interacciones cooperativas y efectos contextuales en dominios sh3 y

TESIS DOCTORAL
INTERACCIONES
COOPERATIVAS Y EFECTOS
CONTEXTUALES EN
DOMINIOS SH3 Y WW
Ana MªZafra Ruano
Granada, 2014
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Ana María Zafra Ruano
D.L.: GR 2230-2014
ISBN: 978-84-9083-303-2
UNIVERSIDAD DE GRANADA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA
Memoria presentada para aspirar al grado de
Doctor en Química
Fdo: Ana Mª Zafra Ruano
Granada, a 3 de Octubre de 2014
Vº Bº
DIRECTORES DE LA TESIS
Dra. Irene Luque Fernández
Profesora Titular
Departamento de Química
Física
Universidad de Granada
Dr. Javier Ruiz Sanz
Profesor Titular
Departamento de Química
Física
Universidad de Granada
El doctorando Ana María Zafra Ruano y los directores de la tesis Irene
Luque Fernández y Javier Ruiz Sanz garantizamos, al firmar esta tesis
doctoral, que el trabajo ha sido realizado por el doctorando bajo la
dirección de los directores de la tesis y hasta donde nuestro
conocimiento alcanza, en la realización del trabajo, se han respetado los
derechos de otros autores a ser citados, cuando se han utilizado sus
resultados o publicaciones.
En Granada, a 3 de Octubre de 2014
Director/es de la Tesis
Irene Luque Fernández
Javier Ruiz Sanz
Fdo.:
Doctorando
Ana Mª Zafra Ruano
Fdo.:
Decía Pedro Casaldáliga “Al final del camino me dirán: ¿Has
vivido? ¿Has amado? Y yo, sin decir nada, abriré el corazón lleno de
nombres”. Y ahora, llegado el final de esta etapa, toca abrir el corazón y
dar las gracias a todos aquellos que de un modo u otro han estado
presentes durante todos estos años.
En primer lugar agradecérselo a mis jefes, Irene y Javi, por la
confianza que han puesto en mi y porque a ellos les debo todo lo que he
aprendido estos años. Gracias a Irene por haber despertado en mi el
gusanillo de la investigación, por haberme abierto las puertas del
laboratorio cuando todavía era estudiante de Química y por todo el
apoyo y las oportunidades que me has dado para crecer como científica.
Gracias a Javi por tu ayuda siempre que la he necesitado (tanta ha sido
que no olvidaré el día que te pusiste a ayudarme a limpiar cacharros con
las infinitas purificaciones de los mutantes), gracias por tu paciencia
infinita conmigo, por preocuparte siempre de que todo esté bien y por
estar ahí en todo momento.
Agradecerle también a Pedro Luis por haberme transmitido la
pasión por la termodinámica, por mostrarme que la ciencia y la química
tienen una gran historia que merece ser contada, por haberme dado la
oportunidad de compartir docencia y por nunca perder ese entusiasmo
por la enseñanza.
Gracias a Jose por estar siempre dispuesto a ayudarme en lo que
he necesitado y por tus consejos para la ciencia y la vida. A Eva
también por tu ayuda incondicional, por tu cercanía y apoyo durante
todo este tiempo. A Salva, siempre genio y figura, gracias por todo lo
vivido, desde los karaokes y las meriendas en tu casa hasta enseñarme
cómo montar un circuito para las prácticas de bioquímica. Gracias por
tu generosidad, por las risas y por ser un buen amigo. A Mª del Mar,
aquella chica que volvía de Alemania cuando yo entré en el laboratorio
y a la que a menudo se le escapaba alguna palabra en alemán que me
hacía dudar si realmente era alemán o almeriense profundo, gracias por
tu apoyo y tu afecto. Gracias a Araceli, porque nos ha tratado siempre
como a sus “niños”, por preocuparte por nosotros, por estar dispuesta a
echarnos una mano en lo que hemos necesitado, por tu confianza, por
tu interés y cariño. A Jose Miguel por ayudarme siempre con la
fotocopiadora, porque por mucho doctorado que esté haciendo, nunca
sabré hacer bien la fotocopia del D.N.I. Gracias también por tu gestión
con las facturas, por no matarme cuando te llenaba la mesa con ellas y
por tu ayuda con todo el tema de papeleos en general. A Anabel
agradecerte siempre tu cercanía, tu cariño y tu apoyo en todo momento.
Gracias al resto de profesores del departamento, a Enrique, Quico, Bea,
Isa, Mercedes, Jose Manuel y Antonio Parody, por el interés mostrado
durante estos años.
Parte de esta tesis y de lo que aprendí cuando empecé se lo debo
a Jose Manuel, gracias por haber sido mi maestro en este mundo de la
biofísica, por todos los buenos ratos que hemos pasado en el laboratorio
y fuera de él, por creer en mi aunque yo sigo pensando que soy la
misma gorriona a la que enseñabas hace 6 años, gracias por hacerme
reír, por tu cariño y por tu amistad. Gracias a Carles porque, aunque
nadie se lo crea, él me enseñó a hacer geles de poliacrilamida y pruebas
de expresión. A Manu y a Bertrand, por estar siempre dispuestos a
echarme una mano en el laboratorio. A Pedro, por amenizarme los
experimentos con buena música, por tu preocupación, por tu ayuda y tu
constancia, estoy segura de que llegarás a ser un gran científico. A
Fátima, por todo lo vivido y por ser fundadora de Quémica Fúsica. A
Fran, infinitas gracias por tu ayuda en el laboratorio, sobre todo con los
dominios WW, por poner siempre un toque de humor al laboratorio,
por dejarme siempre una canción pegadiza en la mente y sobre todo por
tu amistad. A David, gran científico y mejor amigo, por estar siempre
dispuesto a echar una mano a quien lo necesita, por ser un aventurero
de la ciencia y de la vida, por piropearnos siempre de buena mañana
aunque las ojeras nos lleguen al suelo, gracias. A Javi Murciano, por
nuestras conversaciones sobre lo humano y lo divino, por tu confianza y
ayuda, por saber ver siempre el lado bueno de las cosas. Gracias a Jose
Luis y Lorena, el día que os fuisteis se quedó un hueco muy grande en
el laboratorio, gracias por cuidarme, por las batallas con las espadas de
goma espuma, por haberme hecho sentir parte de vuestra familia,
porque a pesar de la distancia y el tiempo la amistad permanece, gracias
por tanto cariño y sobre todo por uno de los regalos más bonitos que
jamás me han hecho, ser la tita de Emma. A mi Mª Ángéles, por la
amistad desde primero de carrera, por nuestros viajes, por tu apoyo y
cariño, por ser ejemplo de superación y valentía, por todas las risas
dentro y fuera del laboratorio, por todo lo vivido y lo que queda por
vivir y compartir. A Sara, creo que podría escribir otro libro para darte
las gracias por tantas cosas. Gracias sobre todo por ser una grandísima
amiga, por estar siempre ahí aunque ahora nos separen unos cuantos
kilómetros, por tu entrega y tu ayuda en el laboratorio (sobre todo
arreglando el ITC), por tantos viajes y tantas experiencias vividas como
las “turistas”, por tirar de mi cuando las fuerzas aflojaban, por venir a
cuidarme cuando estaba enferma. Gracias por todas las risas durante
estos años, por entenderme siempre, parte de esta tesis también es tuya.
A mi compañeros del otro labo, a Noel, Encarni, Ángel, Roci, Sisi,
Héctor, Álvaro y en especial a Inma por tu amistad y cariño. A Adela,
por alegrarme las mañanas con tus “buenos días princesa”, por ser mi
compañera en los conciertos de Ismael Serrano, por tus palabras de
ánimo, por toda la alegría que desprendes y tu amistad. A Sergio, por
sacarme siempre una carcajada, por tu sentido del humor, por tu apoyo
y tus consejos. A Valeria y a Fadia, por las noches delante de una copa
de vino intentando arreglar el mundo, por las fiestas sorpresa, por
escucharme siempre, por levantarme el ánimo, por estar ahí. Gracias a
Asun, por tener siempre unas palabras de apoyo y ánimo y por no
faltarte nunca la sonrisa. A Mari Carmen, por tu confianza, tu amistad
y tu ayuda.
Gracias a mis amigos Iris, Patri, Eli, Macías, Juli, Chema, Fran,
Mariví, Ana y Antonio, por ser el motivo de tanta felicidad durante los
cinco años de la carrera, por todos los buenos momentos, por el banco
de apuntes y exámenes que hicieron que aprobásemos más de una
asignatura, por las celebraciones en la calle Tórtola y en Iznalloz y por
los reencuentros en los que volvemos a repetir una y otra vez las mismas
batallitas con la misma ilusión y siempre nos reímos igual o con más
ganas. En especial agradecerles a Ana y a Antonio, mis compañeros de
la segunda fila año tras año, asignatura tras asignatura. Gracias a
Antonio por venir a rescatarme para tomarnos una cerveza fresquita en
el Vini después de un día entero en el laboratorio, por estar siempre
dispuesto a escucharme, por preocuparte por mi, por tu gran corazón y
por tanto cariño. A Ana, porque parte de lo que soy ahora te lo debo a
ti, gracias por abrirme las puertas de tu vida de par en par, gracias a ti he
podido conocer a grandes personas y he podido vivir momentos
increíbles, por venir a visitarme a Toronto para que se me pasase la
morriña, por todos los años de amistad vividos y los que nos quedan a
las Anas.
Cómo no agradecerles a mis amigos de la vida granadina, a
Mayte, Emilio, Robe, Dani, Sara, Rafa, Pili, a Baldo por tus frases
humorísticas/filosóficas que te hacen comprender mejor la vida, gracias
por vuestro ánimo y cariño. A Marta Marín y Elena, por los desayunos
terapéuticos (aunque nos hagamos un lío con los nombres de las
cafeterías), por estar siempre dispuestas a escucharme y por vuestras
palabras de ánimo. A Elena darte las gracias junto a Migue por haberme
ayudado con todos los temas de Canadá, por contar conmigo siempre
que se ha planeado una excursión, gracias por vuestro apoyo
incondicional.
Gracias a mis “Trinis”, a Pilar, Enri, Merche, Nazaret, Belén
por todo el cariño durante estos años, por haber hecho de la residencia
mi casa pero sobre todo agradecer a Loli haberme cuidado tanto los
años que estuve viviendo allí. Agradecerles a Mª Ángeles y Alberto, por
darme la oportunidad de enseñarles lo poco que sé a las niñas del hogar
de menores, gracias por vuestra entrega y testimonio. A las residentes, a
Rocío, Consuelo, Edu (siempre serás una más de nosotras), a Inma, por
los años de convivencia y amistad, por los cafés y los reencuentros
navideños, por ser grandes amigas. A los monitores del campamento, a
María, Mercedes, Javi, Curro, Marina, Jorge, Elena, Rocío, Fernando y
Paco, por vuestra amistad y por hacerme sentir siempre parte de
Málaga. A Currito, porque quién nos iba a decir que en aquel viaje a
Sevilla iba a conocer a tan tremendo personaje que al final sería un buen
amigo, tenemos muchos cafés y conciertos pendientes.
A mis amigos del instituto a Ascen, Encarni, Mariló y en
especial a Isa por tantos años de amistad, por acordarte siempre de mi
para ver cómo estoy, por acogerme en tu piso después de las fiestas, por
tus palabras de ánimo estos meses, por nuestros momentos
detectivescos, por todos los momentos vividos para los cuales también
necesitaría otro libro para agradecerte.
Quería dedicarle también mi agradecimiento a toda la gente que
conocí durante mi estancia en Toronto. A Pilar, mi compañera de
fatigas y alegrías durante la estancia. Por los desayunos para aclararnos
con los miles de papeles que había que entregar, por los correos
informándome al detalle sobre cómo iba a ser mi llegada a Toronto y la
vida y el frío canadiense. Por haber sido un gran apoyo durante estos
tres meses, por los fines de semana en los que Toronto o Hamilton se
volvían un poco más granadinos. Gracias por descubrirme los
maravillosos cafés del Tim Hortons, por las charlas por Skype cuando la
nostalgia nos invadía, por compartir cada domingo ese ratito de fe, hoy
puedo decir que de Canadá me traje a una gran amiga. Agradecerles
cómo no a Mar y a Pedro, por brindarme siempre su ayuda, por
hacerme sentir como en casa cuando estuve allí, por vuestros consejos y
por los ratitos tan buenos que hemos pasado en el Peppers y por
conseguir que nos pusieran tapas en Toronto, sois geniales. Gracias a
esa pequeña colonia de españoles que fueron como mi familia, a Miren,
Roci, Eugenia, Davinia, Oswaldo, María, Olsen, Matt y Ryan que
aunque canadienses de pro, una vez que cantaron la melodía del
Mercadona tuvieron para mi la nacionalidad española. I would like to
thanks to my supervisor in The Hospital for Sick Children, Daniela
Rotin for give me this opportunity, thanks to my lab mates Avi, Frozan,
Ruth, Chong, Chen, Anthony and Natasha for try to understand my
English, for your help and friendship. Nunca supe de la existencia del
“potluck” hasta que llegué al hospital, gracias a todas por vuestra
acogida, por vuestro interés y por los almuerzos tan deliciosos y sobre
todo a Esther por haberme hecho sentir una más en el departamento. A
Roni, por nuestros piques futboleros (la próxima final del mundial de
fútbol será España-México), gracias por tu afecto y por nuestras
conversaciones. Agradecerle cómo no a mi vecino del laboratorio de al
lado, Ismael, sus visitas mañaneras sustituyendo al café de media
mañana español, por las charlas gastronómicas y por todas las risas que
hacían que se sobrellevase mejor el horrible tiempo canadiense.
Si en algún lugar soy feliz en esta ciudad es en ese rincón entre
San Juan de Dios y San Jerónimo. Gracias a la pequeña y a la vez gran
familia que he encontrado allí, a Dolo, Carmen y Miguel Castro,
Pablete, Loli, Juan Carlos y Antonio Jesús por vuestro cariño, por
vuestra ayuda y confianza. Agradecerle cómo no a Carlos la confianza
puesta en mi, por acercarme a Dios con tus palabras, por tus chistes
malos y por tu entrega en el santuario. A mis catecúmenos (Caro, Juan
Carlos, Iara, Mapero, María, Nacho, Migue, Martola…y así podría
enumerar hasta 25 personajillos), gracias por tanto bien como aportáis a
mi vida, a Richar porque no he podido encontrar mejor compi, por tu
ayuda cada viernes y por todos esos abrazos que acaban con los días
tristes. Durante los tres meses de estancia no faltaba un día en el
recibiese un mensaje de Marian mandándome ánimos o acordándose de
mi en momentos importantes, gracias por tenerme presente, por tu
forma de ver la vida y por la alegría con la que me recibes cada vez que
nos encontramos. Gracias a Lourdes por las largas charlas arreglando el
mundo y nuestras vidas camino al curso de voluntariado, por tu
emoción cada vez que me preguntas por la tesis, por el empeño y
esfuerzo que pones en cada cosa que haces para que salga bien. Gracias
a Bea, María y Caro, por escucharme siempre, por los paseos por
Granada, por nuestras conversaciones, por vuestra forma de ver la vida
con tanto entusiasmo. Siempre he dicho que el al menos una vez en la
vida hay que hacer el Camino de Santiago porque en él siempre
descubres a grandes personas, yo descubrí en mi último camino a tres
grandes peregrinas. Gracias a Mª Luisa, Navarrete y Paula por seguir
caminando juntas en el camino de la vida, por ser apoyo en los
momentos de cansancio, por hacerme reír hasta tener agujetas en la
barriga. Gracias a María y a Jesús, por ser testimonio de amor y
bondad, por compartir conmigo vuestros momentos de felicidad, por las
risas y por vuestras palabras de ánimo y vuestra amistad. Hace dos años
una parte de mi se fue hasta California, gracias a mis chaparritas
Estefani y Marilou por todo lo vivido y compartido durante vuestra
estancia en Granada, porque abrir el buzón es motivo de felicidad
cuando me encuentro alguna de vuestras cartas y postales. Gracias a
Charo por abrirnos las puertas de tu casa cuando apenas nos
conocíamos, por no perder nunca la sonrisa, por sentir que siempre
estás cerca. A Sonia, por saber como me siento sólo con mirarme a la
cara, por los raticos del trío lalala con Emi rescatándome de la rutina de
la escritura de tesis, gracias amigas. Gracias a Samu, corazón con patas
y alegría de vivir en estado puro, gracias por las risas, por los viajes en el
coche fantástico, por estar siempre planeando algo que hacer, por los
buenos momentos delante de una cerveza, por tu presencia y por estar
siempre dispuesto a escucharme.
Gracias a mis amigos del pueblo, a Fátima, Funes, JuanMa, Mª
Paz, Justa y Blanca, por haber compartido desde la plastilina hasta los
botellines de cerveza. Gracias por comprender mis ausencias, por las
conversaciones terapéuticas, por tantos años de amistad.
Finalmente, dar las gracias a mi familia, a mis tíos y primos, por
interesarse por mi y darme ánimos. A mis abuelos, Miguel y Ana, por
sentir su protección aunque no estén ya con nosotros. A mis abuelos
Manuel a María, a mi abuelo Manuel por haberme enseñado a disfrutar
de las pequeñas cosas de la vida, a mostrarme que una simple lata
podría ser el mejor juguete y más ruidoso que se podía tener, por
enseñarme a cuidar y valorar la naturaleza que nos rodea. A mi abuela
María, ejemplo de mujer fuerte y luchadora, por haber sido mi otra
madre, por tanto amor entregado siempre sin esperar nada a cambio, te
quiero abuela. A mis padres, Manuel y María, a los que les debo algo
tan grande como es la vida, por ser para mi ejemplo de amor, entrega,
lucha, sencillez y humildad. Gracias por haberme dejado libertad a la
hora de decidir sobre mi vida, por enseñarme que las cosas que uno
quiere hay que ganarlas con esfuerzo, que siempre hay que sonreír
aunque la vida a veces se complique, por aguantarme cuando estoy
insoportable, por cuidarme siempre, por haber sido mi apoyo durante
estos últimos meses. Esta tesis no hubiese sido posible sin vosotros, por
eso es vuestra. Os quiero.
Muchos son los nombres que se habrán quedado en el tintero,
gracias a todos aquellos que de un modo u otro habéis sido partícipes de
todo lo vivido estos años. Gracias a Dios por haberlos puesto a todos
ellos en mi camino, por ser luz, apoyo y consuelo. Es una fortuna saber
que hay sitios en los que te están esperando con los brazos abiertos. Una
fortuna es escuchar consejos de quien te quiere, porque salen de una
cabeza que piensa en frío y un corazón que siente como el tuyo. Una
fortuna es tener cerca a alguien que considera que debe devolver al
mundo lo bueno que recibió. Una fortuna es conocer a esa persona que
transforma obligación en devoción, que sonríe y llora con la misma
sinceridad, que no es infalible pero saca fuerzas a diario para seguir al
pie del cañón. Una fortuna es poder volver a ver a quien echabas de
menos y recordar viejos tiempos, sin descuidar el presente y teniendo la
certeza de que aún os quedan grandes planes por llevar a cabo. Hoy me
siento afortunada por tener grandes tesoros como vosotros.
“Vosotros sois sal de la tierra y luz del
mundo” Mt 5
A mis padres, Manuel y María
A mi abuela María
ÍNDICE
CAPÍTULO 1.- INTRODUCCIÓN
37
1.1.
Introducción
37
1.2.
Dominios modulares
38
1.2.1.
Reconocimiento de secuencias ricas en prolina
39
1.2.2.
Dominios SH3
42
1.2.2.1. Importancia
plegamiento
biológica,
estructura,
estabilidad
y
42
1.2.2.2. Reconocimiento de ligandos ricos en prolina
45
1.2.3.
51
Dominios WW
1.2.3.1. Importancia biológica, estructura y plegamiento
51
1.2.3.2. Interacción de los dominios WW con ligandos ricos en
prolina
54
1.3.
Familia de las quinasas de tirosina
56
1.3.1.
Quinasa de tirosina cAbl
59
1.3.2.
Quinasa de tirosina cSrc
64
1.4.
Ligasa de ubiquitina humana Nedd4
67
1.5.
Cooperatividad y alosterismo
69
1.6.
Objetivos
70
CAPÍTULO 2.- MATERIALES Y MÉTODOS
75
2.1.
Clonado, expresión y purificación
75
2.1.1.
Dominio SH3 de cSrc
75
2.1.2.
Dominio SH3 de cAbl
76
2.1.3.
Construcciones en tándem de cAbl y cSrc
77
2.1.4.
Dominios WW de hNedd4 y su construcción en tándem
78
2.1.5.
Obtención de mutantes del dominio SH3 de cSrc y de la
construcción en tándem de cAbl
80
2.2.
Preparación de las muestras
81
2.2.1.
Preparación y determinación de las concentraciones de las
disoluciones de proteína
81
2.2.2.
Preparación y determinación de las concentraciones de las
disoluciones de ligando
83
2.3.
Espectroscopía de fluorescencia
84
2.3.1.
Introducción
84
2.3.2.
Experimentos de titulación
espectroscopía de fluorescencia
proteína-ligando
mediante
84
2.3.3.
Análisis de un experimento de titulación proteína-ligando
mediante espectroscopía de fluorescencia
85
2.4.
Calorimetría Diferencial de Barrido
87
2.4.1.
Introducción
87
2.4.2.
Realización del experimento calorimétrico
89
2.4.3.
Cálculo de la capacidad calorífica molar parcial de la proteína
89
2.4.4.
Análisis de las trazas calorimétricas según la termodinámica
de equilibrio. El modelo de equilibrio de dos estados
91
2.5.
Calorimetría Isotérmica de Titulación
94
2.5.1.
Introducción
94
2.5.2.
Diseño del experimento de ITC
95
2.5.3.
Realización de los experimentos de ITC
97
2.5.4.
Formulación y análisis de los experimentos de ITC
98
2.5.4.1. Modelo de unión de un ligando a una macromolécula con “n”
sitios idénticos e independientes
98
2.5.4.2. Modelo de unión de un ligando a una macromolécula con
“m” clases de sitios diferentes e independientes
102
CAPÍTULO 3.- Transmisión de información a través de efectos
alostéricos en el domino SH3 de cSrc
109
3.1.
Introducción
109
3.2.
Resultados y discusión
111
3.2.1.
Identificación de la red de interacciones cooperativas en el
dominio SH3 de cSrc
111
3.2.2.
Comprobación experimental de la predicción de las redes
alostéricas
115
3.2.2.1. Selección de los mutantes del dominio SH3 de cSrc
115
3.2.2.2. Caracterización del equilibrio conformacional de los mutantes
del dominio SH3 de cSrc
116
3.2.2.3. Influencia de la unión del ligando en la energética de unión
120
3.2.3.
Src
Impacto de las mutaciones sobre los niveles de fosforilación de
126
3.2.4.
Robustez de la red alostérica
127
3.3.
Conclusiones
133
CAPÍTULO 4.- Estudio de la distribución conformacional de cAbl y
su modulación por interacciones intramoleculares
137
4.1.
Introducción
137
4.2.
Resultados y discusión
139
4.2.1.
Construcciones de la quinasa de cAbl y cSrc
139
4.2.2.
Equilibrio conformacional del tándem SH3SH2 de Abl y Src
141
4.2.3.
Influencia del conector C2Q en el equilibrio conformacional
del tándem cAblSH3SH2
148
4.2.4.
Papel del conector C3-2 en el equilibrio conformacional del
tándem SH3SH2
156
4.2.5.
Influencia del conector C2Q y las mutaciones en el conector
C3-2 de cAbl en la energética de unión
160
4.3.
Conclusiones
166
CAPÍTULO
5.EFECTOS
CONTEXTUALES
EN
LA
ESPECIFICIDAD Y AFINIDAD DE UNIÓN EN LOS DOMINIOS
WW DE hNedd4
171
5.1.
Introducción
171
5.2.
Resultados y discusión
173
5.2.1.
Construcciones en tándem de los dominios WW de hNedd4
173
5.2.2.
Estudio del equilibrio conformacional de los dominios WW
individuales de hNedd4
174
5.2.3.
Equilibrio conformacional de los dominios WW de hNedd4
en tándem
176
5.2.4.
Estudio de la especificidad de unión en los dominios WW de
hNedd4
178
5.2.5.
Influencia de los efectos contextuales en la especificidad de
unión de los dominios WW de hNedd4
183
5.3.
Conclusiones
191
CAPÍTULO 6.- RESUMEN Y CONCLUSIONES
195
6.1.
Resumen
195
6.2.
Conclusiones
197
CHAPTER 6.- SUMMARY AND CONCLUSSIONS
203
6.1.
Summary
203
6.2.
Conclusions
204
BIBLIOGRAFÍA
209
APÉNDICE
233
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
ADN Ácido desoxirribonucleico
ARN Ácido ribonucléico
Abs Abosrbancia
CD Dicroísmo Circular
Cp Capacidad calorífica molar parcial de una proteína
Cp,ap Capacidad calorífica aparente de una proteína
Cp,app Capacidad calorífica aparente de exceso bruto de una proteína
Cp,D Capacidad calorífica molar parcial del estado desnaturalizado
Cp,N Capacidad calorífica molar parcial del estado nativo
Cp,prot Capacidada calorífica de protonación de una proteína
Cp,s Capacidad calorífica molar parcial del disolvente
DSC Calorimetría Diferencial de Barrido
Da Dalton
EDTA Ácido etilendiamino tetracético
FM Intensidad de fluorescencia de la proteína libre
FML Intensidad de fluorescencia del complejo proteína-ligando
GST Glutation-S Transferasa
IPTG Isopropil β-D-tiogalactopiranósido
ITC Calorimetría Isotérmica de Titulación
Ka Constante de equilibrio de asociación
KD Constante de equilibrio de desplegamiento
Kd Constante de equilibrio de disociación
Ki Constante de equilibrio de unión tras una inyección
LB Medio de cultivo bacteriano Laura Bertani
[L] Concentración de ligando libre
[L]T Concentración de ligando total
[L]b Concentración de ligando unido
[L]0 Concentración de ligando en la jeringa
[M]T Concentración de macromolécula total
[M]i Concentración de macromolécula total tras cada inyección “i”
MALDI-TOF “Matriz-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-ofFlight”
N Estado nativo de la proteína
n Número de sitios de unión de un ligando a una proteína
PDB Banco de datos de proteínas (“Protein Data Bank”)
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
q Función de partición
qi Calor liberado o absorbido en una inyección
Q(N) Calor total acumulado en N inyecciones
RMN Resonancia Magnética Nuclear
RMSD Desviación cuadrática media “Root Mean Square Deviation”
rpm Revoluciones por minuto
SDS Luaril sulfato sódico
SDS-PAGEElectroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de lauril
sulfato sódico
T Temperatura
Tf Temperatura de fusión del oligonucleótido
Tm Temperatura de transición a la que ΔGD = 0
Tr Temperatura de referencia
Ts Temperatura máxima de estabilidad
TEV Virus del mosaico del tabaco (“Tobacco Etch Virus”)
t Tiempo
u.a Unidades arbitrarias para la intensidad de fluorescencia
UV Ultravioleta
Vc Volumen de la célula del calorímetro
Vin Volumen de inyección
Vp Volumen específico parcial de la proteína
Vs Volumen específico parcial del disolvente
ΔCp Cambio de capacidad calorífica de desnaturalización a presión
constante
ΔCp,ap Cambio de la capacidad calorífica aparente de desnaturalización
a presión constante
ΔCp,int Cambio de capacidad calorífica intrínseca de unión
ΔCp,p Cambio de la capacidad calorífica de protonación
ΔGap Cambio de energía libre aparente de Gibbs de la formación del
complejo
ΔGab Cambio de energía libre de Gibbs de la conformación abierta
ΔGcd Cambio de energía libre de Gibbs de la conformación cerrada
ΔGC2Q-ab Cambio de la energía libre de Gibbs de la interacción entre el
conector C2Q y el dominio SH3 en la conformación abierta
ΔGC2Q-cd Cambio de la energía libre de Gibbs de la interacción entre el
conector C2Q y el dominio SH3 en la conformación cerrada
ΔGC2Q-pd Cambio de la energía libre de Gibbs de la interacción entre el
conector C2Q y el dominio SH3 en los estados parcialmente
desplegados
ΔGD Cambio de energía libre de Gibbs de desplegamiento
ΔGmáx Cambio de energía libre de Gibbs en el máximo de la curva de
estabilidad
ΔG2 Cambio de la energía libre de Gibbs para el dominio SH2
ΔG3 Cambio de la energía libre de Gibbs para el dominio SH3
ΔHap Entalpía aparente de unión
ΔHD Entalpía de desplegamiento de una proteína
ΔHp Entalpía de protonación de las cadenas laterales
ΔHm Cambio de entalpía a la temperatura Tm
ΔHexp Entalpía de van’t Hoff o experimental
ΔHcal Entalpía calorimétrica
Δh(T) Función de entalpía específica promedio
<H> Entalpía molar parcial del sistema
Δms Cantidad de disolvente desplazado por la proteína en disolución
dentro de la célula calorimétrica
ΔSap Entropía aparente de unión
ΔSD Entropía de desplegamiento de una proteína
ΔSm Cambio de entropía a la temperatura Tm
Θ Fracción de saturación
Centro de masas espectral
Capítulo 1
Introducción
Introducción
CAPÍTULO 1.- INTRODUCCIÓN
1.1. Introducción
En 1838 el químico holandés Mulder descubrió que ciertas
sustancias derivadas de los aminoácidos constituían la materia básica en
el organismo de plantas y animales y las llamó proteínas, término
propuesto por el químico sueco Berzelius que proviene del vocablo
griego Proteus, dios griego que adoptaba múltiples formas o Prota, que
significa “lo primero”. La mayoría de los procesos biológicos celulares
dependen de las proteínas, las cuales presentan funciones muy diversas
como ayudar a mantener la integridad de las células, conectar diferentes
elementos dentro de ellas, ser responsables del transporte y regulación
de nutrientes y generar, transformar y transferir impulsos nerviosos
entre otras muchascompetencias (Pawson 1995).
Dentro de su funcionalidad, las proteínas establecen una
compleja red de interacciones que es fundamental para una correcta
comunicación celular. Cualquier disrupción en esta red puede derivar
en el desarrollo de numerosas patologías humanas como cáncer,
diabetes o trastornos en el sistema inmunológico y cardiovascular. Por
este motivo, es necesaria una comprensión profunda y detallada de estas
interacciones que nos permita predecir y modular la respuesta
fisiológica, incluso patológica, de la célula ante un estímulo específico,
facilitando así el desarrollo de nuevas estrategias de diseño molecular
que puedan ser utilizadas en el tratamiento de algunas de estas
enfermedades.
La revolución en el campo de la genómica y la proteómica en la
última década, ha dado lugar a la profundización en el estudio del
reconocimiento molecular de las proteínas. La secuenciación del
genoma humano, junto con el de varios organismos modelo y agentes
patógenos, ha proporcionado miles de nuevos genes y proteínas que
deben ser caracterizados tanto estructural como funcionalmente. De
igual manera, es necesario analizar e identificar sus interacciones con
otras moléculas de la célula con el fin de avanzar hacia la comprensión
y el control de los mecanismos de regulación celular. Además, muchas
de estas proteínas identificadas en el genoma constituyen dianas
potenciales para el desarrollo y diseño de nuevos agentes terapéuticos
contra una gran variedad de enfermedades cuyas interacciones hay que
37
analizar y validar. El proceso de unión de estos nuevos compuestos
debe racionalizarse por lo que es necesario profundizar en la
interrelación existente entre la estructura, la estabilidad de la proteína y
sus características funcionales e incorporar al proceso de diseño no sólo
aspectos estructurales, sino también consideraciones termodinámicas y
dinámicas (estabilidad y cooperatividad), genéticas y funcionales, las
cuales son frecuentemente ignoradas en las estrategias de diseño
tradicionales (Velazquez Campoy and Freire 2005; Lafont et al. 2007;
Freire 2008).
1.2. Dominios modulares
Los procesos celulares (transducción de señales, control del
citoesqueleto, ciclo celular, síntesis de proteínas, rutas metabólicas,
replicación del ADN, etc.) están dirigidos por una compleja red de
interacciones proteína-proteína. Cualquier distorsión en esta red de
interacciones puede traducirse en serias alteraciones celulares que se
reflejan en el desarrollo de enfermedades humanas tales como SIDA,
cáncer, Parkinson, Alzheimer, etc. Esta organización celular se
establece a través de un lenguaje molecular, llevado a cabo en muchas
ocasiones por pequeños dominios modulares que reconocen secuencias
específicas en sus dianas y que se encuentran altamente conservados y
presentes en las diferentes familias de proteínas, en número variable y
distintas combinaciones (Pawson 1995; Pawson and Scott 1997;
Pawson and Nash 2000; Pawson et al. 2002). Estos dominios han
proporcionado a la naturaleza un mecanismo muy eficiente para el
control de la actividad celular ya que los distintos módulos contribuyen
a: la localización de enzimas y sustratos para crear cascadas específicas
de señalización, la regulación alostérica de la función de la proteína, así
como al reconocimiento de las diferentes modificaciones posttranslacionales o incluso a la intercomunicación entre distintas rutas de
señalización.
Los dominios modulares son generalmente de pequeño tamaño
(entre 30 y 150 aminoácidos) y se encuentran plegados en estructuras
compactas y estables caracterizadas por uno o más sitios de unión.
Estos dominios se clasifican atendiendo a la homología en su estructura
y secuencia, así cada familia de dominios reconoce pequeñas secuencias
de entre 3 y 6 aminoácidos muy específicas y conservadas en sus
proteínas diana. Por ejemplo, los dominios SH3 se unen a secuencias
38
Introducción
ricas en prolina, los dominios SH2 reconocen restos de tirosina
fosforilada y los dominios PDZ interaccionan con secuencias
correspondientes a extremos carboxilo terminal (Cohen et al. 1995;
Jelen et al. 2003; Mayer 2006). Estas secuencias consenso están
flanqueadas por restos aminoacídicos adicionales que interaccionan con
elementos variables en el sitio de unión del dominio y que parecen ser
responsables de la especificidad de unión dentro de cada familia. De
este modo, las interacciones mediadas por dominios modulares
presentan dos características especialmente interesantes: por un lado,
reconocen epítopos que constituyen secuencias continuas en las
proteínas que los contienen, lo que simplifica notablemente la
identificación in silico de dianas fisiológicamente relevantes para cada
dominio a nivel de los distintos proteomas (Brannetti and HelmerCitterich 2003; Reiss and Schwikowski 2004; Neduva et al. 2005); y por
otro lado, estos dominios presentan sitios de unión cóncavos con
superficies de interacción pequeñas (en torno a 1000 Å2) lo que facilita
el diseño de moléculas de pequeño tamaño que bloqueen estas
interacciones,haciendo de estos dominios atractivas dianas para el
desarrollo de agentes terapéuticos.
1.2.1. Reconocimiento de secuencias ricas en prolina
Dentro de las distintas familias de dominios modulares, los
módulos de reconocimiento de secuencias ricas en prolina (MRP) son
los más ampliamente representados en el genoma humano debido a las
propiedades específicas que confiere la prolina (Creamer 1998; Stapley
and Creamer 1999; Kay et al. 2000; Creamer and Campbell 2002;
Zarrinpar et al. 2003a; Adzhubei et al. 2013). Su bajo número de grados
de libertad rotacional en relación a los demás aminoácidos hace que la
tendencia a formar parte de estructuras secundarias como hélices alfa o
láminas beta sea baja, por lo que estas secuencias ricas en prolina se
encuentran con frecuencia en la superficie molecular, requisito
imprescindible para cualquier secuencia implicada en interacciones
proteína-proteína. Además, la estructura adoptada con mayor
frecuencia cuando se presentan dos o más restos de prolina consecutivos
es la denominada hélice de poliprolina II (PPII), que consiste en una
hélice a izquierdas con tres aminoácidos por vuelta. Esta conformación
adoptada por las secuencias ricas en prolina reduce notablemente el
coste entrópico de la interacción.
39
Actualmente se conocen seis familias de MRP: los dominios
SH3 (Src Homology 3), los dominios WW (que toman su nombre de
dos restos Trp muy conservados), los dominios EVH1 (Enabled
Vasolidator-stimulated-protein Homology), los dominios GYF
(denominados así porque contienen la secuencia característica Gly-TyrPhe), los dominios UEV (Ubiquitin E2 Variant) y la profilina (Ball et al.
2005; Li 2005). Cada una de estas familias de MRP (Figura 1.1)
reconoce secuencias canónicas diferentes que se caracterizan por
contener al menos un resto de prolina (Sudol 1998; Macias et al. 2002).
En general, los distintos MRP contienen al menos un bolsillo
hidrofóbico formado por restos aromáticos muy conservados dentro de
cada familia en el que se acomoda un dipéptido del tipo xP, donde x es
frecuentemente un resto hidrofóbico. Contiguo a estos bolsillos suele
encontrarse otro más variable que es el que interacciona con los restos
del ligando adyacentes a la secuencia central, que serían los
responsables de la especificidad en las interacciones entre los distintos
miembros de una misma familia. Las interacciones de estos dominios
con las secuencias ricas en prolina presentan afinidades moderadas o
bajas, cuyas constantes de disociación varían entre 1 y 500 μM. Esta
baja afinidad de unión hace favorable la formación de complejos
esenciales en la señalización intracelular donde la rápida unión y
disociación forma parte del proceso de transducción de señales.
40
Introducción
Figura1.1. Ejemplos de las familias de dominios modulares, como son los dominios
SH3, WW, GYF, EVH1, UEV, y la familia de proteínas de profilina, que reconocen
secuencias ricas en prolina, formando diferentes complejos con ligandos tipo PPII. En
todos los casos, los ligandos (representados como estructura de varillas) se unen a cada
domino a través de un sitio de unión hidrofóbico formado por restos aromáticos muy
conservados entre los miembros de cada familia de dominios.
Aunque se postula que las divergencias entre los dominios de
una misma familia son suficientes para establecer redes de interacciones
de alta especificidad (Zarrinpar et al. 2003b), con frecuencia se ha
detectado un elevado grado de promiscuidad para alguno de estos
dominios puesto que reconocen un número considerable de dianas con
41
afinidades comparables. A la vista de esta aparente paradoja se ha
propuesto la existencia de dos tipos de especificidad: una especificidad
intrínseca encriptada en cada pareja dominio-ligando y una
especificidad contextual en la que factores como la localización
subcelular o el efecto cooperativo de interacciones múltiplesdesempeñan
un papel importante (Ladbury and Arold 2000; Mayer 2001).
Nuestro grupo de investigación lleva trabajando desde la última
década en la caracterización termodinámica y estructural de numerosas
interacciones de ligandos tanto naturales como de diseño con dominios
SH3 y WW, lo que ha permitido avanzar enormemente en la
comprensión de estas interacciones y en los determinantes de la afinidad
y especificidad de unión. De este modo, se ha demostrado la
importancia de regiones distantes al sitio de unión, como el lazo distal y
el lazo RT, en la distribución conformacional de dominios SH3,
afectando a la energética de unión. Además, tanto los dominios WW
como los dominios SH3 presentan un nivel de especificidad intrínseca
más elevado para secuencias peptídicas derivadas de proteínas o dianas
víricas que el observado para péptidos de diseño o derivados mediante
expresión en fagos o secuencias extraídas de proteínas celulares, en las
que los efectos contextuales parecen tener más peso. En este contexto, la
investigación llevada a cabo en este trabajo se centra en identificar las
regiones que forman las redes cooperativas de transmisión de
información a larga distancia y el estudio de los determinantes
moleculares y los factores contextuales (secuencias de conexión entre
dominios y dominios adicionales) que influyen en la cooperatividad
estructural, así como en la afinidad y especificidad de unión en los
dominios modulares SH3 y WW.
1.2.2. Dominios SH3
1.2.2.1. Importancia biológica, estructura, estabilidad y plegamiento
Los dominios SH3 son los módulos de reconocimiento más
ampliamente representados en el proteoma, con más de 1500 dominios
identificados hasta el momento (Mayer 2001; Macias et al. 2002;
Zarrinpar et al. 2003a). Estos módulos forman parte de proteínas muy
diversas presentes en eucariotas, tales como las quinasas de tirosina Abl,
Yes, Src, Fyn, Lyn, Hck, Lck, Nck, proteínas de unión a actina, Bem1,
cdc25, cortactina, la subunidad del canal de calcio beta1B2, Grb2,
42
Introducción
miosina, la subunidad reguladora de PI3K, espectrina, la proteína ZO-1,
etc. (Kay et al. 2000; Mayer 2001; Zarrinpar et al. 2003a).
Los dominios SH3 actúan generalmente como sitios de anclaje
para el reclutamiento de sustratos y la formación de complejos
supramoleculares que conducen a la modificación enzimática de
algunos componentes. En ocasiones desempeñan también un papel
esencial en la regulación de la actividad enzimática de las proteínas que
los contienen mediante el establecimiento de interacciones
intramoleculares con otros elementos de la molécula (Barila and
Superti-Furga 1998; Arold et al. 2001; Brasher et al. 2001; Brabek et al.
2002). Este es el caso de las quinanas de tirosina de la familia Src,
algunos de cuyos miembros, especialmente Src y Yes, están
relacionados con el desarrollo de procesos cancerígenos. Además de
cáncer, los dominios SH3 están implicados en otras patologías
importantes como el SIDA (Lyn, Hck, Lck), leucemia (Abl),
osteoporosis (Src), o procesos inflamatorios, alérgicos y asmáticos
(Dalgarno et al. 1997; Skorski et al. 1998).
Su importancia biológica, su pequeño tamaño (en torno a 60
residuos) y la relativa simplicidad de sus protocolos de expresión y
purificación, han convertido a los dominios SH3 en candidatos ideales
para su estudio estructural y energético. Gracias a esto, el número de
estructuras tridimensionales para dominios SH3 ha crecido
exponencialmente en la última década, tanto en su estado libre como
formando complejos con ligandos peptídicos (Candel et al. 2007;
Martin-Garcia et al. 2007; Martin-Garcia et al. 2012a; Bacarizo and
Camara-Artigas 2013; Liu et al. 2013; Ortega Roldan et al. 2013),
pudiendo citar así más de 700 estructuras depositadas hasta la fecha en
el banco de datos de proteínas (Protein Data Bank, PDB).
Los dominios SH3 presentan un plegamiento característico
como podemos observar detalladamente en la Figura 1.2. Éste consiste
en una estructura tipo barril β constituida por cinco hebras antiparalelas,
denominadas β1, β2, β3, β4 y β5, dispuestas en dos láminas β
ortogonales entre sí, una de menor tamaño formada por las hebras β2β1-β5 y otra de mayor tamaño formada por las hebras β2-β3-β4. Las
cinco hebras están conectadas por tres lazos de longitud variable
denominados RT, n-Src y distal, de modo que el lazo RT conecta las
dos primeras hebras β1 y β2, el lazo n-Src las hebras β2 y β3, y el lazo
43
distal conecta las hebras β3 y β4. Finalmente, la conexión entre las
hebras β4 y β5 se realiza mediante una vuelta de hélice 310.
El equilibrio conformacional y la estabilidad de los dominios
SH3 han sido caracterizados de forma extensiva por varios grupos de
investigación, incluido el nuestro, que mediante el uso de técnicas
espectroscópicas y calorimétricas han establecido que el equilibrio de
plegamiento de estos dominios puede describirse adecuadamente según
el modelo de dos estados (Martinez et al. 1998; Filimonov et al. 1999;
Martinez and Serrano 1999; Sadqi et al. 1999; Casares et al. 2004;
Casares et al. 2007b).
Figura 1.2. Representación de la estructura tridimensional del dominio SH3 de c-Yes
resuelta por cristalografía de Rayos X (Martin-Garcia et al. 2007) y depositada en
Protein Data Bank (PDB) bajo el código 2hda. Las cinco hebras beta se representan
como β1, β2, β3, β4 y β5 (amarillo), la hélice 310, que conecta las hebras β4 y β5, aparece
en rojo. El lazo n-Src que conecta las hebras β2 y β3, el lazo RT que conecta las hebras
β1 y β2, y el lazo distal que conecta las hebras β3 y β4, se indican en verde. Los restos
aromáticos más conservados que son importantes para la unión de los ligandos se indican
en representación de varillas en el código de colores indicado en el texto.
44
Introducción
1.2.2.2. Reconocimiento de ligandos ricos en prolina
Las interacciones entre dominios SH3 y sus ligandos naturales
se caracterizan por tener afinidades moderadas con constantes de
disociación generalmente en el intervalo de 1 y 200 µM, lo que refleja la
necesidad de establecer interacciones dinámicas de carácter transitorio
en el contexto de las redes celulares de transducción de señales. Los
ligandos de los dominios SH3 contienen generalmente una secuencia
canónica del tipo xPxxP, donde x es normalmente un aminoácido
hidrofóbico, y adoptan una conformación en hélice de poliprolina II
(PPII) en el complejo. Como se ilustra en la Figura 1.3, el sitio de unión
de los dominios SH3 consiste en una hendidura poco profunda que
contiene dos bolsillos hidrofóbicos constituidos por las cadenas laterales
de residuos que se encuentran muy conservados en estos dominios (los
dos residuos de tirosina del motivo ALYDY, el primer triptófano del
motivo WW situado en la hebra β3, el residuo de prolina de la hebra β4
(P) y el residuo de la tirosina en la secuencia SNY de la hélice 310).
Figura 1.3. Representación esquemática del sitio de unión del dominio SH3. En la
figura se representa el sitio de unión modelado con un ligando tipo PxxP en orientación
tipo I. El sitio de unión contiene dos bolsillos hidrofóbicos xP formados por restos
aromáticos conservados (amarillo) y un bolsillo de especificidad adyacente que es más
variable (verde). Las letras P en el ligando indican las posiciones en su secuencia
consenso, P0x1x2P3.
Cada uno de los bolsillos hidrofóbicos acomoda uno de los
dipéptidos del tipo xP de la secuencia consenso, como se muestra en la
Figura 1.3, de modo que cada resto prolina de la secuencia canónica se
intercala entre dos o más restos aromáticos. Los restos adyacentes a la
secuencia central xPxxP interaccionan con un tercer bolsillo responsable
de la especificidad de unión delimitado por los lazos RT y n-Src, más
45
variables en secuencia entre los miembros de las familias SH3
(Zarrinpar et al. 2003a; Ball et al. 2005).
Este modo de unión se caracteriza por la escasez de
interacciones polares en los complejos, ya que generalmente éstas se
limitan a dos puentes de hidrógeno muy conservados, establecidos entre
el Trp en la hebra β3 y la Tyr en la hélice 310 con los carbonilos de
algunos restos prolina de los ligandos, y a un puente salino, presente en
algunos tipos de complejos, establecido entre un resto de aspártico
conservado en el dominio SH3 y un resto de arginina en el ligando. En
la Figura 1.4 se ilustra, a modo de ejemplo, este puente salino
establecido entre el residuo de Asp99 del dominio cSrc-SH3 y el resto
Arg6 del ligando VSL12.
Figura 1.4. Estructura en disolución del complejo formado por el domino cSrc-SH3 y el
ligando VSL12. El dominio SH3 de cSrc se muestra en estructura tipo cinta, y el ligando
VSL12 en estructura de varillas. Los restos cargados Asp99 en la proteína y Arg6 en el
ligando, se representan en estructura de varillas en colores verde oliva y verde oscuro
respectivamente, y el puente salino que forman como una línea discontinua. PDB: 1qwf.
Debido a la pseudosimetría de la conformación PPII los
ligandos ricos en prolina pueden unirse al dominio con dos
orientaciones diferentes (Figura1.5): 1) Tipo I, el ligando va desde el
extremo N al C terminal y está caracterizado por una secuencia
consenso [R/K]x#PxxP. 2) Tipo II, el ligando se orienta desde el
extremo C al N terminal y su secuencia consenso es xPx#Px[R/K].
Con frecuencia # suele ser un resto hidrofóbico y x puede ser cualquier
46
Introducción
aminoácido. Así la orientación del ligando se determina por las
interacciones que establecen los restos que flanquean a la secuencia
consenso xPxxP, en particular por la posición del aminoácido básico
implicado en el puente salino situado dos posiciones anterior al motivo
xPxxP en los ligandos de tipo I y dos restos posterior a este motivo en
los ligandos de tipo II (Feng et al. 1994; Lim et al. 1994). Además, la
orientación del ligando puede también venir dictada por la
conformación de la cadena lateral de un resto de triptófano altamente
conservado de la hebra β3 del dominio SH3 que forma interacciones de
van der Waals (Fernandez-Ballester et al. 2004).
Figura 1.5.Representación esquemática de la unión de ligandos de tipo I (arriba) y tipo
II (abajo) al domino SH3, tomada de la referencia (Mayer 2001).
Los dominios SH3 pueden clasificarse en tres clases diferentes
de acuerdo a su especificidad de unión: 1) Dominios SH3 que se
caracterizan por tener un puente salino entre un resto del ligando
cargado positivamente (Arg o Lys) y un resto cargado negativamente en
la superficie del dominio. En estos casos se observan con frecuencia
complejos tipo I y tipo II, como es el caso del dominio SH3 de cSrc que
puede unir tanto el péptido RPPPLP como el reverso PPVPPR (Sparks
et al. 1996; Kang et al. 2000). Esta situación se representa en la Figura
1.6 para los complejos del dominio cSrc-SH3 con los ligandos VSL12
(tipo I) y APP12 (tipo II); 2) Dominios que interaccionan con el motivo
canónico xPxxP pero que no presentan el puente salino como ocurre
con el dominio SH3 de Abl (Musacchio et al. 1994; Pisabarro et al.
47
1998); 3) Dominios descubiertos recientemente que interaccionan con
secuencias no canónicas que no contienen el motivo consenso y que
presentan modos de unión alternativos o incluso que no contienen
ningún resto de prolina (Kang et al. 2000; Ghose et al. 2001; Liu et al.
2003). Lo cierto es que cada vez es mayor el número de epítopos que
contienen secuencias diferentes a la secuencia canónica xPxxP original,
ampliando el rango de acción de los dominios SH3 en determinados
procesos celulares, lo que hace necesario un estudio más profundo de
estos casos para conocer mejor sus peculiaridades.
Figura 1.6. Representación superficial del dominio cSrc-SH3 formando un complejo con
el ligando VSL12 (panel izquierdo) y el ligando APP12 (panel derecho). El resto Asp99
del dominio SH3, el cual está implicado en el puente salino con el resto de Arg en los
ligandos (Arg6 en VSL12 y Arg7 en APP12), se ha representado en color rosa. Los
ligandos se han mostrado en estructura de varilla y coloreados en un esquema de colores
en arco iris (Azul: N-terminal; rojo C-terminal).
La implicación de los dominios SH3 en el desarrollo de
importantes patologías como cáncer, SIDA y Parkinson entre otras,
además de la evolución de numerosos virus que utilizan el
reconocimiento de secuencias ricas en prolina por parte de estos
dominios para su proliferación, los hace atractivas dianas para el diseño
de moléculas con la capacidad de bloquear o modular las interacciones
entre estos dominios y sus dianas, lo que se ha consolidado como una
estrategia viable para el desarrollo de nuevos fármacos específicos para
el tratamiento de estasenfermedades (Stauffer et al. 1997; Kardinal et al.
2000; Vidal et al. 2001; Lee et al. 2002; Oneyama et al. 2002; Gril et al.
2007).
48
Introducción
Sin embargo, el diseño de ligandos de alta afinidad y
especificidad para dominios SH3 se ha revelado como un reto
especialmente complejo, debido a la baja afinidad de los ligandos
naturales y al complicado balance entre especificidad y promiscuidad
que caracteriza las interacciones mediadas por estos dominios (Cesareni
et al. 2002; Tong et al. 2002; Landgraf et al. 2004). Hasta la fecha son
numerosos los grupos de investigación que han dirigido sus esfuerzos
hacia la identificación y diseño de ligados de alta afinidad para
dominios SH3. Para ello, se han empleado diversas estrategias como el
uso de bibliotecas de compuestos sintéticos, la sustitución sistemática de
las distintas posiciones del ligando por alanina (Ren et al. 1993; Feng et
al. 1994; Yu et al. 1994), técnicas de expresión en fagos (Cheadle et al.
1994; Rickles et al. 1995; Tong et al. 2002; Ferguson et al. 2004;
Karkkainen et al. 2006), la utilización de elementos no peptídicos en los
ligandos (Combs et al. 1996; Feng et al. 1996; Panni et al. 2002), e
incluso la incorporación de D-aminoácidos (Schumacher et al. 1996).
En todos los casos los avances han sido muy limitados, aunque el uso
de métodos de química combinatorial junto con el uso de bibliotecas de
péptidos donde las prolinas clave han sido modificadas, ha
proporcionado algunos ligandos de alta afinidad para dominios SH3
(Nguyen et al. 1998; Aghazadeh and Rosen 1999; Nguyen et al. 2000).
La aplicación de técnicas de diseño racional mediante el uso de
algoritmos computacionales sustentados exclusivamente en la
información estructural, ha proporcionado también algunos resultados
satisfactorios, como los obtenidos por el grupo del Dr. Luis Serrano
(CRG, Barcelona), que ha conseguido varias secuencias de alta afinidad
y especificidad para el dominio SH3 de Abl (Pisabarro et al. 1994;
Pisabarro and Serrano 1996). Sin embargo, el éxito de estas
metodologías de diseño racional ha sido modesto debido a que
considerar la afinidad de unión, determinada por la energía de Gibbs,
como único criterio, constituye una visión muy limitada del proceso de
unión, ya que no proporciona información alguna sobre la naturaleza y
magnitud de las fuerzas que lo dirigen (es decir, las contribuciones
entálpica y entrópica) y, en muchos casos, impide un avance
significativo en el desarrollo de nuevos ligandos o en la comprensión de
la especificidad de unión. Trabajos llevados a cabo por varios grupos de
investigación como el del Dr. Freire, han puesto de manifiesto la
importancia de incorporar estas consideraciones termodinámicas al
proceso de diseño (Luque and Freire 1998; Luque et al. 1998;
Velazquez-Campoy and Freire 2001; Luque and Freire 2002; Luque et
49
al. 2002; Velazquez-Campoy et al. 2004; Velazquez Campoy and Freire
2005; Velazquez-Campoy and Freire 2006).
Según los estudios termodinámicos realizados sobre las
interacciones mediadas por los dominios SH3 y de acuerdo con la
información estructural, el reconocimiento de ligandos ricos en prolina
por los dominios SH3 está basado fundamentalmente en la intercalación
de los restos prolina del ligando entre los aminoácidos aromáticos e
hidrofóbicos del sitio de unión del dominio, con muy pocas
interacciones polares. Es de esperar, por tanto, que este tipo de
interacciones presenten un patrón termodinámico dominado por el
efecto hidrofóbico, que vendría determinado por un componente
entrópico. Sin embargo, el reconocimiento de ligandos ricos en prolina
por los dominios SH3 está gobernado por una entalpía de unión
favorable a la que se opone una contribución entrópica desfavorable
(Renzoni et al. 1996; Ferreon and Hilser 2004; Palencia et al. 2004;
Martin-Garcia 2009). Este comportamiento termodinámico no se puede
racionalizar fácilmente considerando exclusivamente las interacciones
directas entre superficies hidrofóbicas, lo que apunta hacia una mayor
complejidad en el reconocimiento de estos ligandos de la inicialmente
supuesta a partir del análisis de los datos estructurales.
Nuestro grupo de investigación ha aportado nuevos avances en
el campo del reconocimiento de ligandos ricos en prolina por los
dominios SH3. Por un lado, el análisis detallado de la estructura
cristalográfica del complejo Abl-SH3/p41 que ha permitido identificar
un conjunto de cinco moléculas de agua que participan en una compleja
red de puentes de hidrógeno y que median las interacciones entre el
ligando y un grupo de aminoácidos del dominio (Palencia et al. 2004).
Por otro lado, los resultados del análisis termodinámico, estructural y de
dinámica molecular revelan que estas moléculas de agua enterradas en
la interfase de unión del complejo Abl-SH3/p41 juegan un papel
determinante y contribuyen significativamente al patrón termodinámico
observado (Palencia 2008; Palencia et al. 2010). Posteriormente, se han
analizado estructuras cristalográficas de los dominios SH3 disponibles
en Protein Data Bank (PDB), lo que ha permitido observar cómo la
presencia de moléculas de agua en el sitio de unión se repetía en todos
los dominios, permitiendo identificar patrones de hidratación comunes
(Martin-Garcia et al. 2012b; Zafra-Ruano and Luque 2012). Algunas de
estas moléculas de agua forman parte estructural del sitio de unión y
50
Introducción
juegan un papel importante en la formación del complejo, por lo que su
presencia en la interfase de unión de dominios SH3 abre un amplio
campo de posibilidades en el diseño y optimización de los ligandos en
cuanto a especificidad de unión. También, en nuestro grupo de
investigación, se ha desarrollado un algoritmo para el análisis
automatizado de hidratación interfacial mediante dinámica molecular
(Corbi-Verge 2012).
En este sentido, también hay que tener en cuenta algunos
trabajos que han demostrado la importancia de la dinámica molecular,
en particular de los lazos RT y n-Src, en la especificidad de unión
(Roberts 1999; Wang et al. 2001; Yuzawa et al. 2004). Se ha propuesto
que la redistribución conformacional del estado nativo inducida por la
unión del ligando es un factor a tener en cuenta en el patrón
termodinámico anómalo observado en el reconocimiento de ligandos
ricos en prolina por los dominios SH3 (Wang et al. 2001). De hecho,
estudios de intercambio hidrógeno/deuterio en el dominio SH3 de
espectrina, llevados a cabo en nuestro grupo de investigación, indican
que bajo condiciones nativas el dominio SH3 puede considerarse como
un conjunto estadístico de estados conformacionales y presenta,
además, una elevada cooperatividad estructural, lo que significa que
cualquier cambio energético local puede transmitirse eficientemente al
resto de la molécula (Casares et al. 2007a; Casares et al. 2007b). Los
estudios termodinámicos realizados también en nuestro grupo de
investigación con el dominio SH3 de cSrc, demuestran que mutaciones
en los residuos cercanos al sitio de unión no provocan cambios
significativos en los parámetros termodinámicos de unión, sin embargo,
los mayores efectos se observan en las mutaciones llevadas a cabo en el
lazo distal (Martin-Garcia 2009). Estos resultados confirman, por tanto,
la complejidad de las interacciones y la necesidad de profundizar en la
comprensión de los distintos factores que determinan el
comportamiento termodinámico para estos sistemas.
1.2.3. Dominios WW
1.2.3.1. Importancia biológica, estructura y plegamiento
51
Otros módulos de reconocimiento que aparecen ampliamente
representados en distintos sistemas biológicos son los dominios WW
(Hu et al. 2004). El nombre de estos dominios deriva de dos restos
triptófano muy conservados (Trp17 y Trp39) que aparecen espaciados
entre 20 y 22 restos en sus secuencias. Los dominios WW se encuentran
relacionados con diversas funciones involucradas en la regulación de la
transcripción, procesamiento de ARN, reconocimiento de ubiquitina,
tráfico de proteínas, receptores de señalización y control del
citoesqueleto (Kay et al. 2000; Sudol and Hunter 2000; Sudol et al.
2001; Macias et al. 2002). La alteración en alguna de estas funciones da
lugar al desarrollo de enfermedades como el síndrome de hipertensión
de Liddle, distrofia muscular, enfermedades de Alzheimer y Huntington
y cáncer (Pereboev et al. 2001; Sze et al. 2004; Rotin and Schild 2008;
Bellomaria et al. 2010). Además, algunos de estos dominios están
implicados en el desarrollo de infecciones víricas, como Ébola o la
leucemia humana (Timmins et al. 2003; Bouamr et al. 2004). La
relación de estos dominios con todas estas enfermedades hace que sean
atractivas dianas para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos.
Los dominios WW presentan una estructura común y muy
compacta formada por tres hebras beta denominadas β1, β2 y β3 que se
encuentran conectadas por dos lazos cuya extensión es variable y que
constituyen una lámina beta antiparalela. Estos lazos van a contribuir a
la especificidad y afinidad de unión de los ligandos (Figura 1.7). Los
dominios WW contienen aproximadamente 40 aminoácidos y son
considerados los dominios modulares de proteínas naturales más
pequeños que existen con un plegamiento simple en lámina β (Sudol et
al. 2001). Sin embargo, la información estructural disponible para los
dominios WW es mucho más limitada que para los dominios SH3.
Hasta el momento, existen unas 25 estructuras determinadas por RMN
de complejos y de dominios WW libres y muy pocas estructuras
cristalográficas.
52
Introducción
Figura 1.7. Estructura del dominio WW1 de la proteína Yap65 determinada por RMN,
formada por las tres hebras beta β1, β2 y β3 (amarillo). Los dos triptófanos (Trp17 y
Trp39) que se encuentran altamente conservados y dan nombre a estos dominios se
representan como estructura de varillas. PDB: 1jmq.
Actualmente, los estudios de plegamiento de dominios WW son
escasos y, en general, se limitan a experimentos realizados mediante
técnicas espectroscópicas que proporcionan una información muy
limitada. Su equilibrio conformacional ha sido descrito según un
modelo de dos estados, no obstante, se trata de experimentos puntuales
y en general poco informativos en cuanto a la cooperatividad del
equilibrio de plegamiento. Las caracterizaciones cinéticas del
plegamiento llevadas a cabo con distintos dominios WW son más
numerosas y completas, aunque describen diferentes comportamientos
para estos dominios (Crane et al. 2000; Ferguson et al. 2001a; Ferguson
et al. 2001b; Jager et al. 2001; Petrovich et al. 2006; Sharpe et al. 2007).
Debido al enorme interés que ha suscitado el plegamiento de
pequeños dominios modulares y debido a la escasa información
disponible sobre la termodinámica de plegamiento de dominios WW,
nuestro grupo de investigación ha realizado una caracterización
termodinámica detallada y completa del equilibrio conformacional de
algunos dominios WW, utilizando diversas técnicas y metodologías de
análisis (Cobos et al. 2009; Bexiga 2011). Los resultados presentados
para los distintos dominios WW, están de acuerdo con la hipótesis de
que los equilibrios de dos estados y “downhill” no constituyen dos
clases separadas claramente sino que son los límites extremos de una
serie de posibles comportamientos determinados por la altura de las
barreras energéticas, la cual puede ser modulada por las condiciones
experimentales (Mi et al. 2011). El bajo valor de la entalpía específica de
desplegamiento refleja la baja cooperatividad de este dominio. Además,
53
los valores anómalos de la TS (temperatura de máxima estabilidad)
reflejan la necesidad de una elevada plasticidad y flexibilidad en el
estado nativo, necesarias para acomodar ligandos de gran longitud en el
sitio de unión.
1.2.3.2. Interacción de los dominios WW con ligandos ricos en
prolina
El sitio de unión de los dominios WW lo constituye una
superficie cóncava que contiene una serie de restos aromáticos
expuestos, cuya disposición origina un bolsillo hidrofóbico donde se
acomodan los péptidos con conformación PPII. Este bolsillo está
formado por dos restos aromáticos altamente conservados (Tyr28 en la
hebra β2 y Trp39 en la hebra β3) entre los que se inserta el dipéptido xP,
de un modo similar al observado en los dominios SH3 (Figura 1.8).
Además, existe otro bolsillo de especificidad que se localiza en el lazo
que conecta la segunda y tercera hebra, y varía de un dominio WW a
otro dependiendo del tipo de ligando que reconozca. Así se justifica que
esta clase de dominios sea la que presente mayor similitud con los
dominios SH3, existiendo ejemplos de ambos dominios no relacionados
evolutivamente que han convergido hacia un mecanismo común para el
reconocimiento de secuencias en conformación PPII (Sudol et al. 1995;
Zarrinpar and Lim 2000; Zarrinpar et al. 2003a).
Figura 1.8. Representación esquemática del modo de unión mostrado por dominios
WW de la clase I. En la figura se representa el sitio de unión modelado con un ligando
tipo PPxY. El sitio de unión contiene un bolsillo hidrofóbico xP formado por restos
aromáticos conservados (amarillo) y el bolsillo de especificidad adyacente que es más
variable dependiendo del tipo de ligando que reconozca el dominio (verde). Las letras P
en el ligando indican las posiciones en su secuencia P0P-1x-2Y-3.
54
Introducción
Según la secuencia y especificidad de unión con los ligandos
ricos en prolina que reconocen, los dominios WW pueden clasificarse
en cuatro subfamilias o clases (Macias et al. 2000; Schleinkofer et al.
2004). Los dominios WW de clase I que reconocen la secuencia
consenso PPxY. La clase II que interacciona con secuencias consenso
PPLP, muy parecidas a las características de los SH3, también con un
bolsillo de especificidad hidrofóbico de tipo xP (denominado xP2). La
clase III que interacciona con secuencias que contienen una prolina
precedida por fosfoserina o fosfotreonina, del tipo p(S/T)P. Y
finalmente, la clase IV que es la subfamilia más heterogénea donde,
independientemente de los ligandos que puedan reconocer, se agrupan
los dominios que tienen las secuencias más diferentes incluyendo
aquellos que no conservan el Trp39 que forma el bolsillo xP. Existen
otros criterios relacionados con la especificidad de unión, que hacen que
actualmente la clasificación de los dominios WW siga siendo motivo de
controversia. Algunos autores proponen que el motivo de unión de la
clase II debe ser definido como PPxPP (Macias et al. 2002), otros han
sugerido un quinto grupo posible para algunos dominios que reconocen
secuencias flanqueadas o interrumpidas por los aminoácidos arginina o
lisina, del tipo R/LPPP(R) (Bedford et al. 1998; Bedford et al. 2000), o
incluso para aquellos que puedan unir a tirosinas fosforiladas en la
secuencia consenso (Otte et al. 2003).
El modo de unión característico de los dominios WW de clase I
es el más común y mejor estudiado, a este grupo pertenecen los
dominios empleados en los estudios de interacción presentados en este
trabajo. Las dos prolinas de la secuencia consenso PPxY del ligando se
acomodan en el bolsillo hidrofóbico xP frente a los restos aromáticos
conservados Tyr28 y Trp39. El bolsillo de especificidad se ha
denominado bolsillo xY por ser donde se acomoda la tirosina del
motivo. Esta cavidad está formada por restos situados al final de la
segunda hebra y en la mitad de la tercera hebra. Estos son un
aminoácido alifático (Leu, Ile o Val), un resto histidina en la posición
32, un residuo hidrofílico en la posición 35 (Glu, Lys o Arg) y una
treonina en la posición 37. El análisis mutacional de los residuos
semiconservados en las posiciones 30 y 35 demuestran que la
sustitución de éstos no afecta significativamente a la interacción
(Toepert et al. 2001). En cambio, los aminoácidos estrictamente
conservados, His32 y Thr37, resultan fundamentales para la unión del
motivo PPxY (Kasanov et al. 2001; Toepert et al. 2001) ya que la His32
55
interacciona con la Tyr de ligando y la Thr37 establece un puente de
hidrógeno con una de las prolinas del motivo de unión (Pires et al.
2001; Ball et al. 2005).
Al igual que los dominios SH3, los dominios WW pueden unir
los ligandos con dos orientaciones. La orientación parece venir
determinada por restos que no son de prolina dentro de la secuencia
consenso que reconoce cada clase, como por ejemplo el resto Tyr en la
secuencia PPxY de la clase I. Sin embargo, los restos adyacentes que
componen la secuencia consenso parecen ser más importantes tanto
para la afinidad como para la especificidad de unión, lo que indica que
estos dominios tienen un epítopo de reconocimiento muy corto
(Zarrinpar and Lim 2000; Pires et al. 2001). Esta característica podría
justificarse en base al pequeño tamaño de los dominios WW y a la
reducida superficie que exponen para interaccionar con los ligandos.
Estudios de unión de ligandos ricos en prolina, realizados por
fluorescencia, indican que el valor de las constantes de disociación
varían generalmente entre 3 y 350 µM (Macias et al. 1996; Nguyen et al.
1998; Pires et al. 2001; Pires et al. 2005; Kanelis et al. 2006). En nuestro
grupo de investigación hemos sido capaces de obtener a través de
técnicas de expresión en fagos ligandos de alta afinidad, con constantes
de disociación en el orden de nM y que han sido empleados en este
trabajo para el estudio de su especificidad de unión con los dominios
WW de la proteína hNedd4.
Dado que el diseño eficaz de estos ligandos requiere una
profunda comprensión de las fuerzas que dirigen las interacciones entre
los dominios WW y sus dianas, nos hemos propuesto, dentro de los
objetivos de este trabajo, investigar la influencia de elementos
adicionales de la proteína en el equilibrio conformacional evaluando el
impacto de las interacciones cooperativas en la estabilidad de la
proteína y la energética de unión, así como establecer las preferencias de
un ligando por diferentes dominios WW.
1.3. Familia de las quinasas de tirosina
Como se ha mencionado anteriormente, la base del complejo
entramado funcional de los diferentes procesos celulares se basa en el
reconocimiento
específico
entre
proteínas
y
en
su
56
Introducción
activación/desactivación transitoria. Con frecuencia, este proceso se
lleva a cabo mediante la fosforilación o desfosforilación de un residuo
que tenga un grupo hidroxilo libre (-OH), normalmente serina, treonina
o tirosina. Las proteínas encargadas de transferir ese grupo fosfato desde
el adenosín trifosfato (ATP) al residuo de la proteína substrato se
denominan quinasas. Las quinasas de tirosina son el grupo más diverso
y amplio dentro de la familia de las quinasas ya que están implicadas en
diferentes procesos celulares relacionados con la expresión de genes,
rutas metabólicas, crecimiento y diferenciación celular, transporte de
membrana y apoptosis. De este modo, han evolucionado para
desarrollar su función como interruptores moleculares con la mayor
eficiencia posible, lo que las convierte en unas maquinarias moleculares
muy complejas (Pawson and Nash 2003).
Las quinasas de tirosina poseen una estructura común (Figura
1.9) que consiste en un dominio catalítico formado por dos lóbulos: el
lóbulo que se encuentra en el extremo N-terminal (lóbulo N), formado
por cinco hebras beta y una hélice alfa, y el lóbulo situado en el extremo
C-terminal (lóbulo C) que está compuesto principalmente por hélices
alfa y es donde se encuentra la zona de reconocimiento del sustrato
peptídico y el centro activo. El ATP se une a la zona situada entre
ambos lóbulos, cerca del sitio de unión de las secuencias diana de la
quinasa. Unido al dominio catalítico se encuentra el dominio SH2 que
reconoce pequeñas secuencias aminoacídicas que contienen
fosfotirosina, seguido por el dominio SH3 que reconoce secuencias ricas
en prolina (Hubbard and Till 2000; Huse and Kuriyan 2002).
57
Figura 1.9. Superposición de las estructuras de las quinasas de tirosina. En verde se
muestra cSrc y cAbl en azul.
En el genoma humano la familia de las quinasas de tirosina
tiene alrededor de 90 miembros que se pueden dividir en quinasas de
tirosina receptoras, relacionadas con la unión extracelular de ligandos, y
las quinasas de tirosina no receptoras que se encargan de la localización
subcelular de proteínas a través de los dominios modulares (Hubbard
and Till 2000; Manning et al. 2002). El descubrimiento de las quinasas
de tirosina no receptoras, cSrc y cAbl, desencadenó un gran interés
científico debido al poderoso efecto que éstas tienen en el
comportamiento celular. El hallazgo de estos oncogenes virales dio pie
a la necesidad de la comprensión de sus mecanismos ya que revelaría
los principios que gobiernan la regulación celular y la oncogénesis. Así
pues, el esfuerzo investigador se centró inicialmente en entender el
mecanismo catalítico de las quinasas de tirosina.
Uno de los mecanismos más estudiados de la regulación de las
quinasas de tirosina consiste en la fosforilación del llamado lazo de
activación, situado en el dominio catalítico, en el que la carga negativa
del grupo fosfato compensa una carga positiva situada en el motivo
DFG, muy conservado en este lazo, aumentando así la actividad
catalítica de la proteína (Cowan-Jacob 2006). Numerosos estudios han
demostrado que el dominio catalítico de las quinasas de tirosina se
58
Introducción
encuentra muy conservado, tanto a nivel estructural (Figura 1.9) como
en sus mecanismos de regulación (Huse and Kuriyan 2002). Además, se
han descubierto otros eventos de fosforilación que pueden desactivar la
quinasa o cambiar el sitio de fosforilación, estando los dominios que
acompañan al dominio catalítico especialmente implicados en su
regulación (Huse and Kuriyan 2002; Cowan-Jacob 2006). En particular,
los dominios SH2 y SH3 que tienen la capacidad de reconocer motivos
con una secuencia específica y están relacionados con el mecanismo de
regulación de la actividad enzimática. De este modo, se ha comprobado
cómo la eliminación de los dominios SH3 y SH2 provoca la
desregulación de la actividad de cAbl, y la ausencia de cada dominio
modifica de forma característica el comportamiento de cAbl in vivo
(Pendergast 2002).Así, los mecanismos de reconocimiento de sustrato y
los de regulación de la actividad no tienen lugar únicamente en el
dominio catalítico (Mayer and Baltimore 1993; Birge et al. 1996; Yadav
and Miller 2008).
Conocer el mecanismo de regulación de cSrc y cAbl se ha
convertido en uno de los principales retos biomédicos actuales, pues no
solamente permitiría entender con mayor detalle cómo funciona uno de
los elementos clave en la señalización celular, sino que, además, sería
de gran ayuda para desarrollar nuevas terapias contra las formas
oncogénicas de estas quinasas. Estas terapias son especialmente
necesarias en el caso de la leucemia crónica mieloide, donde es común
que los pacientes desarrollen resistencia a los fármacos actuales, ya que
dichas formas resistentes, al contrario de lo que cabría esperar, no sólo
presentan mutaciones en el sitio activo de cAbl, sino también en los
dominios SH2, SH3 y otras zonas de la quinasa (Nagar 2007;
Sherbenou et al. 2010).
1.3.1. Quinasa de tirosina cAbl
cAbl fue una de las primeras quinasas de tirosina identificadas.
En un estudio sobre ratones se descubrió cómo el producto del gen
tumoral (oncogén) del virus del linfosarcoma de Abelson (vAbl), era
también la forma alterada de la quinasa celular cAbl, con capacidad
para transformar las células sanas en tumorales, apareciendo así un
nuevo término, proto-oncogén (Abelson and Rabstein 1970; Colicelli
2010). Posteriormente, se descubrió que una modificación en la región
N-terminal de cAbl, generada por una translocación cromosómica,
59
provocaba una fusióncon el gen BCR dando lugar a la formación de una
proteína denominada BCR-Abl. Esta fusión provocaba una disrupción
en el mecanismo que mantenía a cAbl en su forma inactiva aumentando
la actividad quinasa y dando lugar al desarrollo de la leucemia mieloide
crónica (CML) (Goff et al. 1980; Wang et al. 1984; Pendergast and
Witte 1987).
La estructura de cAbl consiste en un extremo N-terminal o Ncap
que se transcribe en dos isoformas, cAbl-1a y cAbl-1b. La isoforma
cAbl-b se caracteriza por tener una mayor longitud que cAbl-a (15
residuos más) y por la adición de un grupo miristoílo. Esta región carece
de estructura y está seguida por un dominio de reconocimiento de
secuencias ricas en prolina (SH3) y un dominio de reconocimiento de
fosfotirosina (SH2), que se conecta a través de una larga secuencia al
dominio catalítico (SH1). Por último, en el extremo C-terminal existe
una extensa región donde se hallan varios dominios de unión al
citoesqueleto, y que reconocen secuencias señal para la nucleación,
secuencias ricas en prolina y otras de reconocimiento de ADN (Figura
1.10) (Pendergast 2002).
Figura 1.10. Esquema de la organización de dominios de las diferentes formas de
quinasas de tirosina de Abl. Cada dominio se encuentra representado en un color, siendo
el gris el color utilizado para resaltar las partes que han sido alteradas en las formas
oncogénicas. El asterisco azul marca la localización de los residuos fosforilados.
En su conformación autoinhibida, el dominio SH2 interacciona
directamente con el lóbulo C del dominio catalítico, dejando su sitio de
unión parcialmente oculto. A partir de un completo estudio estructural
de la isoforma cAbl-1b, se demostró también que el grupo miristoílo de
la región NCap se encuentra interaccionando con el dominio catalítico,
60
Introducción
insertado en una cavidad del lóbulo C. Aunque no fue posible
determinar la posición de la mayor parte de la secuencia de NCap,
debido a su naturaleza desestructurada, se propuso que esta unión
induciría un cambio conformacional que facilitaría el acoplamiento del
dominio SH2 al dominio catalítico. Por otro lado, el dominio SH3
interacciona con el conector que enlaza el dominio SH2 con el dominio
quinasa (C2Q). Esta secuencia queda enterrada entre el sitio de
reconocimiento de secuencias ricas en prolina del dominio SH3 y el
lóbulo N del dominio catalítico (Nagar et al. 2006).
De la quinasa de tirosina cAbl aún no ha sido posible conseguir
información estructural detallada de su conformación activa para tener
un mejor conocimiento de su mecanismo de regulación, aunque gracias
a técnicas biofísicas como la Dispersión de Rayos X de Ángulo Bajo
(Small Angle X-ray Scattering, SAXS) tenemos algunas pistas de los
movimientos y cambios conformacionales relacionados con la
activación de cAbl (Figura 1.11) (Nagar et al. 2006). La interacción del
conector C2Q con el dominio SH3, aunque débil, parece ser uno de los
componentes críticos de la regulación de la actividad de cAbl, como
sugiere su activación en presencia de proteínas con motivos poliprolina
(Barila et al. 2000; Shishido et al. 2000; Miyoshi-Akiyama et al. 2001) y
los estudios de actividad con mutantes donde se ha eliminado el
dominio SH3 (Franz et al. 1989) o se ha disminuido la afinidad de la
secuencia C2Q mediante la mutación de las prolinas 242 y 249 por
ácido glutámico (Pluk et al. 2002). Estas prolinas son responsables de
que esta secuencia adopte una conformación similar a la hélice PPII
típica de las secuencias reconocidas por los dominios SH3 (Barila and
Superti-Furga 1998).
61
Figura 1.11.Esquema de la regulación de la quinasa de tirosina cAbl. a) Organización
de los dominios de cAbl cuando se encuentra en la forma autoinhibida según la
información cristalográfica disponible. C2Q y C3-2 corresponden a los conectores que
unen el dominio SH2 con el dominio quinasa y los dominios SH3-SH2 respectivamente.
b) Organización de los dominios más probable cuando la quinasa de tirosina cAbl se
encuentra activa de acuerdo con la estructura de baja resolución obtenida por SAXS
(dispersión de rayos X de ángulo bajo) (Nagar et al. 2006).
Otros indicios de la importancia de la interacción del dominio
SH3 en el mecanismo de activación de cAbl provienen de la posibilidad
de bloquear la interacción del dominio con la secuencia C2Q mediante
la fosforilación de algunos de los residuos de tirosina tanto del dominio
SH3 como del conector C2Q (Hantschel and Superti-Furga 2004).
Hasta la fecha se han descrito cuatro puntos de fosforilación en esta
región de cAbl, la tirosina 89 y la 134 en el sitio de unión del dominio
SH3 y la tirosina 245 y la 251 en el conector C2Q. La fosforilación de
cualquiera de estos cuatro residuos parece tener efectos positivos en la
activación de cAbl, probablemente al bloquear el reconocimiento de la
secuencia C2Q por parte del dominio SH3, lo que impediría que la
quinasa adoptase la conformación autoinhibida. Sorprendentemente,
ninguna de estas posiciones es accesible en la conformación inactiva de
cAbl, lo que sugiere que la fosforilación debería ocurrir después de la
activación de la quinasa por otro estímulo. Aunque todas las
fosforilaciones impedirían que cAbl volviese a su forma autoinhibida, la
fosforilación en el sitio de unión del dominio SH3 debe tener un papel
62
Introducción
diferente ya que, a su vez, dificulta el reconocimiento de sustratos
clásicos por parte de este dominio modular (Hantschel and SupertiFurga 2004).
La activación in vivo de cAbl mediante el dominio SH3 en la
célula, como la de todas las proteínas implicadas en los procesos de
señalización, debe ser transitoria, es decir, una vez que cAbl ha
fosforilado el sustrato debe volver rápidamente a la conformación
inhibida. Existen evidencias que indican que en este proceso, la
secuencia que conecta los dos dominios modulares (C3-2) es un
elemento clave que podría estar actuando como un muelle entre la
conformación autoinhibida y la activa, modulando el cambio de
orientación relativa de los dominios SH3 y SH2 (Brasher et al. 2001).
Los primeros indicios de la importancia de esta secuencia
interdominio provienen de un estudio de mutagénesis aleatoria en la
secuencia de cAbl, donde se detectó que la sustitución de la S140 en el
segmento C3-2 por una isoleucina producía la activación de cAbl, tanto
in vivo como in vitro. Un estudio posterior en el que se mutó el mismo
residuo y sus residuos colindantes L141 y E142 por glicina, dio lugar a
una construcción con mayor actividad que el mutante S140I. En ambos
casos, aunque la quinasa cAbl se encontraba activa, la capacidad del
dominio SH3 de unir motivos poliprolina no sólo se vio afectada, sino
que parecía aumentar (Brasher et al. 2001). Además, se han descrito
formas de BCR-ABL que presentan mutaciones en el residuo S140
resistentes a Gleevec (imatinib mesilato), uno de los fármacos que
inhiben la actividad catalítica de Bcr-Abl (Azam et al. 2003). Por lo
tanto, se ha propuesto que la secuencia C3-2 se encuentra involucrada
en los mecanismos que permiten la liberación del dominio SH3 de la
secuencia C2Q, permitiendo así el reconocimiento de otros ligandos.
El papel del dominio SH2 en el mecanismo de regulación está
aún por determinar (Pendergast 2002; Colicelli 2010). Aunque las
interacciones que establece el dominio SH2 con el dominio catalítico
son importantes para la correcta regulación de cAbl, parece que su
misión principal está más relacionada con el reconocimiento de
sustratos para el dominio catalítico.
Como podemos observar, la actividad enzimática de cAbl está
regulada por un gran número de mecanismos, como son la fosforilación
63
de algunos de sus restos de tirosina, sus interacciones intramoleculares,
su interacción con otras proteínas, e incluso, su propia localización
celular (Smith and Mayer 2002). Esto sugiere que el funcionamiento de
la actividad de cAbl depende de que todos los elementos de la proteína,
aunque de distinta naturaleza, colaboren entre sí para llevar a cabo su
función, es decir, estas proteínas deben poseer una elevada
cooperatividad entre sus elementos.
Los fármacos que se han desarrollado para tratar enfermedades
relacionadas con el mal funcionamiento de la regulación de cAbl como
la leucemia crónica mieloide (CML), actúan bloqueando el centro
activo del dominio catalítico, pero no es raro que los pacientes dejen de
responder al tratamiento por el desarrollo de resistencia al fármaco
(Azam et al. 2003). El análisis de las formas resistentes reveló que,
como hemos mencionado anteriormente, no todas las mutaciones que
inducían resistencia se encontraban en el dominio catalítico, sino que
aparecían agrupadas en el dominio SH3, en el dominio SH2 y en las
regiones interdominio (Gorre et al. 2002; Azam et al. 2003; Ernst et al.
2011). Estos resultados, sumados a la baja especificidad que tienen los
fármacos, generalmente basados en homología con la molécula de ATP,
revelan la importancia de enfocar los estudios a la comprensión de los
mecanismos de regulación de esta quinasa de tirosina para el desarrollo
de nuevas terapias anticancerígenas (Dietrich et al. 2010; Zhang et al.
2010).
1.3.2. Quinasa de tirosina cSrc
Francis Peyton Rous descubrió en 1911 el virus causante del
sarcoma en pollos (virus del sarcoma de Rous, RSV), al oncogén
responsable se le llamó vSrc. Más tarde, en 1976, J. Michael Bishop y
Harold E. Varmus descubrieron que en el genoma de pollos sanos se
encontraba un gen (cSrc) con una alta homología en secuencia con vSrc,
y que fue el primer proto-oncogén en ser identificado (Stehelin et al.
1977; Hunter and Sefton 1980).
La estructura de cSrc consiste en un dominio N-terminal
asociado a la membrana (SH4), y que se encuentra unido a un grupo
miristoílo, necesario para la unión de la proteína a la membrana
plasmática. Le sigue un dominio único y poco conservado dentro de la
familia de las Src quinasas, a continuación un dominio SH3, el cual
64
Introducción
media las interacciones proteína-proteína a través de la unión de
ligandos ricos en prolina, un dominio SH2 que reconoce secuencias que
contienen fosfotirosina, un conector SH2-quinasa, el dominio quinasa
que se encuentra altamente conservado y que posee actividad catalítica,
al cual también se le conoce como SH1, y finalmente una región Cterminal (Figura1.12.)
Figura 1.12. Representación esquemática de la estructura de las quinasas de tirosina
cSrc y vSrc. Cada dominio se encuentra representado por un color y el asterisco verde
marca la zona donde se encuentran los residuos fosforilados, la Tyr426 se encuentra en el
dominio quinasa y la Tyr527 en el dominio C-terminal. Como se puede observar, la
única diferencia entre ambas quinasas es que vSrc carece del dominio C-terminal, causa
por la cual siempre permanece en la conformación activa.
cSrc se encuentra normalmente en su estado inactivo o cerrado,
en el cual el dominio SH2 está unido a la Tyr527 fosforilada, situada en
el extremo C-terminal. El dominio SH3 se une al conector SH2-quinasa
y la Tyr416 se encuentra defosforilada. La activación de cSrc puede
ocurrir a través de la unión de un ligando al dominio SH3, por la
existencia de un ligando de alta afinidad con una fosfotirosinaque se
una al dominio SH2 o la defosforilación de la Tyr527 en el extremo Cterminal, este paso provoca la disrupción de las interacciones
intramoleculares de los dominios SH2 y SH3 apareciendo así un estado
conformacional abierto que da lugar a la autofosforilación de la Tyr416,
activándose por completo cSrc (Roskoski 2004) (Figura 1.13). Estos
hechos hacen que cSrc integre de una forma eficiente distintas señales,
permitiendo que actúe como adaptador y regulador en la interacción
proteína-proteína.
65
vSrc, a diferencia de su homólogo cSrc, carece de la región Cterminal por lo que la proteína se encuentra siempre en su conformación
activa. Su actividad descontrolada es la causante de la transformación
de las células sanas a células tumorales, de forma que mutaciones en el
gen cSrc están relacionadas con el desarrollo de procesos tumorales
como cáncer de mama, colon o cerebral (Falsone et al. 2004; Sen and
Johnson 2011).
Figura 1.13. a) Estructura de cSrc en su conformación cerrada, en su forma inactiva el
dominio SH3 se une al conector y el dominio SH2 a la Tyr527 fosforilada. b)
Conformación activa de cSrc, en este caso el dominio SH3 no se encuentra unido al
conector, al igual que el dominio SH2 no se encuentra unido a la Tyr527 ya que no está
fosforilada (Meng and Roux 2013).
Aunque el mecanismo de regulación no está completamente
detallado tanto para cSrc como para cAbl, en general, el dominio
catalítico se mantiene en su conformación autoinhibida mediante el
establecimiento de interacciones intramoleculares, en las que juegan un
papel destacado los dominios SH2 y SH3 (Mayer and Baltimore 1994;
Yadav and Miller 2007; Panjarian et al. 2013). Esto pone de manifiesto
que, aunque modulares, las estructuras de cAbl y cSrc son altamente
cooperativas. Por lo tanto, conocer en profundidad los mecanismos de
regulación de estas quinasas es esencial para el desarrollo de nuevos
fármacos contra sus formas oncogénicas.
66
Introducción
1.4. Ligasa de ubiquitina humana Nedd4
Como se ha mencionado anteriormente, las quinasas de tirosina
controlan funciones básicas en la célula como la división y
diferenciación celular, expresión de genes, transporte de membrana, etc.
La regulación adecuada de estos procesos es crítica ya que cualquier
perturbación en la señalización da lugar a numerosas enfermedades
(Lemmon and Schlessinger 2010). Uno de los mecanismos para la
correcta regulación de las quinasas de tirosina es a través de receptores
relacionados con la ubiquitinación (Bache et al. 2004). Nedd4 (Neural
precursor celldevelopmentallydownregulated 4) pertenece a la familia
de las ligasas de ubiquitina tipo E3-Hect (Homologous E6-AP Cterminus) y fue identificada en 1992 en un cribado de genes
relacionados con la desregulación en el desarrollo del sistema nervioso
central en embriones de ratones (Kumar et al. 1992). La estructura de
Nedd4 consiste en un dominio C2 en el extremo N-terminal y un
dominio de unión a lípidos que media la localización de proteínas en
membrana, este dominio sugiere que la ligasa Nedd4 se encarga de
marcar proteínas de membrana con ubiquitina, aunque se ha observado
que también realiza el etiquetado de proteínas citoplasmáticas y
nucleares. Además, Nedd4 contiene entre uno y cuatro dominios WW
en su región central que unen a motivos PY, y un dominio HECT en el
extremo C-terminal (Figura 1.14) (Harvey and Kumar 1999; Ingham et
al. 2005).
Figura 1.14.Representación esquemática de la estructura de la ligasa Nedd4 humana
(hNedd4). Contiene un dominio C2 (verde), cuatro dominios WW (violeta) y un
dominio HECT (azul).
Nedd4 está implicado en procesos de degradación
proteosómica, transporte de proteínas desde la región trans-Golgi a la
membrana celular o en la internalización de proteínas de membrana
para su posterior reciclaje o degradación lisosómica. Uno de los
sustratos mejor caracterizados de Nedd4 es el canal epitelial de sodio
(ENaC). Este canal lo podemos encontrar en tejido de riñones, pulmón
y colon (Garty and Palmer 1997) y tiene un papel importante en la
homeostasis de sodio y en la presión sanguínea. ENaC está compuesto
por tres subunidades homólogas (α, β, y γ), cada una de éstas contiene
67
un motivo PY en su extremo C-terminal el cual se une con el dominio
WW3 de Nedd4 (Staub et al. 1996). La importancia de la regulación de
ENaC por Nedd4 se pone de manifiesto cuando aparecen mutaciones
en los motivos PY de las subunidades β y γ, dando lugar al desarrollo
del síndrome de Liddle, una forma de hipertensión hereditaria causada
por una elevada actividad de ENaC (Shimkets et al. 1994; Abriel et al.
1999).
Además, los dominios WW de la ubiquitina ligasa humana
Nedd4 han sido identificados como dianas celulares de algunos
dominios L víricos (Martin-Serrano et al. 2001; Freed 2002; Demirov
and Freed 2004). Estos dominios L (del inglés “late domains”) son
pequeñas secuencias muy conservadas que se localizan en las
poliproteínas Gag de algunos retrovirus como el de la leucemia humana
o el VIH, en proteínas estructurales de algunos filovirus como el del
Ébola y radovirus como el de la estomatitis vesicular, cuya presencia e
integridad son imprescindibles para el correcto desarrollo de las últimas
etapas en el ciclo de vida vírico (Pornillos et al. 2002). Los distintos
tipos de dominios L contienen distintas secuencias muy conservadas
denominadas tipo P(T/S)AP, PPxY e YPDL. La amplia distribución de
estas secuencias entre distintos tipos de virus, junto con el hecho de que
estos motivos en ocasiones son intercambiables, ha llevado a plantear
una estrategia común de los virus para su liberación de la célula
huésped (Parent et al. 1995; Puffer et al. 1998; Martin-Serrano et al.
2001). Es importante mencionar que los tres motivos característicos de
los dominios L se han relacionado con las secuencias consenso propias
de módulos de reconocimiento proteína-proteína: dominios SH3 (PxxP)
(Mayer and Eck 1995; Dalgarno et al. 1997), dominios WW (PxxP o
PPxY) (Sudol 1996b; Sudol 1996a) y proteínas adaptadoras AP1 y AP2
(YxxL) (Ohno et al. 1995; Puffer et al. 1998).
Existen muchas evidencias experimentales que indican que los
dominios L no actúan directamente en la morfogénesis del virión, sino
que su principal función es reclutar la maquinaria celular necesaria para
el ensamblaje del virus y para su liberación. El reconocimiento de
pequeños epítopos que han desarrollado organismos sencillos como los
virus ha hecho que el diseño de moléculas con capacidad para bloquear
o modular las interacciones entre los dominios L y sus dianas sea una
estrategia viable en el desarrollo de nuevos fármacos específicos para el
tratamiento de numerosas enfermedades y antivirales de amplio
68
Introducción
espectro (Stauffer et al. 1997; Kardinal et al. 2000; Lee et al. 2002;
Oneyama et al. 2002; Okumura et al. 2008).
1.5. Cooperatividad y alosterismo
Numerosos estudios han demostrado que bajo condiciones
nativas las proteínas se comportan como un conjunto estadístico de
estados
conformacionales
caracterizados
por
una
elevada
cooperatividad estructural (Hilser et al. 1998; Casares et al. 2007b). Esta
cooperatividad conecta el comportamiento de los diferentes
aminoácidos que componen la proteína, por lo que, cualquier cambio
energético puede transmitirse de manera eficiente al resto de la
molécula. De este modo, cualquier interacción que ocurra en una zona
específica de la proteína puede transmitirse hacia regiones distantes del
sitio de unión traduciéndose así como señales directas para activar o
inhibir otras zonas, modular interacciones con otras moléculas o
establecer una red de comunicación intramolecular. El modo en que
estas interacciones se propagan a través de la estructura completa de la
proteína es lo que se conoce como alosterismo (Monod et al. 1965;
Koshland et al. 1966; Tsai et al. 2008). Existen numerosos ejemplos de
proteínas que se encuentran reguladas a través de mecanismos
alostéricos como es el caso de la activación e inactivación de las
quinasas de tirosina cSrc y cAbl (Engen et al. 2008; Panjarian et al.
2013) o la interacción de proteínas víricas con proteínas celulares que
están mediadas por cambios conformacionales inducidas por un ligando
como en la proteína HIV-1 (Leavitt et al. 2004).
Una cuestión fundamental es conocer cómo, perturbando en
una zona concreta, se transmite la señal a través de toda la proteína
hasta zonas alejadas del sitio de unión afectando a la propia actividad
de la proteína. Puesto que la naturaleza del alosterismo es
fundamentalmente termodinámica, la comunicación a larga distancia
podría estar relacionada no sólo con cambios en la conformación
principal (contribución entálpica), sino también en cambios en las
fluctuaciones dinámicas (contribución entrópica) (Wand 2001; Tsai et
al. 2008).
Actualmente existen numerosos métodos con los que estudiar
cómo se propaga el efecto alostérico a nivel atómico. La combinación
de métodos experimentales como espectrometría de masas,
69
cristalografía de Rayos X, RMN, resonancia en superficie de plasma
(SPR), calorimetría isotérmica de titulación (ITC) o numerosos métodos
bioquímicos y métodos computacionales, han conducido a la
comprensión de los mecanismos alostéricos de varios sistemas (Meyer
and Peters 2003; de Azevedo and Dias 2008; Lenaerts et al. 2008;
Kitova et al. 2012; Cubrilovic et al. 2013).
Entender los mecanismos de regulación alostérica tiene una
gran importancia ya que puede ser usado en numerosos campos, como
el diseño de agentes farmacológicos. Hasta hace algunos años, los
fármacos se diseñaban exclusivamente para imitar o inhibir los ligandos
que se unían a los sitios de unión de sus proteínas diana.Pero los sitios
activos se encuentran bajo una gran presión evolutiva para mantener su
función y, para algunas enzimas como las quinasas, es muy difícil
desarrollar inhibidores que se unan únicamente a un miembro de la
familia y no al resto. Sin embargo, uno de los principales beneficios del
diseño de fármacos que actúen sobre sitios alostéricos es principalmente
la especificidad ya que no son sitios muy conservados. Actualmente, se
han descubierto varias moléculas que actúan en zonas alejadas del sitio
de unión de manera selectiva, potenciando o inhibiendo su actividad
fisiológica sin afectar directamente al proceso de señalización celular
(Jahnke et al. 2005; Mian et al. 2012).
1.6. Objetivos
El objetivo principal de esta Tesis es obtener información sobre
la cooperatividad en dominios SH3 y WW así como de la influencia de
otros elementos tanto intrínsecos como extrínsecos sobre el equilibrio
conformacional y la energética de unión, lo que nos permitirá evaluar
los efectos contextuales en la especificad de unión y en la afinidad
proporcionando información relevante para el diseño racional de
inhibidores con función terapéutica.
Los objetivos específicos que se pretenden alcanzar en este trabajo
son los siguientes:
1. Evaluar la influencia de la redistribución conformacional
inducida en el dominio SH3 de cSrc por la unión del ligando en
la termodinámica de unión e identificar aquellas regiones que
contribuyen más significativamente a estos efectos así como las
70
Introducción
redes cooperativas de transmisión de información y su
conservación o variabilidad en los distintos dominios.
2. Estudiar el intercambio de información intermolecular a través
de la influencia de los dominios SH3SH2 y SH3SH2-C2Q en la
regulación de la actividad quinasa en las oncoproteínas cAbl y
cSrc.
3. Investigar la influencia de elementos adicionales en el equilibrio
conformacional y la energética de unión de ligandos de los
dominios WW aislados y en tándem.
71
Capítulo 2
Materiales y métodos
Materiales y
Métodos
CAPÍTULO 2.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Clonado, expresión y purificación
2.1.1. Dominio SH3 de cSrc
El plásmido pET15b que contiene el gen del dominio SH3 de cSrc
de pollo ha sido cedido por el laboratorio del Dr. Ernesto Freire
(Universidad Johns Hopkins, Baltimore, EEUU). Este dominio se ha
expresado en células E. Coli BL21-DE3 (NOVAGEN) con una cola de
histidinas (6xHis tag) en el extremo N-terminal y con un sitio de
reconocimiento para la proteasa trombina, lo que permite eliminar la cola
de histidinas del dominio tras su purificación. Dicha expresión se indujo
con IPTG 1mM cuando la densidad óptica del cultivo celular a 600 nm
alcanzó valores entre 0.6 y 0.8 y se dejó crecer durante toda la noche a
37ºC. Una vez pasado este tiempo, las células se recogieron por
centrifugación a 7000 rpm, a 4ºC durante 10 minutos (centrífuga
HETTICH modelo Roto Super 40, rotor A6.9) y posteriormente se
resuspendieron en tampón fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 0.3 M,
pH 8.0 (Tampón de Equilibrado de Columna; TEC). Las células
resuspendidas fueron lisadas mediante prensa French (AMINCO) a una
presión de 1200 psi y a continuación se ultracentrifugaron (BECKMAN
Optima LE-80, rotor 45Ti) a 30000 rpm, durante 30 minutos y a 4ºC. El
sobrenadante resultante se pasó por una columna de afinidad con 5 mL de
resina Ni-NTA (QUIAGEN) previamente equilibrada con 50 mL de TEC
y se llevaron a cabo sucesivos lavados de 50 mL de TEC con distintas
concentraciones de imidazol (0, 20 mM y 50 mM). Por último, la proteína
se eluyó con 50 mL de TEC con imidazol 500 mM. Las fracciones que
contenían la proteína se dializaron frente a TEC para eliminar el imidazol
y a continuación se llevóa cabo el corte con trombina (SIGMA) a
temperatura ambiente durante 4 horas en una relación de peso
aproximada 50:1. La trombina fue eliminada adicionando resina
benzamidinsefarosa (AMERSHAM BIOSCIENCES). Los productos de
la hidrólisis fueron sometidos a una segunda etapa de cromatografía de
afinidad en Ni-NTA, de modo que la cola de histidinas y la proteína no
hidrolizada quedaron retenidas en la columna mientras que la proteína sin
cola fue eluida en las primeras fracciones, las cuales se concentraron hasta
2-3 mg·mL-1 y se almacenaron a -20ºC en el mismo tampón. En estas
condiciones, el dominio SH3 de cSrc es estable durante varios meses. Las
75
diferentes etapas de la purificación así como la pureza final fueron
controladas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-page) al
16 %. Además, la pureza de la proteína (superior al 99%) y su correcto
peso molecular se comprobaron mediante espectrometría de masas en el
Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada.
2.1.2. Dominio SH3 de cAbl
El gen del dominio SH3 de cAbl, contenido en el plásmido
pET3d, fue ofrecido por el Dr. Luis Serrano (CRG, Barcelona). Dicho
dominio fue reclonadoen el plásmido pBAT4 en nuestro laboratorio, con
la finalidad de optimizar su expresión. El dominio SH3 de cAbl fue
expresado en células E. Coli BL21-DE3 (NOVAGEN) añadiendo como
agente inductor de la expresión IPTG 1mM cuando la densidad óptica a
600 nm alcanzó un valor entre 0.6 y 0.8. Las células se recogieron por
centrifugación a 7000 rpm, durante 10 minutos y a 4ºC (centrífuga
HETTICH modelo Roto Super 40, rotor A6.9) y posteriormente se
resuspendieron en tampón Tris 100 mM, pH 9.0. Una vez resuspendidas,
las células se lisaron en un prensa French (AMINCO) a una presión de
1200 psi y a continuación se ultracentrifugaron (BECKMAN Optima LE80, rotor 45 Ti) a 30000 rpm, durante 30 minutos y a 4ºC. El dominio
SH3 de Abl se precipitó del sobrenadante resultante añadiendo sulfato
amónico muy lentamente y con agitación hasta una saturación del 75%.
El precipitado con sulfato amónico, obtenido por ultracentrifugación a
30000 rpm, durante 30 minutos y a 4ºC, se redisolvió en tampón fosfato
sódico 10 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 6.5. La solución se pasó por
un filtro de 0.45 micras y se sometió a una etapa de cromatografía de
exclusión molecular utilizando una columna Hi-Load Superdex-75 26/60
(AMERSHAM BIOSCIENCIES). El equilibrado y la elución de la
proteína se realizó en el mismo tampón utilizado para resuspender el
precipitado de sulfato amónico. La pureza de las proteínas se controló
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-page) al 16% y
mediante espectrometría de masas siendo ésta superior al 99%. Para su
almacenamiento, la proteína se concentró hasta 11 mg·mL-1en el mismo
tampón, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se mantuvo a 20ºC hasta su utilización.
76
Materiales y
Métodos
2.1.3. Construcciones en tándem de cAbl y cSrc
Las construcciones en tándem de cSrc y cAbl se reclonaron en el
vector pETM11 (TOP Gene Technologies, Quebec, Canadá). Estos clones
fueron expresados en células E. Coli BL21-DE3 (NOVAGEN) con una
cola de histidinas (6xHis tag) en el extremo N-terminal y con un sitio de
reconocimiento para la proteasa TEV, lo que permite eliminar la cola de
histidinas del dominio tras su purificación. Dicha expresión fue inducida
con IPTG 1mM cuando la densidad óptica del cultivo celular a 600 nm
alcanzó valores entre 0.6 y 0.8 para las construcciones de cSrc. En el caso
de las construcciones de cAbl, la inducción se realiza desde el principio ya
que se ha observado en diferentes pruebas de expresión que ésta es la
misma que cuando la densidad óptica a 600 nm se encuentra entre 0.6 y
0.8. Una vez que se añadió el agente inductor a los cultivos, se dejaron
crecer durante toda la noche a 37ºC. Pasado este tiempo, las células se
recogieron por centrifugación a 7000 rpm, a 4ºC durante 10 minutos
(centrífuga HETTICH modelo Roto Super 40, rotor A6.9) y
posteriormente se resuspendieron en tampón fosfato sódico 50 mM,
cloruro sódico 0.3 M, pH 8.0 (Tampón de Equilibrado de Columna;
TEC). Las células resuspendidas fueron lisadas mediante prensa French
(AMINCO) a una presión de 1200 psi y a continuación se
ultracentrifugaron (BECKMAN Optima LE-80, rotor 45Ti) a 30000 rpm,
durante 30 minutos y a 4ºC. El sobrenadante resultante se pasó por una
columna cargada con 5 mL de resina Ni-NTA (QUIAGEN) previamente
equilibrada con 50 mL de TEC y se llevaron a cabo sucesivos lavados de
50 mL de TEC con distintas concentraciones de imidazol (0, 20 mM y 50
mM). Por último, la proteína se eluyó con 50 mL de TEC con imidazol
500 mM. Las fracciones que contenían la proteína se dializaron frente al
tampón recomendado para la hidrólisis con la proteasa TEV (50 mM TrisHCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 8.0) y se incubaron durante toda la
noche a temperatura ambiente con 1 µL de proteasa TEV por cada mL de
disolución de proteína por hidrolizar. Los productos de la digestión se
volvieron a dializar frente al tampón TEC y se sometieron a una segunda
etapa de cromatografía de afinidad en Ni-NTA, de modo que la cola de
histidinas y la proteína no hidrolizada quedaron retenidas en la columna
mientras que la proteína sin cola se eluyó en las primeras fracciones.
Las diferentes etapas de la purificación así como la pureza final
fueron controladas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-
77
page) al 16 %. Además, la pureza de la proteína (superior al 99%) y su
correcto peso molecular se comprobaron mediante espectrometría de
masas en el Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de
Granada. Para su almacenamiento, las proteínas se concentraron hasta 3
mg·mL-1 y se conservaron a 4ºC para su uso inmediato, ya que el proceso
de congelar/descongelar provoca la aparición de agregados en las
muestras.
2.1.4. Dominios WW de hNedd4 y su construcción en tándem
Los genes que codifican los dominios WW3 y WW4 de la ligasa
de ubiquitina humana Nedd4 (código P46934 de la base de datos
SwissProt/TrEMBL) fueron construidos en nuestro laboratorio mediante
el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de
cuatro oligonucleótidos solapantes. La secuencia resultante se diseñó para
que cada secuencia de nucleótidos que codifica los dominios WW esté
situada entre dos dianas de las enzimas de restricción NcoI y HindIII. El
producto de la PCR se digirió con dichas enzimas y se clonó en el
plásmido pETM30 (G. Stier, EMBL, Hidelberg, Alemania). En el caso de
los genes que codifican los dominios WW1 y WW2 y las construcciones
en
tándem
WW1WW2;
WW3WW4;
WW2WW3WW4
y
WW1WW2WW3WW4 fueron adquiridos en la empresa GENEART AG
(Regensburg, Alemania) y reclonados en los vectores pETM30
(construcciones WW1, WW2, WW1WW2 y WW1WW2WW3WW4) y
en pETM11 (construcciones WW3WW4 y WW2WW3WW4) en nuestro
laboratorio. La identidad e integridad de los genes clonados fueron
confirmadas mediante secuenciación de nucleótidos por el Servicio de
Secuenciación del Instituto de Parasitología y Biomedicina “López
Neyra” del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), en
Granada.
Los genes de todos los dominios WW y sus construcciones en
tándem fueron expresados en células E. Coli BL21-DE3 (NOVAGEN)
como proteínas de fusión a Glutatión-S-Transferasa (GST) (en el caso de
las construcciones clonadas en pETM30) y a una cola de histidinas (6xHis
Tag) en el extremo N-terminal, con un sitio de reconocimiento para la
proteasa TEV. Para inducir la expresión se añadió IPTG 1mM cuando la
densidad óptica de los cultivos a 600 nm alcanzó un valor entre 0.6 y 0.8.
Las células se recogieron por centrifugación a 7000 rpm y 4ºC durante 10
minutos (centrífuga HETTICH modelo Roto Super 40, rotor A6.9) y
78
Materiales y
Métodos
posteriormente se resuspendieron en tampón fosfato sódico 50 mM,
cloruro sódico 0.3 M, pH 8.0 (Tampón de Equilibrado de Columna;
TEC). Las células resuspendidas fueron lisadas mediante prensa French
(AMINCO) a una presión de 1200 psi y a continuación se
ultracentrifugaron (BECKMAN Optima LE-80, rotor 45Ti) a 30000 rpm,
durante 30 minutos y a 4ºC. El sobrenadante resultante se pasó por una
columna de afinidad con 5 mL de resina Ni-NTA (QUIAGEN)
previamente equilibrada con 50 mL de TEC y se llevaron a cabo sucesivos
lavados de 50 mL de TEC con distintas concentraciones de imidazol (0,
20 mM y 50 mM). Por último, la proteína se eluyó con 50 mL de TEC
con imidazol 500 mM. Las fracciones que contenían la proteína se
dializaron frente al tampón recomendado para la hidrólisis con la proteasa
TEV (50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 8.0) y se incubó
durante toda la noche a temperatura ambiente con 1 µL de proteasa TEV
por cada mL de disolución de proteína por hidrolizar. Los productos de la
digestión se volvieron a dializar frente al tampón TEC y se sometieron a
una segunda etapa de cromatografía de afinidad en Ni-NTA, de modo
que la cola de histidinas, la proteína no hidrolizada, la propia TEV y la
GST (en el caso de las proteínas clonadas en pETM30), quedaron
retenidas en la columna mientras que la proteína sin cola de histidinas (y
sin GST en su caso) se recogió en las primeras fracciones de elución. Las
diferentes etapas de la purificación, así como la pureza final, fueron
controladas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-page) al
16 %.
Aquellas fracciones que contenían alguna impureza se sometieron
a una etapa adicional de cromatografía de exclusión molecular utilizando
una
columna
Hi-Load
Superdex-75
26/60
(AMERSHAM
BIOSCIENCES) para los dominios WW individuales, o Hi-Load
Superdex-200 26/60 (GE Healthcare) en el caso de las construcciones en
tándem, equilibradas en TEC. Finalmente, la pureza de la proteína
(superior al 99%) y su correcto peso molecular se comprobaron mediante
espectrometría de masas. Las fracciones de las proteínas purificadas se
concentraron hasta 2-3 mg·mL-1, se congelaron en nitrógeno líquido y se
almacenaron a -80ºC. En estas condiciones, las proteínas son estables
durante varios meses.
79
2.1.5. Obtención de mutantes del dominio SH3 de cSrc y de la
construcción en tándem de cAbl
Para la obtención de los mutantes del dominio SH3 de cSrc y de la
construcción en tándem de cAbl se ha utilizado el método de mutagénesis
dirigida QuikchangeSite-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE), que
permite realizar mutaciones (puntuales y múltiples) en un plásmido de
cadena doble (pET15b para los mutantes del dominio SH3 de cSrc y
pETM11 para la construcción en tándem de cAbl) de forma sencilla y con
más de un 80% de eficacia. Los oligonucleótidos cebadores se diseñaron
de acuerdo con la mutación deseada de forma que fuesen
complementarios entre sí y con la cadena doble del plásmido, y con
longitudes aproximadas de 30 a 40 bases, de modo que su temperatura de
fusión (Tf) oscilase entre 73 y 78ºC, ya que elevadas Tf favorecen altas
temperaturas de anillamiento (Ta). La Tf de los oligonucleótidos en este
caso se estimó de acuerdo con la siguiente ecuación empírica:
(2.1.1)
donde N es el número total de bases del oligonucleótido y %G/C es el
tanto por ciento de Guaninas y Citosinas. Además, se intenta que el
triplete que codifica la mutación esté siempre lo más centrado posible en
la secuencia del oligonucleótido y que corresponda con el triplete con
mayor propensión en E. Coli. La PCR fue diseñada según las
recomendaciones del método QuikchangeSite-Directed Mutagenesis Kit
(STRATAGENE), que se ilustra en la Figura 2.1.
Figura 2.1. Esquema general de los ciclos programados para la realización de las PCRs
llevadas a cabo en este trabajo.
Debido a la dificultad que presentó la clonación de algunos de los
mutantes del dominio SH3 de cSrc como F86L, F86W, L108I, L108V,
80
Materiales y
Métodos
W119L e I132V, esta se encargargó al laboratorio del Dr. Peter Liu (TOP
Gene Technologies, Quebec, Canadá).
La purificación de los mutantes procedentes del dominio SH3 de
cSrc y del tándem de cAbl se llevó a cabo siguiendo los protocolos
anteriormente descritos para las respectivas especies silvestres (Sección
2.1.1 y Sección 2.1.3).
2.2. Preparación de las muestras
2.2.1. Preparación y determinación de las concentraciones de las
disoluciones de proteína
Las disoluciones tampón empleadas en este trabajo se prepararon
a partir de las formas ácida y básica del sistema tamponante, como en el
caso del tampón fosfato o añadiendo hidróxido sódico y ácido clorhídrico
hasta ajustar al pH deseado para preparar, por ejemplo, los tampones de
Pipes e imidazol.
Las alícuotas de proteína se dializaron frente a un volumen de
tampón unas 500 ó 600 veces mayor que el de la muestra, para lo que se
introdujeron en una membrana de diálisis de SPECTRA-POR con un
tamaño de poro de 3.5 kDa en el caso del dominio SH3 de cSrc y sus
variantes, el dominio SH3 de cAbl y los dominios WW de hNedd4; en el
caso de la construcciones en tándem de cAbl y hNedd4 el tamaño de poro
usado fue de 12 kDa. Las proteínas se mantuvieron como mínimo el
tiempo necesario para alcanzar el equilibrio de la diálisis (unas 8 horas en
el caso de las membranas utilizadas) a 4ºC con agitación suave.
Transcurrido ese tiempo, se realizó un cambio de tampón de diálisis por
tampón fresco, manteniéndose entre 8 y 12 horas aproximadamente en las
mismas condiciones de agitación y temperatura. A continuación se extrajo
la disolución dializada de proteína de la bolsa de diálisis y se centrifugó
(HETTICH zentrifugen EBA 12) a 14000 rpm, a 4ºC durante 10 minutos
para eliminar posibles agregados.
La determinación de la concentración de las diferentes proteínas
se llevó a cabo midiendo la absorbancia a 280 nm y empleando la
absortividad molar que aparece en la Tabla 2.1. Los coeficientes de
absortividad molar fueron calculados empleando el método de Gill y von
Hippel (Gill and von Hippel 1989).
81
Tabla 2.1. Coeficientes de absortividad molar a 280 nm determinados para las proteínas
presentes en este trabajo.
Proteína
Coeficiente de absortividad molar
(M-1·cm-1)
cSrc-SH3 (+mutantes)*
16500
cAbl-SH3
16800
cAbl SH3SH2
31400
cAbl SH3SH2-C2Q(+mutantes)
39880
cSrc SH2SH3
31400
cSrc SH3SH2-C2Q
36900
hNedd4 WW1
13980
hNedd4 WW2
13980
hNedd4 WW3
11380
hNedd4 WW4
12490
hNedd4 WW1WW2
36440
hNedd4 WW3WW4
23940
hNedd4 WW2WW3WW4
37470
hNedd4 WW1WW2WW3WW4
59930
*Todos los mutantes del dominio SH3 de cSrc tienen el mismo coeficiente de absortividad
molar, exceptuando aquéllos en los que está implicado un aminoácido aromático en la
mutación como es el caso de los mutantes cSrc-SH3 F86W y W119L, para los que el
coeficiente de absortividad molar es 22460 y 10810 M-1·cm-1 respectivamente.
82
Materiales y
Métodos
2.2.2. Preparación y determinación de las concentraciones de las
disoluciones de ligando
Los ligandos peptídicos empleados para los estudios de interacción
fueron adquiridos de las casas comerciales JPT (Berlín, Alemania) y
Peptide 2.0 (Virgina, Estados Unidos). Para aumentar la estabilidad de los
péptidos, éstos se encuentran acetilados y amidados en sus extremos
carbono y nitrógeno terminal, respectivamente, ya que de este modo se
reduce la carga neta además de imitar cómo se encontrarían realmente los
péptidos dentro de la célula.
Todos los ligandos de poliprolina con los que hemos trabajado
poseen un resto de tirosina en su secuencia, exceptuando el ligando
VSL12. Para este ligando, sin cromóforos en su secuencia, hubo que
preparar, en primer lugar, una disolución madre muy concentrada
(generalmente 5 mg·mL-1) en agua. La concentración exacta de esta
disolución se determinó mediante análisis cuantitativo de aminoácidos en
el Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC en Madrid. A
continuación determinamos el coeficiente de extinción molar en agua
midiendo la absorbancia a 220 nm para un conjunto de diluciones
preparadas por duplicado a partir de la disolución madre concentrada.
Representando los valores de absorbancia corregida frente a la
concentración de cada dilución obtenemos una línea recta de cuya
pendiente determinamos el valor del coeficiente de absortividad molar en
agua. El valor de absortividad molar obtenido para VSL12 es 19400 M1
·cm-1. Para las disoluciones del resto de ligandos que presentan un
cromóforo en su secuencia (RLP2, p41, p53bp2, UGR-1 y ÉbolaA) se
prepararon disoluciones madre de 5-8 mg·mL-1 en agua y a partir de esta
disolución se prepararon, añadiendo las cantidades necesarias de agua y
tampón de diálisis, las disoluciones finales a la concentración deseada
para cada experimento, corrigiendo posteriormente el pH. Las
concentraciones de estos péptidos se determinaron mediante medidas de
absorbancia a 274 nm considerando un coeficiente de absortividad molar
de 1400 M-1·cm-1 para el aminoácido de tirosina.
83
2.3. Espectroscopía de fluorescencia
2.3.1. Introducción
La espectroscopía de fluorescencia puede emplearse para el
estudio de procesos de unión de ligandos a las proteínas gracias a la alta
sensibilidad del triptófano a los cambios en su entorno próximo, de tal
manera que la unión de un ligando hace que se observen cambios en el
espectro de emisión. En algunas ocasiones dichos ligandos poseen
fluorescencia propia, que puede cambiar cuando se unen a una proteína
(Daniel and Weber 1966; Anderson and Weber 1969; Condie and Quay
1983). Sin embargo, el proceso de unión de ligandos se puede seguir aún
cuando éstos carezcan de fluorescencia propia, ya que la unión de
ligandos a proteínas normalmente induce cambios en la estructura
tridimensional de las mismas que, si dan lugar a una alteración del
entorno de algún fluoróforo, provocarán cambios en los espectros de
fluorescencia. Todos estos cambios en la emisión de fluorescencia a una
longitud de onda determinada pueden emplearse para obtener la constante
de unión de un determinado proceso.
En nuestro caso, las medidas de fluorescencia realizadas nos han
sido de gran utilidad para obtener una estimación inicial de la constante
de disociación (Kd) de los diferentes ligandos peptídicos (sintéticos y
naturales) a los dominios SH3 y WW, sus construcciones en tándem y
algunos mutantes, siguiendo las variaciones en la intensidad de
fluorescencia y el desplazamiento del máximo de longitud de onda de los
triptófanos presentes en estos dominios.
2.3.2. Experimentos de titulación
espectroscopía de fluorescencia
proteína-ligando
mediante
Las medidas de fluorescencia se han realizado en un
espectrofluorímetro Cary Eclipse (VARIAN, Inc). Para determinar las
diferentes constantes de disociación (Kd), se realizaron una serie de
experimentos de titulación por adición de volúmenes variables de
disoluciones de los diferentes péptidos empleados en este trabajo sobre las
diferentes disoluciones de proteínas. Los experimentos se llevaron a cabo
preparando una disolución madre de proteína de una concentración no
inferior a 50 µM, dializada frente al tampón de diálisis correspondiente al
doble de la concentración requerida para el experimento. Por otro lado, y
84
Materiales y
Métodos
como se ha descrito en la Sección 2.2.2, se preparó una disolución madre
de péptido a una concentración entre 5 y 8 mg·mL-1 en agua. A partir de
estas disoluciones madre de proteína y de ligando se prepararon,
añadiendo las cantidades necesarias de agua y de tampón de diálisis, dos
disoluciones con concentraciones finales de 20 µM de proteína y 1.8 mM
de ligando.
El espectro de la proteína libre se obtuvo utilizando una cubeta de
cuarzo para fluorescencia de 3 mm, de pequeño volumen de muestra y
termostatizada a 25ºC, en la que se introdujeron 120 µL de la disolución
de proteína. A este volumen se le adicionaron progresivamente, mediante
jeringas Hamilton de alta precisión, volúmenes crecientes (entre 0.5 y 25
µL) de la disolución de ligando. Tras cada adición, la disolución de
muestra se homogeneizó y posteriormente se registraron los espectros de
emisión de fluorescencia. Para los ligandos usados en los experimentos de
fluorescencia que contienen restos de tirosina en su secuencia, se
realizaron experimentos adicionales en los que se recogieron los espectros
de fluorescencia, añadiendolos mismos volúmenes de ligando, de una
disolución de tampón que se utilizó como blanco para el análisis. Todos
los espectros de emisión se registraron a 25ºC, entre 300 y 500 nm,
utilizando una longitud de onda de excitación de 280 nm, y rendijas de
excitación y emisión entre 5 y 10 nm (en el caso de las construcciones en
tándem de hNedd4).
2.3.3. Análisis de un experimento de titulación proteína-ligando
mediante espectroscopía de fluorescencia
Una vez sustraída la fluorescencia intrínseca del ligando, se
normalizó cada espectro por la concentración total de proteína en la
cubeta (MT), teniendo en cuenta la dilución de ésta tras cada adición de
ligando. De este modo, la señal de intensidad de fluorescencia en cada
medida del experimento de titulación viene dada por:
(2.3.1)
donde Fi,n se refiere a la intensidad de fluorescencia corregida por la
fluorescencia debida al ligando y normalizada por la concentración total
de proteína (o al área, según el análisis que empleemos); FM es la
intensidad de fluorescencia de la proteína libre; FML la intensidad de
85
fluorescencia del complejo ML, y la fracción de saturación en cada
punto de la titulación, que se define como:
donde MT y LT son las concentraciones totales de proteína y ligando
respectivamente. Sustituyendo 2.3.2 en 2.3.1, podemos obtener la
ecuación correspondiente al modelo para un sitio de unión al cual se
ajustan los datos experimentales:
Para el análisis de los datos experimentales lo más frecuente es
hacer uso, bien de la intensidad de fluorescencia en el máximo del
espectro de emisión de la proteína libre (en nuestro caso 340 nm), o bien
del área bajo la curva del mismo espectro. Si representamos cualquiera de
éstas frente a la concentración de ligando total en la cubeta (LT)
obtenemos la curva característica de unión. Sin embargo, en nuestro caso,
hemos observado que para algunos ligandos además de producirse un
cambio en la intensidad de fluorescencia también se produce un
desplazamiento en la longitud de onda del máximo de emisión. De este
modo, para poder analizar los datos hemos utilizado el centro de masas
espectral (Mohana-Borges et al. 1999), el cual se define como:
donde es el centro de masas en números de onda (cm-1) y Fi es la
. Empleando este
fluorescencia emitida para cada número de onda
método de análisis se consideran simultáneamente tanto los cambios en la
intensidad como los desplazamientos en longitud de onda del máximo de
emisión tras cada adición de ligando. Si representamos el centro de
masas , frente a la concentración de ligando total en la cubeta (LT)
obtenemos igualmente la curva de unión, de cuyo ajuste por regresión no
lineal de mínimos cuadrados de los puntos que definen dicha curva,
empleando la ecuación 2.3.3, podemos obtener el valor de la constante de
disociación (Kd).
86
Materiales y
Métodos
2.4. Calorimetría Diferencial de Barrido
2.4.1. Introducción
La Calorimetría Diferencial de Barrido (Differential Scanning
Calorimetry, DSC) es actualmente la técnica más completa para
caracterizar la energética de plegamiento-desplegamiento de las proteínas.
En general, con esta técnica se estudian los cambios conformacionales
inducidos por la temperatura en proteínas, ácidos nucléicos y membranas
lipídicas (Sanchez-Ruiz 1995; Cobos et al. 2001; Dragan and Privalov
2002; Garcia-Mira et al. 2002; Ruiz-Sanz et al. 2004; Privalov and Dragan
2007; Streicher and Makhatadze 2007; Candel et al. 2008; Varela et al.
2009; Johnson 2013).
Un calorímetro diferencial de barrido registra la capacidad
calorífica aparente de una disolución de macromolécula en función de la
temperatura. El posterior análisis del termograma, utilizando modelos
basados en la termodinámica del equilibrio, puede proporcionar la
caracterización termodinámica completa del proceso de desplegamiento
térmico de dicha macromolécula. Esto permite obtener la capacidad
calorífica parcial absoluta del sistema en función de la temperatura, así
como los parámetros termodinámicos asociados, tales como el cambio de
entalpía, ΔHD, de entropía, ΔSD, de energía de Gibbs, ΔGD, y de
capacidad calorífica, ΔCp, correspondientes a la transición inducida por la
temperatura, así como la función de partición y la población de los
estados predominantes en los que se encuentra el sistema y sus parámetros
termodinámicos característicos.
El modelo de equilibrio más simple que existe para el análisis del
desplegamiento térmico de proteínas es el modelo de dos estados, el cual
supone que las proteínas sólo pueden encontrarse en estado nativo o en
estado desplegado. Otros modelos pueden suponer la existencia de
intermedios de plegamiento significativamente poblados y/o estados con
diferentes grados de asociación (Luque et al. 2002).
87
Figura 2.2. Información contenida en una traza de Calorimetría Diferencial de Barrido
(DSC). En trazo continuo negro se representa, a modo de ejemplo, la curva de capacidad
calorífica en función de la temperatura del domino N-terminal del represor R69 del fago
434 en acetato sódico 20 mM a pH 4.5 (Ruiz-Sanz et al. 1999). Cp,N y Cp,D representan las
capacidades caloríficas de los estados nativo y desnaturalizado en rojo y azul,
respectivamente. La Tm corresponde a la temperatura del máximo del pico de la transición.
La curva sigmoidal en color naranja representa la función de la capacidad calorífica
interna. El área bajo la transición, con rayas naranjas, corresponde al cambio total de
entalpía para la temperatura de desnaturalización, ∆Hm,exp o entalpía calorimétrica.
En la Figura 2.2 se ha representado un ejemplo de una endoterma
de desplegamiento térmico de una proteína con los principales parámetros
que pueden determinarse a partir de un análisis calorimétrico. La
temperatura del máximo del pico de la transición, Tm, corresponde a la
temperatura donde el 50% de las moléculas de proteína se encuentran
desnaturalizadas en el caso de una transición de dos estados sin ningún
tipo de proceso acoplado de asociación o disociación. El calor de la
transición o entalpía calorimétrica correspondiente a la temperatura Tm,
ΔHm,exp, es el área de la curva de capacidad calorífica. Las líneas base de
pre- y post-transición son las funciones de las capacidades caloríficas
dependientes de la temperatura para el estado nativo, Cp,N, y para el
estado desplegado, Cp,D, de la proteína. La diferencia entre estas
funciones, ΔCp,N-D, es el cambio de capacidad calorífica asociado a la
desnaturalización de la proteína. A partir de estos parámetros, se
completa la caracterización termodinámica del desplegamiento mediante
distintas relaciones matemáticas, de acuerdo con el modelo de equilibrio
utilizado para el análisis, pudiendo determinarse parámetros como: el
88
Materiales y
Métodos
cambio de entalpía, ΔHN-D (T), de entropía, ΔSN-D (T), la energía de Gibbs,
ΔGN-D (T), la temperatura máxima de estabilidad, Ts, la temperatura de
inversión de entalpía, TH, etc.
Una descripción más detallada de los fundamentos y
características de esta técnica se puede encontrar en algunas tesis
doctorales desarrolladas en nuestro grupo de investigación (Cobos 2002;
Casares 2003; Candel 2008), y en numerosas referencias bibliográficas
(Sturtevant 1977; Privalov 1979; Privalov 1982; Mateo et al. 1984; Cooper
and Johnson 1994a; Freire 1995; Sanchez-Ruiz 1995; Martinez JC 2011).
2.4.2. Realización del experimento calorimétrico
Para la realización de todos los experimentos de DSC llevados a
cabo en este trabajo se ha empleado un microcalorímetro Cap-DSC
(Capillary cell microcalorimeter de MICROCAL INC.), el cual nos
permite medir la capacidad calorífica de forma continua, calentando o
enfriando a velocidad constante, midiendo la diferencia de capacidad
calorífica entre dos células lo más parecidas posible y que contienen la
disolución de la muestra objeto de estudio (célula de muestra) y una
disolución de referencia (célula de referencia).
El experimento calorimétrico se inicia llenando ambas células con
el tampón filtrado y desgasificado procedente del último cambio de
diálisis y registrando varios barridos de temperatura, para asegurarnos de
que éstos son reproducibles. Estas trazas corresponden a la denominada
línea base instrumental. A continuación, se llena la célula de muestra con la
disolución de proteína y la célula de referencia con la disolución tampón.
Una vez que se han llenado ambas células, se realiza el primer barrido de
temperatura de la muestra manteniendo las mismas condiciones
experimentales. Posteriormente, se realiza un segundo barrido de
temperatura de la muestra sin extraer la proteína del calorímetro para
comprobar la reversibilidad del proceso de desplegamiento.
2.4.3. Cálculo de la capacidad calorífica molar parcial de la proteína
Los ficheros generados por el programa de adquisición de datos
del calorímetro contienen el valor de una señal proporcional a la variación
de la capacidad calorífica de la disolución de proteína con la temperatura.
Con el fin de obtener una caracterización termodinámica completa (Tm,
89
ΔHm,exp, ΔCp,N-D, etc), es necesario realizar un tratamiento de los datos
obtenidos. El primer paso es sustraer la línea base instrumental al primer y
segundo barrido de temperatura de la disolución de proteína. Así se
obtiene la dependencia de la capacidad calorífica aparente de la proteína
con la temperatura (Cp,ap), eliminando las posibles contribuciones
instrumentales a la capacidad calorífica. A continuación, se expresan los
datos brutos (potencia eléctrica frente a temperatura) en términos de
capacidad calorífica molar mediante la siguiente ecuación:
donde υ es la velocidad de barrido de temperatura, c la concentración de
proteína de la disolución y V el volumen de la célula del calorímetro.
Existe una diferencia de capacidad calorífica aparente entre la línea base
instrumental y el barrido de temperatura de la muestra debido a la
diferencia en capacidad calorífica entre la proteína y las moléculas de
agua que la proteína desplaza en la disolución. La capacidad calorífica de
estas moléculas de disolvente desplazadas presenta un valor mucho mayor
que el de las moléculas de la muestra y por tanto, esta diferencia es
generalmente negativa. Para corregir este efecto en los datos obtenidos de
Cp,ap, debido a la sustracción de la línea base, se obtiene la capacidad
calorífica molar parcial, Cp,p:
La diferencia de capacidad calorífica aparente, ΔCp,ap, se puede
expresar como:
donde Δms son las moléculas del disolvente sustituidas, Cp,s la capacidad
calorífica del disolvente, mp la masa de la proteína en la célula de muestra
y, υp y υs los volúmenes parciales específicos del disolvente y la proteína,
respectivamente. Cuando el disolvente es un tampón acuoso diluido, se
utilizan los valores del agua pura (1mL·g-1 y 4.186J·K-1·g-1, para el υs y la
Cp,s respectivamente) y un valor de 0.73 g·mL-1 para υp, que corresponde a
proteínas globulares. Por lo tanto, para convertir Cp,ap en Cp,p, la
transformación que se utiliza es:
90
Materiales y
Métodos
(2.4.4)
donde Pm es el peso molecular de la proteína.
Además, la medida se ve afectada por un tiempo de respuesta
conocido del bloque térmico del instrumento (τ), debido a que la
transferencia de calor que se produce en las células del calorímetro no es
instantánea. Este desfase temporal entre el calor producido y la señal
registrada afecta y distorsiona los termogramas obtenidos, por tanto, es
importante corregir el efecto del tiempo de respuesta en el calorímetro
(Mayorga et al. 1987):
donde ν es la velocidad de barrido de la temperatura.
Todas las operaciones de normalización
los datos brutos de DSC, hasta obtenerlos en
calorífica molar parcial, han sido realizadas
MicroCalOrigin, versión 7.0 (Microcal
Massachusetts).
y tratamiento previo de
unidades de capacidad
mediante el programa
LLC. Northampton,
2.4.4. Análisis de las trazas calorimétricas según la termodinámica de
equilibrio. El modelo de equilibrio de dos estados
Del análisis de la capacidad calorífica molar parcial de la proteína
como una función de la temperatura se pueden obtener los parámetros
termodinámicos del proceso de desnaturalización térmica. Para ello, una
vez comprobado que dicho proceso es reversible, aplicaremos un modelo
de equilibrio. El modelo de equilibrio de dos estados es el modelo más
sencillo que se puede utilizar, según el cual, durante el proceso de
desplegamiento de la proteína sólo existen dos estados poblados en el
equilibrio, que son el estado nativo (N) y el estado desnaturalizado (D). A
continuación se describe este modelo que ha sido el utilizado para el
análisis de los termogramas. Así, para el equilibrio:
La constante de equilibrio aparente par el desplegamiento viene
dada por:
91
(2.4.6)
La función de partición del sistema se define como:
(2.4.7)
A partir de la función de partición pueden calcularse las
poblaciones de los estados N y D:
La entalpía molar parcial del sistema será:
donde ∆HD es la diferencia de entalpía de desplegamiento, ∆HD=HD–HN.
De esta manera, la capacidad calorífica molar parcial, Cp, se define como:
donde Cp,N es la capacidad calorífica molar parcial del estado nativo. Si
ahora expresamos las dependencias de KD, ∆HD y ∆SD con la temperatura
empleando las relaciones de Kirchhoff y van’tHoff, nos queda:
donde
, siendo ∆GD la diferencia de energía de Gibbs
entre el estado desplegado y el nativo.
La ecuación 2.4.11 puede escribirse entonces como:
92
Materiales y
Métodos
Según los trabajos de Privalov y colaboradores, la función que
describe el cambio de capacidad calorífica de desplegamiento de una
proteína no es constante, sino que presenta una dependencia no lineal de
la temperatura. La función de la capacidad calorífica de una proteína
desplegada se puede estimar a partir de su secuencia aminoacídica
(Makhatadze and Privalov 1990; Privalov and Makhatadze 1990). Así, la
función Cp,D(T), que es la capacidad calorífica molar parcial del estado
desnaturalizado, puede describirse como un polinomio de segundo grado.
Por otro lado, la función que describe la capacidad calorífica molar parcial
del estado nativo Cp,N (T), es prácticamente lineal en el intervalo antes de
la transición (Privalov et al. 1989).
Así, se obtienen las siguientes ecuaciones para Cp,D, Cp,N y ∆Cp:
(2.4.16)
(2.4.17)
(2.4.18)
Para obtener las dependencias de ∆HD y ∆SD con la temperatura
integramos las ecuaciones 2.4.12 y 2.4.13:
(2.4.19)
(2.4.20)
donde ∆Hm y ∆Sm son los incrementos de entalpía y entropía de
desplegamiento a la temperatura de la transición (Tm). Esta temperatura
de transición es aquella a la que fD se hace igual a 0.5, ∆GD se anula y por
lo tanto KD se hace igual a 1. En ese punto, el cambio de entropía a la
temperatura Tm, ∆Sm, se puede obtener según la ecuación siguiente:
93
Si integramos las ecuaciones de ∆HD(T) y de ∆SD(T) con respecto
a la temperatura, obtenemos:
(2.4.22)
(2.4.23)
(2.4.24)
Para los ajustes no lineales por mínimos cuadrados de las curvas
de Cp se ha utilizado la ecuación del modelo de dos estados 2.3.14,
implementada en el programa Origin 7.0 (Microcal Software Inc.). Pero
antes es preciso definir todas las magnitudes de las que depende Cp en
dicha ecuación en función de la temperatura (2.3.16 a 2.3.18 y 2.3.22 a
2.3.24). De esta manera la Cp queda expresada en función de la
temperatura y una serie de parámetros, de cuyo ajuste obtenemos los
valores de Tm, ∆Hm, y las dependencias de Cp,N y Cp,D con la temperatura.
A partir de aquí, se puede completar la caracterización termodinámica de
la proteína calculando las funciones ∆HD (T), ∆SD(T), ∆Cp(T), ∆GD (T).
2.5. Calorimetría Isotérmica de Titulación
2.5.1. Introducción
La Calorimetría Isotérmica de Titulación (Isothermal Titration
Calorimetry, ITC) es una técnica que mide directamente el calor que se
absorbe o se libera en cualquier proceso de interacción intermolecular,
como es el caso de asociaciones proteína-ligando, proteína-proteína, etc.
Los experimentos de ITC se realizan a presión y temperatura constantes,
por lo que el calor medido durante la valoración equivale a la entalpía de
este proceso (Wiseman et al. 1989). Si el efecto térmico y la magnitud de
la constante de unión son lo suficientemente grandes, se pueden
determinar parámetros tales como la constante de equilibrio de
asociación, K, el cambio de entalpía de unión, ΔH, así como la
estequiometría de la reacción, n. Como consecuencia, se pueden calcular
la energía de Gibbs y la entropía de formación del complejo (ΔG y ΔS).
Además, si se realizan los experimentos a diferentes temperaturas, es
posible determinar el cambio en la capacidad calorífica del proceso ΔCp.
94
Materiales y
Métodos
Una descripción más detallada de los fundamentos y
características de esta técnica se puede encontrar en algunas tesis
doctorales desarrolladas en nuestro grupo de investigación (Casares 2003;
Palencia 2008), y en varias referencias bibliográficas (Wiseman et al.
1989; Cooper and Johnson 1994b).
2.5.2. Diseño del experimento de ITC
El diseño de los experimentos de interacción se lleva a cabo
usando una de las plantillas de simulación desarrolladas en nuestro grupo
de investigación. Para ello, se utilizan los valores de las constantes de
disociación determinadas mediante espectroscopía de fluorescencia
(Sección 2.3) o, en algunos casos, la información descrita en bibliografía
(afinidad, estequiometría, etc.) y a continuación se optimizan las
concentraciones de ligando y proteína necesarias. Para obtener un
experimento de ITC adecuado, un parámetro muy útil es el producto
K·[MT], cuyo valor debe estar entre 1 y 100, aunque el valor óptimo está
entre 10 y 100, el cual es determinante para optimizar la forma de la curva
isoterma de unión, que debe ser lo más sigmoidal posible. Dicha curva se
obtiene representando el calor por mol de ligando añadido tras cada
inyección frente a la relación entre la concentración de ligando total y la
concentración de macromolécula total (considerando en este caso que el
ligando está en la jeringa de inyección y la macromolécula en la célula de
reacción). Otros parámetros utilizados para la optimización son el
volumen de inyección y la concentración de ligando, los cuales, junto con
la optimización del producto anterior, deben conseguir que se alcance una
saturación elevada (por encima del 80%), indicando que casi la totalidad
de la proteína que contiene la célula calorimétrica se encuentra unida al
ligando (Jelesarov and Bosshard 1999; Velazquez-Campoy et al. 2004;
Velazquez-Campoy and Freire 2006).
En la Figura 2.3 se muestran las simulaciones de un experimento
convencional de ITC, consistente en 20 inyecciones de 5 µL de una
disolución de ligando 5 mM sobre un volumen Vc=1.347 mL, que
corresponde al volumen de la célula de reacción, de una disolución de
macromolécula 1.8·10-4 M, con un único sitio de unión para el ligando.
Hemos considerado cuatro posibles valores de la constante de asociación,
2.5·106; 2.5·105; 2.5·104 y 2.5·103 M-1, que abarcan un intervalo desde una
afinidad relativamente alta, hasta una afinidad baja. Como puede
95
observarse, cuando el producto de K·[MT] está dentro del intervalo
adecuado (10-100) es fácil obtener una isoterma de unión de forma
sigmoidal, lo que posibilita que el ajuste por regresión no lineal
proporcione parámetros con errores estándar aceptables. Cuando el
producto K·[MT] no es tan favorable, bien por tener una constante muy
pequeña o muy alta, o bien porque la macromolécula sea poco soluble, no
es fácil obtener la isoterma de unión completa (con forma sigmoidal)
manteniendo constante el volumen de cada inyección, estas curvas de
unión incompletas o sesgadas proporciona parámetros afectados por un
elevado error y dependencia mutua. Por esta razón, nuestro grupo de
investigación ha prestado especial atención al diseño de experimentos con
un perfil de volúmenes de inyección utilizando diferentes volúmenes para
cada punto de la valoración, siendo, en general, menores en las primeras
inyecciones y aumentando progresivamente de forma no lineal. Otro
beneficio de usar un perfil óptimo de volúmenes de inyección es la mejora
de la relación señal/ruido en la parte final de la curva, donde los calores
debidos a la unión del ligando a la proteína son muy pequeños.
Generalmente, en un estudio termodinámico mediante ITC se
deben obtener dos termogramas; uno correspondiente a la titulación de la
macromolécula con el ligando y un segundo de titulación del ligando con
el tampón de diálisis. Este último, representa los calores de la dilución del
ligando y los posibles artefactos de inyección que deben sustraerse del
termograma principal para obtener los efectos térmicos netos de la
interacción macromolécula-ligando.
96
Materiales y
Métodos
Figura 2.3.Simulación del calor por mol de ligando añadido asociado a cada inyección
para un experimento de ITC con los siguientes parámetros experimentales: VC=1.347 mL;
[M] inicial en célula de 1.8·10-4 M; 20 inyecciones de 5 μL; [L] en la jeringa de inyección de
5 mM; un solo sitio de unión para el ligando, n de 1 y cuatro posibles valores de la
constante de asociación, 2.5·106, 2.5x105, 2.5x104 y 2.5x103 M -1.
2.5.3. Realización de los experimentos de ITC
Los experimentos de ITC se han realizado indistintamente
utilizando dos microcalorímetros isotérmicos de titulación VP-ITC
(MICROCAL INC., Northampton, MA) y MicroCal ITC 200 (GE
Healthcare). Las alícuotas de las proteínas se dializaron frente al tampón
de diálisis al doble de la concentración requerida para el experimento. Las
disoluciones ya dializadas fueron filtradas y desgasificadas para evitar la
formación de burbujas, y equilibradas a la temperatura experimental. La
disolución de proteína en la célula de muestra fue titulada con el ligando
apropiado disuelto en el tampón de diálisis. Las concentraciones de
proteína y ligando para cada experimento variaban en función de la
constante de unión obtenida anteriormente por espectrometría de
fluorescencia, estando éstas entre 10 y 40 µM para las proteínas y entre 0.5
y 3 mM para los ligandos. Los experimentos de titulación se realizaron o
bien inyectando un volumen constante de la disolución de ligando cuando
las constantes de unión eran relativamente elevadas o usando un perfil de
volúmenes de inyección desde 2 hasta 20 µL para poder definir mejor la
curva de titulación. De estos experimentos se obtiene el termograma
correspondiente a la interacción. Del mismo modo, fue necesario obtener
el termograma de la dilución por lo que se tituló el ligando sobre la
97
disolución tampón en ausencia de proteína, utilizando el mismo perfil de
volúmenes.
2.5.4. Formulación y análisis de los experimentos de ITC
El análisis de las isotermas se realizó mediante el ajuste no lineal
por mínimos cuadrados de acuerdo con los modelos de unión de un
ligando a una macromolécula con “n” sitios idénticos e independientes o
“m” sitios diferentes e independientes, dependiendo del tipo de unión del
ligando a la macromolécula. Todos los ajustes de las curvas a los
diferentes modelos se realizaron con el programa Origin 7.0 para ITC.
2.5.4.1. Modelo de unión de un ligando a una macromolécula con “n”
sitios idénticos e independientes
En aquellos casos en los que ni aparece un efecto cooperativo ni la
proteína presenta diferentes clases de sitios de unión para el ligando, el
comportamiento del sistema interaccionante se describe adecuadamente a
través del modelo de unión de un ligando a una macromolécula con “n”
sitios idénticos e independientes. El término “idénticos” implica la misma
constante de unión microscópica a cualquiera de los “n” sitios, y el
término “independientes” que la unión a un sitio cualquiera no modifica
la afinidad de los restantes.
M + nL
MLn
El análisis termodinámico estadístico de un proceso de unión con
estas características nos demuestra que la función de partición de unión
(Z), que describe las poblaciones de los diferentes estados moleculares
accesibles del sistema, es:
(2.5.1)
donde K es la constante de equilibrio por sitio de unión, [L] la
concentración de ligando libre y n es el número de sitios de unión de la
macromolécula para el ligando. La razón de la concentración de ligando
unido, [L]b, con la concentración de macromolécula total, [M]T, conocida
está relacionada con la función de
como parámetro de unión
partición de unión por:
98
Materiales y
Métodos
donde [L] representa la concentración de ligando libre en equilibrio con
las otras especies moleculares que interaccionan en dicho sistema (M,
ML, ML2,…, MLn).
Un experimento convencional de ITC está constituido por una
serie de inyecciones de un determinado volumen de disolución de ligando,
constante o variable para cada inyección, separadas cada una por un
intervalo de tiempo suficiente para asegurar que se ha alcanzado el
equilibrio y se ha transferido o compensado todo el calor liberado o
absorbido. En una inyección cualquiera “i” de la serie, el calor liberado o
absorbido será:
donde Lb representa el ligando unido y ∆Hap es el cambio de entalpía
aparente por mol de ligando unido. Si Vc representa el volumen de la
célula, que coincide con el volumen inicial de la muestra, la ecuación
anterior puede expresarse más explícitamente como:
(2.5.5)
donde [L]b representa la concentración de ligando unido y [M]T la
concentración de proteína en la célula. Si consideramos que el volumen
efectivo que interviene en la reacción es aquel que llena la célula,
entonces, las concentraciones de macromolécula y ligando actuales en la
célula han de corregirse por el volumen desplazado fuera de la célula tras
cada inyección. Así la concentración de macromolécula en la célula
después de cada inyección i ([M]T,i= [M]+[ML]+[ML2]+…) será:
y la concentración total del ligando en la célula de reacción:
99
donde Vin y [L]0 son el volumen de inyección y la concentración en jeringa
del ligando. El calor total acumulado después de N inyecciones será:
Durante el experimento el valor de la variable [L] no es conocida
por lo que operativamente conviene expresarla en función de las variables
experimentales [L]T y Q:
Sustituyendo [L] en la ecuación 2.5.8 por la expresión 2.5.9 se
obtiene una ecuación de segundo grado en Q cuya solución es:
(2.5.10)
Esta ecuación relaciona el calor total acumulado después de N
inyecciones con las variables experimentales Vc, [L]T y [M]T y los
parámetros n, K y ∆Hap a determinar en el análisis de los datos de un
experimento de ITC convencional. Derivando la ecuación 2.5.10 respecto
a [L]T obtendremos una expresión para el calor por mol de ligando
añadido asociado a cada inyección:
De acuerdo con estas ecuaciones, existen dos formas posibles de
analizar los calores experimentales: una en la que se considera el calor por
mol de ligando añadido asociado a cada inyección y otra en la que se
contempla el calor acumulado. La primera, que es la que se ha utilizado
100
Materiales y
Métodos
en este trabajo, tiene la ventaja de evitar la propagación de errores
experimentales debido a que se puede prescindir de los puntos con error
para el análisis, mientras que en el caso de los calores acumulados no es
posible. Por tanto, la ecuación 2.5.11 es la que hemos utilizado para el
ajuste de los datos experimentales, mediante el módulo para calorimetría
isotérmica de titulación del programa Origin 7.0 para ITC.
Una vez corregida la línea base, el termograma neto se integra
para obtener los calores correspondientes de cada inyección de la
titulación y se normalizan por la concentración de ligando total en la
célula tras cada inyección. Estos valores del calor transferido por mol de
ligando añadido (dQi/dLT,i) representados frente al cociente [L]T/[M]T
permiten obtener la isoterma de unión (Figura 2.4). Ajustando dicha
curva a la ecuación 2.5.11 mediante regresión no lineal es posible obtener
los parámetros n, K y ∆Hap de dicha interacción. El resto de parámetros
termodinámicos que caracterizan la interacción se obtienen haciendo uso
de las ecuaciones fundamentales ∆G = -RTlnK y ∆G = ∆H - T∆S.
Figura 2.4. Dependencia del calor liberado tras la inyección de L a M frente al cociente
concentración de ligando total/concentración de proteína total. Los círculos representan los
datos experimentales y la línea el ajuste al modelo de “n” sitios de unión idénticos e
independientes (ecuación 2.5.11).
101
2.5.4.2. Modelo de unión de un ligando a una macromolécula con “m”
clases de sitios diferentes e independientes
En este caso, cada clase de sitio de unión se define como sitios
diferentes (no idénticos) e independientes de las otras clases para el mismo
ligando. El término “sitios diferentes” implica una constante microscópica
de equilibrio para cada clase de sitios, y el término “independiente” que la
unión a un sitio cualquier no modifica la afinidad de los restantes. La
formulación y el desarrollo matemático correspondiente para este modelo
de unión, considerando que sólo existen dos clases diferentes de sitios
(m=2), n1 y n2, se describe a continuación:
Ln2
M+(n1+n2) L
M Ln1
La relación de la concentración de ligando unido en cada sitio,
[L]b,i, respecto a la concentración de macromolécula total, [M] T:
El calor liberado o absorbido en una inyección cualquiera “j”,
será:
donde ∆Hap,ies el cambio de entalpía aparente por mol de ligando unido
para una clase de sitio, i. Por tanto, se puede escribir como:
(2.5.14)
donde Vc representa el volumen de la célula o volumen inicial de la
muestra y [M]T,j la concentración de proteína en la célula en la inyección
“j”. Considerando el volumen efectivo de la célula, el volumen de
inyección,Vin, y la concentración en jeringa del ligando [L]0, se corrigen la
102
Materiales y
Métodos
concentraciones de macromolécula, [M]T,j, y ligando, [L]T,i, mediante las
siguientes ecuaciones:
El calor acumulado después de N inyecciones será:
Durante el experimento el valor de la variable [L] no es conocida
por lo que operativamente conviene expresarla en función de las variables
experimentales ligando unido total
y el calor total
acumulado Q(N):
Sustituyendo y ordenando se obtiene la siguiente ecuación cúbica:
(2.5.20)
donde se definen:
y cuya solución es:
103
(2.5.24)
ahora, las expresiones A, B y C agrupan de nuevo los términos a, b y c
como:
La solución de la ecuación cúbica (2.5.24) nos permite calcular la
concentración de ligando libre, [L], tras un número dado de inyecciones.
Sustituyendo en la ecuación (2.5.18) se calculan los calores asociados a
cada inyección a través de la siguiente ecuación:
104
Transmisión de información a través
de efectos alostéricos en el dominio
SH3 de cSrc
Capítulo 3
CAPÍTULO 3.- Transmisión de información a través de efectos
alostéricos en el domino SH3 de cSrc
3.1. Introducción
Los dominios SH3 desempeñan un papel importante en los
distintos mecanismos de transmisión de señales, por lo que presentan una
afinidad de unión moderada que les permite formar complejos transitorios
y una especificidad lo suficientemente precisa para discriminar entre
sustratos. Durante la última década, nuestro grupo de investigación ha
llevado a cabo un extenso análisis termodinámico de la interacción de
diversos ligandos naturales y de diseño, con los dominios SH3 de cSrc,
cYes y Fyn, con el fin de elucidar los mecanismos que determinan la
afinidad y especificidad de unión de estos dominios. cSrc, cYes y Fyn,
pertenecen a la familia de las quinasas de tirosina y presentan, en relación
al dominio SH3, una identidad del 70% en su secuencia y una elevada
homología estructural (Summy and Gallick 2003). A pesar de su alta
homología y que el sitio de unión es una de las zonas más conservadas, el
estudio termodinámico de la interacción de estos tres dominios con el
péptido VSL12 revela diferencias muy significativas en los patrones
termodinámicos de unión (Martin-Garcia 2009).
El péptido VSL12, cuya secuencia es VSLARRPLPPLP, fue
identificado mediante la técnica de expresión en fagos, une a los tres
dominios con orientación tipo I y hasta la fecha es uno de los ligandos que
presenta mayor afinidad para cualquiera de ellos (Feng et al. 1995). A
pesar de su elevada afinidad, la caracterización termodinámica de su
interacción con los dominios SH3 de cSrc, cYes y Fyn revela una gran
variabilidad en las contribuciones entálpica y entrópica para los tres
dominios SH3. Así, cSrc-SH3 se une a VSL12 con un cambio de entalpía
muy inferior (20 kJ·mol-1 de diferencia) respecto a Fyn y cYes. Este hecho
llama especialmente la atención si tenemos en cuenta que los tres
dominios sólo difieren en un residuo en la región del sitio de unión.
Con la intención de localizar los residuos responsables de esta
diferencia entálpica y así identificar las causas del patrón termodinámico
anómalo que presentan los dominios SH3, nuestro grupo de investigación
realizó un completo análisis mutacional, donde se sustituyeron de forma
sistemática en el dominio SH3 de cSrc todos los restos que difieren en
cYes y Fyn. Este análisis reveló que las mutaciones en los residuos
109
cercanos al sitio de unión no provocaban cambios significativos en los
parámetros termodinámicos de unión. Sin embargo, los mayores efectos
estaban sorprendentemente asociados a las mutaciones en las zonas más
alejadas del sitio de unión como en el lazo distal (H122R, R128E y
R128K). Dado que tanto el sitio de unión como el ligando no han sido
modificados, la variación de entalpía observada no debería de estar
relacionada con cambios en las interacciones directas establecidas en la
interfaz entre el ligando y el dominio. Tampoco es de esperar efectos
asociados a la oclusión de moléculas de agua ni a un comportamiento
diferente del ligando para adoptar la conformación en hélice de
poliprolina II. Por tanto, la variación observada en los parámetros
termodinámicos debería de tener fundamentalmente su origen en la
propagación cooperativa de los cambios locales en la posición 128.
Estudios de resonancia magnética nuclear han demostrado que
cualquier cambio en las interacciones locales del dominio SH3 puede
afectar al comportamiento global de la estructura y a la distribución de las
poblaciones conformacionales, alterando sus propiedades al reconocer y
unir ligandos (Casares 2003; Casares et al. 2007a; Casares et al. 2007b).
Por tanto, se puede decir que las mutaciones introducidas en el lazo distal
provocan una variación local de interacciones que se propagaría a lo largo
del dominio. Esto afectaría a la variación de entalpía de unión al
producirse diferentes fenómenos de reorganización, que se manifiestan en
las diferencias detectadas en los parámetros termodinámicos de la unión a
VSL12.
Para determinar la existencia de dicha propagación se realizó un
estudio de la influencia del ligando en la dinámica conformacional de los
dominios y sus mutantes mediante simulaciones de dinámica molecular,
permitiendo evaluar las variaciones en la dinámica conformacional y
hacer un seguimiento a nivel molecular de la dinámica de las
interacciones diferenciales en cada mutante, con el fin de racionalizar las
diferencias observadas en los parámetros energéticos (Corbi-Verge 2012).
Del análisis de las distintas trayectorias fue posible extraer información
acerca de las interacciones (enlaces de hidrógeno y puentes salinos) intrae inter-moleculares en los distintos dominios y cómo éstas se veían
afectadas por la unión del ligando. Este análisis pone de manifiesto que
las mutaciones puntuales en la posición 128 inducen cambios
significativos en las interacciones electrostáticas que afectan a la dinámica
conformacional del dominio libre.
110
Capítulo 3
De igual modo, se han observado diferencias significativas en la
red de enlaces de hidrógeno intramoleculares correspondientes a los
complejos E128-Fyn/VSL12 y K128-cYes/VSL12 con respecto a R128cSrc/VSL12. En general, se observa que la red de enlaces de hidrógeno
intramoleculares en el complejo silvestre difiere considerablemente de la
observada para los complejos E128-Fyn/VSL12 y K128-cYes/VSL12, que
son bastante similares entre sí. Como se había propuesto a partir de los
resultados experimentales, las mutaciones en la posición 128 del lazo
distal (R128E y R128K) inducen una reorganización de los puentes de
hidrógeno que se propaga a través del dominio y que llega incluso a
afectar a las interacciones que establece el dominio con el ligando. Esto
indica que el reconocimiento de ligandos por parte de los dominios SH3
esconde una complejidad mayor que la descrita tradicionalmente, donde
solamente se tenía en consideración la naturaleza hidrofóbica de la
superficie de reconocimiento, jugando un papel determinante factores
como el equilibrio conformacional del ligando y del propio dominio SH3,
así como la reorganización inducida en las distribuciones
conformacionales de ambos como consecuencia de la interacción.
Con el fin de profundizar en el estudio de estos fenómenos
cooperativos en dominios SH3, establecimos una colaboración con el Dr.
Tom Lenaerts (Universidad Libre de Bruselas, Bélgica), quien ha
desarrollado un método teórico para la predicción de redes cooperativas
en proteínas a partir de la información estructural. La aplicación de esta
metodología a los dominios SH3 de la familia Src ha permitido obtener
información de relevancia sobre las redes cooperativas de transmisión de
información, que ha sido validada experimentalmente como se describe a
continuación.
3.2. Resultados y discusión
3.2.1. Identificación de la red de interacciones cooperativas en el
dominio SH3 de cSrc
El método teórico desarrollado por el Dr. Lenaerts, denominado
MCIT (Raimondi et al. 2013), se basa en determinar cómo el
acoplamiento conformacional de las cadenas laterales de los residuos de
una proteína difiere entre el estado unido y libre. Haciendo uso de los
datos estructurales disponibles en las bases de datos y utilizando la teoría
de la información y, de un modo más específico, el concepto de
información común (Shannon 1997), se puede identificar y cuantificar un
111
conjunto de residuos que interaccionan de forma cooperativa y cuya
función es transmitir los cambios alostéricos a través de la estructura del
dominio.
Para comprender qué residuos se encargan de transmitir la señal
de unión de un péptido a través de toda la estructura del dominio SH3 de
cSrc, el Dr. Lenaerts ha aplicado éste método analizando las estructuras
resueltas por Resonancia Magnética Nuclear (RMN), tanto del domino
cSrc-SH3 libre, como unido al ligando RLP2 (RALPPLPRY) (Feng et al.
1994). Una descripción más detallada del método se puede encontrar en
(Lenaerts et al. 2008; Lenaerts et al. 2009).
Para cada par de residuos se mide el nivel de información común,
es decir, la fuerza de acoplamiento entre dos residuos, normalmente en
posiciones alejadas en la estructura. En la Figura 3.1 se observa que gran
parte de los residuos no experimentan cambios significativos en su
acoplamiento. Como era de esperar, la mayoría de efectos significativos
ocurren a lo largo de los residuos del sitio de unión. Aunque el impacto de
la unión del ligando no está distribuido de forma homogénea, algunos
residuos como D99, W118, y Y136 experimentan cambios dinámicos
significativos, mientras que hay residuos que muestran un efecto menor
como el Y92 o casi nulo como el residuo Y90. Curiosamente, además de
los residuos que están en contacto directo con el ligando, otros
aminoácidos lejanos al sitio de unión también experimentan cambios en
su acoplamiento conformacional con otros residuos de la estructura como
son E106 y L108.
Los residuos que experimentan un efecto alostérico mayor,
denominados grupo informativo, se extraen de los datos de la matriz de la
Figura 3.1 usando el algoritmo CAST (Ben-Dor et al. 1999) que genera
una serie de elementos altamente acoplados basados en medidas de
afinidad. Este grupo informativo se encuentra diferenciado por tres
subconjuntos estructurales: 1) Los residuos que pertenecen al sitio de
unión Y92, D99, W118 y Y136. Estos aminoácidos se encuentran
altamente conservados y forman parte de los tres bolsillos hidrofóbicos
situados en el sitio de unión de la mayoría de los dominios SH3. Se
incluyen también en este grupo los restos D99 y D117. El residuo D99
tiene un papel importante a la hora de determinar la orientación de los
ligandos de clase I y clase II respecto al sitio de unión del dominio SH3 de
Src (Feng et al. 1994; Weng et al. 1995). El residuo D117, no forma parte
112
Capítulo 3
de los bolsillos hidrofóbicos pero establece contactos hidrofóbicos con la
primera prolina del motivo de unión PxxP, así como con la leucina
anterior. Por lo tanto, el residuo D117 puede considerarse dentro del
grupo de residuos del sitio de unión, en contacto directo con el ligando. 2)
Los residuos F86, L100, F102, L108, W119 e I132, localizados en el
núcleo del dominio SH3 y 3) Los residuos que se encuentran expuestos en
la superficie de la proteína T85, E106, N113, y H122.
Figura 3.1. Matriz de cambios dinámicos. En esta matriz se representa el valor absoluto
de la diferencia entre los niveles de información común de las diferentes parejas de residuos
en la forma unida y libre del dominio cSrc-SH3. En azul aparecen aquellos residuos que no
experimentan ningún cambio en su información común, en azul claro aquellos residuos que
no experimentan grandes cambios y en verde y rojo están representados aquellos residuos en
los que se percibe un fuerte efecto en el acoplamiento. Los residuos pertenecientes al sitio de
unión se recuadran en blanco. La numeración de los residuos corresponde a la secuencia de
la proteína completa Src (Uniprot ID: P00523).
En la Figura 3.2 se muestra la red de conexión entre los residuos
del grupo informativo. El grosor de cada trazo es proporcional a la
frecuencia con que se establece contacto entre los residuos, es decir, la
frecuencia con la que los dos residuos tienen al menos un par de átomos a
una distancia menor de 5 Å. En contacto directo con los residuos del sitio
de unión, que se encuentran en contacto directo con el ligando, la red
contiene un grupo de residuos a los cuales nos referimos como subgrupo de
113
primer nivel (L100, F102, N113, I132, y W119), y un grupo de residuos
que interaccionan con el subgrupo del primer nivel, al cual nos referimos
como subgrupo de segundo nivel (F86, E106, L108, y H122).
Figura 3.2. Red de conexión de los residuos del grupo informativo del dominio SH3 de
cSrc. Las líneas representan el contacto entre las cadenas laterales en, al menos, la mitad
del conjunto de estructuras analizadas y con una distancia menor a 5 Å en al menos un par
de átomos de los dos residuos. El color de las líneas indica si hay un cambio positivo (rojo) o
negativo (azul) en la información común durante el proceso de unión y su grosor representa
la magnitud de este cambio. Los círculos en color verde claro corresponden a los residuos del
sitio de unión y los verde oscuro los que no pertenecen a éste, mientras que los aminoácidos
del ligando se representan en naranja.
Se ha observado que entre los residuos del sitio de unión y los
residuos del subgrupo de primer nivel, el acoplamiento conformacional es
más intenso (líneas rojas) cuando se forma el complejo, sin embargo, entre
el primer y el segundo nivel el acoplamiento conformacional es más débil
(líneas azules). Esto significa que antes de la unión los residuos del
subgrupo de primer nivel están conformacionalmente acoplados a los
residuos del subgrupo de segundo nivel. Este acoplamiento se ve
perturbado por la unión, relajando el acoplamiento entre estos dos
subgrupos y aumentando el acoplamiento entre las cadenas laterales del
subgrupo de primer nivel y las del sitio de unión. En este aspecto, el
residuo H122, localizado en la lámina β anterior al lazo distal, se
diferencia de los otros aminoácidos del subgrupo de segundo nivel, ya que
114
Capítulo 3
durante la unión del péptido su estado conformacional llega a estar más
acoplado a algunos residuos en el subgrupo de segundo nivel, por lo que
podría considerarse como un tercer nivel.
3.2.2. Comprobación experimental de la predicción de las redes
alostéricas
3.2.2.1. Selección de los mutantes del dominio SH3 de cSrc
A partir del análisis teórico realizado por el Dr. Tom Lenaerts, y
que se ha resumido en el apartado anterior, hemos podido identificar un
conjunto de residuos en el dominio SH3 de cSrc, cuyas propiedades
conformacionales se encuentran afectadas por la unión del péptido RLP2
debido a interacciones directas o indirectas con otros restos del dominio.
Por lo tanto, sería razonable esperar que los cambios en estos residuos
pudieran, a su vez, alterar el equilibrio conformacional del dominio y/o
traducirse en cambios en las energías de unión y plegamiento. También, si
los residuos seleccionados son relevantes, las mutaciones podrían alterar
las propiedades funcionales de la célula. De este modo, para validar esta
predicción teórica, hemos llevado a cabo el análisis del impacto en la
energética de plegamiento e interacción con ligandos de un amplio juego
de mutaciones identificadas a partir de los resultados teóricos. Puesto que
la mutación de restos en el sitio de unión y en contacto directo con el
péptido producirán previsiblemente cambios en la afinidad que no tienen
por qué estar relacionado con efectos cooperativos, hemos centrado
nuestra atención en los residuos de los subgrupos del primer y segundo
nivel, añadiendo otros residuos que nos servirán como control, por
ejemplo el residuo S94 que afecta directamente a la estabilidad del
dominio y R128 que, como se ha mencionado anteriormente, afecta a la
dinámica conformacional del dominio SH3 de cSrc (Martin-Garcia 2009).
En total hemos clonado, expresado y purificado un total de 15 mutantes
cuyas secuencias se representan en la Figura 3.3. Para cada uno de ellos se
ha analizado el efecto de la mutación en la estabilidad estructural del
dominio y en su interacción con el ligando RLP2.
115
Figura 3.3. Secuencia del dominio silvestre cSrc-SH3 (wt) y de sus mutantes. Los
residuos seleccionados se representan con un código de colores de acuerdo al carácter del
aminoácido. Los residuos que se conservan en el dominio han sido sustituidos por puntos.
3.2.2.2. Caracterización del equilibrio conformacional de los mutantes
del dominio SH3 de cSrc
Para evaluar el impacto de las mutaciones en la estabilidad
estructural y las propiedades conformacionales del dominio SH3 de cSrc
hemos llevado a cabo la caracterización del proceso de desplegamiento
mediante Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) para cada uno de los
15 mutantes obtenidos. De este modo, además de obtener información
termodinámica del plegamiento, nos aseguramos de que los dominios
mutantes se encuentran correctamente plegados a la temperatura deseada,
de modo que los cambios en la energética de unión eventualmente
observados no se deban a un plegamiento inducido por la unión del
ligando, sino a los efectos cooperativos que se pretenden estudiar. Para
poder realizar un análisis termodinámico completo, hemos llevado a cabo
experimentos de desnaturalización del dominio silvestre cSrc-SH3 y sus
mutantes, en tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7.0, condiciones
estudiadas anteriormente en nuestro grupo de investigación (MartinGarcia 2009). Todos los experimentos se han realizado a una
concentración de 0.5 mg·mL-1. En estas condiciones se observa que el
desplegamiento térmico del dominio cSrc-SH3 y de sus mutantes presenta
un alto grado de reversibilidad y se ajusta a un modelo de equilibrio de
dos estados (Sección 2.4.4).
116
Capítulo 3
En la Figura 3.4 se representan los termogramas obtenidos para
todos los mutantes juntos, analizados con un ajuste global de todas las
trazas según el modelo de equilibrio de dos estados, suponiendo una
dependencia lineal con la temperatura de la capacidad calorífica del
estado nativo (Cp, N) y de segundo grado para la capacidad calorífica del
estado desplegado (Cp, D).
Figura 3.4. a) Dependencia de la capacidad calorífica molar parcial con la temperatura
para los mutantes pertenecientes al subgrupo del primer nivel. b) Dependencia de la
capacidad calorífica molar parcial con la temperatura para los mutantes pertenecientes al
subgrupo del segundo nivel. Los datos se obtienen a partir de los experimentos en fosfato
sódico 50 mM, pH 7 y en ambos paneles se representan los termogramas del dominio SH3
de cSrc, usado como referencia los mutantes S94A y R128Q utilizados como control. Los
círculos representan los datos experimentales, mientras que las líneas continuas
corresponden al ajuste global según el modelo de equilibrio de desplegamiento de dos estados
(sección 2.4.4).
En la Tabla 3.1 se muestran los parámetros termodinámicos del
desplegamiento obtenidos para los mutantes y el dominio cSrc-SH3.
117
Tabla 3.1. Parámetros termodinámicos del desplegamiento térmico del dominio cSrc-SH3
y sus mutantes, obtenidos del análisis de las curvas de DSC mediante el modelo de
equilibrio de dos estados.
Tm
∆Tm
∆H25ºC
∆∆H25ºC
∆G25ºC
∆∆G25ºC
Proteína
(oC)
(oC)
(kJ/mol)
(kJ/mol)
(kJ/mol) (kJ/mol)
cSrc-SH3
20.4±1.0
75.5
0
67.7±12.8
0
0
wt
cSrc-SH3
69.6
-5.9
68.4±11.3
0.7±2.6
17.5±0.8
-2.9±0.3
F86L
cSrc-SH3
77.9
2.4
99.6±13.2
31.9±1.5
26.4±1.1
6.0±0.2
F86W
cSrc-SH3
81.3
5.8
98.4±13.1
30.7±2.3
28.3±1.2
7.9±0.3
S94A
cSrc-SH3
68.5
-7.0
55.0±11.1
-12.7±2.9
15.3±0.8
-5.1±0.4
L100V
cSrc-SH3
74.1
-1.1
61.9±12.4
-5.8±1.5
18.8±1.0
-1.6±0.2
F102I
cSrc-SH3
71.5
-4.0
72.6±11.7
4.9±2.0
19.0±0.9
-1.4±0.3
L108I
cSrc-SH3
64.9 -10.6
56.9±11.4
-10.8±5.0
13.9±0.8
-6.5±0.6
L108V
cSrc-SH3
77.1
1.6
84.4±12.9
16.7±1.2
23.7±1.0
3.3±0.2
N113S
cSrc-SH3
72.6
-2.9
59.9±11.8
-7.8±1.6
17.8±0.9
-2.6±0.2
W119L
cSrc-SH3
72.4
-3.1
84.8±12.2
17.1±2.1
21.2±0.9
0.8±0.3
H122R
cSrc-SH3
68.8
-6.5
69.8±83.7
2.1±2.6
17.3±0.8
-3.1±0.3
R128E
cSrc-SH3
77.5
2.0
72.9±13.3
5.2±1.5
22.2±1.1
1.8±0.2
R128K
cSrc-SH3
73.3
-2.2
75.8±12.2
8.1±1.6
20.4±0.9
0.0±0.2
R128Q
cSrc-SH3
75.6
0.1
88.7±12.
21.0±1.0
23.5±1.0
3.1±0.2
I132V
Los errores en los parámetros termodinámicos se han calculado según el modelo que aparece
en el Apéndice I.
118
Capítulo 3
Figura 3.5. Representación en forma de barras de las diferencias de la energía libre de
Gibbs de la estabilidad de los diferentes mutantes respecto al dominio silvestre SH3 de
cSrc. En azul claro aparecen aquellos mutantes cuya diferencia en valor absoluto oscila
entre 0 y 3 kJ·mol-1, en azul aquellos mutantes cuya diferencia en valor absoluto se
encuentra entre 3 y 6 kJ·mol-1, y en azul oscuro aquellos mutantes cuya diferencia en valor
absoluto está entre 6 y 9 kJ·mol-1.
Como se puede observar en la Figura 3.5, la mayoría de las
mutaciones puntuales no producen efectos significativos sobre la
estabilidad del domino cSrc-SH3. Las mayores diferencias aparecen en las
mutaciones F86W, N113S e I132V, en las que se observa un aumento de
la estabilidad con respecto al dominio cSrc-SH3 y las mutaciones F86L,
L100V y L108V donde se aprecia una disminución en la estabilidad
respecto al dominio cSrc-SH3. Uno de los mutantes que fueron
seleccionados y que no aparecen en los resultados experimentales es el
mutante E106F de cSrc-SH3 que no pudo ser expresado, lo cual confirma
la importancia estructural de este residuo previamente descrita (Larson
and Davidson 2000).
A pesar de estas diferencias, todos los mutantes se encuentran
correctamente plegados en las condiciones en las que se lleva a cabo el
experimento. Además a 25ºC, temperatura a la cual se van a llevar a cabo
los estudios de unión, la población del estado nativo es del 100%.
119
3.2.2.3. Influencia de la unión del ligando en la energética de unión
Una vez confirmado que los distintos mutantes del dominio cSrcSH3 se encuentran correctamente plegados, hemos procedido a evaluar el
efecto de las diferentes mutaciones sobre la energética de unión al ligando
RLP2. En primer lugar, y con el fin de obtener una estimación inicial de
las constantes de disociación, hemos realizado el análisis de la interacción
de los mutantes con dicho ligando mediante espectroscopía de
fluorescencia (Figura 3.6). Estos experimentos se han llevado a cabo en
las condiciones estándar de fosfato sódico 20 mM, pH 7.0 y 25ºC.
Figura 3.6. Paneles superiores: espectros de fluorescencia tomados tras al inyección del
ligando RLP2 sobre a) el dominio cSrc-SH3 y b) sobre el mutante L100V, una vez
normalizados con la concentración de proteína, realizados en fosfato sódico 20 mM pH 7.0
a 25ºC. Paneles inferiores: valores del centro de masas (círculos cerrados). La línea
continua corresponde al mejor ajuste para el modelo de unión de un ligando a una proteína
seguido mediante fluorescencia (Ecuación 2.3.3).
Para los mutantes en los que no se produce un cambio
significativo con respecto a la constante de disociación medida para el
dominio silvestre cSrc-SH3 con el mismo ligando, se han llevado a cabo
los experimentos de ITC utilizando las mismas concentraciones de
proteína y de ligando, así como los mismos parámetros instrumentales
120
Capítulo 3
(número de inyecciones, etc.) que en el caso del dominio silvestre. Sin
embargo, para aquellos en los que se ha observado una variación de la
constante de disociación respecto al dominio silvestre, se han optimizado
las concentraciones de proteína y ligando mediante simulaciones de las
correspondientes curvas de titulación (Sección 2.5.2).
Si se representa la entalpía aparente obtenida para el tampón
fosfato frente a la entalpía de ionización a distintas temperaturas y se
analizan los datos mediante regresión lineal, se obtiene directamente de la
ordenada en el origen la entalpía intrínseca de unión. El bajo calor de
ionización del tampón fosfato sódico hace que la entalpía intrínseca de
unión sea muy cercana a la aparente. De este modo, en las condiciones en
las que se han llevado a cabo los experimentos de ITC la entalpía de
unión aparente medida experimentalmente puede ser considerada, dentro
del error, como el valor de entalpía intrínseca de la interacción (MartinGarcia 2009).
En la Figura 3.7 se muestran, a modo de ejemplo, los
experimentos de titulación de algunos de los mutantes con el ligando
RLP2. Los valores de los parámetros termodinámicos obtenidos del
análisis para un sitio de unión de los distintos mutantes se recogen en la
Tabla 3.2, junto con los datos obtenidos para el dominio cSrc-SH3. Como
se puede observar, en todos los casos el proceso de unión está
caracterizado por un patrón termodinámico similar al observado para el
dominio cSrc-SH3, de modo que la interacción está gobernada por una
entalpía de unión favorable a la que se opone parcialmente una
contribución entrópica desfavorable.
121
Figura 3.7. Experimentos de titulación mediante ITC del ligando RLP2 con el dominio
cSrc-SH3 y los mutantes F102L, I132V y W119L, en fosfato sódico 20 mM, pH 7.0 y
25ºC. a) Termograma de titulación formado por los calores por unidad de tiempo liberados
tras la inyección del ligando RLP2 sobre los distintos mutantes. b) Isoterma de unión
correspondiente al experimento a, obtenida después de normalizar los calores de titulación y
corregir los calores por dilución. Los datos experimentales se representan como círculos
cerrados mientras que la línea continua corresponde al mejor ajuste para el modelo de un
sitio de unión (Ecuación 2.5.11).
122
Capítulo 3
Tabla 3.2. Parámetros termodinámicos obtenidos a partir de los experimentos de ITC para
la unión del ligando RLP2 al dominio cSrc-SH3 y sus mutantes, realizados en fosfato
sódico 20 mM pH 7.0 a 25 oC.
Proteína
Kd
(µM)
∆Gap
(kJ/mol)
∆∆G
(kJ/mol)
∆Hap
(kJ/mol)
∆∆H
(kJ/mol)
-T∆Sap
(kJ/mol)
cSrc-SH3
wt
13.8
-27.6±0.13
0.0
-59.4±0.8
0
31.8
cSrc-SH3
F86L
13.5
-27.8±0.04
-0.2±0.3
-60.6±0.4
-1.2±1.2
32.8
cSrc-SH3
F86W
20.2
-26.8±0.04
0.8±0.3
-54.3±0.3
5.1±1.1
27.5
cSrc-SH3
S94A
18.8
-27.0±0.21
0.6±0.4
-57.9±2.1
1.5±2.9
30.9
cSrc-SH3
L100V*
269.3
-20.4±23.01
7.2±46.4
-
-
-
cSrc-SH3
F102I
52.6
-24.5±0.04
3.1±0.8
-56.9±1.1
2.5±1.9
32.4
cSrc-SH3
L108I
20.6
-26.8±0.08
0.8±0.4
-57.8±1.3
1.6±2.1
31
cSrc-SH3
L108V
20.5
-26.8±0.08
0.8±0.4
-61.9±0.6
-2.5±1.5
35.1
cSrc-SH3
N113S
19.0
-27.0±0.08
0.6±0.4
-58.8±0.8
0.6±1.7
31.8
cSrc-SH3
W119L
72.5
-23.7±0.04
3.9±0.3
-49.3±0.4
10.1±1.3
25.6
cSrc-SH3
H122R
11.0
-28.3±0.04
-0.7±0.3
-60.0±0.8
-0.6±1.7
31.7
cSrc-SH3
R128E
9.3
-28.8±0.13
-1.2±0.5
-59.7±0.8
-0.3±1.7
30.9
cSrc-SH3
R128K
11.3
-28.3±0.08
-0.7±0.4
-58.1±0.3
1.3±1.1
29.8
cSrc-SH3
R128Q
11.4
-28.2±0.08
-0.6±0.4
-61.3±0.4
-1.9±1.3
33.1
cSrcSH3
15.5
-26.5±0.04
1.1±0.3
-57.4±0.4
2.0±1.3
30.9
I132V
*
Resultado obtenido por espectroscopía de fluorescencia
Los errores en los parámetros termodinámicos se han calculado según el modelo que aparece
en el Apéndice I.
123
Como se observa en la Figura 3.8, parte de los residuos mutados
tienen un impacto significativo en la energética de unión, sobre todo
teniendo en cuenta que se trata de restos distantes del sitio de unión. Este
es el caso de los residuos L100, F102 y W119, que experimentan una
reducción de la afinidad de unión cercana a los 5 kJ·mol-1. El resultado
para los mutantes L100V y W119L se encuentra respaldado por un
análisis previo del dominio Fyn-SH3 usando la titulación por
fluorescencia (Di Nardo et al. 2003), donde se describen efectos
significativos en la afinidad de unión del péptido VSLARRPLPPLP, con
una longitud de 3 residuos más que nuestro péptido, asociado a esas
mutaciones.
Figura 3.8. Representación en forma de barras de las diferencias de la energía libre de
Gibbs de la unión de los diferentes mutantes respecto al dominio silvestre SH3 de cSrc.
La mutación en el residuo F102I muestra un efecto similar al
mutante W119L en la energética de unión. En otros casos, como ocurre
con la mutación en la posición H122, no se observan efectos importantes
en la energética de unión, aunque se hayan realizado otros experimentos
de ITC con el mutante H122R y el péptido de mayor longitud VSL12, que
han revelado que esta mutación afecta a la entalpía de unión de un modo
significativo, subrayando la importancia de la cadena lateral de la
histidina cercana al lazo distal. Igual sucede con el residuo R128 que
induce una reorganización de los enlaces de hidrógeno y que es la
responsable de las diferencias en la energética de unión entre los
124
Capítulo 3
complejos del dominio SH3 de cSrc, Fyn y cYes y el ligando VSL12 y que
tampoco aparece dentro del grupo informativo (Martin-Garcia 2009). La
ausencia de efectos en la energética de unión para el mutante H122R en
combinación con el péptido corto no está todavía aclarada y requiere un
análisis en mayor profundidad. De todos modos, los datos estructurales de
RMN para los dominios SH3 de cSrc parecen contener la información
necesaria par implicar a este residuo en el grupo informativo.
Todos estos resultados indican que sólo un subconjunto del grupo
informativo juega un papel funcional: los 5 residuos del sitio de unión
(incluyendo el residuo D117); L100, F102 y W119 en el subgrupo de
primer nivel; y el residuo H122 en el subgrupo de segundo nivel (Figura
3.9). Los residuos N113 e I132 en el primer nivel parecen ser una
excepción puesto que, aunque los mutantes N113S e I132V estabilizan
fuertemente el dominio, estos no tienen ningún efecto en la energética de
unión, lo cual está de acuerdo con los resultados observados para el
dominio Fyn-SH3 (Di Nardo et al. 2003). Sin embargo, sería necesario un
muestreo más exhaustivo de mutantes, que podría dar lugar a efectos en la
unión para esta posición.
Figura 3.9. Efecto de la energía de Gibbs en el plegamiento y la unión de los mutantes de
cSrc-SH3. Mientras que la mayoría de los mutantes afecta a la estabilidad, sólo unos pocos
afectan a la unión, como los mutantes F102I, W119L, y L100V.
125
3.2.3. Impacto de las mutaciones sobre los niveles de fosforilación de
Src
Para comprender la importancia biológica de los mutantes L100V,
F102I y W119L que afectan a la afinidad de unión a través de
interacciones cooperativas, se ha estudiado en el laboratorio del Dr.
Lenaerts su influencia en la fosforilación de la quinasa Src. Como se ha
visto en el Capítulo 1, en ausencia de estímulos, Src adopta una
conformación
autoinhibida,
estabilizada
por
interacciones
intramoleculares de los dominios SH2 y SH3 que mantienen el dominio
quinasa en una conformación cerrada (Arold et al. 2001; Boggon and Eck
2004). La activación de la quinasa de Src puede seguirse a través de la
fosforilación de la tirosina 416, ya que este residuo se encuentra accesible
sólo cuando la proteína está en su conformación abierta. Se ha descrito
que mutaciones en el sitio de unión del dominio SH3 (D99N) muestran
un efecto limitado sobre la regulación de la actividad de Src (Cary et al.
2002). Sin embargo, la mutación en la posición D99 del dominio SH3 de
cSrc provoca un aumento en la fosforilación de Y416, aunque no de
forma tan pronunciada como ocurre con el mutante Y527F ya que la
desfosforilación de esta tirosina impide las interacciones intramoleculares
entre los dominios SH2 y SH3, conduciendo a una conformación abierta
que permite la fosforilación de Y416, dando lugar a la activación de la
quinasa de Src.
Al introducir las tres mutaciones en la quinasa de Src (L100V,
F102I y W119L) en células SYF se observa cómo cambian los niveles de
fosforilación respecto a la especie silvestre (Figura 3.10). Los mutantes
W119L y F102I reducen ligeramente la fosforilación de la quinasa de Src
mientras que el efecto del mutante L100V, alejado del sitio de unión, es
equivalente al cambio que produce la mutación D99 que se encuentra en
el sitio de unión. Considerando que los cambios en la fosforilación de
Y416 surge de la ruptura de las interacciones intra e inter-moleculares,
estos resultados indican que estos residuos tienen un modesto papel en el
comportamiento de Src en su contexto celular.
126
Capítulo 3
Figura 3.10. Efecto de los mutantes W119L, F102I, y L100V en los niveles de fosforilación
de Src Y416. Las barras indican la relación entre la proteína fosforilada y la cantidad total
de proteína. L100V muestra un efecto similar a la mutación en el residuo D99 del sitio de
unión. F102A y W119L reduce el nivel de fosforilación ligeramente.
3.2.4. Robustez de la red alostérica
Considerando que el dominio SH3 de cSrc comparte un alto grado
de homología (70%) con el dominio SH3 de Fyn, es de esperar que las
redes alostéricas de ambos dominios presenten una elevada equivalencia.
De hecho, experimentos anteriores con construcciones quiméricas de la
quinasa Src en las cuales el dominio SH3 fue reemplazado por el de Fyn,
demostraron que la regulación de la proteína a través del extremo Cterminal se mantenía en las quimeras (Erpel et al. 1995), indicando efectos
alostéricos similares en ambos dominios. Para comprobar la similitud de
las redes alostéricas de los dominios SH3 de cSrc y Fyn, el Dr. Lenaerts
ha aplicado su método llevando a cabo un análisis del dominio SH3 de
Fyn similar al del dominio SH3 de cSrc, formando un complejo con otro
péptido sintético de tipo I que corresponde a los residuos 91-104 de la
subunidad p85 de la quinasa PI3 (PPRPLPVAPGSSLT). En la Figura
3.11 se puede observar dónde se encuentran los residuos implicados en la
red alostérica del dominio Fyn-SH3, muy similares al grupo informativo
de Src (Figura 3.2).
127
Figura 3.11. Conjunto de residuos del dominio SH3 de Fyn más afectados por la unión
del ligando. Las líneas representan el contacto entre las cadenas laterales en, al menos, la
mitad del conjunto de estructuras analizadas. El color de las líneas indica si hay un cambio
positivo (rojo) o negativo (azul) en la información común durante el proceso de unión y su
grosor representa la magnitud de este cambio. Los círculos en color verde claro corresponden
a los residuos del sitio de unión y los verde oscuro los que no pertenecen a éste, mientras que
los aminoácidos del ligando se representan en naranja.
Ni el residuo H122 ni el N113, encontrados para cSrc, se detectan
en Fyn-SH3, mientras que los residuos T97 y P134, que no participan en
el grupo informativo de cSrc, ahora sí que se incluyen para Fyn. El papel
del residuo N113 en Src es sustituido por una serina en la posición 114.
La cadena lateral más corta para el residuo S114 hace que esté menos
afectada por las limitaciones conformacionales de los residuos vecinos y
que, por tanto, la transmisión de interacciones cooperativas a través del
dominio sea menos efectiva. Como consecuencia, el efecto alostérico
causado por el residuo W119 en Src sobre el residuo N113 no se observa
en Fyn. Por otro lado, el residuo H122 en Src es reemplazado en Fyn por
una arginina (R123), la cual, cuando se reduce el umbral también se une
al grupo informativo, algo que no ocurre en el caso del residuo S114.
Como se ha mencionado anteriormente, el análisis del dominio Fyn-SH3
identifica también los residuos P134 y T97 como parte de este grupo. La
adición de P134 al conjunto de residuos del bolsillo de unión puede
deberse a las diferencias entre los péptidos (Feng et al. 1994; Morton et al.
128
Capítulo 3
1996). Lo mismo sucede para el residuo T97, puesto que en unas pocas
estructuras (menos del 50%), este residuo interacciona con la prolina que
hay después de la arginina en el ligando de tipo I.
Al igual que con cSrc-SH3, hemos validado experimentalmente
estas predicciones para los mutantes W120L y F103I de Fyn-SH3 ya que
en el domino SH3 de cSrc (mutantes W119L y F102I) presentaban una
gran influencia sobre la energética de unión.
De nuevo evaluamos el impacto de las mutaciones sobre la
estabilidad estructural y las propiedades conformacionales del dominio
SH3 de Fyn mediante DSC. Los experimentos de desnaturalización
térmica se han llevado a cabo en las mismas condiciones que para el
dominio SH3 de cSrc y sus mutantes (tampón fosfato sódico 50 mM, pH
7.0 y con una concentración de proteína de 0.5 mg·mL-1). En estas
condiciones el desplegamiento térmico del dominio Fyn-SH3 y de sus
mutantes presenta un alto grado de reversibilidad. En la Figura 3.12 se
representan los termogramas obtenidos para el dominio SH3 de Fyn y sus
mutantes junto a su mejor ajuste según el modelo de equilibrio de dos
estados (Sección 2.4.4). Como se puede observar, ambos mutantes
presentan algún efecto sobre la estabilidad del dominio Fyn-SH3, siendo
destacable el efecto desestabilizante del mutante W120L. A pesar de este
resultado, ambos mutantes se encuentran correctamente plegados en las
condiciones en las cuales se van a llevar a cabo los estudios de unión,
donde población del estado nativo es del 100%.
129
Figura 3.12. Dependencia de la capacidad calorífica molar parcial con la temperatura para
los mutantes F103I y W120L comparados con el domino SH3 de Fyn, obtenidas a partir
de los experimentos en fosfato sódico 50 mM, pH 7.0. Los círculos abiertos representan los
datos experimentales, mientras que las líneas continuas corresponden al mejor ajuste al
modelo de equilibrio de desplegamiento de dos estados (Sección 2.4.4).
Una vez que hemos comprobado que ambos mutantes se
encuentran correctamente plegados, hemos evaluado su efecto sobre la
energética de unión al ligando RLP2. Igual que con los mutantes del
dominio SH3 de cSrc, hemos realizado el análisis de la interacción de los
mutantes con el ligando RLP2 mediante espectroscopía de fluorescencia
(datos no mostrados), para obtener así una estimación inicial de las
constantes de disociación. Estos experimentos se han llevado a cabo en
condiciones estándar de tampón fosfato 20 mM, pH 7.0 a 25ºC.
En la Figura 3.13 se muestran los experimentos de titulación de
los dos mutantes con el ligando RLP2. Los valores de los parámetros
termodinámicos obtenidos del análisis para los distintos mutantes
aparecen en la Tabla 3.3, junto con los datos obtenidos para el dominio
SH3 de Fyn. Como en el caso del dominio cSc-SH3, el proceso está
caracterizado por una interacción gobernada por una entropía favorable a
la que se opone parcialmente una contribución entrópica desfavorable.
130
Capítulo 3
Figura 3.13. Experimentos de titulación mediante ITC del ligando RLP2 con el dominio
Fyn-SH3 y los mutantes F103I y W120L, en fosfato sódico 20 mM, pH 7.0 y 25ºC. a)
Termograma de titulación formado por los calores por unidad de tiempo liberados tras la
inyección del ligando RLP2 sobre los distintos mutantes. b) Isoterma de unión
correspondiente al experimento A, obtenida después de normalizar los calores de titulación y
corregir los calores por dilución. Los datos experimentales se representan como círculos
cerrados, mientras que la línea continua corresponde al mejor ajuste para el modelo de un
sitio de unión (Ecuación 2.5.11).
Del análisis termodinámico tanto de la estabilidad como de la
energética de unión, en este caso de los mutantes F103I y W120L,
podemos suponer que como en el caso del dominio SH3 de cSrc, algunos
residuos tienen influencia sobre la estabilidad mientras que otros afectan a
su funcionalidad o afinidad de unión. Por lo tanto, el algoritmo usado
puede ser capaz de identificar los residuos más relevantes para el grupo
informativo tanto de Src como de Fyn. Por ejemplo, aunque la interacción
entre los residuos F103 y E107 en Fyn no ocurra con la misma frecuencia
que en Src (en este caso entre los residuos F102 y L108), muestreando el
conjunto de estructuras, estos residuos están incluidos en el grupo
informativo de ambos.
131
Tabla 3.3. Parámetros termodinámicos obtenidos a partir de los experimentos de ITC para
la unión del ligando RLP2 al dominio Fyn-SH3 y sus mutantes, realizados en fosfato
sódico 20 mM pH 7.0 a 25 oC.
Proteína
Fyn-SH3
wt
Fyn-SH3
F103I
Kd#
(µM)
∆Gap
(kJ/mol)
∆∆G
(kJ/mol)
∆Hap#
(kJ/mol)
∆∆H
(kJ/mol)
-T∆Sap
(kJ/mol)
9.0
-28.8
0
-60.2
0
31.4
30.7
-25.8
3.0
-53.2
7.0
27.4
Fyn-SH3
9.5
-28.7
0.1
-62.0
-1.8
33.3
W120L
#
Los errores en los parámetros termodinámicos se estiman en torno al 5% para la entalpía
de unión y al 10% para la constante de disociación
En resumen, el análisis teórico y experimental desarrollado en este
capítulo ha permitido identificar que, además de los residuos del sitio de
unión del dominio SH3 en contacto directo con el ligando, existe un
conjunto de 9 residuos del núcleo y fuera de éste (F86, L100, F102, E106,
L108, D117, W119, H122 e I132, de acuerdo con la secuencia de Src y la
numeración) que parecen jugar un papel importante en el alosterismo de
ambos dominios. El Dr. Lenaerts ha analizado con este método diferentes
dominios SH3 que poseen distintos niveles de similitud y distinta
distancia evolutiva. El consenso en las predicciones confirma la robustez
del método, el cual es capaz de identificar patrones específicos incluso
usando distintos péptidos y distintas estructuras de RMN obtenidas en
distintos laboratorios y en diferentes condiciones. También cabe destacar
que las predicciones consensuadas basadas en los dominios SH3 reflejan
los sectores evolutivos identificados en (Halabi et al. 2009) a través de un
análisis de acoplamiento estadístico en las secuencias de los dominios
SH3 de diferentes familias, esto puede ser considerado como una
confirmación más de la robustez de estas predicciones. De este modo, el
método descrito permitiría conocer los aminoácidos implicados en la red
de transmisión de información en una proteína pudiendo conocer la
especificidad del alosterismo en un dominio o en una familia de proteínas
y los papeles funcionales de cada patrón.
Como se verá en el Capítulo 4 de esta Memoria, en el contexto de
las quinasas de tirosina existe una elevada cooperatividad, ya no solo
intradominio, sino también interdominio, necesaria para el correcto
funcionamiento de la proteína (Pellicena and Miller 2001; Yadav and
132
Capítulo 3
Miller 2007). En relación con lo estudiado en este capítulo sería razonable
pensar que los procesos de reconocimiento de sustrato por parte de los
dominios modulares, fundamentales para los mecanismos de activación
de las quinasas, no están regulados solamente por los residuos presentes
en la superficie de interacción, sino que la perturbación provocada por la
unión del sustrato se propagará de forma cooperativa desde el sitio de
unión hacia zonas alejadas de éste. A través de este método se conseguiría
conocer un patrón de alosterismo el cual permitiría diseñar ligandos con
una alta afinidad y especificidad que abran las puertas al desarrollo de
fármacos efectivos para el tratamiento de las patologías en las que estos
dominios están implicados (Hassan et al. 2010).
3.3. Conclusiones
Del análisis computacional y termodinámico llevado a cabo en
este Capítulo se extraen las siguientes conclusiones:
1. Hemos identificado un conjunto de residuos implicados en la
transmisión de información desde el sitio de unión hasta otras
regiones del dominio.
2. El análisis mutacional nos ha permitido validar experimentalmente las
predicciones teóricas, identificando el papel de los residuos predichos.
3. Los experimentos in vivo confirman que los residuos L100, F102 y
W119 provocan un cambio funcional moderado pero significativo en
los niveles de fosforilación de Src, validando la metodología empleada
y poniendo de relevancia la importancia de estos efectos cooperativos
intra-dominio para la regulación de las quinasas.
4. La red alostérica predicha por el análisis computacional para el
dominio SH3 de cSrc puede ser consistente con estructuras homólogas
como se ha demostrado con el dominio Fyn-SH3.
133
Capítulo 4
Estudio de la distribución
conformacional de cAbl y su
modulación por interacciones
intramoleculares
Capítulo 4
CAPÍTULO 4.- Estudio de la distribución conformacional de
cAbl y su modulación por interacciones intramoleculares
4.1. Introducción
En la última década nuestro grupo de investigación ha llevado a
cabo una caracterización exhaustiva, tanto termodinámica como
estructural del dominio SH3 de diferentes familias de dominios modulares
como cSrc, cYes, Fyn o cAbl. Estos estudios han confirmado la
importancia de las moléculas de disolvente en la interacción de dominios
SH3 con ligandos ricos en prolina y han proporcionado una nueva visión
de lo que hasta ahora se había considerado una interacción típicamente
hidrofóbica. De hecho, existen determinadas posiciones ocupadas por
moléculas de agua, que aparecen en el contexto de la quinasa completa de
cAbl, cSrc y Hck (Nagar et al. 2003; Burchat et al. 2006; Cowan-Jacob
2006), lo que podría ser determinante para la funcionalidad de estos
dominios in vivo. Además, como hemos descrito en el capítulo anterior,
hemos puesto de manifiesto la existencia de redes intramoleculares de
interacciones cooperativas que se expanden desde el sitio de unión hasta
posiciones alejadas de éste, subrayando la relevancia de la complejidad de
las interacciones y el papel que el equilibrio conformacional del propio
dominio juega en la determinación del patrón termodinámico de unión.
Actualmente, existen en el mercado unos 60 medicamentos
basados en el desarrollo de péptidos como moléculas terapéuticas
(Kardinal et al. 2000; Lee et al. 2002; Vlieghe et al. 2010). En algunos
casos estudiar los dominios de forma aislada es una aproximación
demasiado simplista a la hora de desarrollar fármacos, ya que se pierde
información tanto de la proteína completa como de la multitud de
interacciones que se establecen en el entorno celular, de ahí la importancia
de estudiar los posibles efectos contextuales. Por esto motivo, tras haber
realizado una caracterización completa del dominio SH3, en nuestro
grupo de investigación hemos abordado el estudio de la influencia tanto
en el equilibrio conformacional como en la energética de unión de los
elementos que componen las quinasas de tirosina de cAbl y cSrc.
Como se ha visto detalladamente en la Introducción, a pesar de la
abundante información que existe sobre cAbl, su regulación sigue siendo
un complicado rompecabezas en el que aún existen muchos interrogantes
sin respuesta. Sabemos que cAbl requiere de un estímulo para llevar a
cabo su actividad enzimática, que dicha activación conlleva un cambio
137
conformacional y que existen, además de los dominios modulares,
numerosos elementos implicados en la regulación de su actividad, lo que
nos permite afirmar que se trata de una estructura altamente cooperativa.
Sin embargo, aún existen muchos aspectos del mecanismo de su
regulación que son desconocidos.
En la base de datos PDB (Protein Data Bank) existen dos
estructuras cristalográficas resueltas de cAbl que corresponden a los
códigos 2ABL y 2FO0. La primera de ellas corresponde a la construcción
en tándem de los dos dominios modulares SH2 y SH3, y la segunda,
resuelta cinco años después, al tándem SH3SH2 acompañado de otras
regiones de cAbl como el dominio catalítico y la región NCap (Nagar et
al. 2006). Si se superponen las dos estructuras del tándem SH3SH2,
usando el dominio SH2 como referencia, se observa cómo el dominio
SH3 se encuentra desplazado en una estructura respecto a la otra (Figura
4.1). Esta diferencia está relacionada con un ligero cambio
conformacional en la secuencia de conexión entre los dominios SH3 y
SH2 (C3-2), que provoca un cambio en su orientación relativa.
Figura 4.1.-Superposición del tándem de los dominios SH3 y SH2 de la estructura
cristalográfica con código 2ABL (rojo) y de la estructura 2FO0 (azul). En ambos
paneles el tándem ha sido superpuesto usando como referencia el dominio SH2. En el panel
de la izquierda se resalta en amarillo la región del conector de ambos dominios que presenta
un cambio conformacional. En el panel de la derecha se ha representado la superficie de la
interfaz de unión del dominio SH3 en ambas estructuras. La superficie ha sido coloreada en
relación con las propiedades de los residuos que la componen: verde para los residuos
polares, azul para los básicos, blanco para los apolares y rojo para los ácidos.
138
Capítulo 4
Una hipótesis que planteamos en éste trabajo fue la posibilidad de
que el cambio conformacional pudiera deberse a la ausencia de
interacciones con elementos reguladores como NCap o la secuencia
conectora entre el dominio SH2 y el dominio quinasa (C2Q), desplazando
el equilibrio conformacional del tándem hacia una conformación que
correspondería a la que adopta cAbl cuando se encuentra en su forma
activa. Para confirmar esta hipótesis, hemos llevado a cabo un estudio del
equilibrio conformacional y la dinámica del tándem SH3SH2 de cAbl
aislado y en el contexto de distintas construcciones que incluyen
elementos adicionales de la quinasa, con el fin de evaluar cómo la
presencia de estos influye en las propiedades conformacionales del
tándem.
Como se ha comentado en Capítulo de Introducción, a pesar de la
elevada homología existente entre la estructura autoinhibida de cAbl y los
miembros de la familia de quinasas de tirosina cSrc, existen pequeñas
pero importantes diferencias en su mecanismo de regulación. Por ejemplo,
en las quinasa de tirosina de cSrc, el dominio SH2 tienen un papel muy
importante en la regulación debido a que en su extremo C-terminal
contiene un residuo tirosina, cuya fosforilación permite que ésta sea
reconocida por el propio dominio SH2, de tal forma que el extremo Cterminal se repliega sobre la estructura estabilizando la conformación
autoinhibida. Sin embargo, en cAbl la ausencia de esta interacción del
extremo C-terminal con el dominio SH2 podría estar compensada por un
aumento en la afinidad de la secuencia C2Q por el dominio SH3, tal
como proponen Enge y colaboradores a partir de los resultados obtenidos
en unos experimentos de intercambio hidrógeno/deuterio y de
espectrometría de masas con diferentes construcciones de la quinasa cAbl
(Chen and Matesic 2007). Con el fin de evaluar si estas diferencias se
reflejan en las preferencias conformacionales del tándem SH3SH2 de Src
y Abl, hemos abordado un estudio paralelo de las correspondientes
construcciones de Src.
4.2. Resultados y discusión
4.2.1. Construcciones de la quinasa de cAbl y cSrc
Para estudiar el papel de los distintos elementos reguladores que
componen la quinasa de tirosina de cAbl, hemos clonado (Capítulo 2)
distintas construcciones tanto de cAbl como de cSrc que se esquematizan
139
en la Figura 4.2. Para cAbl hemos clonado las construcciones:
cAblSH3SH2, cAblSH3SH2-C2Q, cAbl-NCapSH3SH2 (Isoformas 1a y
1b) y cAbl-NCapSH3SH2-C2Q (Isoformas 1a y 1b); y para cSrc:
cSrcSH3SH2 y cSrcSH3SH2-C2Q.
cAblSH3SH2
SENDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSN
YITPVNSLEKHSWYGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESSPGQRSISLRYEGRVYHYRI
NTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLITTLHYPAP
cAblSH3SH2 –C2Q
SENDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSN
YITPVNSLEKHSWYGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESSPGQRSISLRYEGRVYHYRI
NTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDK
W
cAbl-NCapSH3SH2 (1a)
MLEICLKLVGCKSKKGLSSSSSCYLEEALQRPVASDFEPQGLSEAARWNSKENLLAGPS
ENDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSNY
ITPVNSLEKHSWYGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESSPGQRSISLRYEGRVYHYRIN
TASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLITTLHYPAP
cAbl-NCapSH3SH2 (1b)
MGQQPGKVLGDQRRPSLPALHFIKGAGKKESSRHGGPHCNVFVEHEALQRPVASDFE
PQGLSEAARWNSKENLLAGPSENDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNH
NGEWCEAQTKNGQGWVPSNYITPVNSLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVR
ESESSPGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLITT
LHYPAP
cAbl-NCapSH3SH2-C2Q (1a)
MLEICLKLVGCKSKKGLSSSSSCYLEEALQRPVASDFEPQGLSEAARWNSKENLLAGPS
ENDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSNY
ITPVNSLEKHSWYGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESSPGQRSISLRYEGRVYHYRIN
TASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKW
cAbl-NCapSH3SH2-C2Q (1b)
MGQQPGKVLGDQRRPSLPALHFIKGAGKKESSRHGGPHCNVFVEHEALQRPVASDFE
PQGLSEAARWNSKENLLAGPSENDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNH
NGEWCEAQTKNGQGWVPSNYITPVNSLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVR
ESESSPGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLITT
LHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKW
cSrcSH3SH2
TFVALYDYESRTETDLSFKKGERLQIVNNTEGDWWLAHSLTTGQTGYIPSNYVAPSDS
IQAEEWYFGKITRRESERLLLNPENPRGTFLVRESETTKGAYCLSVSDFDNAKGLNVK
HYKIRKLDSGGFYITSRTQFSSLQQLVAYYSKHADGLCHRLTNVCPTS
cSrcSH3SH2-C2Q
TFVALYDYESRTETDLSFKKGERLQIVNNTEGDWWLAHSLTTGQTGYIPSNYVAPSDS
IQAEEWYFGKITRRESERLLLNPENPRGTFLVRESETTKGAYCLSVSDFDNAKGLNVK
HYKIRKLDSGGFYITSRTQFSSLQQLVAYYSKHADGLCHRLTNVCPTSKPQTQGLAKD
AW
Figura 4.2. Secuencias de las construcciones cAbl y cSrc .La región NCap se representa
en rosa fucsia, el dominio SH3 en azul, el dominio SH2 en verde y el conector C2Q en
naranja. El conector entre los dominios SH3 y SH2 se representa en negro.
De todas las construcciones clonadas, se pudieron expresar
cAblSH3SH2, cAblSH3SH2-C2Q, cSrcSH3SH2 y cSrcSH3SH2-C2Q.
Desafortunadamente, para los tándem cAbl-NCapSH3SH2 (Isoformas 1a
y 1b) y cAbl-NCapSH3SH2-C2Q (Isoformas 1a y 1b), los niveles de
expresión fueron muy bajos lo que unido a la irreversibilidad en el
140
Capítulo 4
plegamiento que presentaban las construcciones cAblSH3SH2 y
cAblSH3SH2-C2Q, hizo que se descartara su estudio. Las construcciones
cAblSH3SH2, cAblSH3SH2-C2Q, cSrcSH3SH2 y cSrcSH3SH2-C2Q se
pudieron expresar y purificar en cantidades y pureza suficientes para
abordar su estudio biofísico.
4.2.2. Equilibrio conformacional del tándem SH3SH2 de Abl y Src
Como se puede observar en la Figura 4.1, la conformación que
adopta el tándem SH3SH2 en la estructura cristalográfica 2ABL deja los
sitios de reconocimiento del dominio SH3 en una orientación relativa
totalmente diferente a la observada para la estructura 2FO0. Para que el
tándem pueda adquirir esta conformación en el contexto de la quinasa
completa, es necesario que el dominio SH3 se desplace, dejando de
interaccionar con la secuencia C2Q, como se aprecia en la Figura 4.3,
donde, de nuevo hemos superpuesto ambas estructuras usando como
referencia el dominio SH2. Esta conformación dejaría el sitio de
reconocimiento del dominio SH3 libre para reconocer ligandos externos,
reforzando la idea de que la conformación en la que se encuentra el
tándem SH3SH2 en la estructura cristalográfica 2ABL correspondería a la
que éste adopta cuando la quinasa completa se encuentra activa o, en una
de sus posibles conformaciones activas. De este modo, clasificaremos la
estructura 2ABL como conformación abierta y la estructura de 2FO0
como conformación cerrada.
Estudios computacionales y experimentales del tándem SH3SH2
de proteínas pertenecientes a la subfamilia de la quinasa de tirosina cSrc,
como son Fyn o Hck, han llegado a la conclusión de que esta
construcción puede mantenerse en la conformación observada en su
estado inactivo y puede unirse además a enzimas, incluso en ausencia de
otros elementos de la quinasa (Fushman et al. 1999; Arold et al. 2001;
Ulmer et al. 2002).
141
Figura 4.3. Superposición de la estructura cristalográfica del tándem SH3SH2 aislado
(Rojo) con la estructura del tándem SH3SH2 en el contexto de cAbl autoinhibida
(Azul). Para el tándem aislado se ha utilizado la estructura cristalográfica con código
2ABL. Para la estructura autoinhibida de cAbl se ha usado la estructura con código 2FO0.
La superficie de las interfases de unión de ambos dominios modulares ha sido resaltada en
color cian para el dominio SH3 y en verde para el dominio SH2. El dominio catalítico se
ha representado en naranja.
Para comprobar si cAbl tiene un comportamiento similar a éste,
hemos llevado a cabo un estudio termodinámico del equilibrio
conformacional de la construcción en tándem SH3SH2 de ambas
quinasas. La Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) nos va a
proporcionar información sobre la energética del equilibrio de
desplegamiento, incluyendo además, la información que aporta la forma
de la traza calorimétrica sobre el grado de interacción y cooperatividad
conformacional que existe entre los distintos dominios que componen una
proteína y cómo se encuentra ésta modulada por la interacción de un
ligando (Straume and Freire 1992; Luque and Freire 2002). La
caracterización se ha realizado usando distintas condiciones de pH (3; 3.5;
4; 4.5; 5; y 7) con el fin de encontrar las condiciones adecuadas en las que
la proteína fuese reversible. Desafortunadamente, no pudimos encontrar
la condición en la cual el desplegamiento térmico de ambos dominios
fuese simultáneamente reversible, lo que ha imposibilitado el análisis
cuantitativo de las trazas calorimétricas y la obtención de parámetros
termodinámicos fiables. La única condición en la que, al menos, ambos
dominios se encontraban plegados fue a pH7.0. Debido a su baja entalpía
de ionización, el fosfato sódico sería un tampón adecuado para el estudio
142
Capítulo 4
calorimétrico de las distintas construcciones tanto de cAbl como de cSrc,
sin embargo, dado que el dominio SH2 interacciona con la tirosina
fosforilada, la presencia de grupos fosfato podría introducir artefactos en
la caracterización de la estabilidad y la cooperatividad estructural. De este
modo, hemos llevado a cabo los experimentos en Pipes 50 mM, ya que no
presenta ningún fosfato en su composición y también posee una baja
entalpía de ionización. A pesar de la irreversibilidad de esta construcción,
la comparación de los termogramas nos permite inferir algunos resultados
interesantes de forma cualitativa como se describe a continuación.
En primer lugar, como referencia hemos obtenido las trazas de
DSC correspondientes a los dominios independientes SH3 y SH2 de Abl y
a continuación hemos procedido a caracterizar el desplegamiento térmico
de las distintas construcciones (Panel a, Figura 4.4). En el termograma
obtenido para el tándem de cAbl se muestra claramente la presencia de
dos picos, cada uno de los cuales correspondería al desplegamiento de
cada uno de los dominios que constituyen el tándem de forma individual.
De hecho, la traza calorimétrica del dominio SH3 aislado se corresponde
bastante bien con la transición que aparece a mayor temperatura en el
termograma del tándem. En cuanto al dominio SH2 parece ser que es más
estable cuando está aislado, ya que su Tm se desplaza a temperaturas más
altas. En cualquier caso, en el desplegamiento térmico del tándem
SH3SH2 de cAbl se distinguen claramente dos transiciones indicando
que, a pesar de que pueda existir cierta cooperatividad, los dominios en el
tándem se despliegan fundamentalmente de forma independiente.
Para cSrc la caracterización del equilibrio conformacional, tanto
de los dominios individuales SH3 y SH2 como de su construcción en
tándem, se han utilizado las mismas condiciones que para el estudio de
cAbl. Al igual que para el tándem cAblSH3SH2, el tándem cSrcSH3SH2
es irreversible a todos los pH, siendo a pH 7.0 la única condición en la que
ambos dominios se encontraban plegados. En el Panel b de la Figura 4.4
se observa un comportamiento muy distinto entre cSrc y cAbl, ya que en
el termograma de cSrcSH3SH2 tenemos un único pico muy agudo, lo que
indica que ambos dominios se despliegan de un modo cooperativo. Estos
datos podrían estar relacionados con estudios computacionales previos
que indican que esta construcción puede permanecer en su forma
autoinhibida sin necesidad de otros elementos reguladores.
143
Figura 4.4. Dependencia de la capacidad calorífica molar parcial con la temperatura para
a) cAbl y b) cSrc. En azul oscuro se representa el dominio SH2, en violeta el dominio SH3,
en fucsia el tándem SH3SH2 y en verde la suma de las capacidades caloríficas de ambos
dominios y la contribución a ésta de los aminoácidos que forman el conector C3-2. Los
datos se obtienen a partir de los experimentos en Pipes 50 mM pH 7.0. No ha sido posible
ajustar los datos a un modelo termodinámico debido a que no se han encontrado las
condiciones en las que ambos dominios sean reversibles de forma simultánea.
Como ya hemos comentado, debido a la irreversibilidad de las
transiciones no ha sido posible realizar un análisis cuantitativo detallado
de la cooperatividad en los tándems SH3SH2 de cSrc y cAbl. No obstante,
los resultados obtenidos son muy llamativos en cuanto a la diferencia de
comportamiento de cada una de las quinasas, lo que podría tener
implicaciones importantes en cuanto a sus correspondientes mecanismos
de regulación. En el año 2007, Faraldo y Roux publicaron un estudio
computacional detallado mediante dinámica molecular de las preferencias
conformacionales del tándem SH3SH2 de la quinasa de la familia Src
Hck, en el que analizaron distintas construcciones introduciendo
dominios adicionales y mutaciones en la secuencia de conexión entre los
dominios SH3 y SH2 (Faraldo-Gomez and Roux 2007). Estos autores
llegaron a dos conclusiones importantes en su estudio: por un lado que el
tándem tiene una alta flexibilidad estructural de modo que una vez
disociado del dominio catalítico, puede adoptar una amplia variedad de
conformaciones en las que los dominios SH3 y SH2 se encuentran en
distintas orientaciones y a distintas distancias. Por otro lado, a pesar de la
ausencia de interacciones con el dominio catalítico, la superficie de
energía libre obtenida indica claramente que la distribución
conformacional está diseñada para inducir una clara preferencia del
tándem aislado por conformaciones compatibles con la conformación
144
Capítulo 4
cerrada en la que el dominio SH3 interacciona con la secuencia de
conexión SH2-quinasa en la conformación inactiva de la enzima. Los
autores concluyen que la secuencia de conexión entre los dominios SH3 y
SH2 juega un papel clave en la determinación de estas preferencias
conformacionales. Considerando las diferencias observadas en el
comportamiento cooperativo del tándem SH3SH2 de Abl respecto al
tándem de Src, propusimos como hipótesis de trabajo que el tándem de
Abl presenta un comportamiento diferente a las quinasas de la familia Src
que podría tener importantes implicaciones para la comprensión de su
regulación funcional. Con el propósito de investigar esta idea en detalle se
estableció una colaboración entre nuestro grupo de investigación y el Dr.
Faraldo en el Instituto Max Planck de Franckfurt, para el análisis
computacional del tándem Abl mediante técnicas de dinámica molecular.
Para ello, el Dr. Carles Corbi, miembro de nuestro grupo de
investigación, en colaboración con el Dr. Faraldo, generó una serie de
trayectorias de dinámica molecular de 500 ns donde se puede observar la
capacidad del tándem de adoptar tanto la conformación abierta (2ABL)
como la cerrada (2FO0) (Figura 4.5). Esto haría pensar que existe un
posible equilibrio conformacional entre ambas formas, apoyando así la
hipótesis de que la conformación abierta coincide con la disposición del
tándem cuando cAbl se encuentra activa o, que al menos, éstas serían las
conformaciones más probables dentro del equilibrio conformacional del
tándem en ausencia de interacciones intramoleculares con otras regiones,
como Ncap o C2Q, que podrían modular este equilibrio conformacional.
145
Figura 4.5. Dinámica conformacional del tándem aislado SH3SH2 en dos simulaciones
independientes de 500 ns tomando la conformación cerrada del tándem como punto de
partida. Como coordenadas de los descriptores para el cambio conformacional del tándem se
han domado los ángulos diedros D1 y D2. D1 está formado por el centro de masas de los
residuos P137, L141, W146 y P150, pertenecientes al conector C3-2. D2 está formado por el
centro de masas de los residuos Y134, P137, L141 y W146, también pertenecientes al
conector C3-2. La frecuencia en las que estas coordenadas son visitadas durante la
trayectoria está coloreada en azul cuando son visitadas de 1 a 10 veces, en naranja de 10 a
100 y en rojo las que son visitadas más de 100 veces. En ambas trayectorias el tándem
cambia a la conformación abierta a los 100 ns de trayectoria y después vuelve a su estado
inhibido (conformación cerrada) a los 400 ns de trayectoria.
Aunque las conformaciones observadas sean accesibles durante la
trayectoria de dinámica molecular, nada puede asegurar que sean las
conformaciones más pobladas. Para evaluar de un modo más completo
las dinámicas del tándem SH3SH2 se usó una avanzada técnica de
muestreo denominada metadinámica (Marinelli et al. 2009; Crespo et al.
2010; Biarnes et al. 2012). La metadinámica aplicada a nuestro sistema
nos permite conocer las diferencias de energía libre que existen entre las
conformaciones abierta y cerrada, así como la posible existencia de otras
conformaciones que pudieran estar pobladas. Este cálculo confirmó que
ambos confórmeros eran los dos principales mínimos de energía (Figura
4.6), siendo la conformación abierta el estado más poblado. A través de
las metadinámicas se ha comprobado también que el intercambio entre
146
Capítulo 4
ambas orientaciones está relacionado con un cambio conformacional en el
conector que une los dominios SH2 y SH3.
Figura 4.6. Proyección de la superficie de energía libre en el espacio RMSD respecto a las
configuraciones cerrada (2FO0) y abierta (2ABL). Con un cuadrado azul de 4 Å de lado, se
resaltan las regiones correspondientes a las conformaciones cristalográficas abierta y
cerrada.
La conformación abierta muestreada en las simulaciones es
consistente con las medidas realizadas por SAXS de la forma activa de
cAbl, donde las unidades reguladoras se encuentran parcialmente
desacopladas del dominio catalítico (Nagar et al. 2006).
Si comparamos las dinámicas estructurales obtenidas para el
tándem cAblSH3SH2 y el tándem cSrcSH3SH2, se encuentran entre
ambas diferencias muy significativas. Las simulaciones de energía libre
del tándem SH3SH2 para la quinasa Hck (homóloga a cSrc), identifican
un único confórmero muy cercano a la conformación cerrada (Ulmer et
al. 2002). Estudios previos de la quinasa Fyn, usando cristalografía de
Rayos X y RMN conducen a una conclusión análoga (Fushman et al.
1999; Arold et al. 2001). Por lo tanto, los resultados experimentales en los
que observamos una única transición para el tándem cSrcSH3SH2,
resaltando la elevada cooperatividad que existe entre ambos dominios,
concuerdan con los datos teóricos obtenidos donde el tándem SH3SH2 de
estas quinasas está predispuesto a adoptar conformaciones que conducen
al estado inactivo, en el cual el dominio SH3 puede unirse al conector
C2Q.
147
Para cAbl también concuerdan los datos obtenidos experimental y
computacionalmente. En este caso los dominios SH2 y SH3 se comportan
de forma individual permitiendo que el tándem adopte tanto la
conformación abierta como la cerrada. El hecho de que la regulación del
tándem de cAbl difiera de cSrc en este aspecto, sugiere que la formación
del estado autoinhibido requerirá de otros factores para su regulación.
4.2.3. Influencia del conector C2Q en el equilibrio conformacional del
tándem cAblSH3SH2
Estudios experimentales de intercambio hidrógeno/deuterio
(HDX) sobre el tándem cAblSH3SH2 han demostrado que el dominio
SH3 podría unirse al conector entre el dominio SH2 y el dominio quinasa
(C2Q), incluso en ausencia de otros elementos de la proteína (Koepf et al.
1999). Como hemos visto en el apartado anterior, el tándem aislado
alterna entre dos conformaciones posibles, la abierta o la cerrada. La
conformación cerrada sería compatible con la interacción entre el dominio
SH3 y el conector C2Q, sin embargo, no está del todo claro que esta
interacción sea compatible con la conformación abierta, la cual, es la más
probable cuando el tándem se encuentra aislado.
Para comprobar la influencia del conector C2Q sobre el equilibrio
conformacional del tándem SH3SH2, hemos realizado la caracterización
del proceso de desplegamiento de la construcción cAblSH32-C2Q
mediante DSC. Como en el caso del tándem aislado SH3SH2, se
probaron las mismas condiciones de pH y no se encontró ninguna en la
que ambos dominios fuesen reversibles de forma simultánea. Únicamente
a pH 7.0 ambos dominios se encontraban plegados a la vez. Si
comparamos ambas trazas, la del tándem SH3SH2 aislado y en presencia
del conector C2Q (Figura 4.7), podemos comprobar cómo en presencia de
C2Q, se observa un único pico muy agudo, lo que indica que la
interacción con la secuencia de conexión hace que el desplegamiento del
tándem sea altamente cooperativo.
148
Capítulo 4
Figura 4.7. Dependencia de la capacidad calorífica molar parcial con la temperatura para
el tándem cAblSH3SH2 (fucsia) y el tándem cAblSH3SH2-C2Q (azul). Los datos se
obtienen a partir de los experimentos en Pipes 50 mM y pH 7.0. No ha sido posible ajustar
los datos a un modelo termodinámico debido a que no se han encontrado las condiciones en
las que ambos dominios sean reversibles de forma simultánea.
Como hemos visto anteriormente, el comportamiento en tándem
de cAbl SH3SH2 es muy diferente al comportamiento de cSrc SH3SH2.
Mientras que en el primer caso, ambos dominios parecen desplegarse de
forma individual, en el caso del tándem de cSrc, los dominios SH3 y SH2
presentan una elevada cooperatividad conformacional. Estudios
computacionales realizados previamente (Faraldo-Gomez and Roux
2007) muestran una clara preferencia de cSrc SH3H2 por conformaciones
compatibles con la conformación cerrada, de tal modo que el dominio
SH3 pueda interaccionar con el conector C2Q en la conformación
inactiva de la quinasa. Para analizar el efecto de este conector C2Q en el
equilibrio conformacional del tándem cSrc SH3SH2 hemos llevado a cabo
la caracterización de la desnaturalización térmica de la construcción cSrc
SH3SH2-C2Q por DSC. Al igual que para el resto de construcciones en
tándem, tanto de cSrc como de cAbl, el desplegamiento de este tándem
resulta irreversible a cualquier pH, únicamente a pH 7.0 ambos dominios
se encuentran plegados a la vez. Como podemos observar en la Figura
4.8, la presencia del conector C2Q en el tándem cSrcSH3SH2 hace que la
estructura del tándem SH3SH2 siga siendo altamente cooperativa, además
149
de aumentar ligeramente la Tm de la construcción, lo que podría
relacionar la presencia de C2Q con un aumento de la estabilidad del
tándem.
Figura 4.8. Comparación de la dependencia de la capacidad calorífica molar parcial con la
temperatura para las construcciones cSrcSH3SH2-C2Q (azul) y cSrcSH3SH2 (fucsia). Los
datos se obtienen a partir de los experimentos en Pipes 50 mM y pH 7.0. No ha sido posible
ajustar los datos a un modelo termodinámico debido a que no se han encontrado las
condiciones en las que ambos dominios sean reversibles de forma simultánea.
Para evaluar el efecto de la presencia del conector C2Q en la
distribución conformacional del tándem y en el origen de la
cooperatividad observada, se realizaron simulaciones adicionales de
dinámica molecular con la construcción Abl SH3SH2-C2Q. Para ello se
calcularon dos trayectorias de dinámica molecular de 500 ns para la
construcción cAbl SH3SH2 que incluía también el conector C2Q unido al
dominio SH3 y usando la conformación cerrada como punto de partida
(Corbi-Verge 2012). En estas simulaciones se observó que durante toda la
simulación el tándem permanecía en la conformación inicial (Panel a,
Figura 4.9), en contraste con las simulaciones del tándem aislado,
sugiriendo que la interacción con C2Q no sería posible en la
conformación abierta del tándem SH3SH2. Los cálculos de superficie de
energía libre realizados a través de las metadinámicas proporcionaron
resultados similares (Panel b, Figura 4.9). En éstos se observa una única y
amplia región donde se concentran los valores mínimos de energía libre
150
Capítulo 4
que corresponde a la conformación cerrada del tándem. Estos resultados
indican claramente que la presencia del conector C2Q desplaza la
distribución conformacional del tándem hacia la forma cerrada, de tal
manera que debe ser indispensable la pérdida de interacciones entre el
dominio SH3 y el conector C2Q para el cambio de conformación y la
activación de cAbl. Esto refuerza el papel de C2Q como un elemento
imprescindible en el mecanismo de autoinhibición de cAbl, en contraste
con lo observado para Hck.
Figura 4.9. a) Dinámica conformacional de la construcción cAbl SH3SH2-C2Q en dos
simulaciones de 500 ns las cuales se inician en la conformación cerrada. Las coordenadas de
los descriptores (D1 y D2), están coloreadas según la frecuencia en las que son visitadas
durante la trayectoria. En azul se resaltan las coordenadas visitadas de 1 a 10 veces, en
naranja de 10 a 100 y en rojo las que son visitadas más de 100 veces. b) Proyección de la
superficie de energía libre en el espacio RMSD respecto a la configuración cerrada (2FO0).
Con un cuadrado azul de 4 Å de lado se resaltan las regiones que corresponden a las
conformaciones cristalográficas abierta y cerrada. En ambos paneles podemos observar
cómo la estructura únicamente permanece en su conformación cerrada (Corbi-Verge 2012).
151
Como ya hemos señalado, experimentos previos con quinasas de
tirosina de la subfamilia de Src, determinaron que la afinidad del dominio
SH3 por la secuencia de conexión C2Q era muy baja, estando favorecida
principalmente por el empaquetamiento de esta secuencia entre los
dominios quinasa y SH3 (Brown and Cooper 1996; Boggon and Eck
2004). Sin embargo, Engen y colaboradores propusieron que la secuencia
C2Q de cAbl podría tener una afinidad muy superior por el dominio SH3
que en la familia de cSrc (Engen et al. 2008). Así, la unión de C2Q al
dominio SH3 en la conformación inicial de la trayectoria es suficiente
para que el tándem permanezca durante toda la simulación en la
conformación cerrada. Hay que tener en cuenta que el tándem SH3SH2
no puede adoptar la conformación abierta sin dejar de interaccionar con la
región C2Q, de forma que esta secuencia podría constituir un elemento
clave para mantener cAbl en la conformación autoinhibida.
Con la intención de obtener una interpretación mecanística de los
datos de DSC y poder así compararlos con los resultados obtenidos
computacionalmente, hemos creado dos modelos termodinámicos
estudiando la interacción del tándem cAbl SH3SH2 y cAbl SH3SH2-C2Q.
Los modelos están basados en las relaciones de termodinámica estadística
entre la estabilidad de los dominios, la cooperatividad inter-dominio, y la
unión del ligando. En ambos modelos se consideran las dos
conformaciones alternativas del tándem SH3SH2: conformación 1) el
estado abierto, que corresponde con el mínimo de energía libre cuando el
dominio SH3 no está unido al conector C2Q, y conformación 2) el estado
cerrado, el cual está menos poblado en ausencia de dicha interacción. La
primera conformación se considera como el estado de referencia para la
formulación de los modelos. Las simulaciones de los termogramas de
DSC para cada modelo se aplican tanto al tándem cAbl SH3SH2 como a
la construcción cAbl SH3SH2-C2Q.
En el Modelo 1 asumimos que no existe cooperatividad entre
ambos dominios, es decir, el conector C2Q interacciona con el dominio
SH3 independientemente del estado de plegamiento del dominio SH2. En
el Modelo 2, consideramos que existe una completa cooperatividad en el
desplegamiento del tándem SH3SH2 cuando el conector C2Q está unido,
es decir, los estados parcialmente desplegados no están poblados cuando
está unido el conector. Para cada modelo, consideramos un estado en el
que C2Q se une preferentemente a la conformación cerrada, como predice
152
Capítulo 4
nuestra simulación computacional, y otro estado en el que el conector se
une a la conformación abierta.
Los estados propuestos para cada modelo se enumeran en la Tabla
4.1. Cada estado está representado en función del estado de plegamiento y
unión de cada dominio. La energía de Gibbs respecto al estado de
referencia (conformación abierta) son las variables de entrada de los
modelos. El peso estadístico de cada estado corresponde al exponente de
Boltzmann de esas energías libres. ΔGcd es la diferencia energética entre la
conformación abierta y la cerrada. En todos los cálculos se asume que este
valor es de 20 kJ·mol-1 a 25ºC, el cual corresponde, aproximadamente, al
valor estimado de 17 kJ·mol-1 obtenido en las metadinámicas (Corbi-Verge
2012). ΔGC2Q-ab, ΔGC2Q-cd y ΔGC2Q-pd representan las energías libres de
interacción entre el conector C2Q y el dominio SH3, en la conformación
abierta, en la conformación cerrada y en los estados parcialmente
desplegados del tándem, respectivamente. Finalmente, ΔG2 y ΔG3 son las
energías libres del desplegamiento de los dominios SH2 y SH3 cuando no
se encuentran unidos a C2Q (En el Apéndice II aparece el desarrollo
matemático de cada modelo).
Tabla 4.1. Clasificación de los estados considerados en el Modelo 1 y el Modelo 2,
acompañados por sus respectivas energías libres y el peso estadístico de cada estado. Los
modelos se diferencian en la consideración o no de los estados parcialmente desplegados. Los
dominios SH3 y SH2 se representan como círculos azules y rojos (estado plegado), o
garabatos (estado desplegado), respectivamente. El conector C2Q se muestra en verde.
153
Las simulaciones obtenidas para estos dos modelos se muestran en
la Figura 4.10. Los paneles A y B corresponden al Modelo 1 en el que la
interacción del conector C2Q con el dominio SH3 no implica
cooperatividad entre los dominios que forman el tándem, por lo que la
interacción puede darse tanto en el estado nativo como en el
semidesplegado. En la simulación del panel A esa interacción sólo puede
darse en la conformación abierta del estado nativo y con la misma
intensidad que en el estado semidesplegado (ΔGC2Q-ab =ΔGC2Q-pd), estando
impedida la interacción en la conformación cerrada, para lo que se da un
valor alto a su correspondiente energía de Gibbs (ΔGcd=100kJ·mol-1). En
el panel B se impide la interacción en la conformación abierta
(ΔGab=100kJ·mol-1) y la de la conformación cerrada se equipara a la del
estado semidesplegado (ΔGC2Q-cd =ΔGC2Q-pd). En ambos casos se observa
que al aumentar la intensidad de la interacción del conector C2Q con el
dominio SH3 se produce un desplazamiento del segundo pico a mayores
temperaturas, lo que implica una estabilización de este dominio, mientras
que la transición del dominio SH2 no se ve afectada (Panel A, Figura
4.10) o se desplaza a temperaturas más bajas debido a la estabilización del
estado semidesplegado por la interacción con el conector (Panel B, Figura
4.10). De cualquier modo las simulaciones de los paneles A y B distan
mucho de acercarse a la transición única y aguda que se obtiene
experimentalmente para la construcción cAbl SH3SH2-C2Q. Los paneles
C y D corresponden al Modelo 2 en el cual el valor de ΔGC2Q-pd se
considera muy elevado ya que no se contemplan los estados
semidesplegados. En ambos paneles los termogramas reflejan una
cooperatividad completa, la forma de los picos bajo cualquier condición
se desplaza a mayores temperaturas a medida que aumenta la energía de
interacción. Sin embargo, para las constantes de disociación que se
encuentran en el rango de µM, los valores de Tm se sitúan por encima de
70ºC (Panel C, Figura 4.10). Por el contrario, los picos que aparecen en
torno a 60ºC pertenecen a constantes de disociación superiores a 5 µM
(Panel D, Figura 4.10).
Está claro desde este análisis que la medida de DSC para la
construcción Abl SH3SH2-C2Q es muy distinta a las que aparecen en los
Paneles A y B de la Figura 4.10. El termograma de la Figura 4.7 es mucho
más parecido a los termogramas simulados en los Paneles C y D de la
Figura 4.10. Sin embargo, el rango teórico de los valores de Tm para estos
picos cooperativos depende de si se asumen dos escenarios posibles: 1)
C2Q se une a la conformación abierta, con una constante de disociación
154
Capítulo 4
extremadamente baja (10-100 nm) o 2) C2Q se une a la conformación
cerrada con una constante de disociación en el rango entre mM y µM. No
obstante, sólo la última situación parece más probable, ya que éste es el
rango de la constante de unión observada para el reconocimiento de
poliprolina por dominios SH3 (Palencia et al. 2004).
Figura 4.10. Simulación de los perfiles de capacidad calorífica para la
desnaturalización térmica de la construcción cAblSH3SH2-C2Q. Los paneles A y B
corresponden al Modelo 1 y los paneles B y C se han obtenido a partir del Modelo 2. En los
paneles A y C, se supone que el conector C2Q se une a la conformación abierta del tándem,
la cual es también el estado con menor energía libre. En los paneles B y D el conector C2Q
se une a la conformación cerrada que presenta una mayor energía libre. En cada panel, las
simulaciones de los termogramas de DSC para la forma libre del tándem SH3-SH2 se
muestra en negro y se obtiene usando como valores ΔGC2Q-ab,=ΔGC2Q-cd=ΔGC2Q-pd= 100
kJ·mol-1. Después se explora un intervalo de afinidades de unión del conector C2Q y las
diferentes simulaciones de termogramas obtenidas se representan en distintos colores. En los
paneles A y C el valor de ΔGC2Q-cd es de 100 kJ·mol-1 mientras se varía el valor de ΔGC2Q-ab.
En los paneles B y D ΔGC2Q-abtiene un valor de 100 kJ·mol-1, mientras que el valor de ΔGC2Qcd varía. El valor de ΔGC2Q-pd se considera igual al valor de ΔGC2Q-ab y de ΔGC2Q-cd en los
paneles A y B, respectivamente. En los paneles C y D este valor se considera muy elevado ya
que no se contemplan los estados semidesplegados. Los parámetros de estabilidad usados en
las simulaciones para los dominios individuales son: Tm = 50ºC, ΔH (Tm) = 300 kJ·mol-1,
y ΔCp = 1 kJ· (K·mol-1) para el dominio SH2 y Tm = 70ºC, ΔH (Tm) = 180 kJ·mol-1, y
ΔCp = 1 kJ·(K·mol-1) para el dominio SH3. La diferencia de energía libre entre el estado
abierto y el estado cerrado es de 20 kJ·mol-1, valor cercano al obtenido en los cálculos
computacionales.
155
Los datos de DSC obtenidos indican que la presencia del conector
C2Q tiene un gran efecto en el comportamiento del tándem, acoplando el
desplegamiento de los dominios SH3 y SH2 como una única unidad
cooperativa. Además, de acuerdo con los datos de DSC, las simulaciones
de dinámica molecular y los modelos mecanísticos usados, existe una
interacción preferente del conector con el dominio SH3 en la
conformación cerrada.
4.2.4. Papel del conector C3-2 en el equilibrio conformacional del
tándem SH3SH2
Como ya hemos visto en los apartados anteriores, al superponer
las estructuras cristalográficas 2ABL y 2FO0 (usando como referencia
solamente el dominio SH2), observamos un cambio en la orientación
relativa de los dominios modulares que implica el desplazamiento y
rotación del dominio SH3 respecto al dominio SH2. Como se puede
apreciar en la Figura 4.3, en la zona de la secuencia de conexión entre los
dominios SH3 y SH2 (C3-2), podemos percibir un ligero cambio en
algunos de los residuos más cercanos al dominio SH3 que se traduce en
un cambio en el valor de RMSD del conector C3-2 cuando el tándem
cambia de orientación relativa (Corbi-Verge 2012).
Experimentalmente, mutaciones realizadas en esta región han
dado lugar a un aumento en los niveles de activación tanto en la quinasa
de cSrc como en la quinasa de cAbl (Hantschel and Superti-Furga 2004;
Nagar et al. 2006). Una interpretación factible de estos resultados sería
considerar que las mutaciones realizadas en el conector C3-2 disminuirían
su habilidad de acoplar los dos lóbulos del dominio catalítico en el estado
inactivo, incluso si el complejo está ensamblado (Young et al. 2001;
Nagar et al. 2006). Otra alternativa posible, complementaria a esta
explicación, sería que en los mutantes el equilibrio entre la forma
acoplada y desacoplada de la enzima se desplazaría hacia la segunda, es
decir, hacia el estado activado (Ulmer et al. 2002).
Para investigar la validez de esta segunda interpretación, llevamos
a cabo el estudio del impacto de las mutaciones en el conector cAbl
SH3SH2 sobre la habilidad del tándem para unirse al conector SH2quinasa (C2Q). Para localizar los residuos específicos que debían ser
mutados, se recogieron los valores de los ángulos diedros del esqueleto
peptídico de los residuos que componen la secuencia C3-2 a lo largo de las
156
Capítulo 4
diferentes trayectorias. El análisis mostró que el intercambio entre la
conformación abierta y la cerrada está relacionada con las transiciones
entre los ángulos phi y psi en la posiciones N139, S140 y, aunque en
menor medida, L141 (Corbi-Verge 2012). Algo que, a priori, parece
coincidir con los datos experimentales obtenidos por Brasher y
colaboradores que indican que la mutación a glicina de los restos S140,
L141 y E142 provoca la activación de cAbl (Brasher et al. 2001). Estos
resultados indican que los residuos N139, S140 y L141 del conector SH3SH2 actúan a modo de articulación, modulando el movimiento de
orientación relativa entre los dominios SH3 y SH2, fruto del equilibrio
entre flexibilidad y rigidez conformacional de la secuencia conectora.
Para comprobar que, efectivamente, estos residuos son claves para
modular el equilibrio conformacional del tándem, se sustituyeron los tres
residuos por glicinas, ya que la glicina posee una mayor libertad
conformacional. Esta triple mutación conduce a una disminución
significativa de la Tm respecto a la construcción cAbl SH3SH2-C2Q de
unos 3.5ºC, sin un cambio importante en la forma del termograma
(Figura 4.11). Este desplazamiento lo podemos interpretar como un
reflejo del aumento de la entropía conformacional.
Figura 4.11. Comparación de la dependencia de la capacidad calorífica molar parcial con
la temperatura para la construcción cAblSH3SH2-C2Q (verde) y su variante con la triple
mutación de glicina cAbl SH32-C2Q (3xGly) (Rojo). Los experimentos se llevaron a cabo
en tampón Pipes 50 mM pH 7.0.
157
Estos resultados están en concordancia con los obtenidos
mediante las simulaciones de dinámica molecular, donde se observa que
al introducir estas glicinas se produce un aumento de la flexibilidad de
esta región, aumentando la entropía conformacional del tándem y
favoreciéndose la conformación abierta (Figura 4.12). Sin embargo,
existen conformaciones compatibles con la unión del conector C2Q y el
dominio SH3 que se encuentran significativamente pobladas, quizá por
esta razón no varíe de un modo significativo la forma del termograma.
Estos datos sugieren que, una vez que se activa cAbl, la orientación
relativa de los dominios modulares es muy importante y, por lo tanto, es
necesario que se encuentre controlada.
Figura 4.12. Dinámica conformacional de la mutación (3xGly) en el conector C3-2 en una
simulación de 250 ns. Las coordenadas de los descriptores (D1 y D2), están coloreadas
según la frecuencia en las que son visitadas durante la trayectoria. En azul se resaltan las
coordenadas visitadas de 1 a 10 veces, en naranja de 10 a 100 y en rojo las que son visitadas
más de 100 veces.
Con los resultados obtenidos decidimos probar el efecto contrario,
es decir, en lugar de aumentar la flexibilidad del conector, se sustituyó la
S140 por una prolina, observándose un efecto drástico. La presencia de la
prolina en la construcción cAbl SH3SH2-C2Q genera un termograma en
el que vuelven a aparecer dos picos, que corresponderían al
desplegamiento de cada uno de los dominios de forma individual, del
mismo modo que cuando analizábamos el tándem cAbl SH3SH2, de
forma que, aún en presencia del conector C2Q, los dominios permanecen
desacoplados (Figura 4.13). Esto significaría una pérdida de
cooperatividad respecto a la construcción silvestre cAbl SH3SH2-C2Q.
158
Capítulo 4
Figura 4.13. Comparación de la dependencia de la capacidad calorífica molar parcial con
la temperatura para la construcción cAblSH3SH2-C2Q (verde) y su variante con mutación
de prolina, cAblSH3SH2-C2Q (S140P) (granate). Los experimentos se llevaron a cabo en
tampón Pipes 50 mM pH 7.0.
Una vez más estos resultados están en concordancia con los
obtenidos en las simulaciones de dinámica molecular, donde la mutación
por prolina en el conector C3-2 induce al tándem a adoptar prácticamente
una única conformación, alejada de la forma cerrada, y que
aparentemente es incompatible con la interacción entre el conector C2Q y
el dominio SH3 (Figura 4.14). De este modo, se hace evidente cómo los
residuos que ocupan tanto la posición 140, como las posiciones
colindantes, son claves en el equilibrio conformacional del tándem y, por
lo tanto, vitales para la regulación de la actividad de la quinasa de tirosina
cAbl. Por lo tanto, es lógico pensar, que estas mutaciones explican, al
menos en parte, el aumento en los niveles de activación observados
(Hantschel and Superti-Furga 2004).
159
Figura 4.14. Dinámica conformacional de la mutación S140P en el conector C3-2
en una simulación de 250 ns. Las coordenadas de los descriptores (D1 y D2), están
coloreadas según la frecuencia en las que son visitadas durante la trayectoria. En
azul se resaltan las coordenadas visitadas de 1 a 10 veces, en naranja de 10 a 100 y
en rojo las que son visitadas más de 100 veces.
Estos datos podrían explicar por qué las variantes resistentes de las
formas oncogénicas de BCR-ABL con mutaciones en la región del
conector C3-2 no responden a los inhibidores como Gleevec (Gorre et al.
2002; Azam et al. 2003; Ernst et al. 2011). En la forma oncogénica BCRABL, aunque el mecanismo de autoinhibición esté dañado, el dominio
SH3 debe seguir inhibiendo la actividad gracias a su unión con el conector
C2Q, ya que este mecanismo se encuentra intacto. Una mutación en la
región C3-2 puede acabar por desplazar este equilibrio hacia la
conformación abierta, contrarrestando el efecto inhibidor de la interacción
del dominio SH3 con C2Q, lo que aumentaría la actividad de la forma
oncogénica y disminuiría la efectividad del inhibidor.
4.2.5. Influencia del conector C2Q y las mutaciones en el conector C3-2
de cAbl en la energética de unión
En un primer momento, decidimos llevar a cabo un estudio sobre
el comportamiento del tándem cAbl SH3SH2 y la construcción cAbl
SH3SH2-C2Q en presencia de un ligando rico en poliprolina el cual
presentase una mayor afinidad por el dominio SH3 que el propio conector
C2Q. Para ello, realizamos un estudio mediante Calorimetría Isotérmica
de Titulación de la interacción del tándem cAbl SH3SH2 y de la
construcción cAbl SH3SH2-C2Q con el ligando p41 (APSYSPPPPP)
160
Capítulo 4
(Figura 4.15). Este péptido se obtuvo mediante métodos de diseño
racional a partir del ligando natural 3BP1 (APTMPPPLPP) y es uno de
los ligandos descritos hasta la fecha, con mayor afinidad por el dominio
cAbl-SH3 (Pisabarro et al. 1994; Pisabarro and Serrano 1996). Los
experimentos los hemos realizado en tampón Pipes 20 mM, pH 7.0 a
25ºC y los resultados obtenidos se representan en la Tabla 4.2.
En el caso de las construcciones cSrc SH3SH2 y cSrc SH3SH2C2Q, el estudio de la influencia de un ligando de alta afinidad en la
interacción entre el dominio SH3 y C2Q, se realizó con el péptido VSL12
cuya interacción con el dominio SH3 ha sido estudiada con profundidad
en nuestro grupo de investigación (Martin-Garcia 2009). Los
experimentos de Calorimetría Isotérmica de Titulación (Figura 4.16)
también los hemos llevado a cabo en tampón Pipes 20 mM, pH 7.0 a 25ºC
y los resultados obtenidos aparecen en la Tabla 4.2.
161
162
Figura 4.15. Experimentos de titulación mediante ITC del ligando p41 con el dominio cAbl-SH3, el tándem cAbl SH3SH2 y la
construcción cAbl SH3SH2-C2Q en Pipes 20 mM, pH 7.0 y 25ºC. a) Termograma de titulación formado por los calores por unidad de
tiempo liberados tras la inyección del ligando p41 sobre las distintas construcciones. b) Isoterma de unión correspondiente al experimento
a, obtenida después de normalizar los calores de titulación y corregir los calores por dilución. Los datos experimentales se representan como
círculos mientras que la línea continua corresponde al mejor ajuste para el modelo de un sitio de unión (ecuación 2.5.11).
Figura 4.16. Experimentos de titulación mediante ITC del ligando VSL12 con el dominio cSrc-SH3, el tándem cSrc
SH3SH2 y la construcción cSrc SH3SH2-C2Q en Pipes 20 mM, pH 7.0 y 25ºC. a) Termograma de titulación formado
por los calores por unidad de tiempo liberados tras la inyección del ligando VSL12 sobre las distintas construcciones. b)
Isoterma de unión correspondiente al experimento a, obtenida después de normalizar los calores de titulación y corregir los
calores por dilución. Los datos experimentales se representan como círculos mientras que la línea continua corresponde al
mejor ajuste para el modelo de un sitio de unión (ecuación 2.5.11).
Capítulo 4
163
Para comprobar el efecto de las mutaciones realizadas en el
conector C3-2 en la energética de unión entre el dominio SH3 y el ligando
p41, realizamos un estudio de esta unión mediante ITC en Pipes 20 mM,
pH 7.0 y 25ºC (Figura 4.17). Los parámetros termodinámicos obtenidos
se detallan en la Tabla 4.2.
Figura 4.17. Experimentos de titulación mediante ITC del ligando p41 con los mutantes
cAblSH3SH2-C2Q (3xGly) y cAblSH3SH2-C2Q (S140P) en Pipes 20 mM, pH 7.0 y 25ºC.
a) Termograma de titulación formado por los calores por unidad de tiempo liberados tras la
inyección del ligando p41 sobre las distintas construcciones. b) Isoterma de unión
correspondiente al experimento a, obtenida después de normalizar los calores de titulación y
corregir los calores por dilución. Los datos experimentales se representan como círculos
mientras que la línea continua corresponde al mejor ajuste para el modelo de un sitio de
unión (ecuación 2.5.11).
Desafortunadamente, no podemos extraer información relevante
de estos experimentos debido a la similitud en las constantes de
disociación tanto para cAbl como para cSrc. Tampoco hay una gran
diferencia en la entalpía de unión, exceptuando el caso del mutante
cAblSH3SH2-C2Q (S140P) y la construcción cSrcSH3SH2-C2Q, donde la
diferencia ronda los 20 kJ·mol-1. Este cambio podría estar relacionado con
cambios conformacionales debido a la unión de los ligandos p41 y VSL12
o a los eventos de precipitación observados en el transcurso de los
experimentos de ITC. En cualquier caso, la información obtenida a través
164
Capítulo 4
de los experimentos de titulación calorimétrica es escasa a la hora de
relacionarla con los datos obtenidos tanto por DSC como por dinámica
molecular.
Tabla 4.2. Parámetros termodinámicos obtenidos a partir de los experimentos de ITC para
la unión del ligando p41 al dominio cAbl-SH3, al tándem cAbl SH3SH2 y a la
construcción cAbl SH3SH2-C2Q, y parámetros termodinámicos para la unión del ligando
VSL12 al dominio cSrc-SH3, al tándem cSrc SH3SH2 y la construcción cSrc SH3SH2C2Q. Todos los experimentos están realizados en Pipes 20 mM pH 7.0 a 25 oC.
Kd# (µM)
∆Gap
(kJ/mol)
∆Hap#
(kJ/mol)
-T∆Sap
(kJ/mol)
cAbl-SH3
1.9
-32.7
-85.3
52.6
cAblSH3SH2
4.0
-30.8
-77.6
46.8
7.6
-29.2
-75.9
46.7
cAblSH3SH2C2Q (3XGly)
3.9
-30.9
-77.6
46.7
cAblSH3SH2C2Q (S140P)
4.6
-30.5
-91.7
61.2
cSrc-SH3
0.2
-38.2
-69.3
31.1
0.3
-37.2
-58.9
21.7
0.7
-35.1
-46.1
11.0
Proteína
cAblSH3SH2C2Q
cSrcSH32
cSrcSH3SH2C2Q
Ligando
p41
VSL12
#
Los errores en los parámetros termodinámicos se estiman en torno al 5% para la entalpía
de unión y al 10% para la constante de disociación
165
4.3. Conclusiones
Del análisis del equilibrio conformacional del tándem de los
dominios SH2 y SH3 de cAbl realizado se desprenden las siguientes
conclusiones:
1. El tándem SH3SH2 de cAbl en ausencia de las interacciones con C2Q
se comporta como un interruptor molecular que se encuentra en un
equilibrio conformacional entre dos formas, la abierta y la cerrada,
aunque la más probable es la abierta.
2. La secuencia C2Q, en ausencia de ningún otro elemento de la
quinasa, reconfigura el espacio conformacional del tándem, haciendo
que la configuración más estable sea la cerrada. Esto, sumado al
desplegamiento cooperativo observado por DSC del tándem SH3SH2
en presencia del conector C2Q, reforzaría la idea de que la interacción
entre C2Q y el dominio SH3 tiene una afinidad mayor en cAbl que en
cSrc, respondiendo así a la necesidad de aumentar la estabilidad de la
conformación cerrada en ausencia de las interacciones que establece el
extremo C-terminal con el dominio SH2 para la familia Src.
3. El equilibrio conformacional del tándem se encuentra modulado
gracias a las propiedades de la secuencia que conecta ambos dominios
modulares, C3-2. El conector C3-2 es responsable de limitar la
entropía conformacional del tándem de los dominios modulares,
otorgándoles suficiente libertad para que el dominio SH3 se desplace
para reconocer ligandos y liberar el dominio catalítico, a la vez que
limita las conformaciones posibles para que el dominio SH3 se
mantenga unido a C2Q. Se destaca asimismo el papel de los residuos
que se encuentran en las posiciones 139, 140 y 141.
166
Capítulo 5
Efectos contextuales en la
especificidad y afinidad de unión de
los dominios WW de hNedd4
Capítulo 5
CAPÍTULO 5.- EFECTOS CONTEXTUALES EN LA
ESPECIFICIDAD Y AFINIDAD DE UNIÓN EN LOS
DOMINIOS WW DE hNedd4
5.1. Introducción
Como se ha mencionado en el Capítulo 1, la etapa final del ciclo
de vida de los virus encapsulados consiste en un proceso de fusión con la
membrana de la célula huésped que tiene como resultado la liberación del
virus. En el proceso de liberación del virus están implicadas pequeñas
secuencias ricas en prolina que se denominan dominios L (“Late assembly
domains”) y se hallan en diversas proteínas víricas como las poliproteínas
Gag de los retrovirus o en las proteínas de matriz de rhabdovirus y
filovirus. La eliminación de estos dominios o la alteración de su
secuencia, bloquea la liberación del virus, impidiendo la propagación de
las partículas infecciosas (Gottlinger et al. 1991; Yasuda and Hunter 1998;
Freed 2002; Yasuda et al. 2003). Existen numerosas evidencias
experimentales que indican que los dominios L no actúan directamente en
la morfogénesis del virión, sino que su principal función es reclutar la
maquinaria celular necesaria para el ensamblaje del virus y su posterior
liberación. Este proceso tiene lugar mediante la interacción directa de los
dominios L víricos con proteínas celulares implicadas en los mecanismos
de creación y gestión de vesículas. Los dominios L con secuencia PTAP,
presentes en virus como el VIH-1 o Ébola, interaccionan con el dominio
UEV de la proteína Tsg101 (“Tumor Susceptibility Gene 101” (VerPlank
et al. 2001; Bouamr et al. 2003); mientras que los dominios de tipo PPxY,
presentes en los virus del Ébola, de Mason-Pfizer, del sarcoma Rous y
otros onco-retrovirus como el virus de la leucemia humana de linfocitos T
de tipo I (HTLV1), interaccionan con la ligasa de ubiquitina humana
Nedd4, y más concretamente con el tercer dominio WW (Harty et al.
2000; Harty et al. 2001; Freed 2002; Yasuda et al. 2003; Demirov and
Freed 2004). El diseño de moléculas de pequeño tamaño que bloqueen las
interacciones víricas se ha consolidado como una estrategia viable para el
desarrollo de nuevos fármacos contra patógenos tan letales como el VIH o
el Ébola. Dado que el diseño eficaz de estos inhibidores requiere una
comprensión profunda de las fuerzas que dirigen las interacciones entre
los dominios L y sus dianas, nuestro grupo de investigación fue el primero
en abordar una caracterización termodinámica detallada y completa del
equilibrio conformacional de algunos dominios WW, entre ellos el tercer
y cuarto dominio WW de hNedd4, así como un análisis exhaustivo de la
interacción de estos dominios con sus ligandos (Cobos et al. 2009; Bexiga
2011).
Como hemos visto en los capítulos anteriores, el análisis del
plegamiento y de las propiedades cooperativas es muy relevante para la
comprensión de la regulación y la transmisión de información en los
171
módulos de reconocimiento molecular y, por tanto, para el diseño
racional de ligandos. De este modo, es importante establecer los posibles
efectos que la configuración en tándem de los dominios WW pudiera
tener sobre la estabilidad y cooperatividad estructural de la proteína, así
como los posibles efectos sinérgicos entre los diferentes dominios que
podrían influir en la afinidad y especificidad de unión. Diferentes estudios
estructurales de distintas proteínas con dominios WW en tándem, revelan
que la secuencia que los conecta tiene propiedades y funciones muy
diferentes en cada caso. Esta secuencia puede estar estructurada y orientar
los dominios en caras opuestas, como sucede para la pareja de dominios
WW1WW2 de la proteína Prp40. Esta orientación es necesaria para unir
proteínas específicas en los intrones de los precursores del ARNm en el
espliceosoma (Wiesner et al. 2002). Lo mismo ocurre con los dominios
WW1WW2 de FBP11, donde las cadenas laterales se quedan orientadas
de tal modo que ambos dominios pueden unirse a la vez a sus respectivos
ligandos (Ramirez-Espain et al. 2007). La secuencia que conecta los
dominios también puede ser una secuencia más larga, flexible y
desestructurada como la secuencia ubicada entre los dominios
WW3WW4 de la proteína Suppressor de Deltex Su(dx). Esta secuencia
estabiliza el dominio Su(dx)-WW4 que está parcialmente desestructurado
antes de que se produzca la unión de un ligando al otro dominio Su(dx)WW3 (Fedoroff et al. 2004; Jennings et al. 2007). En ocasiones, la
secuencia de conexión puede ser relativamente corta y flexible
permitiendo que los dominios tengan cierta libertad conformacional pero
obligando a que estén suficientemente próximos el uno del otro para
aumentar la superficie de unión y reconocer ligandos con dos motivos de
unión, este es el caso de los dominios WW1WW2 de la proteína FBP21
(Huang et al. 2009; Klippel et al. 2011). Recientemente se ha descrito otra
forma de unión cooperativa para el primer y segundo dominio en tándem
de Smurf1 y el supresor tumoral WWOX, similar a la del tándem FBP21
WW1WW2, aunque en este caso los dominios individuales Smurf1 WW2
y WWOX WW2, por sí solos no tienen capacidad de unir ligandos ricos
en prolina. Cuando el domino WW2 de Smurf1 se encuentra formando
un tándem con el dominio WW1, interaccionan entre ellos expandiendo
la superficie de unión con el péptido. En este complejo, el domino
Smurf1WW2 proporciona contactos adicionales con los restos contiguos
al motivo PPxY del ligando que se une a Smurf1 WW1, con el
consiguiente aumento en la afinidad de unión (Chong et al. 2010). El
dominio WW1 de WWOX aislado está estructuralmente desordenado,
sin embargo, cuando se une a un ligando se encuentra como una
estructura correctamente plegada. La presencia del dominio WW2 en
tándem hace que el dominio WW1 se estabilice, favoreciendo la unión de
ligandos y aumentando su afinidad (McDonald et al. 2012).
En este contexto, nos hemos propuesto, dentro de los objetivos de
este trabajo, y debido a la importancia del dominio WW3 como diana
172
Capítulo 5
para el desarrollo de agentes terapéuticos, evaluar los posibles efectos
sinérgicos en las construcciones en tándem de los distintos dominios WW
que componen hNedd4, tanto en cuanto a su equilibrio conformacional,
como en el reconocimiento de ligandos.
5.2. Resultados y discusión
5.2.1. Construcciones en tándem de los dominios WW de hNedd4
Para estudiar la influencia de los efectos contextuales en la
cooperatividad y en la especificidad de unión, hemos realizado la
caracterización termodinámica del equilibrio conformacional y de la
energética de unión de los cuatro dominios WW que componen hNedd4,
tanto de forma individual como de sus diferentes construcciones en
tándem. Para ello, hemos clonado, expresado y purificado las siguientes
construcciones de dominios, que se recogen en la Figura 5.1.
hNedd4 WW1WW2
SPLPPGWEERQDILGRTYYVNHESRRTQWKRPTPQDNLTDAENGNIQ
LQAQRAFTTRRQISEETESVDNRESSENWEIIREDEATMYSNQAFPSPPP
SSNLDVPTHLAEELNARLTIFGNSAVSQPASSSNHSSRRGSLQAYTFEEQ
PTLPVLLPTSSGLPPGWEEKQDERGRSYYVDHNSRTTTWTKPTV
hNedd4 WW3WW4
GFLPKGWEVRHAPNGRPFFIDHNTKTTTWEDPRLKIPAHLRGKTSLDT
SNDLGPLPPGWEERTHTDGRIFYINHNIKRTQWEDPRL
hNedd4 WW2WW3WW4
SGLPPGWEEKQDERGRSYYVDHNSRTTTWTKPTVQATVETSQLTSSQS
SAGPQSQASTSDSGQQVTQPSEIEQGFLPKGWEVRHAPNGRPFFIDHNT
KTTTWEDPRLKIPAHLRGKTSLDTSNDLGPLPPGWEERTHTDGRIFYI
NHNIKRTQWEDPRL
hNedd4 WW1WW2WW3WW4
SPLPPGWEERQDILGRTYYVNHESRRTQWKRPTPQDNLTDAENGNIQ
LQAQRAFTTRRQISEETESVDNRESSENWEIIREDEATMYSNQAFPSPPP
SSNLDVPTHLAEELNARLTIFGNSAVSQPASSSNHSSRRGSLQAYTFEEQ
PTLPVLLPTSSGLPPGWEEKQDERGRSYYVDHNSRTTTWTKPTVQATV
ETSQLTSSQSSAGPQSQASTSDSGQQVTQPSEIEQGFLPKGWEVRHAPN
GRPFFIDHNTKTTTWEDPRLKIPAHLRGKTSLDTSNDLGPLPPGWEER
THTDGRIFYINHNIKRTQWEDPRL
Figura 5.1. Secuencias de las diferentes construcciones en tándem de los dominios
WW de hNedd4. El dominio WW1 aparece representado en fucsia, el dominio WW2 en
azul, el dominio WW3 en verde y el dominio WW4 en granate. Las secuencias que
conectan los distintos dominios aparecen en negro.
173
5.2.2. Estudio del equilibrio conformacional de los dominios WW
individuales de hNedd4
Como hemos mencionado anteriormente, nuestro grupo de
investigación realizó una caracterización exhaustiva del tercer y cuarto
dominio WW de la ligasa de ubiquitina humana Nedd4 (Cobos et al.
2009; Bexiga 2011). Los datos obtenidos para hNedd4 WW4 indican que,
aunque el modelo de dos estados describe el comportamiento
experimental de manera razonable, los parámetros termodinámicos
obtenidos no son propios de proteínas dos estados, sino más similares a
los de proteínas tipo “downhill” como BBL (Naganathan et al. 2005) y
gpW (Fung et al. 2008). Además, la existencia de una desnaturalización a
bajas temperaturas y los experimentos de doble perturbación indican que
el nivel de cooperatividad en el equilibrio es muy bajo. En el caso de los
experimentos llevados a cabo con el dominio hNedd4 WW3, no siguen
los criterios establecidos para una proteína dos estados y más bien
apuntan a un plegamiento sin barreras o con barreras de energía muy
bajas separando los diferentes macroestados.
Para poder evaluar los efectos sinérgicos en las construcciones en
tándem, necesitamos caracterizar tanto los dominios individuales como
las construcciones en tándem. Por esta razón, hemos realizado una
caracterización termodinámica de los dominios WW restantes que
componen hNedd4, hNedd4 WW1 y hNedd4 WW2. En la Figura 5.2 se
representan las trazas de DSC correspondientes al proceso de
desnaturalización térmica de los dominios WW1 y WW2 de hNedd4 en
tampón fosfato sódico 50 mM a pH 7.0, condición en la cual el proceso de
desnaturalización ha presentado una elevada reversibilidad. Los
termogramas se han analizado mediante un ajuste individual al modelo de
dos estados (Sección 2.2.4). Los datos termodinámicos obtenidos de este
análisis se representan en la Tabla 5.1.
Tabla 5.1. Parámetros termodinámicos de plegamiento de los dominios WW1, WW2,
WW3 y WW4 de hNedd4.
Proteína
hNedd4
WW1
hNedd4
WW2
hNedd4
WW3
hNedd4
WW4
174
Tm (oC)
∆Hm(kJ/mol)
∆G25ºC
(kJ/mol)
57.1
108.9
8.3
49.3
86.8
4.7
57.2
83.0
7.5
56.8
127.6
9.7
Capítulo 5
En la Tabla 5.1 también se incluyen los valores obtenidos del
mismo tipo de ajuste realizado para las trazas de DSC a pH 7.0 de los
dominios hNedd4 WW3 y hNedd4 WW4. Estos valores difieren
ligeramente de los publicados en (Cobos et al. 2009; Bexiga 2011), ya que
estos se obtuvieron por ajuste múltiple de trazas de DSC y CD obtenidas a
distintos valores de pH. Como ya hemos mencionado anteriormente, los
estudios realizados en nuestro grupo de investigación apuntan a un
comportamiento de los dominios WW cercano a un límite entre un
modelo de dos estados y un modelo “downhill”, indicando una baja
cooperatividad estructural. Esto puede observarse tanto en la anchura de
las transiciones térmicas como en los bajos valores de ΔG a 25 ºC (Tabla
5.1). Además, la intersección de las funciones Cp,N (T) y Cp,D (T),
obtenidas por ajuste simple (Figura 5.2), ocurre a temperaturas bastante
inferiores a la temperatura de convergencia universal de las proteínas
globulares, 140 ºC.
Figura 5.2. Dependencia de la capacidad calorífica de los dominios hNedd4 WW1 (Panel
a) y hNedd4 WW2 (Panel b). Los datos experimentales se han representado como círculos,
en azul oscuro para el dominio hNedd4 WW1 y en magenta para el dominio hNedd4
WW2. Los experimentos se han llevado a cabo en tampón fosfato sódico 50 mM a pH 7.0.
El ajuste al modelo de equilibrio de dos estados se muestra como una línea continua en el
mismo código de colores que los datos experimentales. Las líneas discontinuas en azul
corresponden a las funciones Cp,N (T) obtenidas del ajusto para cada curva y las líneas
discontinuas en cian corresponden a las funciones Cp,D (T), obtenidas también para el ajuste
de cada curva.
En resumen, como se ha descrito previamente para el dominio
WW4 de Nedd4 (Cobos et al. 2009), a pesar de que los datos
experimentales se pueden describir en términos de un equilibrio de dos
estados, el análisis del desplegamiento térmico de los dominios WW
individuales que componen hNedd4 revela valores anómalos para algunos
de los parámetros termodinámicos que son indicios de un proceso más
complejo, como puede ser el desplegamiento sin barreras o la presencia de
otras conformaciones alternativas del estado nativo.
175
5.2.3. Equilibrio conformacional de los dominios WW de hNedd4 en
tándem
Para comprobar si la baja cooperatividad estructural que presentan
estos dominios de forma individual se ve afectada cuando se encuentran
unidos en tándem, hemos llevado a cabo la caracterización
termodinámica del equilibrio conformacional mediante DSC de las
construcciones hNedd4 WW1WW2, hNedd4 WW3WW4, hNedd4
WW2WW3WW4 y hNedd4 WW1WW2WW3WW4. La forma de las
transiciones calorimétricas determinadas mediante DSC de una proteína
con diferentes dominios puede proporcionar información sobre las
interacciones cooperativas entre los dominios.
En la Figura 5.3 se muestran los termogramas correspondientes a
la desnaturalización térmica a pH 7.0 de las distintas construcciones en
tándem, condición en la cual todas presentan una elevada reversibilidad.
Todas las construcciones de dominios WW de hNedd4 en tándem
presentan transiciones muy anchas, que no son compatibles con un
modelo de dos estados. Esto hace pensar en una baja cooperatividad
estructural como en el caso de los dominios WW individuales. Como
podemos observar al comparar las distintas trazas de DSC, no existen
grandes diferencias en la forma de las transiciones de las distintas
construcciones, debilitando la idea de que la presencia de otros dominios
y de las secuencias que los conectan puedan mejorar la estabilidad
marginal que poseen los dominios WW de forma aislada.
176
Capítulo 5
Figura 5.3. Dependencia de la capacidad calorífica con la temperatura medida
experimentalmente mediante DSC para las construcciones hNedd4 WW1WW2 (rojo),
hNedd4 WW3WW4 (negro), hNedd4 WW2WW3WW4 (azul) y hNedd4
WW1WW2WW3WW4 (verde). Los experimentos se han realizado en tampón fosfato
sódico 50 mM a pH 7.0. Las trazas se encuentran desplazadas para una mejor comparación
entre ellas.
En ausencia de interacciones cooperativas, la capacidad calorífica
molar parcial del tándem es equivalente a la adición de las respectivas
capacidades caloríficas de los dominios individuales. Para comprobar si
éste es nuestro caso hemos comparado los perfiles de desnaturalización
por DSC a pH 7.0 tanto de las diferentes construcciones en tándem como
de la suma de los dominios individuales (Figura 5.4). Al comparar las
trazas de las distintas construcciones con las correspondientes sumas de
los dominios individuales más la contribución a la capacidad calorífica de
desplegamiento del conector entre los distintos dominios, apenas existe
diferencia entre ellas dentro del error experimental que conlleva este tipo
de transiciones tan poco cooperativas que dan lugar a trazas
calorimétricas muy ensanchadas. Esto nos confirma la ausencia de efectos
sobre la estabilidad y cooperatividad estructural significativa entre los
dominios presentes en las construcciones en tándem estudiadas y que,
además, las secuencias conectoras se encuentran prácticamente
desestructuradas. Hay que indicar, que en el caso del tándem hNedd4
WW1WW2 el conector es muy largo en comparación con los otros
(Figura 5.1) y podría dar lugar a que presentara algún tipo de estructura,
originando una contribución en la Cp experimental que no se ha tenido en
cuenta en las simulaciones realizadas.
177
Figura 5.4. Comparación de los datos experimentales de DSC de las construcciones en tándem
hNedd4 WW1WW2 (círculos rojos), hNedd4 WW3WW4 (círculos negros), hNedd4
WW2WW3WW4 (círculos azules) y hNedd4 WW1WW2WW3WW4 (círculos verdes) con la
curva de DSC de la suma de los dominios WW individuales correspondientes. La suma de los
dominios individuales se representa como una línea discontinua, en rojo para la suma de los dominios
WW1 y WW2, en negro la suma de los dominios WW3 y WW4, en azul la de los dominios WW2 y
el tándem WW3WW4 y en rosa los dominios WW2, WW3 y WW4. Para el tándem
WW1WW2WW3WW4 se han realizado varias combinaciones de sumas: la línea discontinua en
granate corresponde a la suma del domino WW1 más el tándem WW2WW3WW4, la línea
discontinua en magenta es la suma del tándem WW1WW2 más los dominios individuales WW3 y
WW4, en cian se representa la suma de los dominios WW1, WW2 más el tándem WW3WW4, en
morado tenemos la suma de los tándem WW1WW2 más WW3WW4 y finalmente en azul marino
se representa la suma de los cuatro dominios individuales WW1, WW2, WW3 y WW4.A la adición
de las trazas calorimétricas de los dominios WW individuales se le ha sumado también la
contribución a la capacidad calorífica de desplegamiento de cada aminoácido de la secuencia de
conexión entre los cuatro dominios (Privalov and Makhatadze 1990). Todos los experimentos se han
realizado en tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7.0.
5.2.4. Estudio de la especificidad de unión en los dominios WW de
hNedd4
Como hemos mencionado en la introducción de este
capítulo, el estudio de las interacciones entre los dominios L víricos y los
dominios WW de ligasas tipo Nedd4 a nivel molecular tiene un gran
interés para el diseño racional de inhibidores específicos de estas
interacciones ya que podrían constituir antivirales de amplio espectro.
Uno de los objetivos de este trabajo ha sido evaluar si, tal como
sugiere la independencia funcional de los dominios L víricos (Parent et al.
1995; Freed 2002), la especificidad observada radica en características
178
Capítulo 5
intrínsecas de sus secuencias o, por el contrario, dicha especificidad
responde a factores contextuales, como son la localización celular o el
efecto sinérgico debido a interacciones establecidas con diferentes
elementos de la proteína (Ladbury&Arold 2000). Para ello hemos
investigado la influencia de los distintos dominios WW de hNedd4 sobre
la unión del ligando Ébola A (ILPTAPPEYME), un fragmento
seleccionado a partir de la proteína VP40 del virus del Ébola y del cual se
conoce su interacción con el dominio WW3 de hNedd4 (Harty et al.
2000; Timmins et al. 2003). También hemos seleccionado el ligando
p53bp2 o M1 (EYPPYPPPPYPSG), derivado de la proteína “p53 binding
protein-2” que es una diana natural de hYap WW1 descubierta mediante
la técnica de doble híbrido de levadura (“yeast two-hibrid screening”)
(Espanel and Sudol 2001). Por último, hemos caracterizado la unión del
ligando UGR-1, obtenido en nuestro grupo de investigación a través de la
técnica de expresión en fagos y que es capaz de unirse al dominio WW3
de hNedd4 con una constante de disociación nanomolar, la mayor
descrita hasta la fecha.
La primera caracterización termodinámica y estructural de la
interacción del dominio hNedd4 WW3 con un conjunto de ligandos
peptídicos correspondientes a las secuencias de unión de dominios L de
varios virus, se llevó a cabo en nuestro grupo de investigación con el fin de
analizar los determinantes moleculares de la afinidad de unión en este
sistema (Bexiga 2011). Las afinidades de unión de los dominios L víricos
determinadas para el dominio hNedd4 WW3 confirman que las
secuencias de los dominios L extraídas del contexto de la proteína
completa mantienen la capacidad de reconocer sus dianas naturales.
Además, un estudio de la especificidad de unión de los dominios L
realizado con los dominios WW de la proteína humana asociada a Yes
(hYap) pone de manifiesto que la afinidad de todos los dominios L
analizados, es mayor para su diana natural hNedd4 WW3 que para los
demás dominios WW estudiados. Este resultado indica que las secuencias
víricas seleccionadas presentan cierto nivel de especificidad intrínseca por
el dominio hNedd4 WW3.
Para comprobar si este nivel de especificidad se mantiene con el
resto de dominios WW que conforman hNedd4, hemos llevado a cabo la
caracterización de la energética de unión de los dominios hNedd4 WW1,
hNedd4 WW2 y hNedd4 WW4 con los ligandos Ébola A, p53bp2 y
UGR-1. Con el fin de confirmar la unión y obtener una estimación inicial
de las constantes de disociación que nos permita diseñar correctamente los
experimentos calorimétricos de ITC, hemos realizado titulaciones
preliminares mediante espectroscopía de fluorescencia de cada uno de los
dominios WW con los diferentes ligandos. Los experimentos se realizaron
en tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0 a 25ºC. Los resultados obtenidos
de esta forma se muestran en la Tabla 5.2.
179
En el caso del ligando Ébola A, los resultados de las titulaciones
por fluorescencia confirman la especificidad de este ligando por el
dominio WW3 de hNedd4 sobre los dominios hNedd4 WW1 y hNedd4
WW4, pero no sobre el dominio hNedd4 WW2 que presenta una
constante de disociación similar. El valor de las constantes de disociación
hace que no sea factible realizar los experimentos de ITC ya que
necesitaríamos una elevada concentración tanto de ligando como de
proteína. Para el ligando p53bp2 ocurre igual que con el ligando Ébola A,
los dominios hNedd4 WW2 y hNedd4 WW3 presentan constantes de
disociación parecidas, mientras que para los dominios hNedd4 WW1 y
hNedd4 WW4 las constantes de disociación son mayores. Con el ligando
UGR-1 podemos observar la elevada afinidad que presenta por los
dominios hNedd4 WW3 y hNedd4 WW4. Este ligando también
interacciona con el dominio hNedd4 WW2, aunque con un orden de
magnitud menor. Sin embargo, la afinidad disminuye con el dominio
hNedd4 WW1, dominio del cual, hasta la fecha no se conocen ligandos
de alta afinidad. En la Figura 5.5 se pueden observar, a modo de ejemplo,
los experimentos de titulación mediante ITC de los dominios WW de
hNedd4 aislados con el ligando UGR-1 en los paneles superiores y en los
paneles inferiores se representan las isotermas de unión junto con el mejor
ajuste al modelo de unión de sitios idénticos e independientes.
Al comparar los datos de la Tabla 5.2 se observa claramente que el
aumento de afinidad del ligando UGR-1 por los dominios hNedd4 WW3
y WW4 con respecto al ligando p53bp2 se debe a un aumento notable en
la entalpía de unión (de unos 40 kJ·mol-1), indicando que el ligando UGR1 establece un mayor número de interacciones con estos dominios que
p53bp2. Esta característica también se observa para los dominios hNedd4
WW1 y WW2, aunque el aumento entálpico no es tan acusado y además
hay una compensación entrópica que da lugar a que la afinidad sea
similar para ambos ligandos al unirse a estos dos dominios.
Tabla 5.2. Parámetros obtenidos a partir de los experimentos de fluorescencia e ITC para
la unión de los ligandos Ébola A, p53bp2 y UGR-1 a los dominios WW individuales de
hNedd4. Los experimento se han realizado en fosfato sódico 20 mM pH 7.0 a 25 oC.
180
Capítulo 5
Kd# (µM)
∆Gap
(kJ/mol)
∆Hap#
(kJ/mol)
-T∆Sap(kJ/mol)
hNedd4
WW1*
469
-19.0
-
-
hNedd4
WW2*
166.5
-21.6
-
-
146.9
-21.9
-50.7
28.8
hNedd4
WW4*
605.2
-18.4
-
-
hNedd4
WW1
77.5
-23.5
-47.8
24.3
hNedd4
WW2
6.6
-29.6
-53.6
24.0
5.3
-30.1
-53.4
23.8
hNedd4
WW4
61.7
-24.0
-45.9
21.9
hNedd4
WW1
37.7
-25.2
-59.4
34.3
6.4
-29.7
-79.1
49.4
0.2
-38.2
-99.7
60.8
1.1
-33.9
-86.5
52.6
Proteína
hNedd4
WW3
hNedd4
WW3
hNedd4
WW2
hNedd4
WW3
hNedd4
WW4
Ligando
Ébola A
p53bp2
UGR-1
#
Los errores en los parámetros termodinámicos se estiman en torno al 5% para la entalpía
de unión y al 10% para la constante de disociación. *Datos obtenidos a partir de titulación
por fluorescencia.
181
182
Figura 5.5. Experimentos de titulación mediante ITC del ligando UGR-1 con los dominios hNedd4 WW1 (Panel a), hNedd4 WW2
(Panel b), hNedd4 WW3 (Panel c) y hNedd4 WW4 (Panel d) en fosfato sódico 20 mM pH 7.0 a 25ºC. En los paneles superiores
aparecen los termogramas de titulación formado por los calores por unidad de tiempo liberados tras la inyección del ligando UGR-1
sobre los distintos dominios. En los paneles inferiores se representan las isotermas de unión correspondientes a los experimentos de
titulación, obtenidas después de normalizar los calores de titulación y corregir los calores por dilución. Los datos experimentales se
representan como círculos mientras que la línea continua corresponde al mejor ajuste para el modelo de un sitio de unión (ecuación
2.5.11). Todos los experimentos se han realizado con el calorímetro VP-ITC excepto la titulación correspondiente al dominio hNedd4
WW3, que se ha llevado a cabo en el ITC 200.
Capítulo 5
5.2.5. Influencia de los efectos contextuales en la especificidad de
unión de los dominios WW de hNedd4
Para comprobar la influencia sobre la especificidad de unión de
los efectos contextuales cuando los dominios WW de hNedd4 se
encuentran en tándem, hemos estudiado la unión de los péptidos p53bp2
y UGR-1 a las distintas construcciones de los dominios WW de Nedd4
que aparecen en la Sección 5.2.1 en las mismas condiciones que se han
realizado los experimentos de los dominios WW individuales (fosfato
sódico 20 mM pH 7.0 a 25ºC). Debido al valor de las constantes de
disociación de la interacción entre los dominios WW individuales y el
ligando Ébola A, no se han podido realizar los experimentos de ITC para
las construcciones en tándem. La magnitud de las constantes obtenidas
para la unión de los dominios WW individuales con los ligandos p53bp2
y UGR-1 está dentro de un intervalo adecuado para llevar a cabo las
titulaciones mediante ITC con las construcciones en tándem.
En la Figura 5.6 se representan las isotermas de unión del ligando
p53bp2 a las diferentes construcciones en tándem. El análisis de la
titulación de la construcción hNedd4 WW3WW4 con el ligando p53bp2
se ha realizado mediante un ajuste simple de la isoterma de unión
correspondiente a un modelo de dos sitios de unión diferentes e
independientes (Figura 5.6, Panel a). Los datos obtenidos para dicho
ajuste concuerdan razonablemente con los obtenidos para los dominios
aislados hNedd4 WW3 y hNedd4 WW4, indicando una ausencia, o una
muy baja cooperatividad entre estos dos dominios al formar la
construcción en tándem. Para el caso del tándem hNedd4 WW1WW2
(Figura 5.6, Panel b), no se ha podido obtener un buen ajuste simple a dos
sitios de unión diferentes e independientes. También se ha intentado
realizar un ajuste múltiple de las isotermas de unión de cada uno de los
dominios individuales (al modelo de un sitio de unión) y de la del tándem
correspondiente (al modelo de dos sitios de unión independientes), de tal
modo que los valores de ajuste para cada domio del tándem tienen que ser
los mismos que cuando se encuentran de forma individual (de esta forma
se supondría una ausencia de efectos en la unión del ligando al formar la
construcción en tándem). Este tipo de análisis múltiple para el caso de la
construcción hNedd4 WW1WW2 con el ligando p53bp2 tampoco da un
buen ajuste de las isotermas. En el panel b de la Figura 5.6 se ha
representado la simulación de isoterma para el tándem hNedd4
WW1WW2 correspondiente a un modelo de dos sitios de unión
diferentes e independientes, cada uno de ellos con los valores de unión
(constante de disociación y entalpía de unión) obtenidos en los ajustes
simples para los respectivos dominios WW aislados (ver Tablas 5.2 y 5.3);
se observa una clara desviación con los datos experimentales, que parecen
indicar un menor número de sitios de unión. De hecho al realizar un
183
ajuste simple de la isoterma de este tándem a un modelo un un sitio de
unión, se obtiene un buen ajuste (Figura 5.6, Panel b) y los valores
resultantes para los distintos parámetros de unión son muy similares a los
obtenidos para el dominio hNedd4 WW1 aislado (Tabla 5.3).
Figura 5.6. a) Isoterma de unión del tándem hNedd4 WW3WW4 con el ligando p53bp2,
los datos experimentales se representan como círculos negros, mientras que la línea continua
en rojo corresponde al ajuste simple de dos sitios de unión diferentes e independientes. b)
Isoterma de unión del tándem hNedd4 WW1WW2 con el ligando p53bp2, los datos
experimentales se representan como círculos negros, mientras que la línea continua en rojo
corresponde al ajuste a un único sitio de unión. La línea continua azul corresponde a la
simulación de la isoterma de unión sumando las isotermas de los dominios individuales
hNedd4 WW1 y hNedd4 WW2. c) Comparación de las isotermas de unión
correspondientes al experimento de titulación de la construcción hNedd4 WW2WW3WW4
con el ligando p53bp2 (círculos negros) junto con la simulación de la isoterma de unión
para tres sitios distintos e independientes, cada uno de ellos con los parámetros
termodinámicos obtenidos en los ajustres simples de cada uno de los tres dominios
individuales con el ligando p53bp2 (línea azul). d) Comparación de las isotermas de unión
correspondientes al experimento de titulación de la construcción hNedd4
WW1WW2WW3WW4 con el ligando p53bp2 (círculos negros) junto con la simulación
de la isoterma de unión para cuatro sitios distintos e independientes, cada uno de ellos con
los parámetros termodinámicos obtenidos en los ajustes simples de cada uno de los cuatro
dominios individuales con el ligando p53bp2 (línea azul). Los datos experimentales se han
obtenido en condiciones de tampón fosfato sódico 20 mM, 25 ºC a pH 7.0.
184
Capítulo 5
De estos análisis podemos concluir que para la unión del ligando
p53bp2 con el tándem hNedd4 WW1WW2, existe un efecto muy
importante (incluso el ocultamiento de un sitio de unión) cuando los
dominios hNedd4 WW1 y hNedd4 WW2 se constituyen en un tándem;
mientras que para el caso de los dominios hNedd4 WW3 y hNedd4 WW4
la existencia de estos efectos al formar el tándem es nula o muy pequeña.
Este mismo comportamiento se va a observar de forma muy parecida
cuando se describa la unión de los tándem al ligando UGR-1.
En los paneles inferiores de la Figura 5.6 se representan las
isotermas de unión del ligando p53bp2 a las construcciones en tándem
hNedd4 WW2WW3WW4 y hNedd4 WW1WW2WW3WW4. En estos
casos no se han realizado ajustes a modelos más complejos (de 3 y 4 sitios
de unión) ya que tendríamos demasiados parámetros para ajustar
isotermas con muy poca información, lo que haría que los ajustes no
fueran fiables. Lo que sí hemos realizado ha sido la simulación de las
isotermas usando el programa AFFINImeter para cada tándem
suponiendo que los sitios de unión tienen los mismos valores que los
obtenidos en los ajustes simples a un sitio de unión de las isotermas
correspondientes a los dominios aislados. En estos casos se obtienen
grandes diferencias de las simulaciones con respecto a los datos
experimentales. Por lo tanto la formación de estos tándem, hNedd4
WW2WW3WW4 y hNedd4 WW1WWW2WW3WW4, produce efectos
importantes en la unión del ligando p53pb2 a los dominios WW; en la
Figura 5.6 se puede observar que el número de sitios de unión y/o la
constante de afinidad disminuyen claramente en dichas construcciones en
tándem.
185
Tabla 5.3. Parámetros termodinámicos obtenidos a partir de los experimentos de ITC para
la unión del ligando p53bp2 a los dominios WW individuales de hNedd4 y sus
construcciones en tándem, hNedd4 WW1WW2 y hNedd4 WW3WW4, realizados en
fosfato sódico 20 mM pH 7.0 a 25 oC.
Proteína
N
Kd#
(µM)
∆Gap
(kJ/mol)
∆Hap#
(kJ/mol)
-T∆Sap
(kJ/mol)
hNedd4 WW1
1
77.5
-23.5
-47.8
24.3
hNedd4 WW2
1
6.6
-29.6
-53.6
24.0
hNedd4 WW3
1
5.3
-30.1
-53.4
23.8
hNedd4 WW4
1
61.7
-24.0
-45.9
21.9
hNedd4
WW1WW2
1
90.1
-23.1
-47.8
24.7
ΔG1-23.4
ΔH1-28.6
-TΔS1 5.2
Kd180.0
1*
hNedd4
Kd26.5
ΔG2-29.6
ΔH2-56.1
-TΔS2 26.5
1*
WW3WW4
#
Los errores en los parámetros termodinámicos se estiman en torno al 5% para la entalpía
de unión y al 10% para la constante de disociación. * Análisis realizado por ajuste múltiple
a un modelo de dos sitios diferentes e independientes.
El análisis de la isoterma de unión del tándem hNedd4
WW3WW4 con el ligando UGR-1 se ha realizado a partir de un ajuste
múltiple de las isotermas de unión de los dominios individuales hNedd4
WW3 y hNedd4 WW4 y del tándem hNedd4 WW3WW4, suponiendo
que los valores de unión para cada sitio (constante de disociación y
entalpía de unión) fueran los mismos cuando el dominio está aislado o
cuando se encuentra formando el tándem. En la gráfica podemos observar
que el ajuste es bastante bueno y los valores de las constantes de
disociación y entalpía (Tabla 5.4) se comparan razonablemente bien con
los obtenidos con el ajuste simple de los dominios individuales. Estos
resultados indican que el ligando UGR-1 se une a los dominios hNedd4
WW3 y hNedd4 WW4 de forma similar, tanto si se encuentran aislados
como formando el tándem hNedd4 WW3WW4, por lo que la
cooperatividad entre estos dominios es prácticamente inexistente y el
conector entre ellos no influye en la afinidad por el ligando UGR-1. Esto
estaría en concordancia con los datos obtenidos por DSC que indican un
comportamiento independiente para los dominios y similares a los
descritos para el ligando p53bp2.
186
Capítulo 5
Figura 5.7. a) Isoterma de unión del tándem hNedd4 WW3WW4 y los dominios
individuales con el ligando UGR-1. Los datos experimentales se representan como círculos
negros, mientras que la línea continua en el mismo color corresponde a un ajuste múltiple
de esta curva junto a la isoterma de unión del dominio hNedd4 WW3 (en círculos rojos se
representan los datos experimentales de la isoterma de unión y la línea continua en el
mismo color corresponde al ajuste múltiple) y junto a la isoterma de unión del dominio
hNedd4 WW4 cuyos datos experimentales se representan como triángulos azules y en el
mismo color en línea continua se representan los datos para el ajuste múltiple. El
experimento de titulación calorimétrica se ha llevado a cabo a pH 7.0 a 25 ºC.
Para el estudio de interacción del tándem hNedd4 WW1WW2
con UGR-1 se ha procedido a realizar un análisis análogo al descrito para
el tándem hNedd4 WW3WW4. El análisis llevado a cabo con un ajuste
múltiple con los respectivos dominios individuales hNedd4 WW1 y
hNedd4 WW2 indica que no es posible obtener un juego de parámetros
que describan simultáneamente las tres isotermas de unión. De hecho, la
simulación de la isoterma del tándem hNedd4 WW1WW2 usando para
cada uno de los posibles sitios de unión los valores obtenidos para los
dominios individuales (Tabla 5.4), se aleja mucho de la isoterma obtenida
experimentalmente (Figura 5.8).
187
Figura 5.8. Isoterma de unión del tándem hNedd4 WW1WW2 con el ligando UGR-1, los
datos experimentales se representan como círculos negros, mientras que la línea continua en
magenta corresponde al ajuste a un único sitio de unión. La línea continua azul
corresponde a la simulación de la isoterma de unión sumando las isotermas de los dominios
individuales hNedd4 WW1 y hNedd4 WW2. Los datos experimentales se han obtenido en
condiciones de tampón fosfato sódico 20 mM, 25 ºC a pH 7.0.
Si se intenta ajustar la isoterma del tándem al modelo de n sitios
iguales e independientes, se obtiene un buen ajuste para un único sitio de
unión y con una Kd casi idéntica a la del dominio hNedd4 WW1 (Tabla
5.4), aunque la entalpía de unión es muy distinta; estos resultados son
análogos a los obtenidos para el ligando p53bp2. Como se apuntaba
anteriormente, una interpretación plausible sería que en el tándem
hNedd4 WW1WW2 el sitio de unión para el dominio WW2 se encuentre
enmascarado por el dominio WW1 o por el propio conector entre ambos
dominios, ya que por su longitud y por la cantidad de restos cargados que
posee podría estar parcialmente estructurado y con capacidad de
interaccionar con los dominios.
188
Capítulo 5
Tabla 5.4. Parámetros termodinámicos obtenidos a partir de los experimentos de ITC para
la unión del ligando UGR-1 a los dominios WW individuales de hNedd4 y sus
construcciones en tándem, hNedd4 WW1WW2 y hNedd4 WW3WW4, realizados en
fosfato sódico 20 mM pH 7.0 a 25 oC.
Proteína
N
Kd#
(µM)
∆Gap
(kJ/mol)
∆Hap#
(kJ/mol)
-T∆Sap
(kJ/mol)
hNedd4 WW1
1
37.7
-25.1
-59.4
34.3
hNedd4 WW2
1
6.4
-29.7
-79.1
49.4
hNedd4 WW3
1
0.2
-38.9
-99.7
60.8
hNedd4 WW4
1
1.1
-33.9
-86.5
52.6
1
37.9
-25.1
-96.7
71.6
hNedd4
WW1WW2
hNedd4
WW3WW4
Kd10.3 ΔG1-37.3 ΔH1-94.4 -TΔS157.1
1*
1*
Kd21.2 ΔG2-33.7 ΔH2-81.8 -TΔS248.1
#
Los errores en los parámetros termodinámicos se estiman en torno al 5% para la entalpía
de unión y al 10% para la constante de disociación. *Análisis realizado por ajuste múltiple
para dos sitios distintos e independientes
Como en el caso del ligando p53bp2, la complejidad de las
construcciones
hNedd4
WW2WW3WW4
y
hNedd4
WW1WW2WW3WW4, hace que los ajustes de las isotermas
experimentales no sean fiables ya que implicarían demasiados parámetros
a ajustar para la información que contienen dichas isotermas. Lo que sí
hemos podido realizar, al igual que en el caso de los tándem anteriores, es
la simulación de las isotermas que se obtienen para cada tándem
suponiendo que los sitios de unión tienen los mismos valores que cuando
los dominios se encuentran aislados. Si se observan estas simulaciones,
para el caso del tándem hNedd4 WW2WW3WW4 (Figura 5.9, Panel a),
la simulación se ajusta bastante bien a la isoterma experimental en la parte
correspondiente a altas relaciones de concentración ligando/proteína,
pero es incapaz de reproducir los datos a bajas relaciones. Por tanto,
podríamos suponer que en presencia del dominio WW2 realiza algún tipo
de interacción cuando se encuentra formando el tándem
WW2WW3WW4.
Para
el
caso
de
la
construcción
hNedd4
WW1WWW2WW3WW4, la simulación correspondiente (Figura 5.9
Panel b), se aleja mucho más de la isoterma de unión obtenida
experimentalmente, por lo que podríamos suponer que se están llevando a
189
cabo interacciones más complejas cuando el ligando UGR-1 se une a
hNedd4 WW1WW2WW3WW4. Hay que recordar que ya se apuntaba
un efecto importante en al unión del ligando para la construcción del
tándem hNedd4 WW1WW2.
Es conveniente recordar que estos efectos sinérgicos en la afinidad
de unión no se han observado en la estabilidad estructural (analizada por
DSC), lo que indica que los efectos contextuales en la afinidad de unión
no están asociados a modulaciones del equilibrio conformacional
intrínseco de los dominios pudiendo tener su origen en otro tipo de efectos
que podrían estar relacionados, o bien con la disposición de los dominios
en el tándem, que podrían estar ocultando algunos sitios de unión, o bien
con posibles interacciones con las secuencias de conexión. Esta es una
posibilidad que no debe descartarse considerando la longitud y elevado
contenido en aminoácidos cargados de la secuencia de conexión entre los
dominios WW1 y WW2.
Figura 5.9. a) Comparación de las isotermas de unión correspondientes al experimento de
titulación de la construcción hNedd4 WW2WW3WW4 con el ligando UGR-1 (círculos
cerrados) junto con la simulación de la isoterma de unión para tres sitios distintos e
independientes, cada uno de ellos con los parámetros termodinámicos obtenidos en los
ajustres simples de cada uno de los tres dominios individuales con el ligando UGR-1 (línea
azul). b) Comparación de las isotermas de unión correspondientes al experimento de
titulación de la construcción hNedd4 WW1WW2WW3WW4 con el ligando UGR-1
(círculos cerrados) junto con la simulación de la isoterma de unión para cuatro sitios
distintos e independientes, cada uno de ellos con los parámetros termodinámicos obtenidos
en los ajustes simples de cada uno de los cuatro dominios individuales con el ligando UGR1 (línea magenta). Los datos de ITC se han obtenido en condiciones de tampón fosfato
sódico, 20 mM a pH 7.0.
En este sentido, es de gran interés obtener la estructura
cristalográfica de estas cuatro construcciones unidas a los ligandos p53bp2
y UGR-1 para conocer el tipo de interacciones que se están dando y
conocer el papel funcional que tiene el dominio WW1 cuando se
encuentra formando un tándem con el resto de dominios WW. Estos
190
Capítulo 5
estudios con el ligando UGR-1 se están llevando a cabo en el laboratorio
de la Dr. Ana Cámara, en la Universidad de Almería.
5.3. Conclusiones
De la caracterización del equilibrio conformacional de las
construcciones en tándem de los dominios WW de hNedd4 y del análisis
termodinámico de la unión de diferentes ligandos a estos dominios,
podemos extraer las siguientes conclusiones:
1. La baja estabilidad conformacional de los dominios WW cuando se
encuentran aislados no se ve prácticamente alterada mediante efectos
cooperativos por la presencia de distintos dominios en una misma
construcción en tándem.
2. La afinidad del ligando Ébola A es similar para los dominios hNedd4
WW3 y hNedd4 WW4 y bastante inferior para los dominios hNedd4
WW1 y hNedd4 WW2. Esto indica que el ligando Ébola A sigue
manteniendo un elevado nivel de especificidad. Un efecto muy similar
ocurre para el ligando de alta afinidad UGR-1
3. La elevada afinidad del ligando UGR-1 para los dominios hNedd4
WW3 y hNedd4 WW4 con respecto al ligando p53bp2 se debe a un
aumento considerable en el componente entálpico de la unión,
indicando que el número de interacciones entre el ligando UGR-1 y
ambos dominios es mayor que para el ligando p53bp2.
4. La elevada afinidad (y especificidad) del ligando UGR-1 para los
dominios hNedd4 WW3 y hNedd4 WW4 no se ve afectada cuando
estos dominios forman tándem.
5. La presencia del dominio hNedd4 WW1 en las construcciones en
tándem altera significativamente la afinidad de los restantes dominios
tanto en la unión del ligando p53bp2 como en la unión del ligando
UGR-1.
191
Capítulo 6
Resumen y conclusiones
Capítulo 6
CAPÍTULO 6.- RESUMEN Y CONCLUSIONES
6.1. Resumen
El reconocimiento de secuencias ricas en prolina a través de
interacciones proteína-proteína es clave para el correcto funcionamiento
celular. Debido a la relación de estas interacciones con el desarrollo de
importantes enfermedades humanas, los módulos de reconocimiento de
secuencias ricas en prolina (MPR), están considerados como atractivas
dianas para el diseño de fármacos. Un diseño eficiente y racional requiere
de una profunda comprensión tanto de la naturaleza de estas
interacciones como de su efecto en el equilibrio conformacional, así como
de la cooperatividad estructural del dominio y la influencia de elementos
adicionales en la proteína.
El primer objetivo dentro del trabajo de esta tesis ha estado
centrado en el análisis de las bases moleculares de la comunicación
intramolecular en el dominio SH3 de cSrc. Diferentes estudios
experimentales y teóricos han demostrado que la unión de un ligando
provoca una transmisión de información que es propagada a través de
cambios alostéricos hacia regiones distantes del sitio de unión de la
proteína. La identificación de los residuos relacionados con esta
transmisión de información presenta una gran importancia a la hora del
desarrollo de dianas terapéuticas. El Dr. Tom Lenaerts, de la Universidad
Libre de Bruselas, ha desarrollado un método computacional de análisis
con el cual, haciendo uso de la teoría de la información, se puede
identificar y predecir la red de transmisión de información en la proteína.
En nuestro grupo de investigación hemos validado experimentalmente
este método llevando a cabo un estudio de 15 mutantes, haciendo uso de
la Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) y la Calorimetría Isotérmica
de Titulación (ITC) para determinar el efecto de estas mutaciones en la
estabilidad y la energética de unión. A través de este análisis hemos
identificado un grupo de residuos los cuales están implicados en la
transmisión de información desde el sitio de unión hacia otras regiones
del dominio. Cada uno de estos residuos pueden ser clasificados en dos
grupos: un grupo que influye en la estabilidad de la proteína y otro grupo
que tiene efectos en la afinidad de unión, que se reflejan en una
modulación funcional de la proteína.
La regulación de las señales enzimáticas a menudo se encuentra
mediada por dominios modulares como los dominios SH2 y SH3. El
segundo objetivo abordado en esta tesis ha sido investigar la influencia del
tándem SH3SH2 en la regulación de la quinasa de tirosina cAbl. Los
dominios SH3 y SH2 mantienen a Abl en su conformación inactiva a
través de su ensamblaje con el dominio catalítico. A través de técnicas
experimentales como DSC, técnicas de dinámica molecular y
195
metadinámica, hemos estudiado los factores que influyen en la regulación
de cAbl a través del tándem de dominios SH3-SH2. Nuestros resultados
indican que el tándem Abl SH3SH2 se encuentra en equilibrio entre dos
estados que corresponden a la estructura de la enzima autoinhibida y otra
configuración que es consistente con los datos que existen para la forma
activa. Al comprobar el efecto del conector entre el dominio quinasa y el
dominio SH2 (C2Q) en el equilibrio conformacional del tándem SH3SH2,
tanto los datos experimentales como los computacionales, indican que la
presencia de este conector tiene un efecto muy significativo en el
comportamiento del tándem, acoplando el desplegamiento de los dos
dominios de un modo completamente cooperativo. También hemos
comprobado que el conector entre los dominios SH3 y SH2 tiene un papel
determinante en el equilibrio conformacional de Abl, ya que mutaciones
en este conector provocan el desacoplamiento entre C2Q y el dominio
SH3. Estos resultados proporcionan información importante de la
relación del conector C2Q y el conector entre los dominios SH3 y SH2
con la regulación de Abl.
El último objetivo de esta tesis ha sido investigar la influencia de
elementos adicionales de la proteína en el equilibrio conformacional de
los dominios WW de hNedd4, por lo que se ha estudiado el equilibrio
conformacional y la interacción con ligandos de los cuatro dominios WW
de esta proteína, tanto aislados como en diferentes construcciones en
tándem, evaluando el impacto de la presencia simultánea de varios
dominios WW, y de las secuencias conectoras entre ellos. Para evaluar el
impacto de dominios adicionales en la energética de unión, hemos
realizado diferentes experimentos de ITC en los que hemos estudiado la
unión entre los péptidos Ébola A, p53bp2 y UGR-1 y las construcciones
hNedd4 WW3WW4, hNedd4 WW1WW2, hNedd4 WW2WW3WW4 y
hNedd4 WW1WW2WW3WW4. Además, hemos investigado la
existencia de cooperatividad estructural entre los diferentes dominios
WW de hNedd4 a través de experimentos de DSC de las construcciones
en tándem mencionadas anteriormente. Se ha observado que ni la
presencia simultánea de distintos dominios WW ni de sus respectivos
conectores en las construcciones en tándem producen un efecto
significativo en el equilibrio conformacional de los dominios que, en el
contexto de las construcciones en tándem, mantienen la baja estabilidad y
cooperatividad estructural que presentan los dominios WW de forma
aislada. En cuanto a efectos en la energética de unión se ha demostrado
que los efectos cooperativos son nulos en el caso del tándem hNedd4
WW3WW4 con el ligando UGR-1 y p53bp2. No obstante, la presencia
del dominio WW1 produce cambios significativos en el comportamiento
de los tándem, indicando que o bien el propio dominio o bien la secuencia
de conexión pudiera estar bloqueando la unión a los demás dominios.
Capítulo 6
6.2. Conclusiones
Del trabajo desarrollado en esta Tesis Doctoral se pueden realizar las
siguientes conclusiones generales:
1. Hemos identificado un grupo de residuos aminoacídicos que se
encuentran involucrados en la transmisión intramolecular de efectos
cooperativos al producirse la unión de un ligando al dominio SH3 de
Src. Esta transmisión se realiza desde el sitio de unión hasta zonas del
dominio muy alejadas del sitio de unión. El efecto de estos residuos se
produce bien en la estabilidad del dominio o bien en la propia afinidad
del dominio por el ligando, afectando a la función. El grupo de
residuos identificados en la transmisión intramolecular de
información para el dominio SH3 de cSrc puede ser bastante
conservativo entre dominios SH3 homólogos.
2. Hemos puesto de manifiesto la existencia de efectos cooperativos
entre los dominios SH3 y SH2 de la quinasa de cAbl mediados por sus
conectores, y la repercusión de éstas en la función quinasa de esta
proteína.
a. Así, la presencia del conector C2Q en la construcción en
tándem cAblSH3SH2 produce un fuerte acoplamiento entre
los dos dominios que presentan un desplegamiento altamente
cooperativo.
b. Mediante mutaciones en la secuencia conectora entre los
dominios SH3 y SH2 se ha determinado que este conector
juega un papel muy importante en la configuración del espacio
conformacional del tándem; de hecho, las mutaciones
estudiadas producen una eliminación de la cooperatividad de
desplegamiento causada por el conector C2Q.
3. La presencia simultánea de distintos dominios WW de hNedd4 y de
sus respectivos conectores en una misma construcción en tándem no
afecta significativamente la baja estabilidad estructural que presentan
los mismos dominios WW de forma aislada. Desde el punto de vista
estructural prácticamente no existe cooperatividad entre dichos
dominios. No obstante, la presencia del dominio hNedd4 WW1 en
tándem induce efectos importantes en el reconocimiento de los
ligandos estudiados, posiblemente asociados al bloqueo de alguno de
197
los sitios de unión, bien por el propio dominio o bien por la secuencia
de conexión WW1-WW2.
Chapter 6
Summary and conclusions
SUMMARY
Chapter 6
CHAPTER 6.- SUMMARY AND CONCLUSSIONS
6.1. Summary
The recognition of proline-rich sequences by protein-protein
interaction modules is key for the correct functioning of the cell. Because
of the implication of these interactions in the development of important
human diseases, proline-rich recognition modules (PRM) are considered
as attractive targets for drug design, so that inhibitors of their interactions
could have high potential as therapeutic agents. Efficient rational design
requires a deep understanding of the nature of the interactions themselves,
of their effect on the conformational equilibrium and structural
cooperativity of the domain and of the influence of additional elements in
the protein.
The first aim in this Thesis project has been the analysis of
molecular basis of the intramolecular communication in the cSrc SH3
domain. Different experimental and theoretical studies have shown that
ligand binding information may be propagated by allosteric changes to
distal regions within and between protein domains, leading recently to the
sequence-based identification of protein sectors as novel evolutionary
units. The precise identification of the residues involved in the process has
gained importance. Professor Tom Lenaerts from Free University of
Brussels, has developed a biocomputational analysis for the identification
and prediction of the information network in small protein domains based
on information theory. This approach has been applied to the cSrc-SH3
domain. We have validated his predictions, performing a thermodynamic
study of a set of 15 mutants using Differential Scanning Calorimetry
(DSC) and Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to determine the effect
of a number of selected mutants on the stability and/or binding affinity of
the domain. Through this analysis we have identified a dynamical pattern,
consisting of a limited number of residues, which are implicated in the
transduction of information from the binding site to other regions in the
domain. The predicted residues can be categorized into two subgroups:
one subgroup having stability implications and another with effects in
binding affinity, which is reflected in the protein functional modulation.
The regulation of signaling enzymes is often mediated by
accessory modular domains, such as SH2 and SH3 domains. The second
aim of this thesis has been to investigate the influence of SH3SH2 tandem
in the regulation of Abl tyrosine kinase. SH3 and SH2 domains inhibit
Abl by assembling onto the catalytic domain, allosterically clamping it in
an inactive state. We have used Differential Scanning Calorimetry (DSC),
molecular dynamics and microsecond all-atom simulations to study the
determining factors of a necessary step in the assembly of the
203
autoinhibited form of Abl. Our results indicate that the Abl SH3SH2
tandem is a two-state switch, alternating between the conformation
observed in the structure of the autoinhibited enzyme, and another
configuration that is consistent with existing scattering data for an
activated form. Experimental and computational data indicate that the
presence of the SH2-Kinase linker has a profound effect on the behaviour
of the tandem, coupling the unfolding of the two domains in a fully
cooperative manner. We also show that the SH3SH2 connector plays a
determinant role in the assembly equilibrium of Abl, since mutations
thereof hinder the engagement of the SH2-kinase linker and SH3 domain.
These results provide a thermodynamic rationale for the involvement of
linker and SH3SH2 connector in Abl regulation.
Finally, the last goal of this project has been to investigate the
influence of additional elements of the protein on the conformational
equilibrium of the WW domains of hNedd4, studying the conformational
equilibrium and binding energetics to different peptides of the four WW
domains in this protein, both isolated and in the context of different
tandem constructs, evaluating the impact of the presence of several WW
domains and linker sequences. We have measured by ITC the binding
energetics of different peptide ligands such as Ebola A, p53bp2 and the
ligand UGR-1, to the individual domains and to the hNedd4 WW3WW4,
the hNedd4 WW1WW2, the hNedd4 WW2WW3WW4 and the hNedd4
WW1WW2WW3WW4 tandem constructs. Moreover, we tackled the
analysis of the conformational equilibrium of the different constructs by
DSC. We have found that the presence of different WW domains and
their linkers does not contribute to the stabilization to the isolated
domains. Regarding the effects of the tandem configuration on the
binding energetics, we have not found any cooperative effects for the
hNedd4 WW3WW4, neither with UGR-1 nor with p53bp2. Nonetheless
the presence of hNedd4 WW1 domain does produce significant changes
in binding energetics of these ligands to the tandem, indicating that the
WW1 domain or the WW1-WW2 conection linker could be blocking the
binding to others domains.
6.2. Conclusions
From the study carried out in this Thesis project we can conclude:
1.
204
We have identified a number of residues, which are implicated in the
transduction of cooperative intramolecular effects when a peptide is
bound to Src-SH3 domain. This transduction is performed from the
binding site to other regions in the domain. The effect of these
residues has influence in the stability of the domain or in the binding
Chapter 6
energetic, affecting the function. The group of residues identified in
cSrc-SH3 domain can be quite preserved in homologous domains.
2.
3.
We have confirmed the existence of cooperative effects between cAbl
SH3 and SH2 domains through their linkers and the influence in the
kinase function.
a.
The presence of the C2Q linker in cAbl SH3SH2 tandem has
a profound effect on its conformational properties, coupling
the unfolding of the SH3 and SH2 domains in a highly
cooperative manner.
b.
Mutations in SH3-SH2 connector have shown that this linker
have an important role in the configuration of conformational
equilibrium of tandem; in fact, these mutations reverse the
cooperative unfolding induced by C2Q linker.
The low structural stability of isolated WW domains is not
compensated by the presence of other domains in tandem. From a
structural point of view no cooperativity exists between these
domains. Nevertheless, the presence of hNedd4 WW1 domain in
tamdem has important effects in the ligand binding, probably
associated to the blockage of some of the binding sites, either by the
WW1 domain itself or the linker sequence WW1-WW2
205
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228
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combining allosteric with ATP-binding-site inhibitors." Nature
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229
APÉNDICE
Apéndice
APÉNDICE
APÉNDICE I. Cálculo de errores para los experimentos de ITC y
DSC
•
DSC
(I.I)
(I.II)
(I.III)
(I.IV)
(I.V)
•
ITC
(I.VI)
(I.VII)
(I.VIII)
(I.IX)
(I.X)
233
Apéndice
APÉNDICE II. Modelos termodinámicos para el estudio de la
interacción del tándem cAblSH3SH2 y cAblSH3SH2-C2Q
• MODELO 1.- No existe cooperatividad entre ambos dominios, es decir,
el conector C2Q interacciona con el dominio SH3 independientemente
del estado de plegamiento del dominio SH2.
Variable independiente: x (temperatura experimental, en ºC)
Variable dependiente: y
(capacidad calorífica experimental, en kJ·K-1·mol-1)
Parámetros ajustables:
Tm0U2, Tm0U3 (temperaturas de transición para los estados U2 y U3, en ºC)
HmU2, HmU3
(diferencia de entalpía a la temperatura de transición para los
estados U2 y U3, en kJ·mol-1)
DCpU2,DCpU3 (diferencia de capacidad calorífica para los estados U2 y U3,
en kJ·K-1·mol-1). Se suponen constantes con la temperatura.
DGcd
(diferencia de energía de Gibbs a la temperatura de
referencia,Tr, de 298.15 Kelvin para el estado cd, en kJ·mol-1). DHcd y DCpcd se
suponen nulas.
DGc2q_ab
(diferencia de energía de Gibbs a la temperatura de
referencia,Tr, de 298.15 Kelvin para el estado c2q_ab, en kJ·mol-1). DHc2q_ab y
DCpc2q_ab se suponen nulas.
DGc2q_cd
(diferencia de energía de Gibbs a la temperatura de
referencia,Tr, de 298.15 Kelvin para el estado c2q_cd, en kJ·mol-1). DHc2q_cd y
DCpc2q_cd se suponen nulas.
DGc2q_pd
(diferencia de energía de Gibbs a la temperatura de
referencia,Tr, de 298.15 Kelvin para el estado c2q_pd, en kJ·mol-1). DHc2q_cd y
DCpc2q_cd se suponen nulas.
Desarrollo ecuaciones:
235
R=0.0083143
(constante de los gases en kJ·K-1·mol-1)
T=x+273.15
(conversión de la temperatura experimental de ºC a Kelvin)
Tr=298.15
(temperatura de referencia en Kelvin)
TmU2=Tm0U2+273.15
(conversión de las Tm0U2 y Tm0U3 de ºC a
Kelvin)
TmU3=Tm0U3+273.15
DHU2=HmU2+DCpU2*(T-TmU2)
(diferencia de entalpía para los
estados U2 y U3)
DHU3=HmU3+DCpU3*(T-TmU3)
DSU2=(HmU2/Tm2)+DCpU2*ln(T/TmU2) (diferencia de entropía para U2 y
U3)
DSU3=(HmU3/TmU3)+DCpU3*ln(T/TmU3)
DGU2=DHU2-T*DSU2
(diferencia de energía de Gibbs para U2 y U3)
DGU3=DHU3-T*DSU3
KU2=exp(-DGU2/(R*T))
(constante de equilibrio para U2 y U3)
KU3=exp(-DGU3/(R*T))
Kcd=exp(-DGcd/(R*Tr))
(constante de equilibrio para el estado cd)
Kc2q_ab =exp(-DGc2q_ab /(R*Tr))
(constante de equilibrio para el
estado c2q_ab)
Kc2q_cd =exp(-DGc2q_cd /(R*Tr))
(constante de equilibrio para el
estado c2q_cd)
Kc2q_pd =exp(-DGc2q_pd /(R*Tr))
(constante de equilibrio para el
estado c2q_pd)
(Función de partición)
Q=1+Kcd+Kc2q_ab+Kcd*Kc2q_cd+KU2*Kc2q_pd+KU2+KU3+KU2*KU3
(Derivada de la función de partición con respecto T)
DQ={Kcd*DHcd*(1+Kc2q_cd)+Kc2q_cd*Kcd*DHc2q_cd+DHc2q_ab*Kc2q_a
b+KU2*DHU2*(1+KU3)+KU3*DHU3*(1+KU2)+KU2*Kc2q_pd*(DHU2+D
Hc2q_pd)}/(R*T*T)
DQc=DQ*(R*T*T)
(Fracción molar, población, de cada estado y su derivada con respecto a la
temperatura)
Pcd=Kcd/Q
DPcd=(Kcd*(DHcd*Q-DQc))/(R*T^2*Q^2)
Pc2q_ab=(Kc2q_ab)/Q
DPc2q_ab=(Kc2q_ab*(DHc2q_ab*QDQc))/(R*T^2*Q^2)
Pc2q_cd=(Kcd*Kc2q_cd)/Q DPc2q_cd=(Kcd*Kc2q_cd*((DHcd+DHc2q_cd)*QDQc))/(R*T^2*Q^2)
Pc2q_pd=(KU2*Kc2q_pd)/Q DPc2q_cd=(KU2*Kc2q_pd*((DHU2+DHc2q_pd)*QDQc))/(R*T^2*Q^2)
PU2=KU2/Q
DPU2=(KU2*(DHU2*Q-DQc))/(R*T^2*Q^2)
PU3=KU3/Q
DPU3=(KU3*(DHU3*Q-DQc))/(R*T^2*Q^2)
PU2U3=(KU2*KU3)/Q
DPU2U3=(KU2*KU3*((DHU2+DHU3)*QDQc))/(R*T^2*Q^2)
(capacidad calorífica intrínseca)
Cpint=DCpU2*(PU2+Pc2q_pd)+DCpU3*PU3+(DCpU2+DCpU3)*PU2U3
236
Apéndice
(capacidad calorífica extrínseca)
Cpex=DHcd*DPcd+DHc2q_ab*DPc2q_ab+(DHcd+DHc2q_cd)*DPc2q_cd+D
HU2*DPU2+(DHc2q_pd+DHU2)*DPc2q_pd+DHU3*DPU3+(DHU2+DHU3)
*DPU2U3
y=Cpint+Cpex
***
•
(ajuste a Cp experimental)
MODELO 2.- Existe una completa cooperatividad en el
desplegamiento del tándem SH3SH2 cuando el conector C2Q está
unido, es decir, los estados parcialmente desplegados no están
poblados cuando está unido el conector.
Variable independiente: x (temperatura experimental, en ºC)
Variable dependiente: y
(capacidad calorífica experimental, en kJ·K-1·mol-1)
Parámetros ajustables:
Tm0U2, Tm0U3 (temperaturas de transición para los estados U2 y U3, en ºC)
HmU2, HmU3
(diferencia de entalpía a la temperatura de transición para los
estados U2 y U3, en kJ·mol-1)
DCpU2,DCpU3 (diferencia de capacidad calorífica para los estados U2 y U3,
en kJ·K-1·mol-1). Se suponen constantes con la temperatura.
DGcd
(diferencia de energía de Gibbs a la temperatura de referencia,Tr,
de 298.15 Kelvin para el estado cd, en kJ·mol-1). DHcd y DCpcd se suponen
nulas.
DGc2q_ab
(diferencia de energía de Gibbs a la temperatura de referencia,Tr,
de 298.15 Kelvin para el estado c2q_ab, en kJ·mol-1). DHc2q_ab y DCpc2q_ab se
suponen nulas.
DGc2q_cd
(diferencia de energía de Gibbs a la temperatura de referencia,Tr,
de 298.15 Kelvin para el estado c2q_cd, en kJ·mol-1). DHc2q_cd y DCpc2q_cd se
suponen nulas.
Desarrollo ecuaciones:
R=0.0083143
(constante de los gases en kJ·K-1·mol-1)
T=x+273.15
(conversión de la temperatura experimental de
ºC a Kelvin)
Tr=298.15
(temperaturA de referencia en Kelvin)
TmU2=Tm0U2+273.15
(conversión de las Tm0U2 y Tm0U3 de ºC a
Kelvin)
TmU3=Tm0U3+273.15
DHU2=HmU2+DCpU2*(T-TmU2)
(diferencia de entalpía para los
estados U2 y U3)
DHU3=HmU3+DCpU3*(T-TmU3)
DSU2=(HmU2/Tm2)+DCpU2*ln(T/TmU2) (diferencia de entropía para U2 y
U3)
DSU3=(HmU3/TmU3)+DCpU3*ln(T/TmU3)
237
DGU2=DHU2-T*DSU2
DGU3=DHU3-T*DSU3
KU2=exp(-DGU2/(R*T))
KU3=exp(-DGU3/(R*T))
(diferencia de energía de Gibbs para U2 y U3)
Kcd=exp(-DGcd/(R*Tr))
Kc2q_ab =exp(-DGc2q_ab /(R*Tr))
estado c2q_ab)
Kc2q_cd =exp(-DGc2q_cd /(R*Tr))
estado c2q_cd)
(constante de equilibrio para U2 y U3)
(constante de equilibrio para el estado cd)
(constante de equilibrio para el
(constante de equilibrio para el
(Función de partición)
Q=1+Kcd+Kc2q_ab+Kcd*Kc2q_cd + KU2*KU3
(Derivada de la función de partición con respecto T)
DQ={Kcd*DHcd*(1+Kc2q_cd)+Kc2q_ab*DHc2q_ab+DHc2q_cd*Kc2q_cd*Kc
d+
+KU2* KU3*(DHU2+DHU3)}/(R*T*T)
DQc=DQ*(R*T*T)
(Fracción molar, población, de cada estado y su derivada con respecto a la
temperatura)
Pcd=Kcd/Q
DPcd=(Kcd*(DHcd*Q-DQc))/(R*T^2*Q^2)
Pc2q_ab=(Kc2q_ab)/Q
DPc2q_ab=(Kc2q_ab*(DHc2q_ab*QDQc))/(R*T^2*Q^2)
Pc2q_cd=(Kcd*Kc2q_cd)/Q DPc2q_cd=(Kcd*Kc2q_cd*((DHcd+DHc2q_cd)*QDQc))/(R*T^2*Q^2)
PU2U3=(KU2*KU3)/Q
DPU2U3=(KU2*KU3*((DHU2+DHU3)*QDQc))/(R*T^2*Q^2)
(capacidad calorífica intrínseca)
Cpint=(DCpU2+DCpU3)*PU2U3
(capacidad calorífica extrínseca)
Cpex=DHcd*DPcd+DHc2q_ab*DPc2q_ab+(DHcd+DHc2q_cd)*DPc2q_cd+(D
HU2+DHU3)*DPU2U3
y=Cpint+Cpex
***
238
(ajuste a Cp experimental)
FEBS Letters 586 (2012) 2619–2630
journal homepage: www.FEBSLetters.org
Review
Interfacial water molecules in SH3 interactions: Getting the full picture
on polyproline recognition by protein–protein interaction domains
Ana Zafra-Ruano, Irene Luque ⇑
Department of Physical Chemistry and Institute of Biotechnology, Faculty of Sciences, University of Granada, 18071 Granada, Spain
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 23 March 2012
Revised 27 April 2012
Accepted 30 April 2012
Available online 11 May 2012
Edited by Marius Sudol, Gianni Cesareni,
Giulio Superti-Furga and Wilhelm Just
Keywords:
SH3 domain
Proline-rich ligand recognition
Water-mediated interaction
Protein–protein interaction module
a b s t r a c t
The recognition of proline-rich sequences by protein–protein interaction modules is essential for
many cellular processes. Nonetheless, in spite of the wealth of structural and functional information
collected over the last two decades, polyproline recognition is still not well understood. The patent
inconsistency between the generally accepted description of SH3 interactions, based primarily on
the stacking of hydrophobic surfaces, and their markedly exothermic character is a clear illustration
of the higher complexity of these systems. Here we review the structural and thermodynamic evidence revealing the need for a revision of the current binding paradigm, incomplete and clearly
insufficient for a full understanding of binding affinity and specificity, to include interfacial water
molecules as universal and relevant elements in polyproline recognition.
Ó 2012 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
The establishment of transient protein–protein interactions is
essential for intracellular signaling. A subset of these interactions
are mediated by modular domains [1,2] that recognize short linear
motifs in their targets [3,4]. Contrary to most protein–protein
interactions, implicating large and featureless surfaces with discontinuous binding epitopes, protein interaction modules recognize well defined and continuous sequences that bind to concave
sites in the domain with small interaction surfaces, similar in size
to those of protein enzymes. These properties facilitate the identification of relevant physiological targets and the design of small
size inhibitors [5–7].
An important class of protein-interaction domains is constituted by protein modules recognizing solvent exposed proline-rich
motifs. Amongst all types of short linear motifs, proline-rich sequences are the most widely distributed in the different genomes,
from prokaryotes to eukaryotes [8,9], due, to a great extent, to the
specific properties conferred by the proline amino acid [10–16].
Correspondingly, polyproline-recognition domains (PRD), which
seem to have coevolved with the sequences they recognize [8],
are also the most abundant protein modules in many proteomes
Abbreviations: ITC, isothermal titration calorimetry; Kd, dissociation constant;
SH3, Src homology 3 domain
⇑ Corresponding author. Fax: +34 958 272 879.
E-mail address: [email protected] (I. Luque).
[17,18]. Several families of PRD have been described to date,
including SH3 (Src-homology 3) domains, WW domains (named
after two highly conserved tryptophan residues in the domain),
EVH1
(enabled
vasodilator-stimulated-protein
homology)
domains, GYF domains (so called due to their characteristic
Gly-Tyr-Phe triad) and UEV (ubiquitin E2 variant) domains, together with the protein profilin and the recently identified CAP
(cytoskeleton-associated protein)-Gly domain. A comparative
analysis of the structure, function and ligand recognition properties of the different PRD families can be found in several reviews
[14,17,19–22]. The different PRD families vary in size (ranging between the 35 residues of the WW domains and the 150 residues of
the UEV domains), present different folds and recognize specific
proline-rich ‘‘core motifs’’. In spite of this, they all share a very similar mechanism for proline recognition based on the establishment
of hydrophobic interactions between key proline residues in the ligand and highly conserved hydrophobic pockets in the domain,
leading to a significant level of cross-reactivity within and between
the different PRD families. Nonetheless, because of the central role
that PRD interactions play in the regulation of many cellular processes, including cell growth, differentiation, apoptosis, splicing,
endosomal trafficking or transcription [17,21–23], their interactions with their physiological targets must be specific and well regulated. This apparent paradox between specificity and promiscuity
in polyproline-recognition has been the subject of intense debate
[17–19,21,23–27], highlighting the need for a profound understanding of the molecular basis for binding affinity and specificity
0014-5793/$36.00 Ó 2012 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2012.04.057
2620
A. Zafra-Ruano, I. Luque / FEBS Letters 586 (2012) 2619–2630
in polyproline-recognition. Such detailed knowledge is fundamental for the development of efficient and specific inhibitors of PRD
interactions as potential therapeutic agents and useful tools for
the investigation of cell physiology [22,28].
2. Function and structure of SH3 domains
Among the different PRD, SH3 domains are, by far, the most
abundant in vertebrates (over 300 SH3 domains have been identified in the human proteome [18,29]) and the most extensively
studied [19,30]. SH3 domains are small (about 60 amino acids)
non-catalytic protein modules, found in multi-domain signaling
proteins of different functions and architectures that generally
act as anchor sites for the recruitment of substrates or the formation of supra-molecular complexes. In some cases, these domains
play also an essential role in the regulation of the enzymatic activity of the proteins that contain them through the establishment of
intramolecular interactions with other elements in the molecule
[31,32]. This is the case of the tyrosine kinases of the Src family, involved in carcinogenesis [33]. In addition to cancer, SH3 domains
are associated to other pathologies such as leukemia, Alzheimer
disease, osteoporosis, inflammatory, allergic and asthmatic processes as well as viral infections, including AIDS and hepatitis
C [17,19,21,34,35].
Because of their biological relevance, SH3 domains have been
widely studied, both from structural and functional perspectives.
Today, more than 400 structures of SH3 domains are available
including NMR and X-ray structures of free domains, complexes
and full-length proteins. SH3 domains fold into a common fivestranded b-barrel structure composed of two orthogonal anti-parallel b-sheets (see Fig. 1). The five b-strands are connected by three
loops: a longer one, the –RT loop, which connects strands b1 and
b2 adopting an irregular anti-parallel structure and two shorter
loops, the n-Src and distal loops, connecting strands b2–b3 and
b3–b4 respectively. Additionally, SH3 domains also contain a short
310 helix segment placed between strands b4 and b5 [20,35].
Many efforts have also been devoted to characterizing the stability, conformational equilibrium and folding mechanism of these
domains, which have been shown to fold according to a two-state
model in the absence of intermediates, both in equilibrium and kinetic studies [36,37]. b-Hairpins in the domains play a very relevant role in the determination of the folding mechanism, with
Fig. 1. Structure of SH3 domains. Cartoon representation of the SH3 structure of the
c-Yes SH3 domain (Pdb code: 2hda). The five b strands are shown in yellow, the 310
helix in red and the n-Src, RT and distal loops in green. Conserved aromatic residues
shaping the hydrophobic pockets for proline recognition are shown as sticks.
the folding nucleus being constituted by the distal loop and 310 helix regions [38–41]. In spite of the macroscopic simplicity of the
folding process, NMR H/D exchange experiments have made patent
the statistical nature of the native state conformational ensemble
[42,43], which translates into the existence of regions of high
structural stability (the central portions of the beta strands, the
short 310 helix and the conserved part of the –RT loop) and highly
flexible regions, (n-Src loop and the tip of the –RT loop). According
to this, the SH3 binding site has a dual character, containing regions of high and low structural stability, which facilitates the
transmission of long-range cooperative effects throughout the
structure [44–46], of obvious functional relevance for a protein domain implicated in signal transduction.
Most SH3 domains characterized to date recognize proline-rich
sequences containing a uPpuP motif (where u and p are frequently hydrophobic and proline residues, respectively) [10,20,
25,35]. SH3 ligands bind in a PPII conformation to a flat and hydrophobic surface in the domain consisting of three shallow pockets.
Each of the two uP moieties in the core motif packs tightly into
one hydrophobic pocket, very specific for the recognition of proline
and N-substituted amino acids [47], and formed by highly conserved aromatic residues on the surface of the domain (the two
tyrosine residues in the conserved ALYDY motif at the base of
the –RT loop, the first tryptophan residue of the WW motif at the
boundary between the b3 strand and the n-Src loop, the proline
residue at strand b4 and the tyrosine residue of the SNY motif at
the 310 helix region). Proline staking into these hydrophobic pockets provides the basis for the general recognition of proline-rich sequences. Nonetheless, taking into account the wealth of prolinerich motifs in the proteomes (it has been estimated that about
25% of human proteins contain proline-rich regions [21]), selectivity for proline does not assure specificity between SH3 domains or
other PRD families. In general, binding specificity seems to be
mostly associated to the establishment of additional interactions
between residues flanking the core motif in the ligand and a third
pocket delimited by variable regions of the RT and n-Src loops
[17,20,48,49]. Sequence and conformational variability within
these loops seem to have been exploited by SH3 domains to modulate binding affinity and specificity [25,50–52]. This mechanism
of binding is shared by most PRD families that contain one or
two proline-recognition pockets combined with additional regions
conferring binding specificity. Whether this ‘‘intrinsic’’ specificity
determined by the peptide and domain sequences is enough for
the required in vivo selectivity is under discussion. An additional
level of specificity seems to be conferred by contextual factors,
such as the establishment of tertiary contacts with other elements
in the full-length protein (see [21,23,27] for a review), multidomain binding [31], dimerization [53,54] or cellular co-localization
of proteins [55,56].
The pseudo-symmetry of the PPII conformation allows SH3 ligands to bind in a forward (N-to-C terminal in class I ligands) or reverse (C-to-N terminal in class II ligands) orientation with respect
to the binding site [57]. Even though peptide array screening experiments seem to indicate a general preference for class II ligands
[50], the preferred orientation depends on the characteristics of
the SH3 binding site, being frequently determined by (a) the presence of a basic amino acid, located two residues Nterminal from the uPpuP motif in class I ligands and two residues
C-terminal from the motif in class II ligands, that interacts with an
acidic residue at the RT loop [57,58] and (b) the conformation of a
conserved Trp side chain at the b3 strand in the domain [59]. In fact,
most SH3 ligands identified to date correspond to the consensus sequences fn-R 3p 2u 1P0x1f2P2-fc and fc-R5f4P3u2p1P0w 1-fn for
class I and class II ligands [20,60], respectively. There are other domains, such as Abl–SH3, that interact with ligands containing the
canonical uPpuP motif but lacking positive residues in their se-
A. Zafra-Ruano, I. Luque / FEBS Letters 586 (2012) 2619–2630
quences, which can be considered a second specificity group. Also,
most interestingly, several SH3 domains have been identified that
recognize atypical sequences in their targets (see [21,23] for reviews), including discontinuous epitopes [61–63], slight variations
of the canonical motifs (PxxxPR [64], RKxxYxxY, RxxPxxxP [65]), or
even non-PPII peptides containing the RxxK motif [66,67]. These are
clear examples of how sequence variability within the RT and n-Src
loops, not only allows for a certain level of binding specificity within canonical ligands, but can also be exploited to evolve new binding specificities [17,21,23,26,51].
3. Complexity in polyproline recognition by SH3 domains
During the last two decades a wealth of structural and functional information has been collected for the different PRD families,
especially for SH3 and WW domains, according to their potential as
targets for the development of novel therapeutic agents against a
variety of diseases [22,68,69]. Many efforts have been directed towards the design and identification of high-affinity ligands for SH3
domains [35,70,71] using different strategies, including screening
of libraries of synthetic compounds [28,72,73], phage display techniques [26,74], the use of protein scaffolds to stabilize the PPII conformation [75] and structure-based rational design strategies
directed to optimize peptide sequences [76,77], introduce nonpeptidic elements in the peptide ligands [78–80] or design smallmolecule inhibitors [81,82]. In most cases the results have been
modest, although the use of combinatorial libraries of peptoids,
with synthetic substitutes of key proline residues [47,83,84] and
the combinatorial modification of peptide scaffolds [72,78] have
provided some high-affinity ligands, with dissociation constants
in the nM range. Today, after more than two decades of study,
and in spite of the wealth of structural and functional information
available, the design of high affinity and specificity inhibitors or
modulators of polyproline recognition by SH3 domains or other
PRD families remains quite a challenging task. This is partly due,
as mentioned before, to the delicate balance between promiscuity
and specificity characteristic of these interactions and to the low
binding affinity of most SH3 natural ligands, usually ranging between 1 and 200 lM. These difficulties have been exacerbated by
the lack of a profound and detailed understanding of the forces
driving polyproline recognition.
Traditionally, most identification and optimization strategies
have been directed towards obtaining improvements in the binding affinity of the ligands. This has, indeed, been the case in most
of the above-mentioned works on SH3 domains. However, considering binding affinity, determined by the Gibbs energy of binding
(DG), as the only discriminating parameter in screening procedures
or rational design strategies constitutes a very limited perspective
of the binding process since the Gibbs energy alone does not provide information about the nature and magnitude of the forces
driving the association. This information is, nonetheless, encoded
in the enthalpic and entropic contributions to the binding Gibbs
energy (DG = DH TDS), which arise from different types of interactions and, thus, report on the relative weight of the different
intermolecular forces in a particular binding event [85,86]. Considering that the same binding affinity can arise from many different
combinations of enthalpic (DH) and entropic (DS) contributions,
knowledge of the thermodynamic signature of an interaction (the
proportion in which the binding enthalpy and entropy contribute
to the Gibbs energy) provides a very valuable insight into the
forces governing the binding process [87–89]. Moreover, it is
now well established that incorporating thermodynamic considerations into screening and rational design procedures can contribute to select the best initial leads and devise the best
optimization strategies for the development of the most appropri-
2621
ate ligands in terms of binding affinity, selectivity [90–96] or even
resistance profiles [97,98].
In this sense, the case of SH3 domains has been paradigmatic of
how thermodynamic information can contribute to attain a better
understanding of the binding process. According to the high quality structural information available, the recognition or proline-rich
sequences by SH3 domains has been described as a process based
primarily on the stacking of hydrophobic surfaces in the protein
and ligand, with very few polar interactions. In most complexes,
these are limited to a couple of highly conserved hydrogen bonds
established between the carbonyl oxygens of proline residues in
the ligand and the side chains of two conserved Trp and Tyr residues located at the b3 strand and the 310 helix, respectively, and,
in some cases, to the conserved salt bridge at the specificity pocket.
According to this description, the recognition of proline-rich sequences by SH3 domains would be expected to present a thermodynamic signature dominated by the hydrophobic effect, with the
main driving force being a favorable entropic contribution associated to the increment of the conformational degrees of freedom
of the solvating water molecules that are released into the bulk solvent upon formation of the complex. Correspondingly, the binding
enthalpy would be expected to be unfavorable (positive) or, in an
optimal situation, slightly favorable [89,90]. Nonetheless, all thermodynamic studies of SH3 interactions collected during the last
two decades revealed that the recognition of proline-rich ligands
by these domains is invariably driven by markedly negative (favorable) enthalpic contributions opposed by unfavorable binding
entropies [27,52,67,75,99–108]. This thermodynamic behavior
cannot be rationalized exclusively in terms of direct interactions
between hydrophobic surfaces and, thus, reveals an underlying
complexity in the recognition of proline-rich ligands by SH3 domains, not evident from the interpretation of static three dimensional structures.
Significant efforts have been devoted to deciphering this apparent discrepancy between structure and thermodynamics. These
studies have revealed a highly complex scenario to which several
factors of different nature contribute significantly. In this sense,
several studies have shown that the redistribution of the conformational ensemble of both, peptide and protein, upon formation
of the complex has a significant impact on the binding energetics.
In this way, the calorimetric and structural-thermodynamic analysis of the binding of the Sem-5 SH3 domain to its Sos ligand revealed that the adoption of the PPII conformation by the ligand
upon binding results in unfavorable entropic contributions associated to the reduction in the conformational degrees of freedom of
the ligand and favorable enthalpic effects, estimated to be on the
range of 10 kJ mol 1[99]. Also, the rigidification of the RT and
n-Src loops upon ligand binding and the corresponding reorganization of the intra- and inter-molecular network of hydrogen bond
interactions have been postulated to contribute in a similar manner [43,52,109]. Along these lines, the NMR characterization of ligand binding to the SH3 domain of the Src tyrosine kinase
revealed that the intercalation of the uP moieties from the ligand
in the hydrophobic pockets of the domains results in the disruption
of the intramolecular hydrogen bond network. These alterations
propagate throughout the domain resulting in changes in backbone dynamics that have been postulated to contribute significantly to the exothermic character of the interaction [102,110].
In addition to these conformational effects, the thermodynamic
and structural analysis of several complexes implicating the SH3
domain from the Abl tyrosine kinase brought to light additional effects associated to the presence of interfacial water molecules occluded at the binding site that seem to play a very relevant role in
proline-rich ligand recognition by SH3 domains, highlighting the
need for a revision of the current binding paradigm for these
systems.
2622
A. Zafra-Ruano, I. Luque / FEBS Letters 586 (2012) 2619–2630
4. Interfacial water molecules in Abl–SH3 complexes
The cellular form of the Abelson leukemia virus, c-Abl, is a
tightly regulated tyrosine kinase implicated in the development
of chronic myelogenous leukemia. C-Abl becomes constitutively
activated upon mutation or deletion of the SH3 domains [111].
Moreover, it has been shown that displacement of the SH3 intramolecular interaction with the linker sequence connecting the
SH2 and the kinase domains enhances the inhibitory effect of the
anti-tumor drug Gleevec [112]. Consequently the Abl–SH3 domain
has been targeted for the design of novel ligands of high affinity
and specificity of potential therapeutic applications [76,77]. Starting from the 3BP1 natural ligand (RAPTMPPPLPP), characterized by
a dissociation constant of 34 lM for Abl–SH3 [113], the group of
Luis Serrano was able to derive new ligands with increased affinity
and specificity for the Abl–SH3 domain by rational design strategies. By introducing new favorable interactions with the RT loop,
specific to Abl–SH3, and increasing the tendency of the free peptide to adopt the PPII conformation they arrived to the p40 (APTYSPPPPP) and p41 (APSYSPPPPP) sequences characterized by
2 lM binding affinities and a high selectivity for Abl–SH3 against
Fyn–SH3 [76]. The thermodynamic study of the binding energetics
of the p41 ligand and a set of related peptides to the SH3 domain of
Abl revealed these interactions as a particularly striking example
of the inconsistency existing between the canonical description
of SH3 binding and its thermodynamic signature. In fact, the interactions of p41 related peptides with Abl–SH3 are characterized by
extremely negative binding enthalpies ( 92 kJ mol 1 for p41)
[100], which are notably bigger than the values reported for other
SH3 complexes, typically ranging between 20 and 50 kJ mol 1.
This is particularly striking considering the fact that the p41 peptide
lacks polar or ionizable groups, present in most SH3 ligands in these
thermodynamic studies. The large and negative binding enthalpy is
partially compensated by highly unfavorable entropic contributions, resulting in a binding affinity within the range reported for
other SH3 interactions. This thermodynamic signature cannot be
easily reconciled with the canonical binding mode, especially considering the highly apolar character of the Abl–SH3/p41 binding
interface (2.8 non-polar/polar ratio for the accessible surface area).
In order to understand the molecular basis of the increment in
binding affinity in the p41 optimization process and validate the
design rationale, a detailed thermodynamic study was carried
out with a set of p41 related peptides differing in unique and specific positions in the PPII region [100]. Some of these mutations
implicated solvent exposed residues in the complex [114] not involved in any interactions with the domain, such as Ser5 and
Pro8 in the p41 sequence (see Fig. 2). According to the canonical
binding mode, the replacement of aliphatic residues by proline at
these positions should result in more favorable entropic contributions due to the restrictions imposed on the conformational
ensemble of the free ligand, favoring the adoption of a PPII conformation in the free state. No significant enthalpic effects are to be
expected. This is what has been found in similar situations for
other SH3 complexes [13]. Surprisingly, the analysis of the calorimetric results revealed a very different scenario, unveiling remarkable and surprising effects associated to these substitutions.
Indeed, as expected, the introduction of proline residues at these
positions led to an increase in the binding affinity. Nonetheless,
as illustrated in Fig. 2, this increment was not associated to more
favorable entropic contributions, but to a considerable increment
(up to 15 kJ mol 1) in the negative binding enthalpy, particularly
striking for residues not directly implicated in any interactions
within the complex. Moreover, these effects were also found to
be context-dependent, revealing some level of cooperativity between these two solvent exposed positions.
Indeed, the thermodynamic behavior observed for the Abl–SH3
complexes is a clear indication of the complexity of these interactions to which additional factors, other than the direct interaction
between the ligand and protein surfaces, must be contributing.
With respect to the conformational effects described above, binding studies of a p41-containing miniprotein designed to stabilize
the PPII conformation indicate that, in this particular case, the conformational reorganization of the ligand does not seem to contribute significantly to magnitude of the different thermodynamic
parameters [75]. Interestingly, as illustrated in Fig. 3, inspection
of the crystal structure of the Abl–SH3/p41 complex [114] revealed
the presence of a set of fully buried interfacial water molecules distributed in two distinct hydration regions defined by different
water-coordinating amino acids in the SH3 domains: a) waters
1–3 in Fig. 3 that mediate the interactions between residues in
the n-Src loop and the specificity region of the ligand and b) waters
4 and 5 in Fig. 3 that bridge the interactions between residues
Asn114 and Ser113 in the 310 helix region of the domain and the
PPII region of p41. These residues, which are not in direct contact
with the ligand, define an extended interaction surface characterized by a higher polar character than the canonical binding site,
so that the ratio of apolar to polar surface area drops from 2.8 to
1.7. Interfacial water molecules will serve as adapters that fill
empty spaces and optimize van der Waals interactions, satisfy
the hydrogen bonding potential of the ligand and the binding site
and assist in the dissipation of charges. All these terms might be
expected to contribute favorably to the binding enthalpy
[115,116]. Conversely, fixing a water molecule at the binding interface entails a considerable entropic penalty that counterbalances
these favorable enthalpic effects, so that the impact of buried
water molecules on the Gibbs energy of binding is, often, no more
than modest. These effects are in agreement with the observed
thermodynamic behavior and suggest that interfacial water molecules might be playing a very relevant role in the interaction, contributing significantly to the extremely negative binding enthalpy
of the Abl–SH3/p41 complex.
This hypothesis was confirmed by a structural, thermodynamic
and molecular dynamics study of a set of conservative mutants of
the Abl SH3 domain designed to perturb the water-mediated
hydrogen bond network with a minimum impact on the structural
and conformational properties of the domain. This analysis revealed significant enthalpic effects associated to the mutation of
residues at position 114, at the base of the 310 helix, that coordinate water molecules at hydration sites 4 and 5 without being
implicated in any direct contacts with the peptide ligand. A very
good correlation was found between these enthalpic effects and
the changes induced in the dynamic properties of water molecules
at site 5. From these results, it was possible to tentatively estimate
the contribution to the binding enthalpy of water molecules at this
hydration site to be around 20 kJ mol 1, confirming a very substantial contribution of interfacial water molecules to the strongly
exothermic character of Abl–SH3 interactions [117] and, probably,
to the unexpected cooperative effects associated to the mutation of
solvent exposed residues in the ligand.
In summary, these results demonstrate that the currently accepted binding paradigm is incomplete and does not provide an
adequate description of the binding of Abl–SH3 to the family of
p41 peptides, which interact via two different mechanisms: the
stacking of proline side-chains with the hydrophobic grooves in
the binding site and the establishment of a robust and plastic network of water-mediated hydrogen bonds implicating residues in
the periphery of the canonical binding site. This double binding
mechanism is in better agreement with the thermodynamic behavior of the system and has important implications for molecular
modeling and ligand design.
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2623
Fig. 2. Thermodynamic effects of mutations at solvent exposed positions in p41-related peptides. Thermodynamic cycle summarizing the effects on the thermodynamic
parameters of binding to the Abl–SH3 domain associated to substitutions at positions 5 (blue) and 8 (red) in the ligands. The values associated with the vertical arrows
correspond to the substitutions at position 5 and those associated with the horizontal arrows to the substitutions at position 8. The inset corresponds to the cartoon and
surface representation of the Abl–SH3/p41 complex. P41 ligand is shown as sticks. Mutations sites 5 and 8 are highlighted by blue and red cycles respectively. (Reproduced
with permission from [100]).
Fig. 3. Water-mediated interactions at the Abl–SH3/p41 binding interface. The
structure of the Abl–SH3 domain is shown in a gray cartoon representation.
Residues defining the canonical binding site for polyproline recognition are shown
as gray sticks. The structure of the p41 peptide is shown as cyan sticks. Fully buried
water molecules at the binding interface are shown as green spheres. Peripheral
water-coordinating residues in the 310 and n-Src regions are shown as purple and
dark pink sticks respectively. Water-mediated hydrogen bonds are depicted as
green lines. (Reproduced with permission from [86].)
5. Revision of the general binding paradigm for SH3 domains
Taking into account that all SH3 complexes studied to date
share the same thermodynamic profile, the question arises about
the relevance of the Abl–SH3 dual binding mechanism for other
SH3 domains. In Abl–SH3, the presence of most water molecules
at the binding site is contingent upon ligand binding, being absent
in the structures of free domains, with the exception of water molecules at hydration site 4, at the base of the 310 helix, which is
occupied in all Abl–SH3 structures independently of their ligation
state. Also, the properties of these water molecules, fully buried
and characterized by very high residence times and low B factors,
are not affected by the binding of the ligand. This indicates that
water molecules at this site are structural waters that should be
considered as an integral part of the Abl–SH3 domain. Interestingly, these water molecules are coordinated by the backbone
atoms of highly stable and well conserved residues (see Fig. 3),
suggesting that equivalent water molecules would probably be
found in many other SH3 domains.
Analysis of the SH3 structural database, including close to 100
high resolution crystal structures of SH3 domains from different
proteins including free domains, inter- and intra-molecular complexes with natural ligands, rationally designed and phage-display
peptides as well as full-length target proteins, reveals that this is
indeed the case [118]. As expected from the sequence conservation
of the 310 helix region, water molecules at positions equivalent to
hydration site 4 in Abl–SH3 were found in 77% of all SH3 structures, including complexes and free domains, with properties (solvent accessibility, B factors, and coordination patterns) very
similar, in all cases, to that described for Abl–SH3 (see Fig. 4A, B).
From these observations, it is clear that the water molecule at
the base of the 310 helix is an invariant element in most SH3 domains and seems to be an integral part of the domain structure,
independently of its ligation state. In fact, in the analyzed database,
the absence of this hydration site was generally associated to
anomalous sequences and conformations of SH3 domains and ligands. Consequently, this structural water molecule should be included in binding site descriptions for docking or rational design.
A second structural water molecule, located at the n-Src loop,
was found in about 60% (59% in free domains and 55% in complexes) of all SH3 structures (see Fig. 4C, D). These waters molecules, which are also fully buried and tightly bound, are
implicated in the establishment of an average of 4 hydrogen bonds
with residues within the loop, stabilizing its conformation. In fact,
the presence of these waters has been found to be highly dependent on the length of the loop, being observed in 85% of the structures of n-Src loops between 5 and 8 residues and absent in
structures with shorter or longer loops [118]. Even though, in most
cases, these water molecules are not directly implicated in ligand
recognition, they may play an important indirect role by regulating
the dynamic and conformational properties of the n-Src loop, of
relevance for binding specificity [25,27,52].
Globally, at least one structural water molecule was found in
93% of all free SH3 structures studied. In addition to these
2624
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Fig. 4. Structural water molecules in SH3 domain structures. Cartoon representation of the SH3 domain structures colored in a rainbow scheme. Side chains of residues
constituting the 310 helix hydration site are represented as sticks. Water molecules are depicted as purple non-bonded spheres (A) 310 helix structural waters in free SH3
domains, (B) 310 helix structural waters in SH3 complexes, (C) n-Src loop structural waters in free SH3 domains and (D) n-Src loop structural waters in SH3 complexes.
(Reproduced with permission from [118].)
structural waters, other interfacial water molecules were consistently found in most SH3 complex structures, originating highly
variable hydration patterns. As illustrated in Fig. 5, interfacial
water molecules were found in all analyzed complex structures
distributed throughout the binding interface, mediating the interactions between the ligand and the SH3 domain. As described for
Abl–SH3, water-mediated interactions frequently implicate residues in the periphery of the canonical binding site, different from
those defining the hydrophobic pockets for proline recognition.
This observation underlines the importance of considering interfacial water molecules for a correct definition of the complete SH3
binding interface.
Fig. 5. Cartoon representation of the superposed structures of the SH3 complexes. SH3 domains are colored in a rainbow scheme (blue: N-terminus; red: C-terminus) while
ligands are represented in light pink. Buried interfacial water molecules are shown as purple non-bonded spheres. (Reproduced with permission from [118].)
A. Zafra-Ruano, I. Luque / FEBS Letters 586 (2012) 2619–2630
A third conserved hydration site, equivalent to site 5 in Abl–
SH3, was occupied in approximately one third of the complex
structures. This water molecule, which in the Abl–SH3/p41 complex was found to interact mostly with the ligand through interactions established with the carbonyl oxygens of P6 and p7 in the
peptide, is implicated in an average of 3 hydrogen bonds with
atoms in the protein and ligand and with the structural water molecules at the base of the 310 helix. In this case, a higher variability
exists in the location and interaction pattern of this water molecule
that seems to be dependent mostly on the length of the side chains
at position 114 in the domain and the nature of the central amino
acids in the uPpuP core motif of the ligand. These factors determine whether the hydrogen bonding potential of carboxyl atoms
in the peptide is satisfied by the establishment of direct hydrogen
bonds with the side chains at position 114 in the domain or
through water-mediated interactions [118]. These patterns provide a rationalization for the puzzling thermodynamic results associated to mutations at solvent-exposed positions in the p41 ligand
[100].
In addition to the conserved hydration sites at the polyprolinerecognition region, interfacial water molecules were very frequently observed mediating the interactions between the RT and
n-Src loops and the specificity region of the ligand, giving rise to
highly variable hydration patterns, very dependent on the
sequence of ligands and loops. In general, waters at the RT loop
region were frequently found mediating the interactions between
charged residues in the peptide and the protein. This explains
why no water molecules in the vicinity of the RT loop were observed in the Abl–SH3 complexes. In spite of the high variability
in this region, no significant differences in hydration patterns were
found associated to ligand orientation. Conserved water molecules
in the polyproline recognition region were equally found for class I
and class II ligands and a similar variability in water configurations
was observed for both classes at the specificity region.
In summary, the analysis of the SH3 structural database clearly
shows that the presence of interfacial water molecules is a universal factor in SH3 interactions and, consequently, the dual binding
mechanism described for Abl–SH3, far from being an exception,
is a general feature of these domains. This new description of
SH3 binding is in better agreement with the thermodynamic properties of these systems. In this context, it becomes apparent that
ignoring the role of interfacial water molecules in polyproline recognition by SH3 domains would preclude a full and deep understanding of the molecular basis of binding affinity and specificity.
Consequently, the current description of SH3 complexes needs to
be replaced by a new binding paradigm that incorporates interfacial waters as relevant elements in the mechanism of polyproline
recognition by these domains.
6. Implications for target identification and rational design
This dual binding paradigm opens new perspectives for rational
design and target identification for SH3 domains, since, as it has
been demonstrated in numerous studies, the efficiency of docking
[119–126] or rational design [127–130] procedures can be significantly enhanced if detailed information about of the role and
weight of each water molecule at the binding interface is incorporated into binding site descriptions (see [130,131] for detailed reviews). In this context, important questions arise that would
need to be answered in order to take full advantage of the second
level of interactions provided by the water-mediated hydrogen
bonds in SH3 domains. Is the impact of all interfacial water molecules on the thermodynamic signature of the binding process
equally relevant for all SH3 complexes? What is the actual weight
of these interfacial waters on binding affinity? Do they have a real
2625
impact on SH3 binding specificity? Could new rational design
strategies be devised to improve binding affinity or specificity by
engineering new interactions with interfacial waters of by their
displacement from the binding interface? Should the hydration
profile of a particular domain be considered for docking and ligand
identification protocols? To answer these questions a profound
understanding of the properties and role of each specific water
molecule would be required.
With respect to the binding energetics, it is well established
that the presence of interfacial water molecules will alter the thermodynamic signature of the binding process, resulting in entropic
penalties arising from the reduction in the configurational degrees
of freedom of the occluded water molecules, enthalpic benefits
associated to the establishment of water-mediated hydrogen
bonds and more negative binding heat capacities [132–136]. Nonetheless, to date, estimating the actual contribution of a particular
water molecule to the different thermodynamic parameters remains a considerable challenge. In general, the contribution of each
water molecule would be expected to vary according to its degree
of immobilization and the number and quality of its interactions.
In this sense, theoretical studies applying the theory of inhomogenous fluids predict the entropic cost for water immobilization to
range between 0 and 41 kJ mol 1[137,138]. Also, according to
these studies, the presence of interfacial water molecules always
results in an enthalpic benefit that, in some cases is modest
( 8 kJ mol 1 for a water molecule in the cyclophilin-cyclosporin
A complex [139]), while in others can be very relevant
( 63 kJ mol 1 for a conserved interfacial water in HIV-1 protease
complexes [140]). These theoretical predictions are in good agreement with experimental observations that show a wide spectrum
of entropic and enthalpic effects depending on the specific characteristics of the system. Experimentally, it is observed that the displacement of water molecules from the binding interface, either by
modification of the ligand or mutation of the protein, is associated
to variable entropic benefits combined with enthalpic penalties
that range between 9.5 kJ mol 1 [141] and 30 kJ mol 1 [142]. It is
interesting to point out that the 20 kJ mol 1 estimated to be contributed by the waters at site 5 to the binding enthalpy of p41/Abl–
SH3 [117] falls well within this range.
In spite of the considerable magnitude of the entropic and
enthalpic effects, the net impact of interfacial water molecules on
the binding affinity is not as significant and can be, also, very variable. In this sense, studies carried out with different systems (i.e.
HIV-1 protease [143], scytalone dehydratase [144], OppA peptide
binding protein [145], FK506 binding protein [146], ConA [147],
major urinary protein MUP-1 [142]) reveal that water displacement is sometimes energetically favorable, resulting in improved
binding affinities, and sometimes unfavorable. Moreover, in some
cases, strong enthalpy/entropy compensation dampens all effects,
resulting in very modest or even negligible changes on the binding
affinity. This variability indicates that, in order to efficiently incorporate water-mediated interactions rational design, a good understanding of the properties of the different interfacial waters and
the quality of the interactions they mediate is required. This would
allow us to adequately select which water molecules should be targeted for displacement and which could be considered as good anchor sites for the engineering of new, energetically favorable,
interactions.
Within the last years, several methods have been developed to
easily classify interfacial waters, such as Consolv [148], Waterscore
[149], HINT/RANK [150,151] or GRID [152], which are generally
based on geometrical studies of molecular surfaces, number of
hydrogen bonds, crystallographic B factors and proximity to polar
residues. These type of analysis indicate that the contribution to
the binding Gibbs energy of each water molecule would strongly
depend on its environment, so that tightly bound water molecules
2626
A. Zafra-Ruano, I. Luque / FEBS Letters 586 (2012) 2619–2630
are typically found in polar cavities, fully buried and establishing at
least three hydrogen bonds with the protein and the ligand [153].
Nonetheless, the predictive capacity of these methodologies is still
quite limited. Alternative, more exhaustive and time-consuming
approaches, including free energy calculations such as the double
decoupling method [154,155], or molecular dynamics simulations
can provide a more reliable description of the role of interfacial
waters in a particular system. In this sense, the detailed structural,
thermodynamic and molecular dynamic analysis carried out with
Abl–SH3 complexes provided a very detailed description of the different hydration sites, showing that not all sites at the SH3 interface
are equivalent. This is further sustained by the analysis of the SH3
structural database that confirms the existence of three types of
water molecules in these systems with distinct properties (accessibility, B factors and number of interactions): (a) tightly bound
structural water molecules, conserved in most SH3 structures and
present in free domains as integral part of their structure. These
water molecules do not interact significantly with the ligand; (b)
conserved water molecules in the polyproline region mediating
the interactions with the ligand and characterized by high residence times, such as waters at site 5 in Abl–SH3, which were shown
to interact mostly with the peptide ligands [117] and (c) waters at
the specificity region, more mobile and exposed. Which of these
water molecules should be targeted for rational design?
In general, two different scenarios can be considered to include
interfacial waters in rational design (a) modification of the ligand
to optimize its interactions with interfacial water molecules, aimed
at increasing binding affinity by improving the binding enthalpy or
(b) introduction of new moieties in the ligand that displace binding
site waters present in the free protein or in related complexes, taking advantage of the entropic benefit of releasing a trapped water
molecule. In any case, in order to overcome enthalpy/entropy compensation effects and obtain a net improvement on the binding
affinity, it is important to select carefully the targeted waters. In
the first case, a significant improvement on binding affinity would
only be achieved if the newly engineered interactions can overcome any entropic penalty associated to the additional restrictions
on the configurational degrees of freedom imposed on the water
molecule as well as in the ligand and the protein. These enthalpy/entropy compensation effects can be minimized if the new
interactions are directed against highly structured and stable elements in the binding site [88]. In this sense, the structural water
molecules at the base of the 310 helix, tightly coordinated by backbone atoms of the most structurally stable residues in the domain
[42,45] constitute a good anchor site against which to design new
interactions, i.e. hydrogen bonds, with reduced associated enthalpy–entropy compensation effects, and, thus, with good chances
of leading to significant improvements in binding affinity. On the
contrary, in the second scenario, it is important to select which
water molecules can be easily displaced from the binding interface.
In this sense, water molecules at the polyproline regions (waters at
sites equivalent to position 5 in Abl–SH3) seem to be interacting
predominantly with the ligand with higher conformational flexibility. In this sense, the introduction of new moieties in the ligand to
displace these waters from the binding site and establish interactions with the structural water at the 310 helix could be energetically favorable and lead to improvements on binding affinity. In
any case, the new moieties in the ligand should be carefully design
to establish highly optimized hydrogen bonds in order to compensate for the loss of water-mediated interactions.
In addition to modulate binding affinity, water molecules in
biomolecular interfaces can also play a very relevant role in binding specificity. Because of their small size and their ability to establish multiple hydrogen bonds as donors or acceptors, interfacial
waters are very versatile elements in protein recognition. In some
systems they contribute to narrow binding specificity, as happens
with the recognition of phosphotyrosine peptides by SH2 domains,
where water-mediated hydrogen bonds are essential to maintain
the specificity for a glutamic side chain two positions C-terminal
from the phosphotyrosine residue in the ligands [156]. Nonetheless, in other systems, interfacial waters confer great adaptability
to molecular surfaces allowing a considerable degree of promiscuity in the interactions. The OppA peptide binding protein is a paradigmatic example of this situation. This protein can recognize
oligopeptidic chains between 2 and 5 amino acids independently
of their sequence by combining two levels of interactions: direct,
conserved, interactions between the protein and the backbone of
the peptide ligand and the insertion of the peptide side chains into
hydrophobic pockets that modify their water content depending
on the specific sequence of the ligand. In this way, water molecules
modulate protein binding specificity by occupying in each case
only a few positions from a set of well-defined, highly conserved
and favorable hydration sites at the surface of the protein
[135,157]. This situation is very similar to that observed for SH3
domains. The high variability of hydration patterns found in the
specificity region of SH3 complexes appears to indicate that interfacial water molecules might be acting as adaptors to facilitate the
recognition of diverse sequences, contributing to the versatility
and promiscuity of these domains. Consequently, interfacial waters
seem to be also of great relevance to fully understand binding
specificity and optimize target identification in SH3 domains.
7. Polyproline recognition by other domain families
Even though the structural information available is much more
limited for the other families of polyproline recognition domains,
water mediated interactions were also systematically found in all
high resolution crystal structures available for these systems (13
structures of WW domains from different specificity classes, 6
structures of UEV domains and 10 structures of EVH-1 domains,
including free domains and complexes) [118]. As illustrated in
Fig. 6 for WW and UEV domains, the situation is very similar to
that described for SH3 domains, with some hydration sites corresponding to structural water molecules present and conserved in
free domains and complexes and others being only occupied upon
binding of the ligand. In all cases, as in SH3 domains, these watermediated interactions result in extended binding interfaces with
higher polar character. This is in agreement with the fact that, to
our knowledge, all thermodynamic studies reported for polyproline recognition by PRD reveal a common thermodynamic signature, dominated by favorable enthalpic interactions. It is
interesting to point out that this exothermic character is inherent
of proline-rich motifs, as illustrated by the fact that the binding
of short peptides corresponding to the PPPY core motif for type 1
WW domains is characterized by a binding enthalpy similar to that
found for longer peptides containing charged or polar residues in
their sequences [158]. In any case, to this moment, the structural
information for these systems is insufficient to derive any specific
patterns. Obviously, the actual relevance of this mechanism for all
PRD families will need to be confirmed as the structural and thermodynamic databases increase.
In conclusion, the current evidence indicate that the dual binding mechanism, combining hydrophobic interactions with the
establishment of strong networks of water-mediated hydrogen
bonds, is probably general, not only to SH3 domains, but also to
most families of polyproline recognition modules. This seems to
indicate that the tendency of proline-rich sequences to be highly
hydrated, illustrated by the solid and extensive hydration structure
of the collage triple helices [159,160], has been exploited by nature
to favor the adaptability and plasticity of the different families of
protein modules for the recognition of proline-rich targets. In this
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Fig. 6. Water-mediated interaction patterns in WW and UEV domains. WW and UEV domains are shown in white, ligands are depicted as marine blue sticks and relevant
protein residues are represented as cyan sticks. Interfacial waters are shown as non-bonded spheres (waters in complex structures are colored in blue tones, while waters in
free structures are colored in red, orange, yellow and purple). Hydrogen bonds are depicted as discontinuous lines following the same color scheme. (a) Class IV Pin1–WW
domain, free (1PIN, 2Q5A, 2F21, 2ITK, 1ZCN) and in complex with a phosphoserine peptide. (b) Class I dystrophin–WW domain free (1EG3) and in complex with a bdystroglican peptide (1EG4). (c) Class II FE65–WW domain free (2IDH) and in complex with proline-rich peptide from Mena (2OEI). (d) Tsg101–UEV domain free (3OBS, 2FOR)
and in complex with proline-rich viral late domain sequences (3OBQ, 3OBU, 3OBX). Hydrogen bond patterns common to most structures (including the free domains) are
shown as discontinuous marine blue lines while interactions specific to particular structures are shown in their respective colors. (Reproduced with permission from [118].)
context, understanding the role of interfacial water molecules may
provide important clues for deciphering the specificity versus promiscuity paradox in polyproline recognition.
Acknowledgements
This work was supported by Grants BIO2009-13261-CO2 from
the Spanish Ministry of Science and Innovation, FEDER Funds and
Grant CVI-5915 from the Andalusian Government. Ana Zafra-Ruano is supported by a FPI predoctoral research contract from the
Spanish Ministry of Science and Technology.
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Two-state dynamics of the SH3–SH2 tandem of Abl
kinase and the allosteric role of the N-cap
Carles Corbi-Verge a,1, Fabrizio Marinelli b,1,2, Ana Zafra-Ruano a, Javier Ruiz-Sanz a, Irene Luque a,3,
and José D. Faraldo-Gómez b,2,3
a
Department of Physical Chemistry and Institute of Biotechnology, University of Granada, 18071 Granada, Spain; and bTheoretical Molecular Biophysics
Group, Max Planck Institute of Biophysics, 60438 Frankfurt am Main, Germany
Edited by John Kuriyan, University of California, Berkeley, CA, and approved July 18, 2013 (received for review March 1, 2013)
The regulation and localization of signaling enzymes is often mediated by accessory modular domains, which frequently function in
tandems. The ability of these tandems to adopt multiple conformations is as important for proper regulation as the individual domain
specificity. A paradigmatic example is Abl, a ubiquitous tyrosine kinase of significant pharmacological interest. SH3 and SH2 domains
inhibit Abl by assembling onto the catalytic domain, allosterically
clamping it in an inactive state. We investigate the dynamics of this
SH3–SH2 tandem, using microsecond all-atom simulations and differential scanning calorimetry. Our results indicate that the Abl tandem
is a two-state switch, alternating between the conformation observed in the structure of the autoinhibited enzyme and another
configuration that is consistent with existing scattering data for an
activated form. Intriguingly, we find that the latter is the most
probable when the tandem is disengaged from the catalytic domain. Nevertheless, an amino acid stretch preceding the SH3 domain, the so-called N-cap, reshapes the free-energy landscape of
the tandem and favors the interaction of this domain with the SH2kinase linker, an intermediate step necessary for assembly of the
autoinhibited complex. This allosteric effect arises from interactions
between N-cap and the SH2 domain and SH3–SH2 connector, which
involve a phosphorylation site. We also show that the SH3–SH2
connector plays a determinant role in the assembly equilibrium of
Abl, because mutations thereof hinder the engagement of the
SH2-kinase linker. These results provide a thermodynamic rationale for the involvement of N-cap and SH3–SH2 connector in Abl
regulation and expand our understanding of the principles of
modular domain organization.
|
the catalytic domain, which binds and cleaves ATP, and mediates
tyrosine phosphorylation in protein targets. Additional elements
in Abl are not conserved in Src or Tec and vary among isoforms.
The Abl-1b splice variant, which is our focus, features a long,
seemingly unstructured N-terminal extension preceding the SH3
domain, known as the N-cap, which becomes myristoylated posttranslationally. Following the catalytic domain is another long
stretch, containing various sequence motifs for DNA or cytoskeleton recognition, among others.
The SH3 and SH2 domains not only function as interaction
modules, but also as allosteric inhibitors of the catalytic domain.
In autoinhibited Abl, the three domains are assembled into a
compact arrangement, in which the SH3–SH2 tandem appears to
mechanically clamp the N- and C-lobes of the catalytic domain in
an inactive configuration (Fig. 1A) (6, 7), without directly occluding the active site. The domain-domain linkers appear to be
key elements in this assembly. The SH2 domain docks directly
onto the C-lobe of the catalytic domain, whereas its linker to the
N-lobe engages the SH3 domain. Simultaneously, the portion of
N-cap most proximal to the SH3 domain binds to the short SH3–
SH2 connector, while the myristoyl group, at the very N terminus, inserts itself into a hydrophobic cavity within the C-lobe of
the catalytic domain. Interestingly, Src-family kinases adopt the
same compact domain organization in their down-regulated form
(8), although their equivalent to N-cap serves as a membrane
anchor and is not involved in autoinhibition. Instead, a C-terminal
extension from the catalytic domain containing a phosphorylated
|
Significance
allosteric inhibitors protein–protein interactions
macromolecular assembly population shift leukemia
|
|
There is increasing interest in developing pharmacological
strategies to inhibit the allosteric regulatory mechanisms of
signaling enzymes. The Abl tyrosine kinase is a prominent
target, due to its ubiquitous cellular role and its involvement in
cancer. Here, computational and experimental methods are
used in synergy to probe the mechanism of the regulatory unit
of Abl, whose dual function is to inhibit the enzyme and to
mediate its interaction with other signaling proteins. Our
results provide insights into the thermodynamic basis for the
mechanism of Abl autoinhibition and activation and expand
our understanding of the principles that govern modular
domain organization.
T
yrosine kinases are involved in a wide variety of key signaling
processes and are therefore tightly regulated by the cell. Indeed,
numerous pathologies, ranging from cancer to neurodegeneration,
result from or are associated with deficiencies in kinase regulation.
Consequently, these enzymes are a prominent target for novel
pharmacological strategies against human disease.
This study focuses on Abelson murine-leukemia viral-oncogene
homolog-1 (Abl), which is one of the most ubiquitously conserved
tyrosine kinases. Abl is present in all metazoa, where it plays an
essential role in processes as diverse as cytoskeleton reorganization, DNA repair, and regulation of apoptosis (1, 2). Accordingly,
when constitutively active forms of Abl are present in normal cells,
these are transformed into cancer cells (3). For example, in human
white blood cells, a chromosomal abnormality leads to the fusion
of the bcr and abl genes, which together encode for a cytoplasmtargeted deregulated form of Abl; Bcr-Abl interferes with the cell
cycle, resulting in uncontrolled cell proliferation, and is the principal cause of chronic myeloid leukemia (CML) (4).
The architecture of Abl kinases resembles that of other tyrosine kinase families such as Src and Tec (5). It consists of a Srchomology-3 (SH3) module, which is an interaction domain specialized for recognition of xPxxP sequence motifs; a Src-homology-2
(SH2) module, which recognizes phosphorylated tyrosines; and
E3372–E3380 | PNAS | Published online August 19, 2013
Author contributions: I.L. and J.D.F.-G. designed research; C.C.-V., F.M., A.Z.-R., and J.R.-S.
performed research; C.C.-V., F.M., A.Z.-R., J.R.-S., I.L., and J.D.F.-G. analyzed data; and C.C.-V.,
F.M., I.L., and J.D.F.-G. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
This article is a PNAS Direct Submission.
1
C.C.-V. and F.M. contributed equally to this work.
2
Present address: Theoretical Molecular Biophysics Section, National Heart, Lung and
Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892.
3
To whom correspondence may be addressed. E-mail: [email protected] or jose.faraldo@
biophys.mpg.de.
This article contains supporting information online at www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.
1073/pnas.1303966110/-/DCSupplemental.
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1303966110
PNAS PLUS
enables us to reconcile seemingly contradictory structural and biophysical data on the mechanism of Abl regulation. Our analysis also
enables us to formulate a mechanistic hypothesis for the role of the
N-cap. Finally, we also examine the impact of activating mutations
within the SH3–SH2 unit, particularly in the short connector between the domains.
Results and Discussion
Fig. 1. (A) Crystal structure of Abl in the autoinhibited state (PDB ID code
2FO0). The SH2 domain docks onto the C-lobe of the catalytic domain,
whereas the SH3 domain engages the SH2-kinase linker. This inhibitory
configuration of the SH3–SH2 tandem is referred to as the on conformer
throughout the text. (B) Pseudodihedral angles used to describe the relative
orientation of the regulatory domains during the simulations, encompassing
residues in the C-terminal β-strand of the SH3 domain, the SH3–SH2 connector, and the N-terminal β-strand of the SH2 domain (Methods).
tyrosine associates with the SH2 module and seemingly locks the
complex in the autoinhibited state. Reversible phosphorylation of
this C-terminal tail is a major regulatory mechanism of Src family
kinases (9, 10).
Activation of both Src and Abl is enabled by the disengagement or reconfiguration of the intramolecular interactions just
described (7, 11, 12). Regulation can therefore be thought as
a reversible equilibrium whereby the SH3, SH2, and catalytic
domains are either dissociated or self-assembled in one or more
configurations. External factors, such as competing interactions
involving one or both regulatory domains, will bias this equilibrium in one or the other direction (13). For Abl in particular, the
significance of this mechanism is underscored by the fact that
mutations that impair the correct assembly of the autoinhibited
complex, either in the SH3–SH2 tandem or in the domain-domain linkers, confer CML cells with resistance against inhibitory
drugs designed to target the catalytic domain of the Bcr-Abl
oncogene (14). This outcome has prompted considerable interest
in the mechanisms of allosteric regulation of Abl and other tyrosine kinases and in the development of compounds designed to
interfere with these mechanisms (15–19).
In this paper, we use molecular simulations, free energy calculations, and differential scanning calorimetry (DSC) to study
the determining factors of a necessary step in the assembly of the
autoinhibited form of Abl, namely the organization of the SH3
and SH2 domains into a conformation conducive to its association with the SH2–kinase linker (KL). Our results show that the
conformational dynamics of the Abl SH3–SH2 tandem are
clearly distinct from those of Src and related kinases. This finding
Corbi-Verge et al.
Experimental and computational studies of SH3–SH2 tandems
from several Src family tyrosine kinases, such as Fyn or Hck, have
concluded that these constructs can retain the conformation observed in the down-regulated, assembled enzyme, even in the absence of other elements from the kinase (13, 20, 21). To assess
whether the SH3–SH2 tandem from Abl is similar in this regard, we
calculated two 500-ns molecular dynamics trajectories, both starting
in the inhibitory conformation of the tandem observed in the crystal
structure of the inactivated complex—hereafter referred to as the
“on” state of the SH3–SH2 clamp (Table S1). In the course of these
simulations, the internal structure of each domain was very well
preserved; on average, the conformation of the backbone deviated
from the X-ray structure [root-mean-square-difference (RMSD)]
by only ∼0.6 Å. Nonetheless, significant changes in the relative
orientation of the two domains were observed throughout the
simulations. We monitored these with the two pseudodihedral
angles defined in Fig. 1B. The variations in these dihedral angles in
the simulation time scale were both very significant (up to ∼180°)
and reversible (Fig. 2). Thus, the initial “on” conformation was not
sustained beyond the first 20–50 ns of the simulations, although it
could be transiently observed thereafter. Instead, we observed that
the tandem frequently adopted an alternative, well-defined arrangement, markedly different from the on conformation.
Further analysis of this alternative arrangement, which we
refer to as the “off” or noninhibitory state of the SH3–SH2 clamp,
reveals that it closely resembles (RMSD < 3 Å) an existing crystal
structure of the isolated tandem (22), reported several years before that of the inactive, complete enzyme (6). In this isolated
tandem structure (Fig. 3A), the orientation of the two domains
differs drastically (RMSD ∼10 Å) from that seen in the assembled
kinase complex. The tandem is also slightly more compact, with
Fig. 2. Conformational dynamics of the isolated SH3–SH2 tandem in two
independent simulation trajectories of 500 ns, initiated in the on conformation. Time series of the pseudodihedral angles defined in Fig. 1 are represented as probability histograms in blocks of 20, 100, and 500 ns (red color
equals greater probability). In both trajectories, the tandem switches to the
noninhibitory off conformation within 100 ns; in one of them, the tandem
switches back to the inhibitory on state, after 400 ns.
PNAS | Published online August 19, 2013 | E3373
BIOPHYSICS AND
COMPUTATIONAL BIOLOGY
Isolated SH3–SH2 Tandem Switches Between Two Main Conformers.
since the determination of the structures of the complete enzyme
in the inactive (6) and active (7) states. It is worth noting, however,
that diffusion anisotropy measurements by solution NMR had
previously indicated that the SH3 and SH2 domains in the Abl
tandem have a greater propensity to be in contact than those in
tandems from Src kinases (20, 23), in agreement with our results.
Moreover, the off conformation sampled in our simulations is highly
consistent with small-angle X-ray scattering (SAXS) measurements
obtained for a constitutively active form of Abl, where the regulatory
unit is partially disassembled from the catalytic domain (7) (Fig. 5).
Thus, even though this alternative off conformation of the Abl
SH3–SH2 regulatory unit might have been perceived as an artifact
Fig. 3. (A) Comparison of the on and off conformers of the SH3–SH2 tandem (blue and red, respectively), overlaid only using the SH2 domain; the on
conformer is shown as seen in the autoinhibited configuration of the Abl
complex and viewed from two perspectives. The catalytic domain is shown as
orange spheres, and the SH2-kinase linker is shown in cyan. The RMSD between the two conformations of the tandem (considering regions with
secondary structure only) is ∼8 Å. The off conformer sampled in our simulations closely resembles a crystal structure of the isolated SH3–SH2 tandem
(RMSD, ∼2–3 Å; PDB ID code 2ABL). This alternate conformation does not
interfere with the interaction between the SH2 and catalytic domains but
appears to be incompatible with the engagement of the SH2-kinase linker
by the SH3 domain. (B) Conformational dynamics of the SH3–SH2 tandem in
two independent simulation trajectories of 500 ns, initiated in the off conformation. In one of the simulations, the tandem switches to the on conformation after 50 ns, returning to the off state after 100 ns, and switching
again to the on conformer after 450 ns. In the second trajectory, the tandem
remains in the off state throughout the simulation.
several direct contacts between the SH3 and SH2 domains, specifically involving the distal loop of the SH3 domain and the βB-βc,
βD′-βc loops of the SH2 domain (Fig. S1). By contrast, in the on
conformation, there are no direct interactions between these
domains; instead, this conformation seems to be stabilized by
interactions between the SH3 domain and the SH3–SH2 connector (Fig. S1). Two additional trajectories of 500 ns, now initiated in the crystal structure of the off conformer, confirm that the
Abl SH3–SH2 tandem exchanges between off and on states within
the simulation time scale (Fig. 3B), with a preference for
the former.
To further evaluate the switch-like dynamics of the Abl SH3–
SH2 tandem, we set out to verify that the on and off states are
minima in its conformational free energy landscape. To calculate
this landscape, we used an advanced sampling technique known
as bias-exchange metadynamics (Methods). This calculation,
based on ∼6 μs of simulation time, confirms that the on and off
conformers correspond to the two main energetic minima (Fig.
4A; Fig. S2A), separated by a relatively small barrier, of about 4
kcal/mol (Fig. S3). Moreover, it reveals that the exchange between these two states correlates with a conformational change
within the SH3–SH2 connector (Fig. 4A). Importantly, the off
state is more probable than the on state, by approximately fivefold (see Methods for formal definitions); the population of
the on state is only ∼8% (±2%).
To our knowledge, the mechanistic significance of the off configuration of the Abl SH3–SH2 tandem has not been readdressed
E3374 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1303966110
Fig. 4. Conformational free-energy landscapes of (A) the SH3–SH2 tandem,
(B) the tandem engaged to the SH2-kinase linker (red), and (C) the tandem
engaged to N-cap (green). Each of the free-energy landscapes derives from
∼6 μs of all-atom bias-exchange metadynamics simulations, using five collective variables (Methods). The free-energy landscapes shown derive from
projections of the unbiased probability density on two of these variables;
i.e., the probability density function is integrated along the other variables. S1
represents the relative orientation of the SH3 and SH2 domains; S2 describes
the conformation of the SH3–SH2 connector. The integration excludes values
in S3 larger than 1 nm2, because those are more poorly sampled (Fig. S2).
Corbi-Verge et al.
induced by the crystallization process, this and previous studies
actually indicate that it is mechanistically relevant.
The structural dynamics of the Abl SH3–SH2 tandem and those
in Src-type kinases, therefore, differ significantly. Free energy
simulations of the SH3–SH2 tandem from Hck (a close homolog
of cSrc) identified a single major conformer, which closely resembles the on state (13); previous studies of Fyn using X-ray crystallography and NMR led to an analogous conclusion (20, 21). In
these kinases, the SH3–SH2 tandem is thus predisposed to adopt
conformations conducive to the inactive, assembled form of the
enzyme, in which the SH3 domain can readily engage the SH2–KL.
The fact that the regulatory tandem of Abl differs in this regard
suggests that the assembly of the autoinhibited state involves other
elements, as we discuss below.
Engagement of the SH2–KL Requires the On Conformation. Experi-
mental studies of the Abl SH3–SH2 tandem using hydrogen/
deuterium exchange (HDX) measurements have shown that the
SH3 domain may bind the SH2–KL even in the absence of other
elements of the kinase (24). Here, we showed that the isolated
tandem alternates between two conformational states, referred
to as on and off conformations. The former is known to be
compatible with the interaction between the SH3 domain and
SH2–KL (Fig. 1A); however, it is unclear whether this interaction is also feasible in the off conformation, which, as
mentioned, is inherently preferred by the tandem.
To address this question, we calculated two additional 500-ns
molecular dynamics trajectories of an SH3–SH2 construct that
also includes the SH2–KL, bound to the SH3 domain, with the
on conformation as the starting point (Table S1). As Fig. 6A
shows, the tandem remained in the initial conformation
throughout these simulations (note that spontaneous dissociation of the linker from the SH3 is unlikely to be observed in this
time scale). This result is in clear contrast to what we observe for
the isolated tandem (Fig. 3) and suggests that the interaction
with the SH2-linker would not be viable in the alternate off
conformation of the SH3–SH2 unit. Bias-exchange metadyCorbi-Verge et al.
Fig. 6. (A) Conformational dynamics of the SH3–SH2 tandem when bound
to the SH2-kinase linker, in terms of a histogram of the D1/D2 time series for
two independent simulation trajectories of 500 ns each, both of which were
initiated in the on conformation. (B) Analysis of the interaction between the
Abl SH2-kinase linker and the SH3 domain, via differential scanning calorimetry, for constructs of the SH3–SH2 tandem with and without the linker
and the individual domains.
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PNAS PLUS
BIOPHYSICS AND
COMPUTATIONAL BIOLOGY
Fig. 5. Putative model of fully activated Abl, with the SH3–SH2 tandem in
the proposed off conformation. The model is based on a partial X-ray
structure (cyan) of a deregulated, mutagenized form of Abl (PDB ID code
1OPL, chain B), in which the SH2 domain docks onto the N-lobe of the catalytic domain (7). The SH3–SH2 tandem is overlaid using the SH2 domain as
reference, either in the on or off conformers explored in the simulations
(blue and red, respectively). Both models are fitted into a low-resolution
envelope (gray mesh) constructed on the basis of SAXS measurements for
the same deregulated Abl mutant (7). It is apparent that the experimental
scattering data very likely reflects the SH3–SH2 tandem in the off conformation predicted to be the most probable by our free-energy calculations
(when the tandem is disengaged from the SH2-kinase linker and the N-cap).
namics calculations of the conformational free energy landscape
of this construct support this observation. The calculated landscape, based again on ∼6 μs of simulation time, clearly demonstrates that the off conformer is energetically prohibited (Fig. 4B;
Fig. S2B). Instead, we observe a single free energy minimum
(population 98%), which corresponds precisely to the on conformation observed in the autoinhibited state of the enzyme (Fig.
1A). These results clearly indicate that engagement of the SH2–
KL has a profound effect on the energetic landscape of the Abl
SH3–SH2 tandem.
DSC experiments carried out with SH3–SH2 and SH3–SH2–
KL constructs further support this observation. DSC provides
direct experimental access to the folding/unfolding partition
function, and consequently, the shape of the calorimetric trace
provides insights not only on the energetics of the unfolding
equilibrium, but also on the mechanism underlying the process.
Specifically, the shape of the calorimetric profile of a multidomain protein can provide information on the degree of interaction and conformational cooperativity between domains and
on the influence of ligand binding (25, 26). Thus, to experimentally probe the effect of the kinase linker on the conformational
equilibrium of the SH3–SH2 tandem, we measured the temperature dependence of the partial heat capacity of the individual
SH3 and SH2 domains, the SH3–SH2 tandem, and the SH3–
SH2–KL construct.
Unfortunately, with the exception of the Abl SH3 domain, all
other constructs resulted in irreversible thermodynamic transitions under all conditions studied, precluding a quantitative
evaluation of the linker binding affinity. Nonetheless, from
a qualitative perspective, we observed very revealing differences
between the heat capacity profiles of the SH3–SH2 and SH3–
SH2–KL constructs (Fig. 6B). The thermogram obtained with
the SH3–SH2 tandem features two peaks, each of which likely
corresponding to the unfolding of one domain, based on a comparison with the single-domain thermograms. The SH2 domain
appears to be more stable if isolated; nonetheless, we clearly
discern two transitions for the tandem, indicating that even
though there might be some cooperativity, it is fairly weak. We
can conclude, therefore, that in this construct the two domains
unfold largely independently of each other.
As mentioned, binding of the SH2–KL to the SH3 domain
can take place in the absence of the kinase domain, as previously demonstrated via HDX measurements (24). Simulated
DSC thermograms (SI Text, Table S2) show that if this process
was noncooperative, binding would be expected to result in a
displacement of the peak corresponding to the SH3 unfolding
transition to higher temperatures, whereas the SH2 unfolding
transition would be either unaffected, if the linker were to bind to
the off conformer of the tandem (Fig. S4A), or shifted toward
lower temperatures, if the linker binds to the on conformer (Fig.
S4B). As Fig. 6B shows, however, this is clearly not what is observed
experimentally for SH3–SH2–KL construct. The measured
unfolding thermogram shows instead a single sharp peak, characteristic of highly cooperative transitions, centered around 55 °C,
between the peaks corresponding to the isolated domains.
Highly cooperative transitions can be expected only if we assume that the SH3 domain cannot engage the KL when the SH2
domain is unfolded. However, as illustrated in Fig. S4 C and D,
these peaks are characterized by Tm values much higher than
that of the SH3–SH2–KL construct (Fig. 6B). Highly cooperative
peaks with Tm values comparable to those observed experimentally can be rationalized only in a highly cooperative scenario, as shown in Fig. S4 E and F, in which partially unfolded
states of the SH3–SH2 tandem are not significantly populated.
Nevertheless, the theoretical range of Tm values for these cooperative peaks depends on whether the SH2–KL is assumed to
bind to on or off conformation, i.e., the high or low free energy
states of the tandem, according to our bias-exchange simulations.
In particular, Tm values comparable to the experimental observation (Fig. 6B) are only compatible with two possible scenarios:
(i) the SH2–KL binds to the off conformer, albeit with extremely
low dissociation constants, in the 10- to 100-mM range (Fig. S4E)
or (ii) the linker binds to the on conformation with dissociation constants in the millimolar to micromolar range (Fig. S4F).
Only the latter scenario seems probable, in view of the binding
affinities typically observed for poly-proline recognition by SH3
domains (27).
In summary, the DSC data indicate that the presence of the
linker has a profound effect on the structural dynamics of the
tandem, coupling the unfolding of the two domains in a fully
cooperative manner. Also, from a qualitative perspective, the low
Tm value of the SH3–SH2–KL transitions suggests a preferential
interaction of the linker with the high free energy on conformation, in agreement with the molecular dynamics simulations.
N-Cap Extension Promotes Inactive-Like Conformations. The fact
that the SH3–SH2 unit may engage the SH2–KL, as demonstrated by HDX and DSC experiments, indicates that the affinity
of this interaction must be sufficiently large to overcome the
energy difference between on and off conformers, i.e., to displace the conformational equilibrium of the tandem toward the
on conformation. Nevertheless, the formation of this interaction
would entail a conformational strain in the tandem, because the
off conformer is energetically preferred when the SH3–SH2 unit
is disengaged from other elements in the kinase (Fig. 4A). Such
strain is probably minimal in other tightly regulated kinases such
as Src or Fyn, in which the SH3–SH2 tandem is biased toward
binding-competent conformations. The lack of this conformational drive in Abl suggests a different strategy for the stabilization of the autoinhibited complex relative to other kinases, e.g.,
a higher affinity between SH3 domain and SH2-kinase linker, the
involvement of additional elements in the kinase, or both.
As mentioned above, a key element in the autoinhibition of
Src-type tyrosine kinases is a C-terminal extension of the catalytic domain, featuring a tyrosine phosphorylation site. This site
is recognized by the SH2 domain in the assembled form of the
enzyme, and thus the short C-tail seems to mechanically lock
the down-regulated state (8). Functional studies indicate that the
myristoylated N terminus of the Abl N-cap region (in the 1b
splice variant) might have a comparable role, because mutant
forms that cannot be myristoylated are constitutively active (28).
Indeed, a comparison of crystal structures of autoinhibited and
active Abl suggests that binding of the myristoyl moiety to the
catalytic domain is required for its C-lobe to adopt a conformation complementary with the SH2 domain interface (6, 29).
E3376 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1303966110
The role of the N-cap, however, is not to provide a tight
physical link between the SH3 domain and the myristoyl-binding
pocket. Most of the N-cap can be deleted without impairing the
autoinhibition of the enzyme (28), consistent with the fact that
this region is highly disordered in crystal structures (6, 7). However, a ∼20 amino acid fragment of N-cap immediately preceding
the SH3 domain in Abl-1b is crucial for proper regulation. In one
of the crystal structures of the autoinhibited complex (7), this
fragment establishes several direct interactions with the SH2
domain and the SH3–SH2 connector, one of which is mediated by
a phosphorylated serine (Ser69). Consistent with this finding,
mutation of Ser69 and neighboring residues increases the activation level of the enzyme (28). We therefore hypothesized that
the mechanistic role of this N-cap fragment might be to modulate
the structural dynamics of the SH3–SH2 unit, in a manner that
promotes the engagement of the SH2–KL and further stabilizes
the autoinhibited state.
To assess this hypothesis, we carried out two 500-ns molecular
dynamics simulations of an SH3–SH2 construct including the
N-cap fragment visible in the experimental structure of the autoinhibited enzyme (Fig. 1A) (7), and a bias-exchange metadynamics
calculation of the free energy landscape of the construct. As illustrated in Figs. 4C and 7A, the results indeed show that the Ncap reshapes the conformational landscape of the tandem so as to
favor the on configuration, relative to the off conformer, approximately by a factor of ∼2 (Fig. 4C; Fig. S2C) compared with the
tandem alone (Fig. 4A; Fig. S2A). Specifically, the population of
the on state in this construct is now ∼20% (±5%), i.e., approximately two times more likely than in the SH3–SH2 construct with
no N-cap. The most likely pathway followed by the domains in the
transitions between the states is also not identical, although the
calculated free energy barrier is largely unchanged (Fig. S3).
Fig. 7. Conformational dynamics of the SH3–SH2 tandem, either when
bound to WT N-cap (A), with a mutated form of N-cap that readily dissociates from the tandem (B), or to both N-cap and the SH2-kinase linker (C).
The trajectory data are presented as in Fig. 6. In A and B, the histograms
combine D1/D2 time series for two independent simulation trajectories of
500 ns each, both of which were initiated in the on conformation. A single
trajectory was calculated in C.
Corbi-Verge et al.
Mutations in the SH3–SH2 Connector Influence Assembly Equilibrium.
From the data presented thus far and from previous studies (13,
21, 31), it can be inferred that the connector between the SH3
and SH2 domains in tyrosine kinases is key to determining the
relative arrangements of these domains in space, rather than
being a simple flexible linker. Indeed, our calculated free energy
landscapes for the cAbl SH3–SH2 tandem reveal a clear correlation between the two-state dynamics of the tandem (S1 variable
Corbi-Verge et al.
Fig. 8. Effect of SH3–SH2 connector mutations on the conformational dynamics of the Abl tandem. (A) Analysis of the interaction between the SH2kinase linker and the SH3 domain, via differential scanning calorimetry, for
WT and mutated SH3–SH2-kinase linker constructs. (B) Molecular dynamics
trajectories of the SH3–SH2 tandem, on mutation of the SH3–SH2 connector.
PNAS | Published online August 19, 2013 | E3377
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in Fig. 4) and alternate, well-defined conformations of the connector (S2 variable in Fig. 4).
Experimentally, mutations in this region have been shown to
result in increased activation levels in both Src and Abl kinases
(6, 28). A plausible interpretation of these observations that has
been put forward is that in these mutants the SH3–SH2 unit has
a diminished ability to clamp the two lobes of the catalytic domain in the inactive state, even if the complex is assembled
(6, 31). An alternative, possibly complementary interpretation is
that in the mutants the equilibrium between assembled and
disassembled forms of the enzyme is shifted toward the latter,
i.e., the uninhibited form (13).
To assess this second interpretation, we set out to study the
impact of mutations in the Abl SH3–SH2 connector on the
ability of the tandem to engage the SH2–KL. The specific residues to be mutated were selected on the basis of Ramachandran
plots extracted from the simulations of the SH3–SH2 tandem
presented previously (Fig. S6). This analysis shows that the exchange between on and off conformations of the tandem correlates with ϕ/ψ transitions at positions Asn139, Ser140, and
Leu141. Thus, two different constructs were studied experimentally and computationally: a triple mutant with Gly residues at
these three positions and a single proline mutant at position S140.
The triple glycine substitution leads to a significant decrease in
the melting temperature of the SH3–SH2–KL construct, by
about 3.5 °C, without much change in the overall shape of the
thermogram (Fig. 8A). We interpret this shift to reflect an increased entropic penalty on association of the SH3 domain with
the KL, shifting the binding equilibrium toward unbound conformations. Consistent with this interpretation, molecular simulations of an SH3–SH2 construct carrying these mutations
demonstrate a marked increase in the conformational entropy of
the tandem, relative to the WT, although conformations compatible
with the engagement of the SH2–KL by the SH3 domain are still
significantly populated (Fig. 8B; Fig. S6).
The substitution of Ser140 by proline has an even more drastic
effect. The thermogram for this construct features two peaks and
closely resembles the sum of the thermograms measured for the
BIOPHYSICS AND
COMPUTATIONAL BIOLOGY
In the course of these simulations, the interactions mediated
by pSer69 with residues Ser145 and His144 (which is positively
charged in this case) in the SH3–SH2 connector are preserved.
In a second set of two 500-ns simulations, in which we induced
the dissociation of the N-cap region by replacing Ser69 with alanine, the SH3–SH2 tandem departed from the on configuration, adopting predominantly the off conformer (Fig. 7B),
consistent with the simulations of the SH3–SH2 construct lacking this N-cap segment (Fig. 2). By contrast, the structural dynamics of the tandem in a construct including both N-cap (WT)
and the SH2–KL is very similar to that observed when only the
SH2-kinase linker is bound (Fig. 7C).
The mechanistic implication of these results is that binding of
the N-cap to the SH3–SH2 connector ought to facilitate the
engagement of the SH2–KL by the SH3 domain and thus the
formation of the autoinhibited complex. This allosteric role, not
previously recognized, is in our view not only consistent with the
abovementioned functional assays of mutant forms of Abl (28),
but also with existing HDX measurements designed to probe the
influence of N-cap on the conformational dynamics of the SH3
domain, when in tandem with the SH2 domain (30). Specifically,
Chen et al. (30) reported a twofold increase in the unfolding
half-life of the SH3 domain (i.e., an approximate twofold decrease in the rate of deuterium incorporation) when the tandem
was coexpressed with the SH2–KL. An almost identical shift
(1.9-fold) was measured for a construct containing the N-cap
region instead. Inclusion of both N-cap and the SH2–KL, however, extended the half-life 4.6 times. This result was interpreted
as evidence of noncooperativity between the interactions with Ncap and the SH2–KL; however, our interpretation of this measurement differs. If the HDX measurements are analyzed using a
suitable thermodynamic model (SI Text), it can be shown that an
increase in the SH3 domain half-life by a factor of 4.6 could actually imply that N-cap enhances the affinity for the SH2–KL by
about twofold (Fig. S5). This interpretation would be consistent
with the calculated increase in the population of the on state
when N-cap is included in our simulations.
In summary, our analysis supports a model in which the region
of N-cap most proximal to the SH3 domain may bind the SH3–
SH2 connector in either of the two main conformers of the
tandem, although its affinity for the on conformer is slightly
higher. Either way, binding of N-cap introduces a conformational
bias in the SH3–SH2 tandem toward the on state, thus relieving
the strain associated with the engagement of the SH2–KL, which
as mentioned opposes the intrinsic conformational propensity of
the tandem. The conformational bias induced by N-cap on the
SH3–SH2 tandem is admittedly subtle; however, it should be
noted that mutations that disrupt the interaction of N-cap with
the SH3–SH2 connector result in kinase activity levels that are
only two to six times greater than those of the fully regulated
enzyme (7). Thus, we envisage that these mutations diminish the
thermodynamic stability of the assembled complex, i.e., they result
in an increased population of partially disassembled, and thus
uninhibited, Abl. This subtle perturbation of the regulatory
mechanism is not negligible; by comparison, impairment of the
interaction between the SH3 domain and the SH2–KL, or deletion
of the myristoylated N terminus, lead to an approximate eightfold
increase in kinase activity (28). Thus, the magnitude of the allosteric effect that we propose for N-cap is, in our view, significant.
individual domains, suggesting that the association between the
SH3 domain and the SH2–KL is more severely impaired (Fig.
8A). Accordingly, molecular simulations of the tandem reveal
that the Ser140Pro mutation induces the tandem to adopt essentially a unique conformation (Fig. 8B) that is apparently incompatible with the engagement of the SH2–KL (the RMSD
relative to the on conformer is >6 Å).
In summary, DSC and simulation data provide support to the
notion that mutations in the SH3–SH2 connector significantly
impair one of the necessary intermediate steps in the assembly of
the autoinhibited form of Abl, namely the association of the
SH2–KL with the regulatory tandem. It is therefore logical to
conclude that this impairment accounts, at least in part, for the
increased activation levels observed for such mutants (28).
Conclusions
Modular domains play a central role in the organization and
propagation of signals in protein interaction networks. These
modules may function as scaffolds to facilitate the colocalization
of signaling enzymes and thus contribute to amplify the relay of
signals with the necessary specificity (32). In many cases, such as
tyrosine kinases and phosphatases, tandems of modular domains
also function as intramolecular regulatory units, assembling onto
the catalytic components and allosterically inhibiting their mechanisms (33). The emerging paradigm from studies of the structural
dynamics of these complexes is that the modular regulatory units
have evolved to adopt multiple, well-defined conformations, consistent with their dual functional roles (34). As for other multidomain proteins, the nature of these conformational states seems to
be encoded, at least in part, by seemingly nonstructured linkers
between individual modules (35); thus, mutations or posttranslational modifications of these linkers often have a significant
effect on activity.
Here, we showed that the SH3–SH2 tandem of the Abl tyrosine kinase is a dynamic two-state switch, alternating between the
well-known inhibitory conformation and another configuration
in which both the SH3 domain and the PxxP motifs in the SH2–
KL are exposed and that seems to correspond to the uninhibited
state, according to available SAXS data. We envisage that this
alternate conformer, which is also consistent with an existing
crystal structure, is likely to mediate interactions of Abl with
other proteins. For example, the so-called Abl interactor protein
Abi-2, widely expressed in human tissues, is believed to interact
with Abl concurrently via its proline-rich amino terminus and its
C-terminal SH3 domain, which would engage the Abl SH3 domain and SH2–KL, respectively (36). Likewise, the SH3 domain
of the adaptor protein Crk targets PxxP motifs in Abl (37), while
simultaneously, the Abl SH3 domain recognizes a PxxP motif
within the Crk SH2 domain (38).
Our data also indicate that the specific amino acid sequence of
the connector between the SH3 and SH2 domains has evolved to
restrict the conformational flexibility of the regulatory unit, so
that a well-defined set of conformations is favored; mutations in
this connector, therefore, are likely to influence the thermodynamic equilibrium between autoinhibited and uninhibited forms
of Abl, as was previously proposed for Src family kinases (13),
whose domain architecture is similar to that of Abl. Nevertheless, our simulations reveal subtle differences between Abl and
Src kinases. In particular, we find that in Abl, the so-called N-cap
complements the SH3–SH2 connector in stabilizing the SH3–SH2
unit in a conformation conducive to the autoinhibited state. This
allosteric role is consistent with comparative activity measurements of WT and mutant forms of Abl, as well as with unfolding
experiments specifically probing the stabilizing role of the N-cap,
according to our own independent analysis of the published data.
In summary, we gained detailed structural and thermodynamic information on the molecular mechanism of regulation
of a signaling enzyme of significant biomedical importance,
E3378 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1303966110
which is also paradigmatic among modular domain proteins.
From a methodological standpoint, our study also underscores
the potential of computationally distributed, enhanced-sampling
simulation methods for the quantitative analysis of conformational
exchange processes. We envisage that such methods will surely
complement conventional simulation approaches focused on sampling ever-increasing time scales.
Methods
Unbiased Simulations. Molecular dynamics trajectories were calculated with
NAMD 2.7b1 (39) and the CHARMM22/CMAP protein force field (40, 41). The
simulation systems (Table S1) were prepared with CHARMM (42). Each of the
constructs was immersed in a truncated-octahedral water box, 75 Å in size,
which also included 0.15 M KCl and counter ions to neutralize the net charge
of the protein. To optimize the protein–solvent interface, each system was
energy minimized with harmonic restraints on protein atoms and crystallographic water molecules and subsequently equilibrated via conventional
molecular dynamics simulations, with gradually weaker restraints, over 4 ns.
All restraints were then released, and the simulations were continued for up
to 500 ns per repeat. All trajectories were calculated at 298 K and 1 atm,
using a stochastic thermostat/barostat, and periodic boundary conditions.
The integration time step was 2 fs. Electrostatic interactions were computed
using the Particle-Mesh-Ewald (PME) algorithm with a real-space cutoff
distance at 12 Å; the same cutoff distance was used for van der Waals
interactions, modeled with a Lennard-Jones function.
Processing of SAXS Data. The X-ray scattering data reported in ref. 7 for
a deregulated, mutant form of Abl was scanned from the published figure
(Fig. 3C, red curve) and used to construct a 3D, low-resolution shape
reflecting the most probable conformation of the enzyme. Specifically, we
used the simulated annealing procedure in GASBOR (43) to construct 34
alternative shapes consistent with the probability distribution of interatomic
distances derived from the scattering data. These shapes were aligned and
averaged using DAMAVER (44). The normalized space discrepancy among
these shapes is 1.46 ± 0.045, which is only slightly higher than the value
originally reported in ref. 7 (1.362 ± 0.032). The final SAXS envelope shown
in Fig. 5 was then obtained from the average shape, using DAMFILT.
Alternative conformations of the atomic structure of the SH3–SH2-kinase
complex were fitted into the envelope using DAMSUP.
Free Energy Landscapes. All bias-exchange metadynamics calculations were
carried out with GROMACS/PLUMED (45, 46) and the CHARMM22/CMAP
protein force field, using analogous simulation systems and conditions as
above, except for the introduction of a virtual hydrogen scheme, which
enable us to use a time step of 4 fs. In bias-exchange metadynamics, a series
of concurrent simulations or replicas are carried out in which the protein
is adiabatically driven from one conformer to another, through historydependent biasing forces that oppose sampling of conformations previously
explored (47, 48). At a given frequency, attempts are made to exchange the
biases accumulated in each replica, using a Metropolis Monte Carlo acceptance criterion, as in other Hamiltonian exchange schemes (49). Effectively,
this procedure results in the flattening of the conformational free energy
landscape of the molecular system, and therefore, the protein is eventually
able to interexchange between the reference states easily, in all replicas. At
convergence, the accumulated biases may be combined and transformed
into an unbiased probability distribution, i.e., a free energy landscape. Each
of the calculations (Table S1) involved 32 simulation replicas and biasing
potentials on five collective variables, referred to as D1, D2, and S1–S3.
Twelve replicas included a metadynamics bias on S1 and S2; 15 replicas on S1
and S3; and 4 replicas on D1 and D2. The last replica was unbiased. D1 and D2
are pseudodihedral angles defined by the centers-of-mass of the backbone
atoms of residues 137, 141, 146, and 150 and residues 134, 137, 141, and 146,
respectively (Fig. 1B). S1 and S2 are so-called path collective variables (50),
defined in terms of the RMSD values of a given conformation relative to the
two alternate structures of the SH3–SH2 tandem, namely those in PDB ID
codes 2ABL and 2FO0. Finally, S3 measures the orthogonal distance to the
straight path between these two conformations (50). By construction, S1 and
S3 monitor the relative orientation of the two domains, each defined by the
Cα trace of the regions with secondary structure within these domains; S2
specifically monitors the conformation of the SH3–SH2 connector, defined
by the Cα trace of residues 136–145. The normalization factor λ was set to
4 nm−2 for S1 and S2, and to 30 nm−2 for S3. Boundary quadratic potentials
were used to restrict S1 and S3 to values between 1 and 2 and S3 to values
between 0 and 3 nm2. To avoid systematic errors in the calculated free en-
Corbi-Verge et al.
DSC. The heat capacities of all samples were measured as a function of
temperature with a high-precision differential scanning VP-DSC microcalorimeter (MicroCal). Samples were prepared by extensive dialysis against
a large volume of the appropriate buffer (50 mM Pipes, pH 7.0). All DSC
experiments were performed at a scan rate of 1.5 K·min−1 using a protein
concentration around 0.6 mg·mL−1. Protein samples and reference solutions
were properly degassed and carefully loaded into the cell to avoid bubble
formation. Thermal denaturation scans were recorded from 5–100 °C.
Samples were cooled down inside the calorimeter and reheated to check the
reversibility of the unfolding process at each experimental condition. The
DSC thermograms were systematically corrected for the time response of the
calorimeter and for the instrumental baseline obtained with both calorimeter cells filled with the corresponding dialysis buffer. After normalization
for protein concentration, the partial molar heat capacity curves (Cp) were
calculated from the resulting thermograms, assuming a value of 0.73 mL·g−1
for the partial specific volume of all proteins.
Protein Samples. The Abl SH3 domain was expressed and purified as previously described (27). The full-length Abl-1b gene encoded for Escherichia
coli was synthesized and cloned into the pETM-28a plasmid by GeneArt.
DNA fragments corresponding to the Abl SH2 domains and to constructs
SH3–SH2 (Ser78 to Pro237) and SH3–SH2–KL (Ser78 to Trp253) were subsequently subcloned by Topgenetech into the pETM-11 plasmid (Protein
Expression and Purification Core Facility, EMBL), containing an N-terminal
6xHis tag and a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site. SH3–SH2–KL
mutants were constructed using the QuikChange site-directed mutagenesis kit
from Stratagene. Plasmid-encoded SH2, SH3–SH2, SH3–SH2–KL, and its mutant
constructs were expressed in E. coli BL21 (DE3) strain (Novagen). Cells were
ACKNOWLEDGMENTS. We thank Dr. José C. Martínez for many helpful discussions. This project was funded in part by Project EXC115 of the German
Research Foundation (J.F.G.) and Grants BIO2009-13261-CO2 and BIO201239922-CO2 of the Spanish Ministry of Science and Innovation (to I.L.), as well
as by the Fondo Europeo de Desarrollo Regional and Grant CVI-05915 from
the Andalusian Government (to I.L.). C.C.-V. and A.Z.-R. were recipients of
a Formación de Personal Investigador fellowship from the Spanish Ministry
of Science and Innovation. Computing resources were provided in part by
the node of the Andalusian Network for Scientific Supercomputing at the
University of Granada. Mass spectrometry measurements were performed at
the Center of Scientific Instrumentation of the University of Granada.
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PNAS | Published online August 19, 2013 | E3379
PNAS PLUS
grown on Luria-Bertani medium at 37 °C. Protein expression was induced at
OD 600 nm ∼ 0.6–0.8 with 1 mM isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside for 12–
20 h at 37 °C. Cells were resuspended after 10-min centrifugation at 8,346 × g
and 4 °C in 50 mM phosphate and 0.3 M NaCl, pH 8.0, buffer [column buffer
(CB)] and broken with two passes in a French pressure cell. After 30-min centrifugation at 70,409 × g and 4 °C, the supernatant was loaded onto a 5-mL NiSepharose column (Pharmacia) equilibrated with CB. The protein was eluted
with a solution of CB + 500 mM imidazole. Protein-containing fractions were
extensively dialyzed against TEV buffer (50 mM Tris·HCl, pH 8.0, 0.5 mM EDTA,
and 1 mM DTT) to eliminate imidazole. The His-tag was hydrolyzed by overnight incubation with TEV protease in the presence of 1 mM ditiothreitol at
room temperature. The cleaved proteins were recovered by a second chromatography step on a Ni-Sepharose resin (Pharmacia). Protein purity was
checked by SDS/PAGE to be >95%. Finally, the identity and purity of the purified proteins were confirmed by matrix-assisted laser desorption/ionization
time of flight experiments carried out at the Center of Scientific Instrumentation of the University of Granada. Samples were concentrated to
0.6–0.8 mg·mL−1 in 50 mM Pipes buffer, frozen in liquid nitrogen, and stored at
−80 °C. Under these conditions, protein samples were stable for several
months. Protein concentration was determined from absorbance measurements at 280 nm using an extinction coefficient of 39,880 M−1·cm−1 for SH3–
SH2–KL (19.9 kDa), 31,400 M-1·cm−1 for SH3–SH2 (17.8 kDa), and 16,894
and 17,420 M−1·cm−1 for the SH3 Abl (7.4 kDa) and SH2 Abl (11.4 kDa)
domains, respectively.
BIOPHYSICS AND
COMPUTATIONAL BIOLOGY
ergies, a boundary correction scheme was also used at these values, as described previously (51). In the metadynamics simulations that included the Ncap region or the SH2–KL, distance restraints were applied to a subset of
residue pairs (or centers-of-mass) to ensure that these remained bound to
the SH3–SH2 tandem. The reference value and for each restrain was derived
from the unbiased simulations previously carried out for these constructs.
For SH3–SH2–KL, we used the following pairs: Pro149 and Trp118/Trp129;
Pro242 and Tyr89/Tyr134; and Val244 and Phe91/Pro131. For NCap–SH3–SH2,
we used Ser69 and His144; Trp67 and Trp146/Phe168/Val218; and Leu73
and Val218/Trp146.
The time-dependent metadynamics bias was progressively developed over
the first 100 ns of simulation time per replica (the filling time), in which the
height of the biasing-Gaussians, added every 2 ps, was gradually reduced
from 0.5 to 0.1 kJ·mol−1. The widths of the biasing Gaussians was, however,
constant, namely 0.03 (or 0.05 for NCap–SH3–SH2), 0.07 (0.015), and 0.07
nm2 for S1, S2, and S3, respectively, and 0.3 rad for both D1 and D2. Exchanges
between pairs of replica were attempted every 2 ps. On average, the exchange acceptance ratio was ∼30–40% among biased replicas and ∼2–10%
between these and the unbiased replica, depending on the construct.
The free energy landscapes in Fig. 4 and Fig. S2 were derived from the
sampling subsequent to the filling time, namely 106 ns for SH3–SH2, 102 ns
for SH3–SH2–KL, and 58 ns for NCap–SH3–SH2, per replica. The derivation
followed a methodology previously described (52), using METAGUI (53).
Briefly, the weighted histogram analysis method was used to combine the
sampling gathered in all replicas and to derive the global, unbiased free
energy landscapes. This calculation requires, for each replica, the biased
probability distribution of all microstates in collective-variable space, the
time-averaged bias potential accumulated during the simulation (after the
filling time) on each microstate, and the variance of this average. The latter
was defined as the mean-squared difference between two time averages,
each spanning one half of the simulation. For a given microstate and a given
replica, the larger the variance, the smaller the contribution of that replica
to the unbiased probability of that microstate; for computational convenience, a cutoff in the variance of (8 kBT)2 was used in the calculation of the
weights. To compute the populations of the on and off states cited in the
text, the unbiased probability distribution in S1–S3/D1–D2 was first recalculated in terms of the RMSD with respect to each reference structure, i.e., PDB
ID codes 2ABL (RMSD1) and 2FO0 (RMSD2). The probability of the on state is
the integral of this 2D function for 0 < RMSD2 < 4 Å and 6 < RMSD1 < 10 Å,
whereas for the off state is 0 < RMSD1 < 4 Å and 6 < RMSD2 < 10 Å. Error
estimates were computed as described previously (52).
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