MATERIALES Y METODOS Cepa de Mycobacterium tuberculosis

MATERIALES Y METODOS
Cepa de Mycobacterium tuberculosis
Se utilizó una cepa de referencia de Mycobacterium tuberculosis H37Rv
tipificada en el Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica
(INDRE), y proporcionada para este trabajo por el Laboratorio Estatal de Salud Pública
(LESP) de Hermosillo, Sonora.
Cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Los procedimientos que involucraron la manipulación de cepas fueron llevados a
cabo en el Departamento de Micobacterias del LESP, utilizando una campana de
bioseguridad tipo 2. La reactivación de la cepa, se realizó en tubos para cultivo con el
medio de Löwenstein-Jensen en plano inclinado; la cepa fue sembrada en el medio e
incubada a 37°C hasta observar el desarrollo del microorganismo. La pureza del cultivo
se verificó mediante pruebas bioquímicas para micobacterias y tinción de Ziehl-Neelsen.
Una vez verificada la pureza del cultivo, se procedió a la inoculación en sistemas de
cultivo conteniendo 400 mL del medio líquido Sauton. Los medios fueron incubados a
37°C en reposo durante 4 semanas.
Filtrado de Cultivo
Para la obtención del filtrado proteico con la mayor representatividad de
componentes proteicos, se utilizó un sistema de filtración acoplado a una bomba de
vacío, utilizando una membrana de nylon con punto de corte de 0.2 µm (Millipore). Los
filtrados fueron sometidos a un proceso de concentración utilizando centricones con
membranas de nitrocelulosa de 10,000 Da de punto de corte, en una centrífuga
refrigerada a 4ºC y 2,500 rpm (Sigma Chemical Co, St Louis Mo, USA). Después de la
concentración se dializó el filtrado exhaustivamente contra agua tridestilada. Por último,
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las fracciones proteicas fueron liofilizadas (Labconco Corporation, Kansas City, Mo,
USA) y se almacenaron en refrigeración a 4ºC hasta su procesamiento.
Estimación Proteica del Filtrado de Cultivo
La concentración proteica del filtrado de cultivo fue estimada por el método de Bradford
(Bradford, 1976) en microplaca, utilizando albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en
inglés) como proteína estándar para la curva de calibración. El rango de concentración de la
curva fue de 3.125 µg/mL a 100 µg/mL.
Identificación de Perfil Electroforético en una Dimensión del Filtrado de Cultivo
La masa de los componentes proteicos del filtrado de cultivo de Mycobacterium
tuberculosis, se estimó por medio de electroforesis en condiciones desnaturalizantes y
reductoras (Laemmli, 1970) en geles de poliacrilamida en gradiente al 15%, en una
cámara vertical, a 80 volts constantes. Se cargaron 10 µg de proteína por pozo en el gel
de poliacrilamida y el gel fue teñido con AgNO3 (Blum y col., 1987).
Estandarización de Métodos Inmunoquímicos Para la Identificación de Antígenos
con Proteínas del Filtrado de de Cultivo
Electrotransferencia e Inmunodetección (Western blot)
Una vez realizada la electroforesis en geles de poliacrilamida de proteínas de
filtrado de cultivo se llevó a cabo la estandarización de la electrotransferencia en cámara
semi-húmeda (Towbin, 1979) a hojas de papel de nitrocelulosa (Bio-Rad, Richmond,
CA). Se ensayaron dos diferentes tiempos de electrotransferencia, de 1 hora y 1 hora con
10 minutos a 120 mA y 20 V constantes. Posteriormente, la estandarización de la
inmunodetección se realizó, seguida de dos esquemas de bloqueo en solución
amortiguadora de fosfato de potasio 20 mM, pH 7.2 (PB) con Tween 20 (PBT) al 0.02%
(Towbin, 1979), en el primero con 5% de leche descremada en solución PBT y en el
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segundo esquema con leche al 5% y BSA al 0.5% en solución PBT, ambos con
incubación de 14-16 horas a 4ºC.
Para
la
estandarización
del
proceso
de
identificación
de
antígenos
inmunodominantes se utilizó el suero de una persona sin tuberculosis con reacción
positiva al PPD y un suero de una persona con tuberculosis activa. El antisuero
secundario anti-human IgG (Fc specific) (Sigma Chemical Co, St Louis Mo, USA)
utilizado en este proceso, estaba conjugado con peroxidasa. La reacción fue revelada
por quimioluminiscencia (PIERCE Super Signal West Pico Chemiluminiscent
Substrate). Se ensayaron dos esquemas; en el primero, el bloqueo a 4º C sin agitación
durante 12 horas, con BSA al 0.5% y leche descremada al 5% en PBT; el antisuero
primario fue incubado a temperatura ambiente durante 2 horas en agitación (en dilución
1:50, 1:100, 1:200 y 1:400), y el antisuero secundario (en dilución 1:2000, 1:4000,
1:6000 y 1:8000) durante 2 horas a temperatura ambiente en agitación. En el segundo
esquema, el bloqueo se realizó con leche descremada al 5% en solución PBT; el
antisuero primario fue incubado a temperatura ambiente durante 2 horas en agitación (en
dilución 1:50, 1:100, 1:200 y 1:400), y el antisuero secundario (en dilución 1:2000,
1:4000, 1:6000 y 1:8000) durante 2 horas a temperatura ambiente en agitación. En
ambos esquemas la membrana de nitrocelulosa fue lavada 8 veces durante 5 minutos con
PBT, los lavados se realizaron después de cada incubación.
Ensayo de Manchas (Dot blot)
Para la estandarización del ensayo de manchas (Towbin, 1989), se realizó la
inmovilización directa del antígeno sobre la membrana de nitrocelulosa, colocando tres
concentraciones diferentes:
0.7, 0.35 y 0.175 µg/µl del filtrado de cultivo de
Mycobacterium tuberculosis H37Rv, en PB 20 mM, pH 7.2, luego se realizó el bloqueo
de la membrana con leche descremada al 5% por 14-16 horas en PBT, se realizaron 5
lavados con PBT por 5 minutos después de cada incubación; el antisuero primario fue
incubado a temperatura ambiente (en dilución 1:20 y 1:50) por 1 hora; la interacción
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entre las proteínas y los anticuerpos del suero fue revelada incubando la membrana con
un antisuero secundario (anti-human IgG, Sigma, St. Louis MO) conjugado con
peroxidasa (en dilución 1:1000 y 1:2000) por 1 hora, a temperatura ambiente. La
reacción fue revelada con diaminobencidina (DAB) y peróxido de hidrógeno como
sustrato (Sigma Chemical Co, St Louis Mo, USA).
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