acido hialuronico de bajo peso molecular con peptidos o proteinas

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : A61K 47/36
11 Número de publicación:
2 182 886
7
51
ESPAÑA
A61K 38/27
A61K 38/30
C08B 37/08
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 95906577.2
kFecha de presentación: 10.01.1995
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 750 515
kFecha de publicación de la solicitud: 02.01.1997
T3
86
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87
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k
54 Tı́tulo: Acido hialurónico de bajo peso molecular con péptidos o proteı́nas.
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73 Titular/es: Pharmacia Aktiebolag
k
72 Inventor/es: Jederström, Gustav
k
74 Agente: Dávila Baz, Angel
30 Prioridad: 10.01.1994 SE 9400036
112 87 Stockholm, SE
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.03.2003
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 182 886 T3
16.03.2003
Aviso:
k
k
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 182 886 T3
DESCRIPCION
Ácido hialurónico de bajo peso molecular con péptido o proteı́na.
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La invención se refiere a una matriz blanda, flexible y continua, liofilizada de ácido hialurónico de
bajo peso molecular, o una sal del mismo, que contiene al menos un péptido o una proteı́na, útil como
una composición farmacéutica.
El ácido hialurónico (HA) es un glicosaminoglicano presente en la naturaleza que consiste en un
polı́mero lineal de unidades repetitivas de ácido glucurónico y N-acetilglucosamina. El peso molecular
puede variar a lo largo de un amplio intervalo dependiendo de la fuente. El HA está presente en varios
tejidos de animales y en algunos órganos, tales como crestas de gallo, en concentraciones suficientemente
altas para la extracción a escala comercial. Tal tejido contiene HA de un amplio intervalo de pesos moleculares y, durante una serie compleja de etapas de extracción, purificación y esterilización, las cadenas
de alto peso molecular se degradan más o menos dando como resultado un producto final que tiene un
intervalo de pesos moleculares considerablemente más estrecho.
Los parámetros crı́ticos que determinan las caracterı́sticas del producto final a este respecto son la
distribución de pesos moleculares de HA en el material de partida, el grado de degradación de las cadenas
de HA durante el procedimiento de purificación y esterilización y la eficacia de la retirada de HA de bajo
peso molecular.
R
(Kabi Pharmacia AB,
Un producto de ácido hialurónico disponible comercialmente es HEALON
Uppsala, Suecia) que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 4.000.000 daltons. El producto
se produce según se esboza en US 4 141 973 y es un producto ultrapuro. Hay muchas referencias literarias
relativas al uso de productos viscoelásticos de HA en aplicación oftalmológica y la preparación de tales
productos, incluyendo la preparación de HA quı́micamente modificado.
El HA es conocido en formulaciones de liberación lenta y en WO 9005522 se menciona HA como un
portador de liberación lenta junto con una proteı́na de unión para, por ejemplo, GH o IGF.
En US 4772419, se describe un artı́culo conformado basado en HA posiblemente derivado, reticulado,
o una sal del mismo, que en un estado capaz de hincharse con agua, sustancialmente no hinchado, tiene
un contenido de materia seca de al menos 65 por ciento en peso y una resistencia a la tracción mayor que
100 N/cm2 . El HA es de alto peso molecular, por ejemplo aproximadamente 3.000.000 Da. El artı́culo
podrı́a producirse mediante liofilización. Se obtenı́an láminas delgadas de estructura similar a papel o
estructuras similares a celofán. El artı́culo podrı́a usarse para prevenir la adhesión y el acrecentamiento
de tejidos.
El ácido hialurónico de bajo peso molecular (LMWHA) podrı́a producirse mediante hidrólisis ácida o
enzimática y fraccionación ulterior. Estos procedimientos son conocidos en la técnica.
El LMWHA es conocido como portador para agentes activos farmacéuticos y también para la propia
actividad farmacéutica.
45
En EP 138 572, un producto que comprende HA con Mw de 50.000-100.000 se indica como útil para
la curación de heridas y HA con un Mw de 500.000-730.000 es útil para inyecciones intraoculares e intraarticulares. También se describen los fragmentos de HA como portador para fármacos, por ejemplo EGF,
en gotas oculares.
50
En EP 197 718, HA con Mw diferente entre 30.000-730.000 es útil en el campo oftálmico y dermatológico. LMWHA con EGF se menciona como ejemplo.
55
HA con Mw de 500-800.000 junto con agua para un trastorno cosmético y de la piel se conoce de GB
2 228 736.
En US 5 079 236, se describe HA con Mw 50.000-200.000 para el tratamiento de la osteoartritis y la
función de las articulaciones y en JP 1 290 631 se reivindica HA con Mw 50.000-300.000 para el tratamiento de la artritis y la retinopatı́a diabética.
60
WO 9316732 y WO 9316733 describen HA o fragmentos del mismo (por ejemplo < 750.000) y un
fármaco, por ejemplo NSAID antiinflamatorio, diclofenac, naproxeno, un anticancerı́geno, especialmente
útil tópicamente para la piel.
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5
En GB 2 235 204 se describe que se forma una pelı́cula o lámina fácilmente soluble en agua para
uso cosmético cuando el ácido hialurónico se liofiliza a vacı́o. El ácido hialurónico usado tiene un peso
molecular de 1.200.000, dando una solución viscosa en agua. La capa que contiene fosfato de magnesio-Lascorbilo se usa como una lámina cosmética para una máscara facial. La hidratación de la piel, la tensión
de la piel y el efecto blanqueador se muestran para esta composición.
EP 522 491 describe una composición liofilizada que comprende ácido hialurónico y un polipéptido,
que se administra mediante inyección después de la reconstitución de la composición.
10
15
WO-A-94 025 17 se publicó el 3 de Febrero de 1994, representando ası́ el llamado documento P. En
ese documento, se describe un método para preparar geles biocompatibles insolubles en agua, pelı́culas
y esponjas haciendo reaccionar ácido hialurónico con una carbodiimida. El peso molecular del ácido
hialurónico usado es aproximadamente 1.200.000 Da. El producto es un ácido hialurónico modificado. El
producto puede usarse como adyuvantes quirúrgicos y como vehı́culos de aporte de fármacos.
La presente composición reivindicada comprende ácido hialurónico de bajo peso molecular y un
péptido o una proteı́na, que da un efecto ventajoso inesperado cuando se usa para la administración
de un fármaco.
20
25
Para la producción de una matriz, que es blanda, flexible y continua y preferiblemente en la forma
de una capa, son necesarias fuerzas de unión e interacciones especiales dentro de la molécula. El ácido
hialurónico con un peso molecular alto tiene una estructura especial de la molécula, que no puede compararse con la estructura molecular del ácido hialurónico de bajo peso molecular. Un experto en la técnica
no podrı́a prever cómo podrı́a reaccionar el ácido hialurónico de bajo peso molecular cuando se liofilizara.
Cuando se administra un fármaco tópicamente, un problema es saber cuánto fármaco se libera durante
un cierto tiempo, de modo que el paciente siempre reciba la dosificación correcta por unidad de tiempo.
30
35
Cuando se aporta el fármaco gota a gota sobre una úlcera, la cantidad total está bien definida pero
hay dificultades en la administración del fármaco en una cantidad definida sobre toda la superficie y este
método requiere normalmente cuidado clı́nico.
Se ha encontrado ahora que cuando se liofiliza una solución acuosa de un péptido o una proteı́na y
LMWHA que no está reticulado, se forma una capa en forma de una torta con una estructura como un
tejido o un papel de filtro. El “papel” es poroso, masivo y homogéneo. Este “papel” puede cortarse en
una forma deseada, puede desgarrarse y se maneja fácilmente. Para este “papel”, se conoce la cantidad
exacta del fármaco por área. Esto significa que la dosificación puede ser precisa cuando se conoce el área
del “papel”.
40
También se ha encontrado que cuando se aplica este “papel” tópicamente, sublingualmente o bucalmente, la cantidad total del fármaco se libera rápidamente.
El fármaco es estable y mantiene la actividad dentro de esa formulación durante el almacenamiento.
45
La formulación reivindicada es biocompatible cuando se aplica a seres humanos y es un medio perfecto
para el tratamiento de úlceras de diferente tipo.
50
El “papel” o la “torta” pueden aplicarse directamente a la úlcera o en la boca. El fármaco será
liberado rápidamente de ese modo por el pus o la saliva.
También se ha encontrado que el fármaco puede estar presente en una alta concentración cuando se
liofiliza junto con HA de bajo peso molecular.
55
La presente invención se refiere ası́ a una composición farmacéutica en la forma de una capa de una
matriz blanda, flexible y continua liofilizada de ácido hialurónico de bajo peso molecular, caracterizada
porque comprende un ácido hialurónico, que no está reticulado, que tiene un peso molecular entre 50.000
y 200.000 Da o una sal del mismo, que contiene al menos un péptido o una proteı́na.
60
El péptido o la proteı́na podrı́an ser, por ejemplo, GH, IGF-I, IGF-II o EGF o mezclas de los mismos.
Por GH se entiende hormona del crecimiento o análogos funcionales de la misma, por IGF se entiende
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factor de crecimiento similar a insulina o análogos funcionales del mismo, tanto por IGF-I e IGF-II como
por EGF se entiende factor de crecimiento epidérmico o análogos funcionales del mismo.
5
Un agente antibiótico puede mezclarse con una hormona del crecimiento o un factor del crecimiento
cuando se aplica a una herida.
Por análogo funcional se entiende una sustancia que tiene la misma actividad biológica que el péptido
o la proteı́na y que tiene al menos 75 % de homologı́a con el péptido o la proteı́na.
10
La invención se refiere además a un procedimiento para la fabricación de la matriz o la composición
farmacéutica, que se caracteriza por liofilizar una solución acuosa del ácido hialurónico de bajo peso
molecular y el péptido o la proteı́na en una capa. Esta liofilización y la producción adicional del artı́culo
farmacéutico pueden ser estériles.
15
La invención también se refiere al uso de ácido hialurónico de bajo peso molecular liofilizado, que no
está reticulado, que tiene un peso molecular entre 50.000 y 200.000 Da, en la forma de una capa, como
portador para un péptido o una proteı́na.
Este uso es preferiblemente para la dosificación exacta del péptido o la proteı́na.
20
25
La invención también se refiere al uso de la composición farmacéutica reivindicada para la fabricación
de un medicamento para la curación de heridas y a un método para obtener exactamente una dosificación
predeterminada de un péptido o una proteı́na que pueden administrarse tópicamente, que se caracteriza
por liofilizar una solución acuosa del ácido hialurónico de bajo peso molecular y el péptido o la proteı́na
para formar una capa.
La capa puede tener entre 1-40 mm y es preferiblemente de 2-12 mm.
La GH puede estar en una concentración de 1-200 UI/Ml y está preferiblemente entre 5-120 UI/ml.
30
El pH puede estar entre 6,0 y 8,0 en la solución acuosa antes de la liofilización.
La hormona del crecimiento se usa aquı́ como un ejemplo para la utilidad de la invención.
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Estabilidad de proteı́nas
La estabilidad de las proteı́nas depende de las propiedades quı́micas y fı́sicas de la proteı́na.
40
Se conocen diferentes rutas de degradación, tales como desamidación, oxidación, segmentación y agregación.
La desamidación y la oxidación son reacciones quı́micas comunes que comprenden cambios de la estructura primaria de la proteı́na. La desamidación se produce especialmente en soluciones acuosas, pero
una baja temperatura y un bajo pH de las soluciones suprimen la reacción de desamidación.
45
Diferentes formas de agregación resultan de la inestabilidad fı́sica de la proteı́na. Los agregados pueden ser solubles o insolubles y la unión de ambas formas puede ser covalente o no covalente.
50
Los agregados pueden dar soluciones opalescentes pero también pueden ser una agregación no visible
que sólo puede observarse quı́micamente.
55
La prevención de la agregación covalente en formulaciones de proteı́nas es de importancia ya que tales
procedimientos son irreversibles y podrı́an dar como resultado la producción de especies inactivas que
además también pueden ser inmunogénicas. Los cambios en la estructura primaria también pueden dar
lugar a cambios de conformación que pueden ser la causa de autoasociación de la proteı́na y agregación.
La agregación no covalente que se produce bajo ciertas condiciones puede conducir a precipitación y
pérdida de actividad.
60
Sin embargo, controlando estas reacciones de degradación, es posible probar indirectamente que el
fármaco (en los ejemplos, GH) retiene toda la actividad biológica. (Bristow A F y otros Pharmeuropa,
Human Growth Hormone, Vol. 3, 1-49, Marzo de 1991).
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Métodos
Enfoque isoeléctrico (IEF) con evaluación densitométrica
5
El IEF es un método de acuerdo con el cual puede evaluarse la extensión de la desamidación.
10
15
La separación de los componentes de hGH se lleva a cabo en un gradiente de pH, que se establece
entre dos electrodos y se estabiliza mediante anfolitos portadores. Las proteı́nas migran hasta que se
alinean en su punto isoeléctrico en el gradiente, punto en el cual una proteı́na no posee carga global neta
y por lo tanto se concentra a medida que la migración cesa. Ası́, la separación se obtiene de acuerdo
con la carga. La distribución relativa de formas de hGH cargadas se cuantifica mediante exploración
densitométrica de polipéptidos teñidos con azul de Coomassie.
Cuanto mayor es el porcentaje del monómero, mayor desamidación.
Distribución de tamaños de polipéptidos (SDS-PAGE)
20
25
Proteı́nas en preparaciones de somatropina, hGH, se desnaturalizaron mediante dodecilsulfato sódico
(SDS) para dar complejos moleculares cargados negativamente de SDS-proteı́na. La separación se obtuvo a continuación de acuerdo con el tamaño molecular mediante electroforesis en geles de poliacrilamida
(PAGE) en presencia de SDS. La distribución relativa de tamaños de polipéptidos de hGH se cuantificó
mediante exploración densitométrica de las bandas de polipéptidos teñidas con plata.
Inspección visual
La apariencia de las soluciones se inspeccionó a simple vista de acuerdo con Ph. Eur. 2a¯ Ed. La
escala es de I a IV y I es lo más transparente.
30
Ejemplos
Ejemplo 1
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40
Se ha producido ácido hialurónico con un peso molecular de aproximadamente 150.000 daltons a partir
de hialoronato de Na. Se disolvieron 2,51 g de hialoronato de Na (Pharmacia Ab, Suecia) en 500 ml de
agua en atmósfera de argón.
Se añadieron 16 ml de HCl y la mezcla se agitó ulteriormente durante 2 horas a 22-23◦C. El pH era
<1. La solución se neutralizó hasta pH 7,0 con NaOH 0,5 M. A continuación, se añadió HCl 0,37 M y la
solución se agitó durante 5 horas a 45◦C, en atmósfera de argón. Se alcanzó a continuación pH 7,0 con
NaOH 0,5 M.
La solución se dializó usando un tubo de dialización con agua destilada. El tubo usado era 130885/10
30 M con un corte 12-14 x 103 D.
45
El peso molecular del ácido hialurónico se analizó en la solución y el ácido hialurónico se liofilizó. La
liofilización se realizó durante 30 horas en un liofilizador de rotación a de -5◦C a -50◦C.
Ejemplo 2
50
Ácido hialurónico con un peso molecular (LMWHA) de 150.000 en agua se mezcla con hormona del
R
de Pharmacia AB, Suecia) de modo que cada ml comprende 6,5 mg de
crecimiento (GH, Genotropin
LMWHA y 100 UI de GH. Se ponen 10 ml de la solución en una placa Petri con un diámetro de 70 mm
con tapa. Las soluciones se liofilizan de acuerdo con el siguiente esquema:
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Congelación
60
1◦ secado
2◦ secado
0-5◦ C durante 3 horas
-45◦ C durante 26 horas
-30◦ C durante 28 horas a 0,1 mBar
+25◦ C durante 5-6 horas a 0,1 mBar
5
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Después del almacenamiento a 5-8◦ C durante un mes la torta se disuelve en 2 ml de agua destilada y
se analiza. Se obtuvieron los siguientes resultados: (Tabla 1)
TABLA 1
5
Pruebas:
1.
2.
3.
10
15
20
25
30
4.
tiempo de disolución (minutos)
transparencia
SDS-PAGE
agregados (%)
GH (%)
Fragmento (%)
IEF
Componente principal (%)
desamidación (%)
5
11
0,6
98,8
0,7
99
0
Ejemplo 3
Ácido hialurónico con un peso molecular (LMWHA) de 150.000 se mezcla con hormona del creciR
de Kabi Pharmacia AB, Suecia) del siguiente modo: se mezclan 65 mg de
miento (GH) (Genotropin
R
, 76 UI/ml, y se diluyen hasta 10 ml con agua destilada,
ácido hialurónico con 2,65 ml de Genotropin
de modo que cada ml comprende 6,5 mg de LMWHA y 20,1 UI de GH. Se aportan 10 ml de la solución
en una placa Petri con el diámetro de 70 mm con tapa. Las soluciones se liofilizan como se describe en
el Ejemplo 2.
La torta liofilizada es como un papel de filtro que puede curvarse y puede cortarse. El diámetro es
6,0 cm y el grosor es 0,5 cm2 .
R
y 2,3 mg de ácido hialurónico,
Se formula 1 cm2 de la torta para contener 7,1 UI de Genotropin
150.000 daltons.
35
Se corta y analiza 1 cm2 de la torta. Véase la Tabla 2.
TABLA 2
Meses
40
0
1
1
5◦ C
30◦ C
1
2
3
0,5
99
0,5
2,9
96,2
0,8
4,5
94,5
1,0
99
1
97
1
94
0
Pruebas:
45
1.
2.
50
3.
tiempo de disolución (minutos)
SDS-PAGE
agregados (%)
GH (%)
Fragmento (%)
IEF
Componente principal (%)
desamidación (%)
55
Los resultados de la formulación reivindicada confirman que un fármaco en una matriz liofilizada de
ácido hialurónico de bajo peso molecular puede almacenarse a baja temperatura durante al menos un
mes a 30◦ C.
60
Este resultado era sorprendente, ya que las proteı́nas y especialmente la GH normalmente son inestables y no es posible almacenarlas a temperatura ambiente durante un perı́odo de tiempo tan largo.
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ES 2 182 886 T3
Mediante un ensayo biológico, la nefelometrı́a, se determinó la cantidad de GH por unidad de área.
Se encontró que la hormona del crecimiento estaba distribuida uniformemente (homogéneamente) en la
torta.
5
Estos resultados demuestran indirectamente que la hormona del crecimiento retiene la actividad
biológica completa, ya que se observaba poca o ninguna degradación después del almacenamiento de
hormona del crecimiento formulada con ácido hialurónico de bajo peso molecular liofilizado.
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25
30
35
40
45
50
55
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REIVINDICACIONES
5
1. Composición farmacéutica en la forma de una capa de matriz blanda, flexible y continua, liofilizada,
de ácido hialurónico de bajo peso molecular en la forma de una capa, caracterizada porque comprende
un ácido hialurónico, que no está reticulado, que tiene un peso molecular entre 50.000 y 200.000 Da, o
una sal del mismo, y al menos un péptido o una proteı́na.
2. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que el péptido se elige de
al menos uno de GH, IGF-I, IGF-II y/o EGF.
10
15
3. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, mezclada con un agente antibiótico.
4. Procedimiento para la fabricación de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por liofilizar una solución acuosa del ácido hialurónico de bajo peso molecular
y el péptido o la proteı́na en una capa.
5. Uso de una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para
la fabricación de un medicamento para la curación de heridas.
20
6. Uso de ácido hialurónico de bajo peso molecular liofilizado, que no está reticulado, que tiene un
peso molecular entre 50.000 y 200.000 Da, en la forma de una capa, como portador para un péptido o
una proteı́na.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, para la dosificación exacta del péptido o la proteı́na.
25
8. Método para obtener exactamente una dosificación predeterminada de un péptido o una proteı́na
que puede administrarse tópicamente, caracterizado por liofilizar una solución acuosa de ácido hialurónico de bajo peso molecular, que no está reticulado, que tiene un peso molecular entre 50.000 y
200.000 Da, y el péptido o la proteı́na, para formar una capa.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
8