Dicroísmo circular - Instituto de Biotecnología
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Métodos
Físico-Químicos en
Biotecnología
19 de Noviembre de 2013
M. en C. Esperanza Mata
Martínez
[DICROÍSMO CIRCULAR]
Instituto de Biotecnología-UNAM
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 3
Dicroísmo circular ............................................................................................ 5
Descripción ............................................................................................................... 5
Antecedentes históricos ............................................................................................ 6
Antecedentes teóricos ............................................................................................... 8
Principios básicos .................................................................................................. 8
Mediciones de DC ................................................................................................... 14
Métodos computacionales ................................................................................... 16
Cálculo del DC ..................................................................................................... 18
Aspectos experimentales ........................................................................................ 19
Instrumentación ................................................................................................... 19
Preparación de la muestra ................................................................................... 22
Almacenamiento .................................................................................................. 25
Determinación de la concentración de la muestra................................................ 27
Colección de datos .............................................................................................. 28
Procesamiento de datos y características espectrales ......................................... 35
Aplicaciones de DC ................................................................................................. 39
Análisis de proteínas ........................................................................................... 41
Análisis de ácidos nucleicos ................................................................................ 53
Análisis nanoestructurales ................................................................................... 59
REFERENCIAS ................................................................................................ 67
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INTRODUCCIÓN
Algunas biomoléculas poseen asimetría molecular, es decir, sus imágenes en
espejo no son idénticas. Estas moléculas son llamadas quirales (Hammes G.,
2005). Uno de los ejemplos mejor conocidos es el átomo de carbono que está
enlazado tetraédricamente a cuatro átomos o grupos de átomos diferentes.
La
quiralidad
es
una
característica
molecular
fundamental,
y
la
estereoselectividad, formación preferente de un estereoisómero (isómero que
tiene la misma fórmula molecular y la misma secuencia de átomos enlazados, con
los
mismos enlaces entre
sus
átomos,
pero
difieren
en
la
orientación
tridimensional de sus átomos en el espacio) sobre todos los posibles, regula los
procesos biomoleculares más importantes tales como las interacciones ligandoreceptor y catálisis enzimática (Ranjbar B. y Gill P., 2009).
La interacción de una molécula quiral con la luz polarizada (Figura 1) es muy
específica y ha demostrado ser un método importante para la caracterización
estructural tanto de moléculas pequeñas como de macromoléculas (Fasman G.,
1996).
Esencialmente, uno de los tipos de medición comúnmente empleado para
determinar el efecto de la luz polarizada en una molécula asimétrica es el
dicroísmo circular (DC) (Hammes G., 2005), que se define como la diferencia entre
la absorción de luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha por
compuestos ópticamente activos.
La luz polarizada circularmente es quiral, es decir, se encuentra en dos formas no
superponibles, las cuales son imágenes en el espejo una de otra. Para discriminar
entre las dos formas quirales de la luz, una molécula debe ser quiral, lo cual
incluye a la extensa mayoría de moléculas biológicas.
Los efectos producidos por la incidencia de la luz sobre moléculas quirales son
relativamente pequeños pero pueden ser medidos fácilmente con instrumentos
modernos. Por lo tanto, medidas de dicroísmo circular proporcionan información
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detallada, estructural y enantiomérica de proteínas, carbohidratos, ácidos
nucleicos, productos farmacéuticos, etc. (Fasman G., 1996). En el caso particular
de proteínas, el DC es una técnica muy valiosa, ya que permite llevar a cabo
estudios estructurales en las condiciones donde las biomoléculas funcionan
normalmente: en solución, proporcionando así medidas de cambios estructurales
esenciales para su función biológica. Por ejemplo, en desórdenes tales como la
enfermedad del Alzheimer, puede seguirse la conversión de un péptido sencillo en
fibrillas destructivas (Barrow C., 1992 y Hope J., 1996).
Los experimentos de DC son de baja resolución; por tanto para relacionar los
fenómenos espectrales con alteraciones en la estructura de la proteína se aplican
métodos computacionales. La implementación combinada de experimentos de DC
y la teoría es, con frecuencia, la única posibilidad para determinar la configuración
absoluta de moléculas pequeñas (Berova N, 2007 y Woody R., 1996).
La investigación teórica de DC de proteínas y de sus complejos puede ser
bastante complicada debido al gran tamaño de las moléculas proteicas, la
importancia de los cambios conformacionales, las propiedades electrostáticas y
los efectos del solvente. Incluso con las computadoras modernas y códigos de
química cuántica, no es factible calcular la quiralidad de un complejo proteico
directamente. Como alternativa, es necesario aplicar métodos aproximados, donde
parámetros derivados experimentalmente pueden ser incluidos. No obstante, la
comprensión del mecanismo de generación de DC de las proteínas constituye el
eslabón perdido fundamental, que relaciona la estructura y dinámica de la proteína
con el espectro observado experimentalmente y puede proporcionar una visión
más profunda en la biofísica e ingeniería de proteínas.
En las últimas décadas, se han desarrollado varias técnicas basadas en DC para
mejorar la medición molecular de estructuras biológicas (Whitmore L., y Wallace
B., 2008). Los más conocidos de ellos son: DC electrónico convencional (EDC),
DC
magnético
(MDC,
DC
magnético
vibracional
(MVDC),
XMDC),
DC
fluorescencia detectada (FDDC), DC cercano al infrarojo (NIR-DC), DCs
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vibracional (VDC, FTIR-VDC), HPLC-DC, DC en espectrofluorómetro de mezclado
rápido, y DC de radiación de sincrotrón (SRDC).
Figura 1. Esquema de los componentes del campo eléctrico no polarizado (a), luz polarizada
linealmente o plana (b), la luz se mueve a lo largo del eje Y. Para la luz no polarizada, se mueve
en todas direcciones, mientras que para la luz polarizada linealmente o plana sólo se encuentra
en la dirección Z. Para la luz polarizada circularmente (c), la dirección de rotación puede
dirigirse en sentido de las manecillas del reloj o en dirección contraria. (Modificada de Ranjbar
B. y Gill P. 2009).
Dicroísmo circular
Descripción
El dicroísmo circular se expresa frecuentemente como la propiedad que poseen
algunos materiales de absorber la luz a diferentes grados dependiendo de la forma
de polarización del haz incidente. Se dice que un material presenta dicroísmo
circular cuando la absorción de la luz circularmente polarizada en una dirección
(derecha) es diferente de la absorción de la luz circularmente polarizada en la
dirección opuesta (izquierda) (Figura 2) (Hammes G., 2005; Berova N., 2000;
Velluz L., 1965; Abu-Shumays A., 1966; Hennessey J.P., 1981).
Cuando la luz se polariza circularmente, surge un componente secundario de
absorbancia. Este componente secundario de absorbancia se mide como el
cambio entre la luz polarizada circularmente (RCP) a la derecha e izquierda, y la
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diferencia resultante se expresa como absorbancia (Berova N., 2000 y Velluz L.,
1965).
Figura 2. Esquema de DC en el que se mide la diferencia en absorción. (Modificada de Ranjbar
B. y Gill P. 2009).
Antecedentes históricos
La teoría de la actividad óptica ha recorrido un largo camino desde que este
fenómeno se observó por primera vez por Arago en 1811. Posteriormente, Jean
Baptiste Biot demostró que el plano de polarización de la luz se alteraba después
de pasar a través de un cristal de cuarzo (Biot J.-B., 1812). Tres años después,
Biot reportó una rotación similar del plano de polarización de la luz polarizada
linealmente en varios líquidos, incluyendo trementina y soluciones de alcanfor
(Biot J.-B., 1815). Louis Pasteur interpretó estas observaciones a nivel molecular,
en 1848, época en la cual no se comprendía la conformación tridimensional de las
moléculas (Fasman G.D., 1996). Sin embargo, Pasteur demostró que el acido
tartárico existe en dos formas asimétricas que giran el plano de polarización en
diferentes direcciones (Pasteur L., 1848). En 1874, Le Bel (Le Bel J. A., 1874) y
Van`t Hoff (Van‘t Hoff J. H., 1875) relacionaron el poder rotatorio a la disposición
asimétrica de los sustituyentes de un átomo de carbono saturado, identificando los
fundamentos de la estereoquímica. Mediante la definición de quiralidad, la química
fue reconocida como una herramienta poderosa, capaz de explicar las
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propiedades de los azúcares y de muchos otros compuestos orgánicos y, que
posteriormente condujo al desarrollo de nuevas metodologías analíticas, tales
como la dispersión óptica rotatoria (ORD) (Snatzke G., 1968) y la espectroscopía
de dicroísmo circular (DC) (Berova, N., 2000).
Aunque la causa de la actividad óptica se desconocía, el desarrollo de un marco
teórico para describir y entender el fenómeno demostró ser una tarea compleja.
La primera teoría adecuada del poder óptico rotatorio fue presentada por Born
(Born M., 1915). Esta fue investigada exhaustivamente por Kuhn (Kuhn W., 1929)
y luego reformulada por Rosenfeld en 1928 (Rosenfeld L., 1928), quien introdujo la
ecuación, con su mismo nombre, para el cálculo de la fuerza rotacional de una
transición, que está relacionada a su intensidad en el espectro DC.
Debido a la sensibilidad del DC y ORD para la estructura secundaria de proteínas,
se intentó hacer la predicción del espectro óptico de los polipéptidos. En 1956,
Fitts y Kirwood (Fitts D. D. y Kirkwood J. G., 1956) calcularon la rotación óptica de
un péptido helicoidal usando la teoría de la polarizabilidad, mientras que Moffitt
(Moffitt W., 1956) en los años 50s hizo el cálculo empleando la Teoría del exciton
(Davydov A. S., 1971). Moffitt demostró que el acoplamiento del dipolo eléctrico
que permite transiciones electrónicas
*, en una disposición helicoidal,
conduce a una transición que está en una combinación en fase, con una
polarización neta paralela al eje de la hélice, y dos transiciones que están en una
combinación fuera de fase, con una polarización neta perpendicular al eje de la
hélice. Así, correctamente predijo la naturaleza de la α-hélice dextrógira en
proteínas. Esto sucedió años antes de que se resolviera, por primera vez, la
estructura cristalográfica de una proteína por rayos X.
Sin embargo, esta aproximación no se desarrolló fácilmente con un método
cuantitativo. En 1961, Doty estableció la dependencia de ORD en el contenido de
α-hélices e identificó las transiciones electrónicas del grupo peptídico como la
fuente más probable de poder rotatorio de las proteínas (Urnes P. y Doty P.,
1961). Después confirmó, experimentalmente, los cálculos de Moffitt (Moffitt W.,
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1956) de la división del excitón, al resolver las tres bandas electrónicas del péptido
y atribuyéndolas a las transiciones n
*y
*, respectivamente (Holzwarth
G. y Doty P., 1965).
Basados en los estudios mencionados, se ha vuelto factible calcular el espectro de
DC de moléculas y hoy en día, se emplea de manera rutinaria para moléculas
pequeñas, por ejemplo, para determinar la configuración absoluta de compuestos
sintetizados o aislados (Specht K. M., et al., 2001; Tanaka K., et al., 2005; Butz
P., et al., 2002; Furche F., et al., 2000; Schreiber M., et al., 2001). Sin embargo, la
estimación del DC de proteínas sigue siendo un reto, debido a su tamaño y
flexibilidad.
Para el cálculo del espectro óptico de moléculas grandes, tales como proteínas y
cristales, se han desarrollado varios métodos que hacen frente al tamaño de estos
sistemas. El modelo de interacción del dipolo (De Voe H., 1964; De Voe H., 1965;
Applequist J., 1979; Sathyanarayana B. K. y Applequist J., 1985; Bode K. A. y
Applequist J., 1996; Carlson K. L., et al. 2006; Lowe S. L., et al; 2002) considera
que los átomos y cromóforos actúan como dipolos oscilatorios puntuales, que
interactúan entre sí durante los momentos dipolares inducidos en presencia de un
campo eléctrico.
Antecedentes teóricos
Principios básicos
La luz polarizada circularmente se puede producir por la superposición de dos
haces de luz que están oscilando perpendicularmente entre sí y propagándose
con una diferencia de fase de
/2 radianes. La magnitud del vector del campo
eléctrico del haz de luz resultante es constante, pero gira alrededor de la dirección
de propagación. Si el vector forma una hélice dextrógira, se refiere a una luz
polarizada circularmente a la derecha; mientras que, si el vector forma una hélice
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levógira se refiere a una luz polarizada circularmente a la izquierda (Figura 3)
(Fasman G. D., 1996; Eliel E. L., 1994).
Figura 3. Luz polarizada circularmente, a la izquierda y derecha, propagándose en el espacio.
Modificada de Bulheller B. M., et al., 2007.
Un observador estacionario que mira hacia la fuente de luz del vector del campo
eléctrico de luz polarizada circularmente ve que ésta está girando en sentido
contrario a las manecillas del reloj, con respecto a su progresión en el espacio. Sin
embargo, lo más importante es la dependencia del vector del campo con respecto
al tiempo. En este caso, el vector de la luz polarizada circularmente a la derecha
gira en la dirección de las manecillas del reloj
(Figura 4) (Snatzke G., 1968;
Barron L. D., 1982).
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Figura 4. Dependencia de la luz polarizada circularmente a la derecha de la distancia desde la
fuente de luz, S, (arriba) y del tiempo (abajo) cuando un observador en la posición O está
viendo hacia la fuente de luz. La hélice se mueve a lo largo de la dirección de propagación sin
girar, causando que el vector de la luz polarizada circularmente hacia la derecha gire en sentido
contrario a la dirección de las manecillas del reloj en el espacio, pero en el sentido de las
manecillas del reloj en el tiempo. Modificada de Bulheller B. M., et al., 2007.
Las moléculas quirales tienen la ventaja de poseer índices de refracción diferentes
para la luz polarizada circularmente dextrógira y levógira, es decir, los haces de
luz viajan a diferentes velocidades y son absorbidos en diferentes grados
dependiendo de cada energía. Esto significa que los coeficientes de extinción
molar para la luz circularmente polarizada dextrógira y levógira son diferentes,
εL≠εR. Este efecto se llama DC y la absorbancia diferencial, ∆ε, entre la luz
polarizada circularmente a la derecha y a la izquierda se grafica contra la longitud
de onda λ para producir el espectro de DC (Berova N., 2000; Cantor C. R. y
Schimmel P. R., 1980; Sreerama N. y Woody R. W., 2004).
∆ε= εL- εR
La integral de ∆ε en un rango de longitud de onda asociada con una transición
particular se conoce como la fuerza de DC o fuerza rotacional de esa transición.
Esto es análogo a la fuerza oscilatoria de la absorción normal. Desde el punto de
vista de la electrodinámica cuántica, la fuerza rotacional, R0κ, de una transición del
estado basal 0 a un estado electrónicamente excitado κ es el producto del
momento dipolar de la transición eléctrica, , y el momento dipolar de la transición
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magnética,
La probabilidad de una transición 0
se representa por la integral
, que puede considerarse como un dipolo oscilante inducido por el haz de
luz incidente (Cantor C. R. y Schimmel P. R., 1980).
lineal, mientras que
integral
describe un desplazamiento
caracteriza una circulación de carga y en consecuencia la
, se entiende como un bucle de corriente inducido por luz. Por
consiguiente, la combinación de
y
crean un desplazamiento de carga
helicoidal, dando lugar a una interacción diferente con luz polarizada circularmente
a la izquierda y a la derecha. Mientras que para el operador
aquel para
es un vector real,
es un vector imaginario, ya que describe la rotación de carga en un
sistema complejo coordinado (Cantor C. R. y Schimmel P. R., 1980), que involucra
al operador del momento lineal :
=
donde
x ,
= ∇,
es la carga, m la masa del electrón, c la velocidad de la luz,
es la
posición del operador del electrón, h es la constante de Planck dividida entre 2 , i
=
y ∇ es el operador de gradiente. La fuerza de rotación está dada por la
ecuación de Rosenfeld (Rosenfeld L., 2004):
R0κ=Im(
donde
y
),
indican las funciones de onda del estado basal y excitado,
respectivamente e Im la parte imaginaria del producto.
Empleando la ecuación de Rosenfeld, es posible obtener la fuerza rotacional de
una molécula y por tanto calcular su espectro de DC. Sin embargo, esto requiere
funciones de onda para los estados basal y excitado, que debido a limitaciones de
cálculo solo se puede determinar "ab initio" (―a partir de primeros principios") para
compuestos bastante pequeños. Los cálculos sobre proteínas, que comprende
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cientos de átomos y miles de electrones, son por tanto un reto, que exige algunas
aproximaciones.
La elipticidad molar es otra medida para el DC, y se define como:
[ ] = 100 /Cl
donde C y l son la concentración molar y la longitud de la trayectoria (cm) de la
celda, respectivamente. La elipticidad molar
se reporta como deg .cm2.dmol o
como deg.M-1.m-1, y estas dos unidades son equivalentes.
La integrada de la intensidad de una banda de DC proporciona una medida de la
fuerza del DC, llamada la fuerza de rotación. La fuerza rotacional tiene unidades
de erg.cm3 y se define experimentalmente como:
R = (h/32 NA)
= 2.295 x 10-39
donde h es la constante de Planck, c es la velocidad de la luz, y NA es el número
de Avogadro.
La fuerza rotacional se define teóricamente, siguiendo el tratamiento de Rosenfeld
(Rosenfeld L., Z. 1928), como la parte escalar del producto de los momentos de
transición del dipolo eléctrico (μ) y del magnético (m) de una transición electrónica.
R = Im *μ.m}
Esta definición sugiere las unidades más usadas frecuentemente para la fuerza
rotacional de los magnetrones de Debye–Bohr (DBM= 0.9274X10-38 erg.cm3).
Usando la ecuación anterior y las funciones de onda de la mecánica cuántica para
los estados basal y excitado, uno puede calcular la fuerza rotacional para una
transición dada como:
Roa = Im {(oІμІm) . (aІmІo)}
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donde μ es el operador del momento de transición del dipolo eléctrico, una medida
del desplazamiento lineal de carga de excitación; y m es el operador del momento
de transición del dipolo magnético, una medida del desplazamiento circular de la
densidad electrónica en la excitación. La superposición de μ y m resulta en un
desplazamiento helicoidal de carga, que interactúa de manera diferencial con la
luz circularmente polarizada a la izquierda y a la derecha.
La expresión para la fuerza rotacional dada en la ecuación anterior es dependiente
de origen debido a la dependencia de origen del operador del momento de
transición del dipolo magnético. Una formulación alterna de la fuerza rotacional
independiente de origen, se conoce como la formulación velocidad-dipolo, (Moffitt
W., 1956; Moscowitz A., 1965) que emplea el operador de gradiente, ∇, y se utiliza
normalmente en el cálculo teórico del DC.
Roa = - (eh/2 mνoa) Im {(oІμІm) . (aІmІo)}
donde e y m son, respectivamente, carga y masa de un electrón, y νoa es la
frecuencia de la transición o a.
El cálculo del espectro del DC a una longitud de onda dada, λ, se hace asumiendo
bandas Gaussianas para todas las transiciones y empleando la relación entre DC,
∆εκ, y la fuerza rotacional, Rκ, para una transición κ dada con un medio de ancho
de banda (la mitad del ancho de banda de DC a 1/e de su máximo) de ∆κ.
∆εκ = 2.278Rκλκ/∆κ
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Mediciones de DC
Los instrumentos DC (conocidos como espectropolarímetros) miden la diferencia
en absorbancia entre los componentes L y R de la luz polarizada circularmente,
pero generalmente la reportan en términos de elipticidad ( ) en grados. Cabe
señalar que =
(b/a) donde b y a son los ejes mayor y menor de la elipse
resultante (Figura 5). Existe una relación simple entre ∆ε y elipticidad (en grados),
concretamente =32.98 ∆ε. El espectro de DC se obtiene cuando el dicroísmo se
mide como una función de la longitud de onda.
Figura 5. Origen del efecto del DC. (A) Los componentes polarizados circularmente a la
izquierda (L) y derecha (R) de la radiación polarizada plana: (I) los dos componentes tienen la
misma amplitud cuando combinados generan la radiación polarizada plana; (II) los componentes
son de amplitud diferente y la resultante es polarizada elípticamente (línea punteada). (B) La
relación entre absorción y espectro de DC. La banda 1 tienen un espectro de DC positivo con
absorción L mayor que R; la banda 2 tiene un espectro de DC negativo con absorción R mayor
que L; la banda 3 corresponde a un cromóforo aquiral. Modificada de Kelly S. M., et al., 2005.
Existen varios métodos por los cuales el efecto DC se puede medir en un
espectropolarímetro: (a) modulación/ajuste, en el cual la radiación incidente se
cambia continuamente entre los componentes L y R, (b) sustracción directa, en la
cual las absorbancias de los dos componentes se miden por separado y se restan
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uno del otro, y (c) elipsométrico, en el cual se mide la elipticidad de la radiación
transmitida (Johnson Jr W.C., 1996).
Figura 6. Diagrama de un espectropolarímetro (Jasco J-810). La radiación polarizada plana se
produce por el paso de la luz desde la fuente de luz (FL) a través de dos prismas (P1 y P2) y
una serie de espejos (E1 a E5) y divisores (D 1-D3). Un rayo ordinario (O) es enfocado por una
lente (L), y pasa a través de un filtro (F) hacia el modulador (DCM). Los componentes
polarizados circularmente pasarán después a través del obturador (OB) hacia el compartimento
de la muestra, antes de ser detectados por el fotomultiplicador (FM). (E representa los rayos
extraordinarios). Modificada de Kelly S. M., et al., 2005.
Si bien es cierto que los métodos (b) y (c) tienen algunas ventajas potenciales en
términos de resolución temporal de DC (Johnson Jr W.C., 1996), el método de
modulación/ajuste es por mucho el más utilizado comúnmente. En un instrumento
de DC, la luz polarizada plana se divide en los componentes L y R al pasar a
través de un modulador sujeto a un campo eléctrico alternante (la frecuencia
empleada más comúnmente es de 50 kHz). El modulador utilizado generalmente
consiste de un piezoeléctrico de cristal de cuarzo y de una placa delgada de
material isotrópico (por ejemplo, cristal de silicio) firmemente acoplada al cristal. El
campo eléctrico alternante induce cambios estructurales en el cristal de cuarzo;
esto hace que la placa transmita luz polarizada circularmente en los extremos del
campo. Como la radiación transmitida cambia entre los componentes L y R, estos
se detectan a su vez por un fotomultiplicador.
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Siempre se tiene que recordar que en la mayoría, si no es que en todos los
estudios biológicos, las señales de DC observadas son muy pequeñas, por
ejemplo, las mediciones de elipticidad típicamente están en el rango de 10 mdeg,
correspondiente a una diferencia en absorbancia en el orden de 3x10-4. Por lo
tanto, en estudios de DC es particularmente importante prestar atención a las
condiciones experimentales para asegurarse de obtener datos significativos.
Métodos computacionales
El cálculo del espectro de DC se puede hacer usando métodos directos y
aproximados. De los métodos directos, el más empleado es el TD-DFT (Dreuw y
Head-Gordon, 2005). De los métodos aproximados, el más utilizado en los
cálculos del espectro de DC es el método de la matriz de Baylay, Nilsen, y
Schellman (Bayley et al., 1969); sin embargo, la Teoría de perturbación de primer
orden de Tinoco (Tinoco, 1962) y el modelo de interacción también se aplican
(Woody, 1996).
TD-DFT es una extensión del Teorema de Kohn–Sham para las propiedades de
los estados basal y excitado utilizando el formalismo de la respuesta lineal. La
calidad de los cálculos depende fuertemente de la elección del funcional
intercambio-correlación específica con la preferencia de híbridos funcionales. El
método funciona satisfactoriamente para una gran mayoría de sistemas orgánicos,
bio-orgánicos, y bio-inorgánicos; sin embargo, se ha demostrado que da lugar a
diversas discrepancias para las transiciones de transferencia de carga (CT). El
método se puede aplicar para los cálculos de los estados excitados de moléculas
que contengan decenas de átomos pesados pero no puede aplicarse a sistemas
grandes como las proteínas.
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No obstante, la comparación entre los resultados obtenidos en sistemas modelo al
nivel de TDDFT y métodos más aproximados validan la aplicación
de dichos
métodos en sistemas grandes.
El método de la matriz es un método aproximado desarrollado por Baylay, Nielsen,
y Schellman que se puede implementar para la exploración de sistemas con
múltiples cromóforos como las proteínas (Bayley et al., 1969).
Existen varios métodos para calcular los espectros de DC de proteínas. En 1962,
Tinoco adoptó un enfoque de perturbación, en el que cual él consideraba a los
cromóforos de una proteína por separado (Tinoco I., 1962) y asumía que los
electrones estaban localizados en un cromóforo particular, con fuerzas
Coulómbicas como el único medio de interacción entre diferentes cromóforos
(Kirkwood J. G., 1937). El método de la matriz (Bayley, P. M., 1969; Woody R. W.,
1968; Woody R. W. y Tinoco I., 1967), derivado del modelo de excitón de Frenkel,
(Davydov A. S., 1971) se usa comúnmente para cristales moleculares y
agregados. Es una formulación mejorada del método de Tinoco (Tinoco I., 1962) y
consiste en resolver el problema del valor propio a través de una matriz de
diagonalización en lugar de aplicar la teoría de la perturbación siendo por tanto
más precisa (especialmente para los estados degenerados y cuasi-degenerados)
y de fácil implementación en algoritmos informáticos. En el método de la matriz, se
asume que los orbitales de diferentes cromóforos no se superponen de modo que
no se produce la transferencia de carga inter-cromóforo. El método de la matriz es
bastante exitoso en el cálculo de del espectro de proteínas. El DC de las proteínas
con una alta cantidad de α-hélices se puede calcular casi cuantitativamente (Hirst
J. D. y Besley N. A., 1999).
En el método de la matriz, la proteína se divide en M cromóforos independientes,
con un monómero de función de onda
is
para cada grupo cromóforo i 0 y estado
electrónico. La función de onda del estado excitado de la proteína kth,
κ
, se
escribe después (como primera aproximación) como una combinación lineal de
configuraciones electrónicas
ia,
en la cual sólo el grupo cromofórico i, está en
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estado excitado a y todos los otros están en el estado basal 0 (Sreerama N. y
Woody R. W., 2004). Así,
ia=
donde
ia es
10… ia… j0… M0
la función de onda del cromóforo i después de una transición 0 a, y
κ=
El estado basal de la proteína es, de manera similar,
0=
10… i0… j0… M0
Cada transición en el espectro de DC está caracterizada por una fuerza rotacional
y una energía que se relaciona con la intensidad experimental. Para calcular el
espectro de DC, se requieren las funciones de onda
κ
para cada estado
electrónico excitado κ de la proteína (o por lo menos aquellos que ocurren en la
región espectral de interés). Los resultados de estos cálculos son una simple
intensidad y longitud de onda de cada transición. Para producir un espectro
también se necesita una forma y un ancho de banda para cada transición.
Cálculo del DC
La implementación del método de la matriz como un programa de ordenador es
muy sencillo. El cálculo requiere las coordenadas de los átomos y la posición de
los cromóforos en la proteína. Cada cromóforo está caracterizado por un conjunto
de monopolos describiendo el potencial electrostático y para cada grupo en la
proteína, el conjunto respectivo de monopolos se superpone sobre los átomos de
carbono. Mediante el cálculo de la interacción entre todas las diferentes
excitaciones electrónicas, se construye la matriz Hamiltoniana y se determinan las
fuerzas rotacionales, produciendo un espectro de líneas, es decir, valores para la
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fuerza rotacional de cada transición. Sin embargo, en un espectro experimental,
las transiciones se expanden debido al principio de incertidumbre, componentes
vibrónicos sin resolver y la interacción de los cromóforos con su entorno
incluyendo otros cromóforos y el solvente. Así, se observa aproximadamente una
superposición de bandas de forma Gaussiana. Puesto que el resultado de los
cálculos es un espectro lineal, se requiere una función de circunvolución de forma
lineal. Las formas de líneas Gaussianas proporcionan mejores resultados en
comparación con las curvas Lorentzianas.
Aspectos experimentales
Instrumentación
Toda la instrumentación para DC disponible comercialmente utiliza la técnica de
modulación dada a conocer por Grosjean y Legrand (Grosjean M. y Legrand M.,
1960; Velluz L., et al., 1965; Drake A., 1986). La luz de un monocromador es
polarizada linealmente, luego pasa a través de un dispositivo de modulación, un
modulador fotoelástico (PEM) (Billardon M., y
Badoz J.,
1966; Kemp
J. C.,
1969), que convierte la luz polarizada linealmente a luz polarizada circularmente,
alternando entre luz polarizada circularmente a la izquierda (lcpl) y luz
circularmente polarizada a la derecha (lcpr) a la frecuencia de modulación. La luz
incidente en la muestra se modula entre polarización circular derecha e izquierda,
entonces si la muestra presenta DC, la intensidad de la luz detectada por el
fotomultiplicador también se va a modular a la misma frecuencia. La corriente en el
circuito del fotomultiplicador consistirá, por tanto, de una pequeña corriente alterna
(ac) y una corriente directa larga (dc). Los componentes de estas corrientes están
separados y el componente de la ac se amplifica. La razón de las corrientes ac y
dc es directamente proporcional a la diferencia en absorbancia para rcpl y lcpl. El
componente dc se mantiene a un nivel constante por un sistema servo que ajusta
el alto voltaje aplicado al fotomultiplicador. Así, ∆ε es directamente proporcional al
componente ac y por lo tanto a la ganancia del amplificador.
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Los instrumentos de DC están disponibles comercialmente de varias fuentes:
Jasco
Inc.
(http://www.jascoinc.com/),
Aviv
Biomedical
Inc.
(http://www.avivbiomedical.com/), OLIS Inc. (http://www.olisweb.com/), y Applied
Photophysics (http://www.photophysics.com/). Un sistema Peltier controla la
temperatura. También se requiere un conjunto de celdas de cuarzo de alta calidad
con buena transmisión en el UV lejano (ya sean rectangulares o cilíndricas) con
longitudes de trayectoria que van de 0.1 a 10 mm. Las micro o semimicro celdas
con longitud de trayectoria de 10 mm se utilizan particularmente para mediciones
de DC en el UV cercano empleando volúmenes pequeños (0.25 ml). Las celdas se
adquieren de varios proveedores (por ejemplo,
Hellma;http://www.hellma-
worldwide.de/). Las celdas con longitudes de trayectoria menores a 1 mm siempre
se deben calibrar. Esto se hace fácilmente usando la celda para registrar un
espectro de absorción convencional de cualquier solución con absorbancia
conocida con precisión. Las celdas tienen algo de deformación intrínseca que da
lugar a artefactos de DC significativos, y aunque se puede tolerar la deformación
moderada, es posible eliminar los efectos de la deformación al orientar la celda
siempre en la misma dirección que el instrumento. Las celdas se deben limpiar
inmediatamente después de usarlas para evitar la acumulación de depósitos de
proteína difíciles de eliminar. Esto se puede hacer usando una preparación de
solución limpiadora de celdas Hellmanex II. Después de limpiar las celdas se
deben enjuagar con agua destilada, luego con etanol, y secarlas usando una
bomba de aire o mediante evaporación. Las celdas se deben almacenar
de
acuerdo a las instrucciones indicadas por el fabricante. Todos los reactivos
empleados deben ser de la más alta pureza posible. Es particularmente importante
que cualquiera de los solventes
orgánicos empleados sea de pureza
espectroscópica y se debe verificar la ausencia de impurezas.
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Cuidado del instrumento y calibración
El instrumento de DC siempre debe purgarse con nitrógeno de alta pureza, libre
de oxígeno por lo menos 20 minutos antes de encender la fuente de luz y a lo
largo de las mediciones. Si el oxigeno está presente, éste se puede convertir a
ozono por la luz del UV lejano de la lámpara de alta intensidad, y el ozono puede
dañar las superficies ópticas. Las altas tasas de flujo de nitrógeno son necesarias
generalmente para hacer mediciones a longitudes de onda corta.
La calibración del instrumento debe verificarse periódicamente. Aunque hay
diversos estándares de DC disponibles, uno de los más usados es el acido
sulfónico de alcanfor d10 (d10-CSA). La concentración exacta de una solución de
d10-CSA en agua (a ~2.5 mM) se debe determinar de un espectro de absorción
(usando ε285=34.5 M-1 cm-1) y no de su masa porque este compuesto en estado
sólido es altamente higroscópico.
La absorción diferencial (∆ε) registrada a 290.5 nm en una celda de longitud de
trayectoria de 10 mm debe ser C∆εM,290.5 (o 32,98C∆εM,290.5 miligrados), donde
∆εM,290.5= 2.36 M-1cm-1 (Johnson, 1990). Si la intensidad no se encuentra dentro
del 1% del valor esperado, el usuario debe consultar el manual del fabricante para
obtener información sobre el procedimiento del ajuste apropiado. También es
recomendable verificar la longitud de onda de calibración del instrumento y su
rendimiento general de transmisión en el UV lejano frecuentemente. Debido a que
la solución d10-CSA tiene una segunda banda a 192.5 nm (∆εM,192.5= -4.72 M-1cm1
), uno puede verificar el funcionamiento en el UV lejano mediante el registro del
espectro del estándar d10-CSA utilizando una celda de longitud de trayectoria de 1
mm. Si los valores (absolutos) de la relación de intensidades de los dos picos de
d10-CSA es significativamente menor de 1.95, entonces la maquina ya no está
funcionando correctamente; esto se debe probablemente al envejecimiento de la
lámpara o a la degradación de los espejos, muy probablemente el primer espejo
después de la fuente de luz. Esta medición también proporciona una
comprobación útil de la calibración de la longitud de onda del instrumento, aunque
esto se puede hacer simplemente escaneando con un filtro de óxido de holmio la
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trayectoria de la luz y monitoreando el voltaje en el fotomultiplicador del
instrumento.
Preparación de la muestra
Todas las muestras deben de ser de la más alta pureza posible. Se pueden
obtener resultados erróneos incluso cuando existan niveles relativamente bajos de
impurezas, si estos tienen señales de DC fuertes. Por ejemplo, señales débiles de
proteínas en el UV-cercano pueden saturarse por señales fuertes de niveles
relativamente pequeños de ácidos nucleicos contaminantes. Uno de los
principales problemas en las medidas de DC es que las señales se distorsionan
significativamente si no llega la suficiente luz al fotomultiplicador y, en términos
prácticos, esto quiere decir que no se pueden hacer medidas confiables en
muestras con una absorbancia (muestra + solvente) mayor a 1. Siempre se debe
verificar el espectro de absorción de una muestra para comprobar que no se
supere este límite de absorbancia. En el UV-lejano, las mediciones de absorbancia
de la muestra por sí misma son generalmente bastante pequeñas, y el principal
problema surge de la absorción de los componentes del amortiguador, casi todos
los cuales limitarán la penetración del UV-lejano en cierta medida.
La mayoría de los componentes de los amortiguadores generalmente permitirán
mediciones de DC por debajo de 200 nm (Johnson, 1996b). Sin embargo, se
deben evitar siempre que sea posible, altas concentraciones de cloro y nitrato,
ciertos solventes (dioxano, DMSO), altas concentraciones (>25 mM) de algunos
amortiguadores biológicos (HEPES, PIPES, MES), altas concentraciones (>0.25
mM) de quelantes comunes (EGTA/EDTA), y altas concentraciones (>1 mM) de
agentes reductores (ditiotreitol y 2-mercaptoetanol). También es digno de
mencionar que el agua destilada almacenada en botellas de polietileno,
generalmente, conducirá a una transparencia pobre en el UV lejano debido a la
presencia de polímero eluído. Los espectros de DC de proteínas de membrana se
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registran en su forma solubilizada en detergente para evitar artefactos derivados
de la dispersión de la luz diferencial y de la absorción plana (Fasman, 1996).
Los espectros de DC de proteínas en el UV-lejano (260-178 nm) son intensos, y
se requieren cantidades relativamente pequeñas para registrarlas. Debido a que
todos los enlaces peptídicos contribuyen al espectro observado, la cantidad de
material (medido en mg/ml) es efectivamente igual para cualquier proteína. Las
mediciones se hacen casi invariablemente en celdas de longitud de trayectoria
corta para reducir la absorción por los componentes del amortiguador.
Normalmente se utilizan 200 μl de una solución 0.1-0.15 mg/ml cuando se emplea
una celda con longitud de trayectoria de 1 mm o 30 μl de una solución de 1.0-1.5
mg/ml cuando se utiliza una celda de 0.1 mm (desmontable). Esta última es
preferible para una buena penetración en el UV-lejano, pero el material
generalmente no se recupera.
Los espectros de DC en el UV-cercano de las proteínas son, generalmente, de un
orden de magnitud más débil que los espectros de DC en el UV lejano.
Registrarlos por tanto requiere muestras más concentradas y/o longitudes de
trayectoria más largas. Los espectros se registran comúnmente bajo condiciones
similares a aquellas utilizadas para medir un espectro de absorción convencional,
por ejemplo, utilizar una celda de longitud de trayectoria de 10 mm y pretender un
pico de absorbancia en el rango de 0.7-1.0 (la absorbancia óptima para la mejor
relación señal: ruido en una medición de DC, es de hecho, 0.869 Johnson, 1996b).
Se pueden utilizar soluciones menos concentradas si las señales de DC son
intensas y las muestras más concentradas, pueden de hecho, ser evaluadas
utilizando celdas de longitud de trayectoria corta, cuando sea necesario. Los
espectros de DC de ácidos nucleicos en el UV-cercano, los cuales son
significativamente más fuertes que los de las proteínas, se deben registrar con un
pico de absorción en el rango de 0.7-1.0.
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Caracterización
Las proteínas deben tener por lo menos 95% de pureza. La identidad de la
proteína y la autenticidad de cualquier modificación post-traduccional se puede
confirmar mediante medidas de espectrometría de masas en la proteína completa
o en fragmentos peptídicos.
La proteína debe estar libre de ácidos nucleicos o fragmentos de oligonucleótidos,
que a menudo contaminan a las proteínas recombinantes. La presencia de tales
contaminantes se puede detectar fácilmente mediante la medición del espectro de
absorción de una muestra. Para las proteínas la relación ε280/ ε260 es normalmente
1.7 y para ácidos nucleicos esta relación es normalmente 0.6; debe tenerse en
cuenta que las relaciones precisas dependen, en cierta medida, de la composición
de aminoácidos y bases, respectivamente. La mejor forma de eliminar los ácidos
nucleicos (o fragmentos) es tratar el extracto obtenido de la lisis celular con
nucleasas apropiadas antes de continuar con la purificación de proteínas (Price
N.C., 1999; Scopes R.K., 1994).
La diálisis o permeación en gel se debe utilizar para remover agentes protectores
o iones de amortiguadores que podrían causar problemas con la señal de DC.
Este es especialmente el caso con altas concentraciones (100-500 mM) de (a)
imidazol para eluir proteínas con una etiqueta de histidinas (Ni-NTA), y (b) iones
de cloro (NaCl) usados para eluir proteínas de columnas de intercambio iónico, ya
que estas muestran alta absorbancia en la región del UV-lejano.
La solución de la proteína debe ser cristalina, sin la presencia de agregados
insolubles de proteínas, ya que estos causarán artefactos debidos a (a) dispersión
diferencial de la luz, que surge cuando la luz incide en partículas quirales de
dimensiones comparables o mayores que su longitud de onda, y (b) absorción de
aplanamiento que se origina en la alta concentración de proteínas en tales
agregados. Estos factores distorsionan la forma y magnitud del espectro de DC y
también disminuirán la relación señal:ruido (Johnson Jr W.C., 1996; Wallace B.A.,
1984; Wallace B.A., 1987). Para descartar la presencia de agregados, además de
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la inspección visual de la muestra, se puede utilizar espectrofotometría,
ultracentrifugación analítica y/o permeación en gel. Las soluciones de proteínas se
pueden centrifugar o filtrar a través de filtros Millipore de 0.2 μm para remover
material agregado y partículas de polvo; no obstante, después de la centrifugación
se debe verificar la concentración de la muestra.
Almacenamiento
La integridad del estado plegado de las proteínas en solución representa un
balance complejo entre las fuerzas proteína-solvente y proteína/proteína. La
mayoría de las proteínas son solubles y estables en sistemas acuosos en un
intervalo estrecho de pH. Por lo tanto, en general es necesario emplear sistemas
amortiguadores adecuados (Stevens L., 1992) y es probable que se requiera una
cierta fuerza iónica para dispersar
las cargas de superficie de la proteína.
También se debe recordar que los amortiguadores deben de usarse dentro de un
rango cercano a una unidad de pH a cada lado del pKa apropiado y a una
concentración suficiente para resistir cambios en pH por la adición de ligandos
altamente cargados como el ATP-4. Ciertos amortiguadores, como el TRIS, tienen
un alto coeficiente de temperatura (Stevens L., 1992) y el pH debe verificarse a la
temperatura a la cual se usan.
Además, se pueden agregar una serie de agentes protectores a la solución de
proteínas; la función de éstos es mimetizar las condiciones en las que el agua
presente una actividad menor (concentración) que en una solución de
amortiguador diluida (Scopes R.K., 1994; Scopes R.K., 1996). Los agentes
utilizados más ampliamente incluyen sales u osmolitos como la prolina, β-alanina o
alcoholes polihídricos como el glicerol o la sacarosa (Arakawa T., 1982; Bolen
D.W., 2004). La adición de glicerol al 50% (v/v) se utiliza para el almacenamiento,
ya que esto permite que las soluciones se mantengan a -20
sin congelarse. Se
ha investigado extensivamente la forma exacta en la cual los diversos agentes
protectores causan la estabilización. Se cree que los alcoholes polihídricos
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funcionan preferencialmente aumentando la hidratación de las proteínas. El efecto
de diferentes sales en las proteínas es bastante complejo; las series Hofmeister
representan un ordenamiento de aniones y cationes basados en su capacidad de
precipitar o estabilizar proteínas. Se ha propuesto que estas series reflejan la
capacidad de los iones de afectar los enlaces de hidrógeno en agua, aunque otros
estudios sugieren que el efecto diferencial de los iones proviene de la perturbación
ion-específica de la estructura macromolecular (Gurau M.C., 2004). Otros agentes
protectores que se agregan a las soluciones de proteínas durante su
almacenamiento incluyen inhibidores para prevenir la degradación por proteasas,
y ditiotreitol (un agente reductor que mantiene las cisteínas de las cadenas
laterales en su estado reducido). Estos agentes protectores se agregan
normalmente a concentraciones cercanas a 1 mM en la solución de proteínas.
Cabe señalar que el ditiotreitol absorbe fuertemente por debajo de los 220 nm, por
lo que la absorbancia de un amortiguador que contenga este compuesto se debe
verificar cuidadosamente bajo las condiciones empleadas para registrar espectros
de DC en el UV lejano. El EDTA se agrega normalmente como agente
estabilizador, ya que no sólo quela los metales iónicos esenciales requeridos para
la actividad de algunas proteasas, sino aquellos metales iónicos que podrían
causar daño a las cadenas laterales de las cisteínas. Aunque el grupo carboxilato
4 del EDTA absorbe significativamente por debajo de 200 nm, la inclusión de 1
mM de EDTA no causa problemas significativos en la celda de longitud de
trayectoria corta (0.02 cm).
Si las proteínas se almacenan en solución, se tienen que dializar para reemplazar
los agentes protectores por el amortiguador en el que se llevarán a cabo los
estudios de DC. Si la proteína se almacena o se suministra liofilizada se debe
redisolver cuidadosamente en el amortiguador, con agitación suave para evitar la
desnaturalización. La solución resultante puede requerir centrifugación o filtración
para remover agregados insolubles, y posiblemente diálisis o permeación en gel
para remover cualquier material agregado como protector antes de la liofilización.
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Determinación de la concentración de la muestra
Conocer la concentración precisa de las muestras es absolutamente esencial en
un análisis del espectro de DC para determinar el contenido de estructuras
secundarias y si uno desea hacer una comparación válida entre diferentes
muestras de proteínas o ácidos nucleicos. El análisis de proteínas por los métodos
de Lowry o Bradford no es suficientemente preciso para utilizarse en mediciones
de DC a menos que hayan sido calibrados muy cuidadosamente para la proteína
bajo investigación empleando concentraciones determinadas con un método más
directo, como el análisis cuantitativo de aminoácidos. Al emplear la espectroscopía
de absorción, si se conoce el coeficiente de extinción molar, la concentración de la
proteína se puede calcular con una precisión considerable. El espectro de
absorción se debe registrar, idealmente, con control de temperatura y se debe
prestar especial atención para la correcta resta del punto de referencia, de manera
particular, cuando se utilizan amortiguadores que contienen agentes reductores.
Muestras con alta dispersión siempre se deben aclarar mediante centrifugación a
baja velocidad o filtración antes de la determinación de la concentración. Si el
espectro aun así muestra dispersión significativa de la luz se debe aplicar una
corrección de fondo arriba de ~315 nm. En la mayoría de los casos, es razonable
asumir que la dispersión es de naturaleza Rayleigh y que la absorbancia debida a
la dispersión es proporcional a λn (donde el exponente n es generalmente cercano
a 4). La contribución de la dispersión de la luz se debe restar a 280 nm, por
ejemplo, sería entonces (A350
nm)(350/280)
4
= 2.442 x A350
nm.
Un método más
elaborado, implementando en un programa de hoja de cálculo, consiste en graficar
In (Aλ) contra In (λ) para λ>315 nm y se hace un ajuste de mínimos cuadrados a la
línea recta. Este método tiene la ventaja que las desviaciones significativas de la
linealidad podrían indicar la presencia de contaminantes en lugar de dispersión de
la luz, y que se puede calcular el valor real de la longitud de onda del exponente
(n). La contribución de la dispersión para el rango completo de longitudes de onda
se puede construir y se resta del espectro medido (Gill y von Hippel, 1989; Pace et
al., 1995), que es, por supuesto una medición más confiable. Esto se hace mejor
con el método de Edelhoch (Pace et al., 1995). Hacer diluciones idénticas de la
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proteína en el amortiguador experimental y en el mismo amortiguador conteniendo
6 M de hidrocloruro de guanidina y registrar el espectro de absorción con el
amortiguador de sustracción adecuado. Si es necesario, corregir la dispersión de
la luz y medir la absorbancia a la longitud de onda elegida. Luego, por ejemplo, el
coeficiente de extinción a 280 nm se calcula de la composición de aminoácidos
como (Paceet al., 1995):
ε280, amortiguador = (A280 , amortiguador)( ε280, GuHCl)/ A280, GuHCl
donde ε280, GuHCl (M-1cm-1) = (#Trp)(5685) + (#Tyr)(1285) + (#cistinas)(125)
Cualquiera que sea el método de determinación empleado, es acertado asumir en
los análisis posteriores un error de hasta 5%.
Colección de datos
Habiendo elegido la concentración adecuada de muestra y la longitud de
trayectoria de la celda, es necesario seleccionar los ajustes adecuados en el
instrumento. Además de elegir el rango de longitudes de onda apropiado para la
medición, es necesario seleccionar la velocidad de muestreo, la constante de
tiempo experimental (o tiempo de respuesta), amplitud de la banda espectral, y el
número de mediciones a ser promediadas. También se debe tener en cuenta la
selección de la temperatura para la medición.
Rango de longitud de onda
El espectro de proteínas en el UV-lejano generalmente debe analizarse desde 260
nm hasta la longitud de onda más baja posible. Este límite bajo de longitud de
onda dependerá en gran medida de la composición del amortiguador utilizado. Los
espectros en el UV cercano son analizados rutinariamente en el rango de 340-225
nm para proteínas y de 340 nm hasta la longitud de onda más baja posible para
los ácidos nucleicos.
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Amplitud de la banda
La amplitud de la banda es una medida de la precisión con la cual un
monocromador selecciona la luz de la longitud de onda elegida. Aumentar la
amplitud de la banda permitirá que más luz incida sobre la muestra y a su vez en
el fotomultiplicador, pero disminuirá la capacidad para resolver bandas
espectrales. La amplitud de la banda debe ser menor o igual a 1 nm; se utilizan
valores menores a 0.1 nm, en estudios de DC de rutina, particularmente para
resolver estructuras finas en el espectro del UV cercano de proteínas (Jones C., et
al., 2004).
Constante de tiempo y velocidad de muestreo
La constante de tiempo es una medida del tiempo en la cual los datos de DC se
promedian y dependerá del modo preciso de operación del instrumento (el tiempo
de respuesta, o el tiempo de permanecía tienen significados similares para
diferentes tipos de instrumentos).
Se sugieren un conjunto de reglas generales:
Velocidad de muestreo x constante de tiempo < amplitud de banda < W/10
donde W = la amplitud a la mitad de la altura espectral característica de la
muestra bajo investigación (Scopes R.K., 1974).
Por ejemplo, si se asume que la amplitud de banda es 0.5 nm, se pueden utilizar
combinaciones de constantes de tiempo y velocidad de muestreo de 2 s y 10
nm/min o 0.25 s y 100 nm/min. Se pueden ajustar estos valores para obtener
estudios de alta resolución cuando se requiera una amplitud de banda pequeña.
Es importante que cualquier desviación de estas reglas se realice sólo si se
demuestra que esto no distorsiona el espectro obtenido en un instrumento de DC
particular (por ejemplo para dar cabida a una velocidad de muestreo más rápida).
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Número de mediciones
El aumento del número de mediciones mejora la relación señal:ruido (S/R); la
relación S/R es proporcional a la raíz cuadrada del número de mediciones.
En la práctica el número de mediciones y la velocidad de muestreo (y por lo tanto
constante de muestreo) dependen del tiempo disponible para el experimento y
también tienen que tomar en cuenta cualquier limitación impuesta para (a) la
estabilidad de la muestra en las condiciones empleadas, y (b) la estabilidad del
instrumento.
No es posible emitir recomendaciones definidas acerca de la combinación de los
ajustes de la máquina a ser utilizada bajo todas las circunstancias. El balance
entre velocidad de muestreo, constante de tiempo y número de mediciones
dependerá de factores tales como el tiempo disponible para el experimento y la
estabilidad de la muestra bajo las condiciones empleadas, y esto debe
investigarse en cada caso.
Además, la concentración de la proteína y la longitud de la trayectoria se deben
ajustar para mejorar la calidad de los datos.
Elección correcta de la concentración de la proteína y longitud de trayectoria
de la celda
Una de las grandes fortalezas del DC es que puede utilizarse para estudiar
proteínas en un rango amplio de concentraciones, lo cual puede proporcionar
información valiosa de procesos dependientes de concentración tales como la
asociación entre proteínas o péptidos que contienen el motivo de cierre de leucina
para generar estructuras tipo espiral enrollado que se unen al acido
desoxirribonucleico (ADN) (Weiss M.A., et al., 1990; Zitzewitz J.A., et al., 1995).
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La meta en DC es mantener la absorbancia total de la muestra (debido a la
proteína y al amortiguador o solvente) dentro de límites razonables (regularmente
menores a 1) para evitar el ruido excesivo. De hecho, la relación señal:ruido en
DC es máximo teóricamente cuando la absorbancia es 0.869 (Johnson Jr W.C.,
1996). La absorbancia de la muestra se controla convenientemente por el trazo de
voltaje de alta tensión (el voltaje aplicado al fotomultiplicador). Para obtener datos
confiables, este debe mantenerse dentro de límites específicos (generalmente el
voltaje debe ser menor a 700 V, pero este valor dependerá del instrumento que se
esté usando).
Los valores de absorbancia de una solución de una proteína típica (Stevens L.,
1992) de 1 mg/ml en una celda de una longitud de trayectoria de 1 cm a varias
longitudes de onda se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
a
Valores de absorbancia para proteínas en el UV
Longitud de onda (nm)
Absorbancia (solución de 1 mg/ml en
una celda de longitud de trayectoria de
1 cm)
190
65
193
68
200
45
205
32
210
21
215
15
220
11
230
5
260
~0,6
280
~1
310
<0,05
320
0
b
b
c
c
a
Los valores de absorbancia mostrados se deben considerar como típicos para proteínas
comunes, y no como valores exactos. Los datos se adaptaron de Stevens L., 1992.
b
Este valor depende del contenido de triptófanos y tirosinas de la proteína; los valores para A280
están en el rango de 0 a 4.
c
Asumiendo que no existan factores que absorban en este rango.
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Con el fin de cumplir con el criterio de absorbancia (por ejemplo, una absorbancia
total de la muestra
1), se puede ajustar la concentración de la proteína o la
longitud de trayectoria de la celda o ambas. Por ejemplo, para mantener una A190
o inferior a 1.0 se puede utilizar una concentración de 10 mg/ml y una longitud de
trayectoria de 0.001 cm o una concentración de 1 mg/ml y una longitud de
trayectoria de 0.01 cm o una concentración de 0.1 mg/ml y una longitud de
trayectoria de 0.1 cm. Por lo tanto, se puede estudiar en el UV lejano, una gama
muy amplia de concentraciones, aunque tiene que tenerse en cuenta que en
soluciones muy diluidas (<10 μg/ml) una proporción significativa de la proteína se
puede absorber sobre la superficie de la celda. Utilizando celdas rellenables con
longitudes de trayectoria en el rango de 0.01 a 0.05 cm los volúmenes requeridos
estarán en el rango de 0.3 a 0.4 ml; la mayor parte de este volumen (>90%) se
puede recuperar. Con celdas desmontables, se requiere una gota de solución
(0.05 ml o menos); esto no se puede recuperar fácilmente cuando se desmontan
las celdas después de realizar las mediciones espectrales. Los efectos de variar la
concentración de proteína y la longitud de la trayectoria de manera inadecuada
pueden conducir a la obtención de artefactos en la medición de DC.
En las regiones del UV cercano y del visible, el rango de concentraciones que se
puede estudiar es más limitado. Con una concentración de proteína de 0.5 mg/ml,
la longitud de trayectoria típica es 1 cm; a una concentración de 5 mg/ml, la
longitud de trayectoria podría ser 0.1 cm. Utilizando una celda rectangular, es
posible emplear 1 ml de una solución de 0.5 mg/ml para obtener un espectro. Si la
proteína tiene un cromóforo que absorbe en la región visible/UV (por ejemplo,
piridoxal-5`-fosfato, flavina o hemo) la concentración y longitud de trayectoria
usadas están en el mismo rango que para la región del UV cercano.
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Estudios de DC a diferentes temperaturas: control de temperatura
Los estudios de DC a diferentes temperaturas proporcionan información de la
estabilidad de las proteínas. Este tipo de experimentos se han podido realizar más
fácilmente con la introducción de dispositivos Peltier que permiten que la
temperatura dentro de la celda se modifique en una manera más sistemática de lo
que es posible con un baño de circulación externa. Sin embargo, existen diversos
puntos a tener en cuenta cuando se llevan a cabo estudios térmicos. Estos
podrían requerir la realización de controles cuidadosos, por ejemplo:
Podría haber un pequeño pero significativo cambio en la longitud de
trayectoria de la celda.
El solvente se podría evaporar a altas temperaturas, conduciendo a un
cambio en la concentración.
Podría haber transferencia de calor ineficiente, de modo que la temperatura
de la solución de proteína dentro de la celda no refleje la de la fuente
externa.
Podría haber un efecto de la temperatura en la magnitud de las señales de
DC.
Es una buena práctica siempre registrar los espectros de DC con control de
temperatura. Esto es particularmente importante para el espectro de proteínas en
el UV-lejano, que regularmente muestran una dependencia de temperatura
bastante pronunciada, incluso fuera del rango de cualquier desdoblamiento de la
proteína inducido térmicamente. Estos pequeños cambios en la señal de la
proteína plegada con respecto a la temperatura reflejan un cambio real en la
conformación y no son debidos simplemente a cambios en las propiedades ópticas
de una hélice o una hebra. Los cambios, que son regularmente lineales con
respecto a la temperatura, se deben probablemente a cambios en las
interacciones hélice-hélice (Greenfield, 2004).
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Una vez ajustados los parámetros descritos arriba, se aconseja realizar una sola
medición para verificar que la selección sea apropiada. Los espectros de DC serán
seriamente distorsionados si el voltaje del fotomultiplicador se eleva por arriba de
un cierto límite, generalmente del orden de 600 V. El límite menor de longitud de
onda seleccionado para espectros en el UV-lejano debe restablecerse al valor más
alto si el límite de voltaje del fotomultiplicador se excede. Por otro lado, si el voltaje
es tan alto en la región del UV cercano, se debe reducir ya sea la concentración
de la muestra o la longitud de trayectoria de la celda. El espectro de las proteínas
en el UV cercano normalmente no tiene intensidad significativa en la región de
315-340 nm. Si hubiera señal significativa en esta región (con frecuencia volverse
más negativa hacia longitudes de onda menores), podría deberse a que hay
contribución de un puente disulfuro en el espectro. El límite de longitud de onda
superior para una medición debe ampliarse para permitir la alineación correcta con
respecto a la línea basal.
La medición completa se debe hacer con las suficientes repeticiones para
aumentar la relación S/R hasta niveles aceptables. Si fuera necesario, por ejemplo
en titulaciones, se deben hacer las adiciones requeridas a la celda y repetir la
medición. Hacer adiciones (especialmente a celdas de longitud de trayectoria
corta) tiene varios problemas. El volumen pequeño de la muestra debe mezclarse
completamente, ya sea por inversión o usando una punta delgada de pipeta. Esto
se tiene que hacer con mucho cuidado para evitar la casi inevitable pérdida de
solución que ocurrirá durante esta manipulación.
Otro problema encontrado frecuentemente, especialmente con muestras de
proteína diluidas, es que el material se pierde debido a que se absorbe en las
paredes de la celda o en las puntas de la pipeta.
En la práctica, se puede hacer poco con respecto a esto, pero se aconseja
verificar el funcionamiento del equipo realizando una titulación ficticia en la que
simplemente se agrega amortiguador a la muestra para comprobar que los
cambios en intensidad no se deban únicamente a la dilución. Finalmente, ya que
las adiciones pueden aumentar la absorción total, siempre vale la pena estimar (o
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mejor aun medir) la absorbancia final antes de empezar un experimento en el que
se hacen adiciones.
El paso final es registrar la intensidad basal usando la misma celda, el mismo
amortiguador y los mismos ajustes del instrumento. Estrictamente hablando, el
registro basal debe hacerse usando un amortiguador que contenga algún
componente que presente la misma absorción que la muestra pero que no tenga
señal de DC (Johnson, 1996b). Sin embargo, esto rara vez se hace y es poco
probable que sea un problema importante excepto con señales muy débiles. Se
debe reducir el número de mediciones hechas para registrar la señal basal, ya que
cualquier
ruido en este registro se añade a la medición de la muestra en el
subsecuente procesamiento numérico.
Procesamiento de datos y características espectrales
Procesamiento de datos
El primer paso es restar la medición de la línea basal de la medición
de la
muestra. Todos los espectros deben colectarse con una longitud de onda de
partida (260 nm para el espectro del UV-lejano; 340 para el espectro del UVcercano) de por lo menos 15-20 nm al inicio de la medición, donde no debería
haber señal. Después de la resta de la línea basal esta región debería, y
generalmente es, plana, sin embargo esta señal nunca es cero. El desplazamiento
vertical lento de la señal en espectrofluorómetros de DC es la causa común de
este problema. La solución es hacer un promedio de la señal aparente de los
primeros 15-20 nm del espectro y restarle este valor de la curva total.
El espectro se debe convertir a las unidades deseadas. En el caso de las
proteínas, la señal de DC observada, S en miligrados (1 miligrado= 32.98 x ∆A), se
convierte al coeficiente de extinción molar de DC (∆εM) o la media del coeficiente
de extinción molar residual (∆εMRW) usando:
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∆εM = S/32.980 x CM x L o
∆εMRW = S x MRW/32.980 x Cmg/ml x L (unidades: M-1cm-1)
donde L es la longitud de trayectoria (en cm), CM es la concentración molar, Cmg/ml
es la concentración en mg/ml, y MRW es el peso medio de los residuos (peso
molecular dividido entre el número de residuos). A pesar de que las proteínas
globulares grandes generalmente tienen un peso medio de residuos de
aproximadamente 111, el valor real siempre debe calcularse para evitar grandes
errores potenciales en el cálculo de las intensidades.
El cálculo de las intensidades en el UV-lejano se realiza casi siempre con base a
los residuos para facilitar la comparación entre proteínas y péptidos con pesos
moleculares diferentes. Las intensidades en el UV-cercano deben reportarse
generalmente en molar en lugar de en base a los residuos ya que sólo cuatro
aminoácidos de la cadena lateral contribuyen a la señal de DC en esta región. En
el caso de ácidos nucleicos, las intensidades de DC pueden calcularse usando la
base, pares de bases, o concentraciones molares.
Las intensidades de DC también se reportan como elipticidad molar ([ ]M) o
elipticidad media de residuos ([ ]mrw), que puede calcularse directamente como:
[ ]M = S/ 10 x CM x L o
[ ]mrw = S x MRW/ 10 x Cmg/ml x L (unidades: grados x cm2dmol-1)
Los valores [ ] y ∆ε se interconvierten usando la relación [ ] = 3298∆ε.
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Características espectrales
Espectro de proteínas en el UV-cercano
Las bandas de DC en el UV-cercano de residuos individuales en una proteína
pueden ser positivos o negativos y pueden variar dramáticamente en intensidad,
con residuos que están inmovilizados y/o tienen interacciones acopladas a
residuos aromáticos vecinos con oscilación, los cuales producen las señales más
fuertes. Por tanto, existe poca correlación entre el número de residuos aromáticos
y la intensidad de DC aromático, y el espectro de DC en el UV-cercano de una
proteína no permite decir nada concreto con respecto a la estructura terciaria. El
conocimiento de la intensidad y posición de las bandas de DC esperadas para un
cromóforo particular es útil para comprender el espectro de DC observado en el
UV-cercano de una proteína y las características principales de los cuatro
fluoroforos se resumen abajo (Strickland, 1974; Woody and Dunker, 1996):
La fenilalanina presenta una estructura bien definida en el rango de 255270 nm y sus picos se observan generalmente cercanos a 262 y 268 nm
(∆ε
0.3 M-1cm-1).
La tirosina generalmente tiene un máximo en el rango de 275-282 (∆ε
2
M-1cm-1), posiblemente con un hombro de unos 6 nm hacia el rojo (longitud
de onda mayor).
El triptófano, muestra con frecuencia, una estructura fina arriba de los 280
nm en la forma de dos bandas Lb [una a los 288 a 293 y otra a 7 nm hacia
el azul (de longitud de onda menor), con el mismo signo (∆ε
5 M-1cm-1)] y
una banda La (alrededor de 265 nm) con estructura poco fina (∆ε
2.5 M-
1
cm-1).
El DC de la cisteina comienza a una longitud de onda larga (>320 nm) y
muestra uno o dos picos anchos arriba de 240 mn (∆ε
1 M-1cm-1); el pico
de longitud de onda larga frecuentemente es negativo.
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Espectro de proteínas en el UV-lejano
El espectro de proteínas en el espectro del UV-lejano depende del contenido de la
estructura secundaria y la simple inspección del espectro generalmente revelará
información acerca de la clase estructural de la proteína. Los rasgos
característicos del espectro de diferentes clases de proteínas se describen a
continuación (Venyaminov y Yang, 1996):
Todas las proteínas tienen una banda intensa negativa con dos picos (a
208 y 222 nm) y una banda muy positiva (en 191–193 nm). Las
intensidades de estas dos bandas reflejan el contenido de α-hélices. Los
valores de ∆εmrw para una proteína completamente helicoidal pueden ser del
orden de -11 M-1cm-1 (a 208 y 222 nm) y +21 M-1cm-1 (a 191 y 193 nm).
Los
espectros
de
proteínas
completamente
β
regulares
son
significativamente más débiles que los espectros de las proteínas α. Estos
espectros comúnmente tienen una banda negativa (a 210-225 nm, ∆εmrw: -1
a -3.5 M-1cm-1) y una banda fuertemente positiva (a 190-220 nm, ∆εmrw: 2 a
-6 M-1cm-1).
Los péptidos desordenados y las proteínas desnaturalizadas presentan una
banda fuertemente negativa (a 195-200 nm, ∆εmrw: -4 a -8 M-1cm-1) y una
banda mucho más débil (que puede ser positiva o negativa) entre 215 y 230
nm (∆εmrw: +0.5 a -2.5 M-1cm-1).
Las proteínas α+β y α/β casi siempre tienen espectros dominados por el
componente α-helicoidal y por tanto con frecuencia muestran bandas a 222,
208, y 190-195 nm. En algunos casos, puede haber un solo espectro ancho
mínimo entre 210 y 220 nm debido a las contribuciones superpuestas de αhélices y hojas β.
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Ácidos nucleicos
Debido a que las bases aromáticas son planas, éstas no poseen ninguna señal
intrínseca de DC; la presencia de los azúcares es la que crea la asimetría que
conduce a las señales pequeñas de DC de los nucleótidos monoméricos.
Asimismo, el empacamiento de las bases en las diferentes formas poliméricas
resulta en contactos estrechos y en interacciones electrónicas que producen la
intensa señal de DC de los ácidos nucleicos y oligonucleótidos. El DC es sensible
a estructuras secundarias debido que la naturaleza precisa de las interacciones
determina la forma del espectro. Las principales conformaciones de los ácidos
nucleicos son la A y la B. En amortiguadores acuosos neutros con
concentraciones moderadas de sal, el ADN usualmente se encuentra en la forma
B, mientras que el ARN adopta la forma A. Estas conformaciones tienen espectros
de DC característicos que dependen de la composición de bases y en cierto modo
del tipo de azúcar (Johnson, 1996a). La variación en las formas espectrales con
respecto a la composición de bases es, por supuesto, significativamente más
importante con oligonucleótidos cortos. Por esta razón, el DC empleado, por lo
general, empíricamente en el estudio de la conformación de los ácidos nucleicos
se hace mediante la comparación de un espectro medido experimentalmente con
respecto al de un ácido nucleico de estructura conocida (Bishop y Chaires, 2002;
Johnson, 1996a).
Aplicaciones del dicroísmo circular
Cualquier cambio conformacional en la estructura de macromoléculas se puede
evaluar usando DC. De esta manera, el desdoblamiento de biomoléculas (tales
como proteínas, ácidos nucleicos, glucósidos, etc.) se mide como un cambio en el
espectro de DC, y sirve para dar una medida de la cantidad relativa de cambios
que han ocurrido en los componentes. Como para los espectros de absorción, es
bien sabido por ejemplo, que las proteínas nativas tienen un espectro de DC
característico, con cambios pequeños únicos para cada proteína particular
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(Fasman G.D., 1996; Hennessey J.P., Johnson W.C., 1981). La forma de la curva
del espectro, así como los máximos positivos y máximos negativos, proporciona
información acerca de la proteína. Así, por ejemplo, picos presentes en el rango
200-250 nm de la longitud de onda (UV-lejano) indican generalmente un espectro
con forma ―w‖ con puntos bajos alrededor de 222 y 208 nm siendo indicativo de la
presencia de estructuras α-helicoidales, y un espectro con forma ―v‖ con puntos
bajos alrededor de 217-220 nm es indicativo de estructuras correspondientes a
hojas β. Sin embargo, se han reportado precisiones de 97% para hélices, 75%
para hojas β, 50% para giros/vueltas, y 89% para otras estructuras secundarias,
respectivamente (Manavalan P., Johnson W.C. Jr, 1987).
El análisis en el rango del UV-cercano, 250-300 nm, proporciona información
acerca de la estructura terciaria. Otras partes del espectro, alrededor de 410 nm
pueden proporcionar información estructural para proteínas tipo hemo (Kelly S.M.,
Price N.C., 1997).
La unidad principal definida para el DC es la ―elipticidad‖, que se describe como la
tangente de la razón del eje elíptico menor
y mayor. En otras palabras, la
existencia de elipticidad se conoce como DC (Hammes G.G., 2005). De acuerdo a
la literatura, para reportar el DC de una muestra, se utiliza comúnmente la media
de elipticidad residual (grados cm2 dmol-1) y el dicroísmo circular molar o ∆ε (Lmol-1
cm-1) (Berova N., 2000).
Como se describe más adelante, las aplicaciones de espectroscopía de DC
pueden clasificarse en varias áreas de estudios biológicos tales como:
evaluaciones conformacionales de proteínas y ácidos nucleicos; termodinámica de
plegamiento y desplegamiento de biomoléculas; estudios de interacción de
biomoléculas asimétricas (interacciones proteína-proteína, interacciones DNAproteína, interacciones proteína-ligando e interacciones DNA-ligando); y cinética
de plegamiento y desplegamiento de macromoléculas.
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Análisis de proteínas
Determinación de la estructura secundaria de proteínas
La estructura secundaria de las proteínas se puede determinar por espectroscopía
de DC en la región espectral del ―UV lejano‖ (190-250 nm). A estas longitudes de
onda, el cromóforo es el enlace peptídico, y la señal se origina cuando éste se
localiza en un ambiente regular plegado (Kelly S.M., Price N.C., 1997). La energía
más débil de transición en el cromóforo del péptido es una transición n
*
observada a 210-220 nm, que involucra electrones no enlazantes de 0 del
carbonilo. Sin embargo, la energía más fuerte es una banda de absorción centrada
a 190 nm debido a la transición
que involucra los electrones
del carbonilo
(Hammes G.G., 2005; Berova N., 2000). Por lo tanto, la intensidad de las
transiciones depende de los ángulos de torsión de
y ψ. Las α-hélice, las hojas β,
y las estructuras helicoidales aleatorias dan lugar a un espectro de DC de forma y
magnitud característica, respectivamente (Figura 7) (Kelly S.M., et al., 2005).
Figura 7. Ejemplo de gráficas
mostrando espectros de DC en el UVlejano asociados con diversos tipos de
estructuras secundarias. Línea sólida:
α-hélice; líneas discontinuas largas:
hoja β antiparalela; línea punteada:
vuelta β tipo I; línea discontinua
cruzada: hélice 31 extendida o hélice II
poli (Prolina); línea discontinua corta:
estructura irregular. Modificada de
Kelly S. M., et al., 2005.
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Existen espectros de DC particulares para revelar la estructura secundaria de
cualquier proteína. Tal como se determinó, para los espirales al azar, el espectro
de DC en el UV lejano es positivo a 212 nm (n
) y negativo a 195 nm (
El espectro de DC de las hojas β es negativo a 218 nm (
nm (n
*).
*) y positivo a 196
). Para una α-hélice, el acoplamiento del excitón de la transición
conduce a un espectro (
*) perpendicular positivo a 192 nm, (
*
*) paralelo
negativo a 208 nm, y negativo a 222 nm desplazado hacia el rojo (Manavalan P.,
Johnson W.C. Jr, 1987; Kelly S.M., et al., 2005). La fracción aproximada de cada
tipo de estructura secundaria que está presente en cualquier proteína se puede
determinar analizando su espectro de DC en el UV-lejano como una suma de
múltiplos fraccionarios de tales espectros de referencia para cada tipo estructural.
Aunque el espectro de DC refleja un promedio de la totalidad de las moléculas
(por ejemplo, el 50% de una proteína contiene hojas β), la técnica no es tan
poderosa para determinar cuáles son los residuos específicos que participan en
cada región (Berova N., 2000; Kelly S.M., et al., 2005).
Técnicamente, el espectro de DC en el UV lejano requiere una solución de 20-200
µL con 1 mg/mL a 50 µg/mL de proteína, en cualquier amortiguador que no tenga
una absorbancia alta en esta región del espectro (por ejemplo, no deben de
emplear altas concentraciones de ditiotreitol, histidina, o imidazol en la región del
UV lejano) (Kelly S.M., et al., 2005; Kelly S.M., 2000).
Información acerca de la estructura terciaria de proteínas
El espectro de DC de una proteína en la región espectral del UV cercano (250-320
nm) puede ser sensible a ciertos aspectos de la estructura terciaria (Figura 8). A
estas longitudes de onda, los cromóforos son los aminoácidos aromáticos y los
enlaces disulfuro, y las señales que estos producen son sensibles a la estructura
terciaria global de las proteínas (Kelly S.M., et al., 2005).
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Figura 8. Espectro de DC en el UV-cercano para la deshidrocinasa tipo II de Streptomyces
coelicolor. Los rangos de longitud de onda corresponden a señales de cadenas laterales de
fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptófano (Trp). Modificada de Krell et al. 1996.
Los aromáticos permiten transiciones
del sistema de enlaces
* que están directamente en el plano
y son ortogonales uno del otro (Kelly S.M., 2000). Las
señales en la región de 255-270 nm se atribuyen al grupo fenil de residuos de
fenilalanina, mientras que señales de los 275-285 nm se atribuyen al grupo indol
del triptófano. Los enlaces disulfuro dan lugar a amplias señales débiles en todo el
espectro del UV cercano sin estructura vibrónica (Kelly S.M., et al., 2005; Kelly
S.M., et al., 2000; Krell T., et al 1996; Purdie N., et al., 1989).
El espectro
en el UV-cercano puede ser sensible a pequeños cambios en la
estructura terciaria debido a interacciones proteína-proteína y/o cambios en
condiciones de disolvente (Purdie N., et al., 1989). La intensidad de la señal de
espectro de DC en la región del UV cercano es mucho más débil que en la región
del UV lejano. El espectro de DC en el UV cercano requiere cerca de 1 mL de
proteína en solución con una densidad óptica a 280 nm de 0.5-1 (que corresponde
a 1 mg/mL de la mayoría de proteínas) (Kelly S.M., et al., 2000; Krell T., et al 1996;
Purdie N., et al., 1989).
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Comparabilidad de conformación
Con frecuencia, es necesario demostrar que una modificación en una proteína
genera conformaciones equivalentes para realizar su función adecuadamente
(Figura 9). Por ejemplo, después de una modificación (química/genética) en una
proteína específica, el DC es una buena técnica para comparar entre formas
nativas y modificadas (Kh. Tafreshi N., et al, 2007; Protasevich I., et al., 1997;
Hadizadeh Shirazy N., et al., 2007).
Figura 9. Espectro de DC en el UV-lejano para la luciferasa nativa (rLuc) y mutantes de
luciferasa (rLuc (Arg)). Modificada de Kh. Tafreshi et al. 2007.
Por ejemplo se mostró que la expresión de una mutante activa de luciferasa (rLuc
(Arg)) bajo las mismas condiciones que la forma nativa (rLuc) implica formación y
replegamiento de una luciferasa plegada apropiadamente sin agregación, lo cual
se confirmó por DC (Figura 9) (Kh. Tafreshi et al. 2007).
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Estabilidad térmica
La estabilidad térmica se evalúa empleando el DC para monitorear cambios en el
espectro con el aumento de la temperatura (Figura 10) (Kelly S.M., Price N.C.,
1997). En algunos casos, todo el espectro de DC en la región del UV cercano o
lejano puede monitorearse en una serie de temperaturas. Alternativamente se
puede elegir una sola longitud de onda que monitorea algunos factores específicos
de la estructura de la proteína, y la señal a esa longitud de onda se registra
continuamente a medida que la temperatura aumenta. El DC se usa regularmente
para evaluar el grado al cual el pH de una solución, amortiguador, y suplementos
tales como azúcares, aminoácidos o sales alteran la estabilidad térmica (Hassan
Sajedi R., et al., 2004; Hassan Sajedi R., et al., 2007).
Muchas proteínas se agregan o precipitan rápidamente después de desplegarse,
haciendo el desplegamiento irreversible. La reversibilidad de una reacción de
desplegamiento se puede evaluar enfriando la muestra y después calentándola
para observar si la reacción de desplegamiento se duplica (Kelly S.M., Price N.C.,
1997). Encontrar las condiciones de disolvente que hagan el despliegue reversible
es más importante para la estabilidad a largo plazo (vida útil) que el aumento de la
temperatura de fusión. Si la fusión es completamente reversible, la temperatura de
fusión está directamente relacionada con la estabilidad conformacional y la
termodinámica del plegamiento de la proteína se puede extraer de los datos de
DC (Kelly S.M., et al., 2005). Si la proteína precipita o se agrega cuando está
desplegada, la reacción de fusión será irreversible, y la temperatura de fusión
reflejara la cinética de agregación y la solubilidad de la forma desplegada de la
molécula como también de la estabilidad conformacional intrínseca. La
cooperatividad de la reacción de desplegamiento se mide cuantitativamente por el
ancho y forma de la transición de despliegue (Kelly S.M., 2000). Una reacción de
despliegue altamente cooperativa indica que la proteína existe inicialmente como
una estructura compacta, bien plegada, mientras que una reacción de fusión muy
gradual, no cooperativa indica que la proteína existió inicialmente como una
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proteína
muy flexible,
parcialmente
desplegada
o
como
una
población
heterogénea de estructuras (Kelly S.M., Price N.C., 1997; Kelly S.M., et al., 2005).
Figura 10. Ilustración esquemática de muestreos termales realizados para la misma proteína
(BAA) en dos amortiguadores diferentes. DC a 222 nm mostrado por BAA a diferentes
temperaturas en amortiguador TRIS en ausencia (línea gruesa) y en presencia (línea delgada)
2+
de 10 mM de CaCl2. En ausencia y presencia de Ca , los valores de Tm de BAA fueron 71.7 y
80 °C respectivamente. Modificada de Hassan Sajedi et al. 2004.
Punto de fusión de la estructura secundaria
Siguiendo los cambios a lo largo del espectro completo de DC en la región del UVlejano, se puede determinar si a altas temperaturas la proteína está perdiendo la
totalidad de su estructura secundaria, si pierde sólo una porción de su estructura
secundaria, o simplemente experimenta cambios conformacionales que involucran
un cambio en la estructura secundaria (Figura 11) (Riahi Madvar A., et al., 2005;
Hassani L., et al., 2006).
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Figura 11. Perfiles de puntos de fusión de la luciferasa nativa (N) y mutante (M). Los espectros
se tomaron a 25-70 ˚C en un amortiguador de fosfato (0.95 M, pH 7.0). Modificada de Riahi
Madvar A., et al 2005.
Ocasionalmente, la forma desplegada de una proteína poseerá una estructura
secundaria definida, pero no totalmente diferente con respecto a la forma nativa
(Kelly S.M., et al., 2005; Kelly S.M., 2000).
Punto de fusión de la estructura terciaria
Cambios en la estructura terciaria pueden seguirse al monitorear los cambios en el
espectro de DC en la región del UV-cercano. Tales estudios revelaran si la fusión
de una proteína se lleva a cabo en una reacción de un solo paso (con pérdida
concomitante tanto de estructura secundaria como de terciaria), o en una reacción
de dos pasos (Kelly S.M., 2000; Purdie N., et al., 1989).
Por ejemplo, en las curvas de fusión para barnasa al observar el DC con respecto
a la temperatura en el UV lejano (194 nm) y UV cercano (280 nm) a pH 5.5 y 2.4
(Figura 12), se indica una disminución pronunciada de DC a 194 nm con el
aumento de la temperatura y esto se debe a una fusión cooperativa de la
estructura secundaria, y la disminución a 280 nm indica pérdida de la estructura
terciaria. La congruencia de las curvas de fusión a 194 y 280 nm confirma que las
alteraciones en la estructura secundaria y terciaria son simultáneas (Schulga A., et
al., 1998).
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Figura 12. Curvas de puntos de fusión para barnasa a (1) pH 2.4 y (2) pH 5.5 desde la
dependencia de temperatura de DC a 280 (línea continua) y 194 nm (línea discontinua).
Modificada de Schulga et al. 1998.
Fusión de complejos proteicos
Se puede determinar el efecto de formar un complejo proteína-proteína (por
ejemplo, ligando-receptor, antígeno-anticuerpo, o dímeros/polímeros) sobre la
estabilidad térmica de proteínas individuales en el complejo (Figura 13) (Maroufi
B., et al., 2008). Esto funciona mejor si las proteínas individuales tienen espectros
de DC que sean bastante diferentes uno del otro, de tal manera que los cambios a
una longitud de onda específica se puedan monitorear para seguir los cambios en
la proteína correspondiente. En estos casos, es posible determinar si existe un
aumento en la estabilidad de una o ambas proteínas después de la formación del
complejo (Mattice W.L., et al., 1976).
El desplegamiento térmico de un monómero y un dímero de lisozima a pH 2
(Figura 13) muestra que la transición del monómero es sigmoidea con un punto
medio Tm (cerca de 52 °C), pero la forma de dímero para el desplegamiento
termal no es sigmoidea y su estabilidad cambia (Maroufi B., et al., 2008).
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Figura 13. Desplegamiento térmico del monómero de lisozima (A), y el dímero de lisozima (B)
como un complejo de proteína a pH 2 y monitoreado a 222 nm. Modificada de Mauroufi et al.
2008.
Determinación de estructuras proteicas tipo glóbulo fundido
El glóbulo fundido es una estructura estable que corresponde a un estado de las
proteínas donde están parcialmente plegadas y se encuentra en condiciones
ligeramente
desnaturalizantes
tales
como
bajo
pH,
con
un
compuesto
desnaturalizante suave o alta temperatura (Pande V.S., et al., 1998). Los glóbulos
fundidos se contraen y en general tienen una estructura secundaria similar a la
nativa pero una estructura terciaria dinámica como se ha visto por espectroscopía
de DC en el UV cercano y lejano (Kuwajima K., 2002; Alikhajeh J., et al., 2007;
Mossavarali S., et al., 2006; Asghari S.M., et al., 2004; Hosseinkhani S., et al.,
2004). Estos rasgos son similares a aquellos observados en los estados
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intermedios transitorios encontrados durante el plegamiento de ciertas proteínas,
especialmente en las proteínas globulares que experimentan colapso hidrofóbico,
y por lo tanto el término ―glóbulo fundido‖ también se usa para referirse a ciertos
estados intermedios durante el plegado de proteínas correspondientes a la región
más estrecha del túnel de plegado de mayor energía con respecto al estado
nativo pero más bajo que en el estado desnaturalizado. Se cree que los conjuntos
de glóbulos fundidos muestreados durante el plegamiento y desplegamiento de
proteínas son más o menos similares (Arai M., et al., 2000).
Los estudios experimentales del plegamiento de los intermediarios de diversas
proteínas globulares han demostrado que el glóbulo fundido es un intermediario
productivo real del plegamiento (Shokri M.M., et al., 2006). Las características
estructurales del estado de glóbulo fundido son evidentes y comunes entre
diferentes proteínas, e indican que el estado es estructuralmente intermedio entre
el estado nativo y el estado completamente plegado (Moosavi-Movahedi A. A., et
al., 2003).
La comparación entre el espectro de DC en la región del UV cercano y el UV
lejano de una proteína pueden demostrar como las modificaciones afectan su
estructura (Figura 14). Por ejemplo, la transición al estado glóbulo fundido
muestra estar acompañado por la pérdida de interacciones terciarias mientras que
la mayor parte de la estructura secundaria se conserva. Esto se pone de
manifiesto por la desaparición de las bandas de DC en la región del UV cercano y
el espectro de DC casi sin cambios en la región del UV lejano (Hosseinkhani S., et
al., 2004; Boren K., et al., 1999; Ptitsyn O.B. 1992). Como consecuencia, si una
proteína conserva su estructura secundaria pero no su estructura tridimensional
definida (por ejemplo, un plegamiento incorrecto o una estructura ―glóbulo
fundido‖), la señal en la región del UV-cercano será casi cero (Hosseinkhani S., et
al., 2004). Por otro lado, la presencia de señales significativas en el UV-cercano es
un buen indicativo de que la proteína está plegada en una estructura bien definida.
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Figura 14. Espectro de DC en el UV-lejano (A) y UV-cercano (B) para la glucosa oxidasa nativa
(N) y modificada (M). Modificada de Hosseinkhani et al. 2004.
Análisis biofísicos de péptidos que penetran la célula
Los péptidos penetradores de células (PPC) son péptidos con la capacidad de
trasladarse a través de la membrana plasmática de células de mamífero (Langel,
2007). Estas macromoléculas biológicas, han creado un nuevo horizonte en la
investigación biomédica para obtener formas más eficientes para transportar
cargas considerables tales como péptidos (Hallbrink M., et al., 2001; Pooga M., et
al., 1998), proteínas (Morris M.C., et al., 2001), plásmidos de DNA (Morris M.C., et
al., 1999), oligonucleótidos (Morris M.C., et al., 1997), ácidos nucleicos peptídicos
(ANP) (Koppelhus U., et al., 2002; Eriksson M., et al., 2002), e incluso
nanopartículas (Koch A.M., et al., 2003) o liposomas (Tseng Y.L., et al., 2002) a
través de la membrana plasmática en compartimentos celulares. El DC permite
una rápida estimación de las estructuras secundarias de los péptidos penetradores
de células y es muy adecuado para seguir los cambios en sus estructuras
secundarias dependiendo de la concentración, pH, amortiguador, y en la
naturaleza y composición de los lípidos (Herbig M.E., et al., 2007).
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Por ejemplo, la presencia de poliprolina II (PPII) en la estructura de un péptido rico
en prolina (como PPC) se puede evaluar fácilmente mediante DC (Pujals S., et
al., 2008; Rabanal F., et al., 1993). El espectro de PPII presenta una banda
positiva débil a 228 nm y una banda negativa intensa a 203 nm. Debido a la
debilidad de la banda positiva, ésta sólo se observa cuando se trabaja a bajas
temperaturas (Figura 15, inserto). Cuando se aumenta la temperatura, la
estructura del péptido PPII se hace más flexible, causando una disminución en la
intensidad de ambas bandas (Figura 15) (Pujals S., et al., 2008).
Figura 15. Espectro de DC de 50 µg de SAP a diferentes temperaturas (desde 0 hasta 70 ˚C,
un espectro cada 10 ˚C y hasta 90 ˚C) en un amortiguador acuoso de fosfato 10 mM a pH 7.
Inserto: amplificación de la región correspondiente a la banda de 228 nm. Modificada de Pujals
S. y Griralt E. 2008.
Del mismo modo, la estructura secundaria de penetratina (como un PPC) se ha
determinado en una serie de estudios bajo diversas condiciones. Como una
tendencia general, la penetratina está principalmente desestructurada en
amortiguador (ocasionalmente con una contribución significativa de hojas β) y se
transforma en una α-hélice en micelas de SDS y en liposomas de PC neutros,
mientras que en liposomas cargados negativamente se induce la formación de
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hojas β (Berlose J.P., et al., 1996; Magzoub M., et al., 2002; Thoren P.E., et al.,
2004; Magzoub M., et al., 2003). En otro estudio (Persson D., et al., 2004), se
demostró que la transición de α-hélice a hoja β ocurrió durante la agregación de
vesículas y una subsecuente transformación de vuelta a una conformación αhélice tuvo lugar durante la desagregación espontánea. La secuencia de
modificaciones de penetratina en la que uno o dos triptófanos son reemplazados
por fenilalanina tenía propensión a adoptar una estructura de hoja β, mientras
penetratina sin esta modificación tenía tendencia a la forma α-hélice (Magzoub M.,
et al., 2003). En general, la estructura secundaria de penetratina parece ser
altamente dependiente de varios factores clave, como el tipo y carga de los
lípidos, la concentración, y la relación péptido a lípido. En contraste a penetratina,
los análisis de DC de transportan (un PPC) mostraron que su estructura
secundaria es menos variable e independiente de la densidad de carga de los
lípidos. Transportan presentó cerca del 30% de α-hélices en agua y 50-60% en
sistemas modelo de membrana como micelas de SDS (Lindberg M., et al., 2001),
micelas de dodecilfosfocolina (Barany-Wallje E., et al., 2004), y vesículas
unilamelares (Magzoub M., et al., 2003).
Análisis de ácidos nucleicos
Comparación entre nucleótidos y nucleósidos
Los nucleótidos son los principales bloques de construcción, que constituyen la
estructura asimétrica de los ácidos nucleicos (RNA/DNA). El azúcar quiral de los
nucleótidos tiene una asimetría intrínseca y la fuerte interacción de la transición
* de las bases cromofóricas con la alta energía en los azúcares produce un
DC de baja intensidad (Van Holde K.E., et al., 1998). De hecho, el DC de ácidos
nucleicos depende principalmente de la geometría de apilamiento de las bases. La
diferencia en el DC entre un nucleósido, adenosina (A), y un dinucleósido fosfato,
adenil-3,5-adenosina (ApA), se ilustra en la figura 16 (Warshaw M.M., et al., 1970;
Bloomfield V.A., et al., 2000).
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El DC de un dinucleósido fosfato de adenosina es aproximadamente de un factor
10 veces mayor que el DC de una adenosina. En la adenosina, el DC depende de
la interacción de la adenina con su ribosa y los grupos fosfato; mientras que en los
dinucleósido fosfato, el DC se origina principalmente de la interacción quiral
adenina-adenina (Warshaw M.M., et al., 1970; Bloomfield V.A., et al., 2000). La
combinación de los extremos positivo y negativo en ambos extremos de los 260
nm se denomina banda del excitón; existe otra banda del exciton a 215 nm. Los
signos positivos (componente positivo de longitud de onda larga, componente
negativo de longitud de onda corta) de estas dos bandas indica que las dos
adeninas están formando un apilamiento diestro de ApA (Warshaw M.M., et al.,
1970; Bloomfield V.A., et al., 2000; Bush C.A., et al., 1967).
Figura 16. Espectro de DC de adenil-3´-5´-adenosina (ApA) comparado con adenosina (A).
Para ambas moléculas, los espectros están dados por mol de nucleósido. Los espectros son
para soluciones acuosas a pH 7 y a temperatura ambiente. Modificada de Warshaw M. M. et al
1970 y Bloomfield V. A. et al. 2000.
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Determinación de la conformación de ácidos nucleicos
El espectro de DC de ARN-A, ADN-A, ADN-B y ADN-Z en el rango de 200-320 nm
se muestra en la figura 17 (Bloomfield V.A., et al., 2000; Gray D.M., et al., 1981;
Sprecher C.A., et al., 1979; Gray D.M., et al., 1978; Riazance J.H., et al., 1985).
Figura 17. Espectro de DC arriba de 200 nm para ARN-A dextrógiro y ADN-A, ADN-B
dextrógiro, y ADN-Z levógiro (las unidades son por M/cm/mol de nucleótido) [Datos adaptados
de Bloomfield V. A. et al. 2000]. El ARN-A es del virus del hongo Penicillium chrysogenum de
ARN de doble cadena con un contenido de G + C del 54%; esta en trifluoroetanol al 80%,
fosfato 0.667 M, pH 7 [Datos adaptados de Sprecher et al. 1979]. El ADN-B es de E. coli en Na
+
0.02 M, pH 7 [Datos adaptados de Gray et al. 1978]. El ADN-Z es poli [d(CG) d(CG)] en NaClO,
pH 7 [Datos adaptados de Riazance et al. 1985].
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Tanto el ARN-A y el ADN-A tienen espectros de forma similar, el ARN-A tiene un
máximo cercano a 260 nm, un mínimo cercano a 210 nm, y un DC negativo
pequeño entre 290 y 300 nm. El ADN-A tiene un máximo a 270 nm, un mínimo
cercano a 210 nm y un DC cero a 300 nm y más allá (Bloomfield V.A., et al., 2000;
Gray D.M., et al., 1981). El ADN-B tiene un espectro de DC conservado por
encima de 220 nm con componentes aproximadamente iguales positivos (275 nm)
y negativos (245 nm) centrados alrededor de 260 nm (Bloomfield V.A., et al., 2000;
Sprecher C.A., et al., 1979)
El máximo del ADN-B tiene menos de la mitad de la magnitud máxima del ADN-A.
Por supuesto, las formas y magnitudes exactas del espectro de DC dependerá de
la secuencia de bases, pero el conjunto de patrones permanecerá constante
(Bloomfield V.A., et al., 2000; Riazance J.H., et al., 1985). El ADN-Z tiene un
espectro conservado arriba de 240 nm con componentes positivos (260 nm) y
negativos (290 nm) aproximadamente iguales centrados alrededor de los 280 nm
(Bloomfield V.A., et al., 2000; Gray D.M., et al., 1978).
Empleando DC de vacío se ha demostrado que los ácidos nucleicos dextrógiros
(ADN-A, ADN-B, ARN-A) tienen un pico positivo intenso cercano a 186 nm y un
DC negativo debajo de 180 nm; las moléculas levógiras (ADN-Z, ARN-Z) tienen un
pico negativo intenso a 190-195 nm, un híbrido a 184 nm, y un pico positivo por
debajo de 180 nm (Bloomfield V.A., et al., 2000; Riazance J.H., et al., 1985).
Los cálculos de DC para secuencias distintas a las medidas muestran que por
debajo de 220 nm las dobles hélices dextrógiras tienen un DC positivo pareado y
los dúplex levógiros tienen uno negativo pareado. Por lo tanto, un buen método
para determinar el sentido de una hélice dúplex es medir el DC en el rango de
longitudes de onda de 170 a 220 nm (Bloomfield V.A., et al., 2000; Riazance J.H.,
et al., 1985; Gray D.M., et al., 1990).
En resumen, el DC es la técnica más utilizada para comparar las conformaciones
de ADN o ARN y para detectar cambios cuando se cambia el solvente o la
temperatura. Por ejemplo, se ha encontrado que una diversidad de cambios en las
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condiciones (temperatura, disolventes alcohol, y alta sal) causan una disminución
en una longitud de onda específica (por ejemplo 275 nm) (Williams A.L. Jr, et al.,
1986; Nelson R.G., 1970; Gennis R.B., et al., 1972; Studdert D.S., et al., 1972;
Ivanov V.I., et al., 1973; Ivanov V.I., et al., 1974; Girod J.C., et al., 1973; Johnson
W.C. Jr, et al., 1974; Hanlon S., et al., 1975).
Sin embargo, la asignación de la ―forma C‖ del espectro de DC es crucial ya que
se encuentra a menudo, para el ADN, en sistemas condensados o empacados.
Estudios de DC de bacteriófagos (Maestre M.F., et al., 1971; Dorman B.P., et al.,
1973), adenovirus (Baase W.A., et al., 1979), cromatina (Shih T.Y., et al., 1970;
Hanlon S., et al., 1972) y nucleosomas (Lawrence J.-J., et al., 1976; Rill R., et al.,
1973), todos sugieren que el ADN adopta la estructura representada por este
espectro en condiciones biológicas (Bloomfield V.A., et al., 2000).
Determinación de interacciones ligando-ácido nucleico
El ADN es un blanco obvio para la intervención farmacológica ya que la
perturbación de su estructura indudablemente tendrá implicaciones biológicas
significativas. Por ejemplo, estudios sobre la interacción de porfirinas catiónicas
(como un ligando) y sus derivados con el ADN han recibido interés en los últimos
años (Asadi M., et al., 2005; Asadi M., et al., 2004). Particularmente, se ha
reportado que las porfirinas desde el punto de vista de su uso en la terapia
fotodinámica de las células cancerígenas (Fiel R.J., et al., 1981), cuchillas de ADN
(Prasueth D., et al., 1986; Magda D., et al., 1995) y como fármacos para el
tratamiento de algunas enfermedades infecciosas como el SIDA (Dixon D.W., et
al., 1990).
Los grupos fosfato cargados negativamente a lo largo del esqueleto de la
estructura del ADN puede unir moléculas pequeñas a través de interacciones
electrostáticas, pero los principales sitios de unión de los fármacos en una hebra
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de ADN de doble cadena son los surcos mayor y menor en la estructura de doble
hélice y la intercalación entre bases (Hammes G.G., 2005; Fornasiero D., et al.,
1981). Muchos de los fármacos utilizados contienen anillos aromáticos, y por
ejemplo de tal unión, se considera a la interacción del ADN con el colorante
naranja de acridina, aunque este compuesto no es un fármaco como tal (Hammes
G.G., 2005; Fornasiero D., et al., 1981), no es ópticamente activo por sí mismo,
pero su unión al ADN induce actividad óptica en la molécula. Esto sucede debido a
que la unión causa que los estados de energía electrónica del naranja de acridina
aquiral se acoplen con los estados de energía electrónica del ADN quiral. La
actividad óptica inducida es bastante común cuando moléculas pequeñas
aquirales se unen a macromoléculas quirales. El espectro de DC del naranja de
acridina unida a ADN se muestra en la figura 18 para diversas relaciones de
colorante unido/ADN (Hammes G.G., 2005; Fornasiero D., et al., 1981).
Figura 18. DC por mol de naranja de acridina unida a ADN a los valores indicados de (colorante
unido)/(ADN). Modificada de Hammes G.G., 2005; Fornasiero D., et al., 1981.
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El valor negativo de Δε se observa a valores muy bajos de colorante unido/
naranja de acridina, pero como esta proporción aumenta, una gran banda positiva
se desarrolla (Hammes G.G., 2005; Fornasiero D., et al., 1981). A las mayores
proporciones mostradas, se observan ambas bandas fuertes negativa y positiva.
Se ha desarrollado una interpretación molecular de estos resultados. A muy bajas
concentraciones de naranja de acridina, la unión es a través de la intercalación
entre las bases, con la estructura del anillo de la naranja de acridina paralela a las
bases (Hammes G.G., 2005; Fornasiero D., et al., 1981). Esto produce un DC
negativo inducido con un Δε mínimo de cerca de -8/M/cm. A medida que la
concentración de ligando aumenta, el colorante se une al surco que induce un DC
positivo con un valor máximo de cerca de -30/M/cm. Estas dos señales de DC
inducido se aumentan a altas concentraciones de colorante debido a interacciones
entre los niveles de energía electrónica de las moléculas de colorante unido
(Hammes G.G., 2005; Fornasiero D., et al., 1981). Este ejemplo demuestra la alta
sensibilidad del espectro de DC con respecto a la naturaleza del proceso de unión
y a la estructura secundaria del ADN. Se han llevado a cabo estudios con
diferentes tipos de ligandos (Safaei E., et al., 2007; Bathaie S.Z., et al., 2007).
Análisis nanoestructurales
Estudio conformacional de las biomoleculas al interactuar con
nanopartículas
La determinación del comportamiento conformacional de las biomoléculas
adsorbidas en una superficie de nanopartículas utilizando DC merece cierta
atención (Liu H., et al., 2007).
Aunque de un espectro de DC no es posible determinar exactamente si una
biomolécula mantiene su actividad biológica, es posible estimar el grado de
desnaturalización de una proteína o ácido nucleico comparando el espectro de DC
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de la forma nativa y de la forma inmovilizada en una superficie (Tziampazis E., et
al., 2000). Por ejemplo, empleando DC, se han estudiado proteínas del plasma
[tales como albúmina de suero bovino (BSA) y fibrinógeno en plasma humano
(FNG)] adsorbidas en diversas estructuras de nano polímeros y se demostró que
el contenido de α-hélices de BSA y FNG disminuye en poli(2-metoxietilacrilato)
(PMEA), PHEMA, y poli(2-etilhexilacrilato) (PEHA) comparado con BSA y FNG
nativos (Tziampazis E., et al., 2000). Por consiguiente, el contenido de estructuras
secundarias se pudo analizar cuantitativamente basándose en el espectro de DC y
fue obvio que el contenido de α-hélices de BSA nativa, BSA absorbida en la
superficie de PMEA, PHEMA, y PEHA fueron 51%, 37%, 15% y 8%,
respectivamente (Tanaka M., et al., 2000).
Del mismo modo, el cambio conformacional del ADN una vez que interactúa con
las nanopartículas funcionalizadas se ha determinado empleando DC (Ghosh P.S.,
et al., 2007; Goodman C.M., et al., 2006). Como se define, una mezcla de
nanopartículas de oro funcionalizadas en monocapa representan una estructura
prometedora para el desarrollo de moléculas reguladoras de ADN (Goodman
C.M., et al., 2004), y han mostrado ser vectores de transfección altamente
eficientes (Goodman C.M., et al., 2004). Algunos estudios revelaron que
nanopartículas de amonio funcionalizadas cuaternariamente cambian la señal de
DC en una medida sustancial (Sandhu K.K., et al., 2002). Por ejemplo, las
nanopartículas
catiónicas
terminadas
en
amina
(tales
como
NP_L-Phe)
desnaturalizan la estructura secundaria del ADN (Figura 19A), como se indica por
la disminución de la elipticidad a 280 nm después de la adición de las
nanopartículas (Ghosh P.S., et al., 2007).
En el caso de las nanopartículas con cadenas laterales hidrofóbicas, los espectros
de DC de las cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, NP_L-Trp y NP_L-Phe)
mostraron un desenrrollamiento más eficiente en comparación con las cadenas
laterales alifáticas (por ejemplo, NP_L-Leu; Figura 19B) (Ghosh P.S., et al., 2007).
Este desenrrollamiento aumentado surge probablemente del apilamiento
*
de los anillos aromáticos en la cadena lateral con las bases de ADN (Kikuta E., et
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al., 1999). Para las nanopartículas con cadenas laterales hidrofílicas, NP_L-Arg
desestabiliza la estructura del ADN más que NP_ L-Lys (Figura 19C) (Ghosh P.S.,
et al., 2007). Este efecto puede atribuirse a la posibilidad de enlaces de hidrógeno
estables entre la porción de guaninas de arginina y de las bases del interior del
ADN (Ghosh P.S., et al., 2007; Hermann T., et al., 2000).
Figura 19. El espectro de DC de 37-mer de ADN de doble cadena (0.25 µm) en un
amortiguador 5 mM de AcOH/NaOH (pH 5). (A) disminución en la elipticidad a 280 nm ( 280)
posterior a la adición de nanopartículas en una solución de ADN. Cambio en el espectro de DC
de ADN por (B) nanopartículas hidrofóbicas y (C) nanopartículas hidrofílicas (NP 0.6 µm).
Modificada de Ghosh et al. 2007.
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Información acerca de los nanoacarreadores
Los estudios de DC son usuales para la caracterización de nanovehículos como
dispositivos potenciales para el suministro de genes o fármacos en la
nanomedicina y sus interacciones con biomoléculas y fármacos han atraído
considerable atención en estudios recientes (Zhang X.G., et al., 2008; Wang X.H.,
et al., 1999; Singh J., et al., 2008; Kissmann J., et al., 2008). El DC no sólo permite
obtener información estructural ensamblada de los nanovehículos, también los
espectros de DC pueden predecir la eficiencia de tales nanomateriales en el
empacamiento de una construcción genética para suministrarla a una célula
huésped. Además, el análisis conformacional del ADN, antes (o después) de su
empacamiento en un nanovehículo se puede monitorear mediante DC (Caminade
A.-M., et al., 2005; Sadeghizadeh M., et al., 2008; Xu Y., et al., 1996; Chaumette
J.L., et al., 1998; Yevdokimov Y.M., et al., 2003).
Cuando un solo grupo quiral tal como el aminofenil propanediol (Chen Y.M., et al.,
1998) o binaftil (Rosini C., et al., 2000) están localizados en el centro de
dendrímeros PBzE, los datos de DC proporcionan información acerca de la
variación del ángulo
diedral en el binaftil (Murer P., et al., 1995). Para los
dendrímeros completamente quirales, las propiedades quirales de dos series de
dendrímeros poliarileter de generación 0 a 3 (Cicchi S., et al., 1998) y de
dendrímeros basados en dihidroxipirrolidina (Dennig J., et al., 2002) muestran que
el
espectro
de
DC
cambia
dramáticamente,
indicando
subestructuras
conformacionales en las ramificaciones.
Las variaciones en los espectros de DC de timo de ternera y ADN lineal
claramente indican una transición de la forma ADN-B A cuando se expone a
bajos niveles (<10 µg/ µL de solvente) de dendrosomas (Den123; auto-organizado
de monómeros anfipáticos) (Sadeghizadeh M., et al., 2008; Dennig J., et al.,
2002). Sin embargo, las variaciones espectrales en el timo de ternera y el ADN
lineal muestran una transición suave de ADN-B a ADN-A (un intermedio entre las
estructuras ADN A y B) cuando se expone a altos niveles de Den123 (mas de <10
µg/ µL de solvente) (Sadeghizadeh M., et al., 2008) (Figura 20).
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Figura 20. Espectro de DC de ADN de timo de ternera y su mezcla con Den123 (un anfipático
autoensamblable) con bajos niveles de este último; (2) Den/ADN: 1/17, (3) Den/ADN: 1/10, (4)
Den/ADN: 1/5, (5) Den/ADN: 1/1, (6) Den/ADN:5/1. (B) Espectro de DC de ADN de timo de
ternera mezclado con Den123 con altos niveles de este último; (1) solo ADN, (2) Den/ADN:
1/17, (3) Den/ADN: 1/10, (4) Den/ADN: 1/5, (5) Den/ADN: 1/1. Los datos se adaptaron de
Sadeghizadeh M. et al. 2008.
Análisis de DC indican que el ADN presente en el agua del espacio inter-laminar
está presente en la forma C en oposición a la forma más usual la forma B. Se
observó un cambio similar en la conformación del ADN (de la forma B a la C) una
vez que se dio el atrapamiento y la condensación del ADN en reversa en micelas
de tamaño nano formadas por surfactante no iónico (Budker V.G., et al., 2002). Si
el ADN estaba presente en el espacio central acuoso, se podría esperar que el DC
fuera prácticamente igual al de la forma B (Figura 21) (Kudsiova L., et al., 2008).
Estos cambios sugieren una alteración en la conformación del ADN cuando se
encapsula en las vesículas. Cambios similares en el espectro de DC se observan
para el ADN encapsulado en vesículas preparadas utilizando dipalmitoilfosfatidilcolina y DMPC (Budker V.G., et al., 2002).
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Figura 21. El espectro de DC de ADN de ternera en agua (presenta en su forma usual B) se
muestra en dos concentraciones, 0.01 y 0.025 mg/ml. En el espectro de ADN se observa un
desplazamiento significativo a la izquierda cuando el ADN se encuentra encapsulado en
nanovesículas. La longitud de onda cuando en el DC se registran cambio de ser positivo a
negativo se desplaza de 260 nm para el ADN en solución a 253 nm para el ADN encapsulado
en vesículas DSPC. La relación del máximo positivo al negativo DC la absorbancia para el ADN
dentro de las vesículas fue 3.87 comparado con 1.1 para el ADN de timo de ternera en solución.
Modificada de Kudsiova L. et al. 2008.
Análisis de las funciones biológicas del ADN en nanopartículas
La fabricación de nanocables está mostrando tener un gran potencial en el futuro
de los nanodispositivos (Gu Q., et al., 2006). En este sentido, los nanocables
magnéticos son de interés para los dispositivos de almacenamiento de memoria
(Yogeswaran U., et al., 2008), y los nanocables metálicos tienen un alto potencial
en los biosensores (Li Y., et al., 2006). Puesto que es esencial encontrar procesos
de fabricación rentables para estas nanoestructuras (Li Y., et al., 2006), un camino
prometedor es la utilización de biomoléculas en la nano-escala. Sin embargo, la
interacción entre biomoléculas y nanopartículas no se conoce, claramente. La
comprensión de la manipulación de las biomoléculas permitirá controlar mejor el
método de fabricación de plantillas de nanocables. Se ha demostrado que el ADN
tiene las propiedades deseadas para las plantillas de estructuras metálicas (Braun
E., et al., 1998). También se demostró que el ADN puede usarse para el ensamble
de nanopartículas metálicas y magnéticas, creando plantillas para nanocables de
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ADN (Kinsella J.M., et al., 2007). Con el uso de endonucleasas de restricción y
ADN ligasa, se demostró (en experimentos en gel), que las plantillas de los
nanocables de ADN se pueden cortar en secuencias específicas y después ligarse
juntos nuevamente (Kinsella J.M., et al., 2007). En tales estudios, el DC se puede
usar para examinar el mecanismo de recorte y ligación de las plantillas de los
nanocables de ADN (Kinsella J.M., et al., 2005). Por ejemplo, la manipulación
enzimática de las plantillas de ADN para los nanocables magnéticos y metálicos
se exploró a través de DC (Figura 22) (Kinsella J.M., et al., 2007; Jaganathana H.,
et al., 2008).
Se mostró que en proporción 1:1 ADN: nanopartícula (NP), el ADN molde digerido
y ligado era capaz de mantener la estructura de la forma ADN-B tanto para la NP
metálica y magnética. También a concentraciones de NP >1:5 ADN:NP, el DC
muestra desnaturalización y se inhibe la actividad enzimática (Jaganathana H., et
al., 2008). Por consiguiente, estos fenómenos muestran que
en altas
concentraciones de NP, el ADN molde pierde sus propiedades de bioreconocimiento, sin embargo, aún es capaz de mantener su estructura y
propiedades de doble hélice a bajas concentraciones. Estos
resultados
proporcionan información significativa con respecto a la alteración estructural y
eficacia de bio-reconocimiento del ADN molde después de la manipulación
enzimática (Kinsella J.M., et al., 2007; Jaganathana H., et al., 2008).
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Figura 22. Espectro de DC de moldes de ADN en diversas relaciones de masa ADN: NP que se
cortaron con la enzima de restricción BamHI. El esquema de colores indica nanopartículas (NP)
de (A) de oro y (B) Fe2O3. El DC de los templados se midió a temperatura ambiente. Modificada
de Jaganathana H. 2008.
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