrera/Luiziana
Ferreira
P
José Gregorio Cabrera
T
Max Chavarría/ Pablo
Nikel /Raúl Platero
P
T