LA INTERACCIÓN ENTRE IZUMO1 Y JUNO EN LA FECUNDACIÓN

LA INTERACCIÓN ENTRE
IZUMO1 Y JUNO EN LA
FECUNDACIÓN
El conocimiento de la proteína espermática, Izumo1,
ha permitido descubrir el receptor asociado a ella
(Juno), permitiendo un mejor entendimiento de la
fertilización.
PABLO MARCOS CAVA
GENÉTICA MOLECULAR 2014
Wassarman, P. M. (2014) Sperm protein finds its mate. Nature 508, 466-467.
Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., & Wright, G. J. (2014). Juno is the egg Izumo receptor and is essential
for mammalian fertilization. Nature.
INTRODUCCIÓN – ANTECEDENTES
La fertilización es el proceso por el cual los óvulos y espermatozoides interactúan, logrando el
reconocimiento mutuo, y fusionándose para crear un cigoto. Este cigoto se desarrollará formando un nuevo
individuo, y permitiendo así la continuidad de una especie.
A pesar de los numerosos estudios sobre la fertilización en los mamíferos, los mecanismos moleculares que
la propician no estaban totalmente corroborados o eran aún desconocidos. En cambio tras varios años de
investigación, se ha descubierto el posible receptor que interacciona con la proteína espermática
responsable de la adhesión del esperma al óvulo durante la fertilización (Izumo 1) y que está esclareciendo,
a partir de trabajos tanto en animales genéticamente manipulados como in vitro, algunas de las posibles
moléculas esenciales en la fecundación y sus mecanismos.
La proteína descubierta, receptora de la proteína espermática (Izumo1), se denomina Folr4 porque procede
de la familia de receptores del folato; y se encuentra en la membrana plasmática del óvulo. Además se
propone denominar al receptor como Juno.
Se ha observado que la interacción Izumo1 con Juno se conserva dentro de varias especies de mamíferos,
incluyendo seres humanos. Los ratones hembra que carecen de Juno son infértiles. Tras la fecundación la
expresión de Juno disminuye notablemente, sugiriendo además un posible mecanismo de membrana que
bloquee la polispermia (penetración de más de un espermatozoide dentro del óvulo en un mismo evento de
fertilización) (Fig. 1).
Figura 1. a - Explica el mecanismo de adhesión del esperma al óvulo durante una fertilización
común. El receptor Juno está en el oolema (membrana del óvulo) debajo de la zona pelúcida.
b – Tras la fertilización, Juno se expulsa mediante vesículas extracelulares (bloqueo de la
polispermia).
El descubrimiento de un par receptor esencial en el proceso de fertilización ofrece un nuevo punto de
investigación en el desarrollo de nuevos tratamientos; por tanto el estudio se basa en la interacción entre la
proteína espermática, Izumo 1 y su receptor en el óvulo, Juno (o Folr4) y las propiedades y características
de esta asociación.
PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS DE LA ASOCIACION ENTRE Izumo 1 Y Folr4
MÉTODOS EXPERIMENTALES Y RESULTADOS
1. Juno es el receptor de Izumo1 en el ovocito.
- Para identificar cual era el receptor de Izumo 1 se expresó su ectodominio para utilizarlo como una sonda
que sirviese para amplificar la interacción con el receptor en el óvulo. Además se oligomerizó mediante una
secuencia peptídica que formaba pentámeros (COMP) y así favorecer la visualización. Esta sonda se unió a
la membrana del óvulo inmaduro sin fecundar (ovocito) (Fig. 2).
Figura 2 - muestra la composición de la sonda utilizada. Posee un promotor de
CMV para favorecer la transcripción del ectodominio. Una región CD4,
seguida por COMP, proteína de matiz que favorecía la oligomerización en
pentámeros. Y por último hay dos etiquetas (β-Lac y His) para la identificación
y purificación respectivamente.
- Se propuso el cambio de nombre de Folr4 por Juno, debido a que se observó que su función no consistía
en absorber el folato, sino que permitía la interacción con Izumo1. Esto se analizó a partir de la
comparación con los aminoácidos de Folr1 y Folr2, los cuales si absorbían el folato. (Fig. 3)
Figura 3 - muestra la comparación de las secuencias alineadas de Folr1, Folr2 y Juno tanto en ratones como en
humanos. En roja se presentan los aminoácidos claves para la absorción de folato, en cambio en Juno, se observan
aminoácidos en azul que deberían ser rojos; estos aminoácidos son aquellos que determinan que la función sea de
unión a Izumo 1 y no de absorción de folato.
2. La interacción entre Juno e Izumo 1 es directa y conservada.
- Directa. Se demostró a través de la expresión y purificación del ectodominio de Juno mediante
plasmoresonancia. De esta forma se demostró que es una interacción altamente transitoria pero directa entre
Izumo1 y su receptor en el óvulo.
Antiguas observaciones afirmaban que el dominio Izumo era suficiente para la unión al óvulo, sin embargo
se han hecho estudios recientes con interacciones de afinidades más bajas para observar sí la eficiencia de la
unión variaba. Para ello se ha expresado no solo el ectodominio de Izumo1, sino también los de Izumo 3 y 4
y se ha comprobado que a diferencia de lo que se creía, solo Izumo 1 y Juno interaccionan directamente
propiciando una fecundación eficaz (Fig. 4).
Figura 4 - muestra como la interacción entre Izumo 1 y Juno
(en ratón) tiene una constante de unión en equilibrio transitoria
pero directa. Cuanta más cantidad de Juno-CD4, mayor será la
respuesta.
- Conservada. Se expresaron todos los ectodominios de Izumo y Juno de algunos mamíferos (cerdo,
humano, ratón o zariguella entre otros) y se observó una clara vinculación y relación entre ellos por lo que
se confirmó la conservación dentro de mamíferos (Fig. 5).
Figura 5. b – muestra la especificidad de unión de Izumo1
con Juno (Folr4) en ratón. c - La interacción Izumo1-Juno
se conserva a través de los mamíferos.
3. Juno es esencial para la fertilización.
Para alcanzar esta conclusión, primero se agregó un anticuerpo monoclonal anti-Juno para bloquear la
interacción entre Juno e Izumo1 en ensayos de fertilización in vitro (FIV) y se observó su eficacia como
inhibidor de la fertilización incluso a concentraciones mínimas (µg ml-1).
Se crearon ratones deficientes en Juno, es decir se interrumpió el locus con el alelo para Folr4. Se observó
que los individuos -/-, tanto machos como hembras se desarrollaban morfológicamente de la misma forma
que los wildtype; pero en cuanto a los apareamientos, los resultados variaban notablemente. Los machos -/y hembras +/- eran aún fértiles, pero en cambio, las hembras -/- no consiguieron producir ni una sola
camada en los 3 meses durante los cuales se cruzaron con machos wildtype fértiles confirmados. Estas
hembras se comportaban normalmente y respondían de manera adecuada a tratamientos hormonales
(generaban óvulos normales y en un número que no difería de la media) pero eran totalmente infértiles (Fig.
6).
Figura 6. a – Muestra cómo el anticuerpo anti-Juno impide totalmente la fecundación.
b – Muestra como las hembras de ratón deficientes en Juno no tienen eficacia en la
fecundación, ni en el caso de un apareamiento con machos fértiles.
c – Los ratones deficientes en Juno no consiguen que el esperma se fusione con el óvulo;
quedando este en el espacio perivitelino.
4. Juno desaparece rápidamente tras la fertilización.
Después de la fertilización natural, los ovocitos se vuelven muy refractarios a la entrada de nuevos
espermatozoides y para ello Juno desaparece de la superficie del óvulo en forma de vesículas extracelulares
que evitan que se internalice. De esta forma se evita la polispermia. Esto se consigue mediante dos
mecanismos que aún no están totalmente demostrados: el slowacting, sección de enzimas que endurecen la
zona pelúcida del óvulo para evitar la fusión de más espermatozoides; y el fasteracting, que consiste en
cambios bioquímicos.
Estudios recientes han demostrado que a diferencia de la fecundación natural, en la partenogénesis con
etanol y en la inyección de intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), Juno no desaparece y por tanto
no se bloquea la polispermia. (Fig. 7)
Figura 7. a – Fertilización natural: Juno (tinción verde) se encuentra en la superficie
celular durante la metafase, pero a medida que avanza la meiosis desaparece; hasta el
punto en el que en la fase pronuclear no aparece. c – ICSI o partenogénesis: Juno no
desaparece en ninguna fase de la meiosis a pesar de haberse fusionado ya un
espermatozoide.
Algunos de los procedimientos experimentales necesarios para los estudios fueron:
1. Generación y cría de ratones transgénicos.
Se generaron ratones deficientes en Juno que contenían un alelo Knockout en el locus genómico de
Folr4/Juno, llamado Folr4tm1a. Si el ratón tiene los dos alelos interrumpidos se considera homocigoto -/-.
Se usaron células madre embrionarias derivadas de ratones C57BL/6N con el locus Folr4/Juno correcto y se
inyectaron en blastocistos de ratón, para posteriormente trasplantarlos a ratones pseudoembarazadas con el
locus interrumpido y crear así ratones quimera.
Se utilizó una segunda colonia de ratones transgénicos Folr4tm2a para descartar que la deficiencia en Juno
se debiese a mutaciones secundarias y no a la interrupción del locus con el alelo Folr4. La fertilidad de los
diferentes ratones se probó con múltiples apareamientos.
2. Producción de proteínas recombinantes.
Las regiones que codificaban los dominios extracelulares de Juno e Izumo 1, que interaccionan entre ellos,
se hicieron mediante síntesis de genes y de codones optimizados para la expresión, a partir de una
biblioteca de cDNA equivalente al de los óvulos de ratón.
Para ello se flanquearon los dominios extracelulares con sitios únicos de restricción de NotI y AscI, los
cuales se utilizaron para clonar las proteínas en vectores de expresión, que además tenían una etiqueta de
biotina o de una secuencia pentamérica para su identificación.
3. Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)
Inyecciones mediante pulsos piezoeléctricos a través de la zona pelúcida para permitir la entrada de algunos
espermatozoides. Tras esto con un único pulso de mayor intensidad, se rompe el oolema y se introduce la
cabeza de un único espermatozoide para la fecundación.
CONCLUSIONES
Los estudios realizados sobre la asociación de Juno con Izumo1 han permitido demostrar algunas de las
hipótesis que se manejaban sobre la interacción entre la proteína espermática y el óvulo, de las cuales las
más relevantes son las siguientes:
-
La interacción de Izumo1 con Juno es imprescindible para la fecundación.
Juno es indetectable tras la fertilización.
Hay una pérdida de expresión gradual de la proteína de unión.
Se bloquea la polispermia en la fertilización natural.
Posibles investigaciones futuras relacionadas:
-
-
-
Métodos anticonceptivos que actúen sobre el complejo Izumo1-Juno:
Esto supondría un avance en los anticonceptivos, ya que dejarían de utilizarse medicamentos de
alto nivel hormonal que a la larga pueden provocar una mayor dificultad en la fertilización.
Estudio de las proteínas relacionadas con la fusión celular:
Hay evidencias que sugieren que aunque Izumo1 induce interacciones de superficie tales como la
adhesión entre las membranas celulares, no promueve la fusión de la membrana (no encontraron
evidencias de fusión celular). Como se mencionaba anteriormente; se ha llegado a la conclusión de
que la interacción Izumo 1- Juno es necesaria para la adhesión entre el esperma y los óvulos, pero
se ha comprobado que la fusión celular necesita otras proteínas de membrana. Por tanto los nuevos
estudios deberían centrarse en descubrir que otras proteínas pueden estar implicadas en esa fusión
celular.
Proceso de eliminación de Juno tras la fertilización: Únicamente se conoce que se produce de forma
extracelular mediante vesículas pero no se conoce como es posible que Juno no desaparezca en la
fertilización no natural; es decir, nuevas investigaciones deben centrarse en descubrir que consigue
retener a Juno en la superficie del óvulo e impedir así el bloqueo de la polispermia.
BIBLIOGRAFÍA
- Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., & Wright, G. J. (2014). Juno is the egg Izumo receptor and is essential
for mammalian fertilization. Nature.
- Okabe, M. (2013). The cell biology of mammalian fertilization. Development, 140(22), 4471-4479.
- Wassarman, P. M. (2014) Sperm protein finds its mate. Nature 508, 466-467.