Teórica 2 (29-02 tarde) Anexo

01
Curso de Postgrado:
Histología animal comparada: técnicas básicas para
microscopía óptica y electrónica (marzo 2016).
Técnicas Especiales para grupos de
Invertebrados.
Sexta Edición 2015
Índice de las pantallas al final
Λ=Զ=Z
MATERIAL DE DOCENCIA PARA CONSULTA
No utilice este material didáctico fuera de contexto.
Si no es capaz de desarrollar algo semejante, cite la fuente.
.
Histología Especial:
Para cultivos especiales consultar: [email protected]
En este apartado vamos a describir metodologías aplicadas a grupos de organismos.
02
Protistas con afinidad animal:
Ya hemos hablado de las coloraciones para frotis, las cuales se aplican perfectamente
aquí. Especialmente nos hemos referido brevemente, a la coloración de bacterias,
hongos y las técnicas aplicadas para los estudios parasitológicos (Pantalla 24).
Muestreo: La forma de obtención esta directamente relacionada con el hábitat donde
estos organismos se encuentran. Ellos aparecen en lugares comunes de muestreo como
plancton o bentos, pero ciertos organismos se concentran en lugares poco habituales
de la naturaleza: la película superficial de algunos cuerpos de agua, la espuma de mar,
el fango; son ejemplos de lugares que deben ser considerados en el momento de hacer
un muestreo para protistas.
Otro planteo diferente es cuando hay que considerar a los simbiontes, comensales o
parásitos. En estos casos deben ser ubicados los hospedadores respectivos, para
disponer de los organismos que conviven con ellos.
Para una mayor comprensión se dividirá a los protistas según la forma de locomoción.
Para cada subgrupo existen distintos tratamientos, ya que se busca dejar expuestas
ciertas partes celulares especiales que sirven a la taxonomía o a su descripción, como
tipos y distribución de cilias, flagelos, estructuras esqueléticas, de protección tantos
secretadas como agregadas, etc.
Paramecium
Vorticela
Amebas
Pseudópodos
Chaos
Flagelados
Parásito
intestinal
Ciliados
Giardia
.
Histología Especial:
Protistas con afinidad animal: (continuación)
03
Propósitos Generales: Se unta un portaobjetos o mejor un cubreobjetos con albúmina
glicerinada. Se agrega una gota de cultivo o de la muestra viva, se extiende y se deja
reposar unos minutos, que no se seque. Se fija con el líquido de Schaudinn [bicloruro
de mercurio saturado en frío 6 – 7 %, 2 partes; alcohol etílico absoluto o de 95 %, 1
parte; en el momento de usar se debe agregar ácido acético glacial al 1 %], durante
unos 5 minutos. Hidratar y defijar el mercurio. Teñir con hematoxilina – eosina; se
sugiere hematoxilina de Carazzi – eosina alcohólica o un carmín borásico de Grenacher.
Otros fijadores: también se puede fijar con los siguientes líquidos de Bouin, Clarke (Carnoy)
[alcohol etílico absoluto 30 mililitros; ácido acético glacial, 10 mililitros]; Champy [ácido crómico al
1 %, 7 partes; dicromato de potasio al 3 %, 7 partes; tetróxido de osmio al 2 %, 4 partes], Da Fano
[formol, 15 mililitros; nitrato de cobalto, 1 gramo; agua destilada, 100 mililitros] (Trégouboff &
Rose, 1957; Kudo, 1968). Se recomienda el ácido crómico de 0,5 a 1 %.
Amebianos: Actinópodos: se puede utilizar alcohol etílico de manera
general, observando las piezas esqueléticas y de protección, lóricas,
caparazones y conchas. Por supuesto que el alcohol etílico debe estar
libre de ácidos. Se recomienda realizar varias pruebas previas para
constatar la integridad de las piezas esqueléticas y de protección.
Foraminíferos: Solución Madre: bórax, 30 gramos en 1 litro de formol
(o hexametilentetramina, 200 gramos por litro) (nunca glicerofosfato
de sodio) (se puede utilizar la Solución Madre directamente); Solución
de Trabajo: 5 ml de la Solución Madre; propilen glicol, 4,5 mililitros;
propilen fenoxetol, 0,1 mililitros; 90 ml de plancton en agua de mar.
pH 8,2; Relación animales, fase líquida 1:9. Se mantiene entre 5 y 15
°C. Se guarda en frascos de 10 ml bien tapados.
Acantarios: Se agrega cloruro de estroncio (SrCl2.6H2O),
para que no se disuelvan las espículas, pero no mucho
porque puede precipitar sobre los organismos.
Acantario,
Acanthometron
Globigerina
.
Histología Especial:
Protistas con afinidad animal: (continuación)
04
Flagelados no calcáreos: Se fijan y se colorean con una solución yodada. Se agrega 1
mililitro de esta mezcla por 100 ml de muestra o gotas hasta color de té. Se decolora
con tiosulfato de sodio al 1 %.
Flagelados calcáreos: se procede como con los foraminíferos. No bajar de un pH 7.
Ciliados: Como anestésico general se recomienda el sulfato de níquel al 1 % o más
diluido. Se adiciona gota a gota. Es un veneno ciliar.
Tintínidos: fijar con Schaudinn y colorear con Feulgen o Giemsa.
Simbionte
en cloaca de
anfibios
Parásito
intestinal
Amoeba, azul de toluidina
Giardia, H - E
Balantidium, H -E
Los preparados se pueden montar en medios acuosos, aunque pueden perder color, o
en medios deshidratados, donde se puede perder nitidez. Recomiendo por lo tanto
hacer pruebas de coloraciones, variando tiempos y fundamentalmente montados en
distintos medios. Los resultados buenos en un principio, cambian con el tiempo, y
algunos preparados viejos, mejoran.
.
Histología Especial:
Técnicas de Impregnación Argéntica
Protistas con afinidad animal: (continuación)
05
Método para colorear microestructuras filamentosas e infraciliatura:
La infraciliatura es el conjunto de fibras y estructuras que se encuentran por debajo de la
membrana plasmática de los ciliados y como este tramado es constante sirve para clasificarlos.
También este método sirve para describir el sistema basal de los flagelos y demás filamentos
intracelulares. Para cortes existen otras técnicas de impregnación.
Tetrahymena
Método plata seco: confeccionar el frotis y secar al aire. Tratar entre
6 a 8 minutos por nitrato de plata al 2 %. Lavar y exponer a la luz
solar con fondo blanco entre dos y ocho horas. Controlar reducción.
Lavar, secar en estufa y montar directamente en bálsamo.
Método plata húmedo: confeccionar el frotis y fijar en solución saturada de
bicloruro de mercurio, 95 ml y 5 ml de formol comercial. Lavar bien (grifo y
destilada) y tratar con nitrato de plata al 2 %, durante 20 minutos. Agregar agua
destilada y exponer al sol entre 10 minutos y una hora, hasta reducción deseada.
Lavar bien con agua destilada y durante 3 minutos cada uno, y montar.
Método de Bodian modificado: hacer el frotis con albúmina glicerinada y
luego fijarla con formaldehído al 10 % o Bouin - Hollande. Lavar con agua
destilada y clarificar con hipoclorito de sodio al 2 % por no más de 30
segundos; sólo si es necesario porque hay mucha materia orgánica en el
medio (no se aconseja). Secar los portaobjetos y luego tratar con
proteinato de plata al 0,8 % (protargol en comercios). Colocar en estufa
a 45 °C por 30 minutos. Enjuagar con agua destilada a la misma
temperatura. Hidroquinona al 0,4 % (diluir de solución de sulfito de sodio
al 5 % con hidroquinona al 1 %), no más de 30 segundos y revisar por
microscopio (sacar enjuagar y observar; sí falta regresar a la solución de
hidroquinona). Detener al lavar con agua destilada y tratar rápidamente
Aspidisca
con tiosulfato de sodio al 2,5 % por 30 segundo. Deshidratar y montar.
Aclaración: haciendo los respectivos controles, se puede distinguir entre una sustancia argentafín
cuando sólo reduce la plata, y una sustancia argirófila cuando la impregnación es posible con una
reducción con mordientes, colocada antes o después. Si es argentafín es argirófila pero no al revés.
.
Histología Especial:
Porifera:
06
Conservación en seco: escurrir, envolver en papel de diario y poner al sol, luego
terminar de secar a la sombra en corriente de aire seco.
Conservación en líquido: se escurre y se pasa al alcohol etílico 70 %.
Propósitos histológicos: Debido a la presencia de espículas de sílice o de carbonato de
calcio, y a la generación de una alta proporción de células con contenido de reserva
(del tipo vitelo), se recomienda la siguiente técnica y luego continuar normalmente.
Doble inclusión de celoidina – parafina de Peterfi:
Material fijado en formaldehído
deshidratación; alcohol absoluto; benzoato de metilo o acetato de butilo + celoidina
(colodión) al 1 % (partes iguales) de 3 a 5 horas, 3 cambios, dejando en el último por
24 horas; 2 baños de benceno 15 minutos; benceno saturado de parafina a 30 °C en
estufa por 15 a 30 minutos; parafina sola. Luego, refijar en Bouin o Zenker (no olvidar
de desublimar o defijar) y descalcificar con líquido fijador de Jenkins o desilicificar.
Es muy importante la elección del
sentido del corte, para entender
la estructura de la esponja
.
Histología Especial:
Cnidaria y Ctenophora:
07
Anestesiar con el agregado de gotas de una solución de mentol (24 gramos en 10 ml de
alcohol etílico absoluto), hasta crear una capa sobre la superficie del recipiente y
tapar; se deja entre 12 y 16 horas; se fija. También se puede utilizar sales de
magnesio, manganeso o anhídrido carbónico y se fija. Las actinias se anestesia con
cloruro de magnesio. Para las medusas y sifonóforos se usa cloroformo gota a gota
sobre el cultivo o también cloruro de magnesio.
Fijar con paraformaldehído, 40 g; glicerofosfato de sodio, 5 g; agua de mar, 100 ml; probar con una
dilución 1:9 de formol al 0,2 % de hidróxido de sodio, luego de unas horas pasar al formaldehído al
4 %; dejar extender el animal en muy poca agua y añadir igual volumen de Bouin caliente (70 °C),
luego de unos minutos pasar a Bouin a temperatura ambiente y dejar actuar durante unas 12 horas,
se lava varias veces con alcohol etílico 70 % y guardar en esta concentración.
En estos animales las técnicas histológicas son muy difíciles de realizar, debido a la poca densidad
celular y a la existencia de una alta proporción de agua en la sustancia intercelular. Cualquier
método que endurezca el tejido, merece ser probado. Los hidrozoos se estudian mediante
transparentados. Las anémonas aceptan bastante bien los procesos histológicos. Las medusas y los
ctenóforos se distorsionan mucho con la deshidratación, pero mantienen su morfología. En este
último caso es mejor deshidratar todo el ejemplar y luego trozarlo para la inclusión.
Hidrozoo
Medusa
Anémona
Ctenóforo
.
Histología Especial: Cnidaria: (continuación)
08
Para medusas y ctenóforos: al fijar sólo usar formaldehído al 4 o 5 % tamponado con
bórax (no hexaminas). Para que las medusas, no se contraiga se puede sumergir
previamente, en agua dulce. Se pueden conservar en glicerina, 20 partes; alcohol
etílico 70 %, 40 partes; agua 40 partes; cambiar el líquido poco a poco.
Platyhelminthes: (de vida libre)
Anestesiado: Para propósitos generales se pueden utilizar cloruro de magnesio al 8 %,
hidroxilamina al 1 % (en marinos); o gotas de alcohol etílico al 10 % o cloruro de
magnesio al 2,5 % (de agua dulce). Los gusanos planos libres (microturbelarios), se
pueden narcotizar con alcohol etílico 10 %, agregado muy lentamente al cultivo.
Fijación: Procedimiento 1: dejar que se desplacen por el fondo del recipiente y cuando
están estirados cubrirlos con sublimado ácido de Steinmann – Breslav [un volumen de
ácido nítrico; un volumen de cloruro de mercurio al 5 % en solución fisiológica; un
volumen de agua destilada]; se lava en alcohol etílico 30 %; desublimar con alcohol
etílico yodado y conservar en alcohol etílico 70 %.
Procedimiento 2: Gotas de ácido nítrico al
2 %, cuando muertos, fijar con 0,7 % de
cloruro de sodio en solución saturada de
sublimado corrosivo (bicloruro de
mercurio) 30' => alcohol etílico 70 %
yodado => alcohol etílico 70 %.
En general, se puede fijar en líquidos
Dalyellia viridis, un
fijadores que contengan cloruro de
microturbelario
mercurio, desublimar y pasar a alcohol
etílico 70 %. Es aconsejable también
utilizar Bouin caliente. Los temnocéfalos
Temnocéfalo,
se los fija en líquidos fríos.
simbionte de cangrejos de agua dulce
.
Histología Especial: Platyhelminthes: (continuación)
09
Fijación de helmintos parásitos. Método de Brumpt: se extrae el parásito del medio y se
lo coloca en un portaobjetos; se pasa una o dos veces por la llama de un mechero
Bunsen y se fija en una parte de formaldehído 5 % y cuatro partes de alcohol 96 % .
También se aconseja usar Bouin caliente (+ o – 50 °C) entre dos portaobjetos.
Cestodo
Monogeneo
Trematodo
Planaria de tierra (Bipalium)
Fijación de planarias: Colocar la planaria sobre un portaobjetos y se le agrega unas
gotas de fijador para atontarlas y rápidamente colocarle un cubreobjetos y sumergir
todo en fijador (Zenker o Bouin). El ácido acético a bajas concentraciones las atonta.
Planaria transparentada,
coloreada con carmín
Planarias,
difíciles de fijar, mucha
práctica y paciencia. También
probar con Bouin caliente.
Planaria con
“coloración natural”
Alimento con colorante
.
(Nemertea, Priapulida, Sipunculida, Echiurida, 10
Enteropneusta, Pterobranchia)
Gusanos no segmentados marinos:
Histología Especial:
Anestesiado: Este paso es muy importante ya que para la determinación de estos
animales se necesita que estén bien relajados, especialmente si poseen tentáculos y se
necesita que se encuentren desplegados para una buena observación. En forma
general se anestesian con sulfato de manganeso, monohidratado al 2 % o solución de
cloruro de magnesio hexahidratado, al 7,5 % o sulfato de magnesio heptahidratado al
20 %, en el agua de mar, o solución fisiológica isotónica. Mezclar partes iguales del
cultivo o del medio donde se encuentran los organismos y esta solución. Probar porque
las soluciones de sales de magnesio o manganeso dan resultado disímil.
Se aconseja dejar a los animales que se distiendan en un recipiente con
agua de mar; agregar gotas de una solución de mentol en alcohol
Echiurida
etílico, hasta crear una capa sobre la superficie del recipiente y tapar,
que las corrientes de agua con alcohol etílico no lleguen a los animales;
se dejan entre 12 y 16 horas. Cuando no reaccionen, se disponen como
uno quiere y se los fija. Para que el introvertio de los priapúlidos y
sipuncúlidos quede hacia fuera, es necesario ejercer alguna presión,
especialmente luego de la anestesia y antes de la fijación.
Nemertea
Sipunculida
Priapulida
.
(Nemertea, Priapulida, Sipunculida, Echiurida, 11
Enteropneusta, Pterobranchia.)
Gusanos no segmentados marinos:
Histología Especial:
Fijación: Luego de una buena anestesia no es importante la fijación. Ésta puede ser con
formaldehído 2 % tamponado o con alcohol etílico al 96 %.
Para fines histológicos pueden utilizarse un gran número de líquidos fijadores, pero
dan muy buenos resultados los que tienen en su composición bicloruro de mercurio.
Se puede utilizar el líquido de Kleinenberg o picrosulfúrico [agua saturada con ácido
pícrico, con 2 % de ácido sulfúrico], utilizar en forma directa o diluyéndolo con 3
volúmenes de agua isotónica y se puede utilizar para todos los animales. También con
alcohol etílico 70 % al 0,5 % de ácido crómico, se pueden conservarlos en este líquido.
El Bouin, el Bouin – Hollande y el Helly, dan buenos resultados pero las coloraciones
pueden ser poco brillantes. Se conservan en alcohol 70 %, con hasta 10 % de
glicerina.
Enteropneusta
Pterobranchia (colonia)
.
Histología Especial:
Nematoda:
12
Anestesiado: Se narcotizan con gotas de cloroformo agregadas al medio, hidrato de
cloral en solución al 10 %, sulfato de magnesio al 20 %, en la solución fisiológica o
agua de grifo declorada. Siempre hacer pruebas, aislando a los animales y
anestesiarlos por separado.
Fijación: Probar con los siguientes procedimientos: con calor, luego se conservan en
formaldehído al 5 %; con formaldehído al 5 % caliente a 40 o 50 °C; con FAAGO
[formol comercial, 5 ml; alcohol etílico 50 %, 90 ml; glicerina, 1,5 ml; ácido acético, 2
ml; trazas de ácido ósmico], caliente a 50 °C; con solución saturada de cloruro de
mercurio, sólo o con formaldehído al 4 % (aa), se puede usar caliente o fría; con 1
volumen de formol, 1 volumen de ácido acético, 8 volúmenes de agua destilada; con 10
ml de alcohol etílico 96 %, 30 ml de formol, 5 ml de ácido acético, 200 ml de agua
destilada; con formol ácido [formol, 10 ml; ácido acético, 10 ml; agua destilada, 10 ml].
Los nematomorfos se pueden tratar de la misma manera.
Los preparados se realizan dejando reposar a los animales en
muy poco de agua de cultivo y adicionarle el mismo volumen de
formol ácido caliente a 50 °C (no dejarlos mas de 24 horas); se
pasan a glicerina y se colocan en cámara de evaporación (bajo
vacío y ligeramente caliente a 25 °C); se montan a los animales
directamente en glicerina nueva. Enjuagar el fijador.
Otra forma es fijar en formol ácido; se pasan a una mezcla de
formaldehído al 5 % y lactofenol [ácido láctico, 46 ml; fenol, 60
ml y glicerina 96 ml] al 5 %, evaporar a 40 °C; lactofenol puro y
cementar. Se puede usar esmalte de uñas como cementante. Se
pueden colorear con trazas de azul de algodón o fucsina ácida
(0,1 %) en la mezcla de formol y lactofenol.
Deshidratar mediante la solución: 20 partes de alcohol 96 %, 1 parte de glicerina y 79 partes de
agua y colocar el recipiente en cápsula cerrada con alcohol 96 %. Pasar a 5 partes de glicerina y 95
de alcohol 96 %.
.
Histología Especial:
13
Annelida:
Anestesiado: Polychaeta: con alcohol etílico 70 % gota a gota, en el agua de mar; se
mezcla partes iguales de agua de mar y una solución al 7,5 % de cloruro de magnesio
hexahidratado, o una solución al 20 % de sulfato de magnesio monohidratado. Para los
tubícolas se puede usar hidrato de cloral al 0,2 %.
Oligochaeta: primero purgarlos dejándolos en caja de Petri, con papel de filtro por 48
horas, húmedos y sin luz. Utilizar alcohol etílico 10 % agregado gota a gota en el agua
de cultivo (microdrilos) o agua declorada (megadrilos), hasta que pare de moverse y
adicionar hasta insensibilidad. Si el animal se excita tratar con menos concentración.
Probar con hidrocloruro de hidroxilamina al 2 %.
Hirudinea: Igual que con los oligoquetos. También con cloroformo o clorhidrato de
cocaína, durante 1 a 5 horas hasta que no reaccionen al ser estimulados con un pincel.
Poliquetos
(marinos)
Hirudíneos (de agua
dulce y terrestres)
Oligoquetos megadrilos
(terrestres)
Oligoquetos microdrilos
(de agua dulce)
.
Histología Especial: Annelida: (continuación)
Fijación: Polychaeta: Para todos planctónicos y
bentónicos se usa formaldehído al 2 % tamponado
o alcohol etílico 70 % o alcohol etílico 70 % con
Chaetogaster limnaei /
un 3 % de yodo, lavar con alcohol etílico 70 %,
Biomphalaria tenagophila
tres veces. También se puede usar, Bouin a 60 °C,
Forético y depredador
en pequeño volumen hasta muerte y luego Bouin
normal durante 1 a 3 horas y pasar a alcohol etílico En el caso especial de
los poliquetos, es mejor
70 %. Para cortes histológicos dan excelentes
sacarles las acículas y la
resultados los fijadores que contengas mercurio.
mayoría de las quetas
Las soluciones de formaldehído o alcohólicas, se
luego de la fijación,
pueden dejar por mucho tiempo, pero luego se
debido a que al realizar
deben pasar al alcohol etílico al 70 %, con un 10
los cortes histológicos
% de glicerina. Los tubos o habitáculos se deben
puede arrastrar tejido y
dejar en alcohol etílico 70 %, los calcáreos deben
perder datos
importantes. En
estar protegidos contra la disolución con
oligoquetos con muchas
soluciones tamponadas.
quetas (Megascolecide)
Oligochaeta: Macrodrilos: fijarlos con alcohol
también puede ser útil
etílico 70 %, Bouin o Zenker.
realizar los cortes luego
Microdrilos: se fijan directamente con Schaudinn
de la zona de quetas.
(desublimar) o alcohol etílico 70 %.
Es muy importante
Otros fijadores: Baker, Bouin o Zenker. Cortar el
purgar los oligoquetos
extremo posterior de los animales para que el
terrestres, para que no
se dañen los tejidos ni
fijador penetre.
la cuchilla.
Hirudinea: Con Schaudinn o alcohol etílico 50 % formaldehído 2 %, mitad y mitad. Se conservan en Glossiphonia (hirudíneo con
alcohol etílico 80 % o formaldehído 5 %.
probóscide que pueden protruir)
14
.
15
Histología Especial:
Mollusca:
En general: Anestesiado: Probar con sales de cloruro de magnesio;
solución al 1 % de una mezcla de acetona – cloroformo;
mezcla de 1 parte de glicerina, 2 partes de alcohol etílico 70 %, 2 partes de agua de
mar;
solución de hidrato de cloral al 0,1 %;
solución saturada de mentol en alcohol etílico 70 % o 96 %, agregar gotas sobre la
superficie del cultivo (5 o 6) de acuerdo con la superficie del recipiente y tapar.
Cuando los animales no reaccionan al pincharlos se retiran de la concha y se los fija.
Pulpos
Calamares
Sepias
A los cefalópodos se le coloca en el saco visceral un
algodón con éter o cloroformo.
Los poliplacóforos necesitan que los anestesien y los
dispongan, antes de fijarlos, atados a trozos de
vidrio o material plano inerte, para que queden
estirado, con el pie lo más plano posible.
Quitón
.
Histología Especial:
Mollusca: (continuación)
Hay que cuidar las estructuras de
carbonato de calcio.
16
Fijación en general: solución al 4 % de formaldehído neutralizado y tamponado a pH 8;
líquido de Bouin, ojo, deteriora las conchas;
líquido de Newcomer [6 partes de alcohol etílico isobutílico, 3 partes de ácido
propiónico, 1 parte de éter de petróleo, 1 parte de dioxano, 1 parte de acetona],
deteriora las conchas y es peligroso;
animales con conchas en alcohol etílico 70 % libre de ácido. No se usa hexaminas.
Los cefalópodos necesitan de inyecciones con fijador para acelerar la fijación interna,
especialmente en la cavidad paleal y en la cavidad general, en pulpos se recomienda
una inyección en la “cabeza” y por la boca.
Gastropoda: Anestesiado: Para los caracoles terrestres se utiliza un método poco
ortodoxo, sumergir a los animales en agua, no permitiéndoles que tomen aire.
Para los animales de agua dulce se puede utilizar gotas de una solución de mentol en
alcohol etílico.
Se puede inyectar cocaína al 2 % a nudibránquios y tectibránquios, para anestesiarlos.
nudibránquios
tectibránquios
.
17
Histología Especial:
Mollusca: (continuación)
Bivalvia: Se anestesian con alcohol, hidrato de cloral, cocaína o derivado artificial.
La fijación es igual a los gasterópodos.
Para el estudio de las conchas, se pueden tratar con agua caliente (70 °C) hasta que se
abran las conchas y conservarlos en alcohol etílico 70 %. No usar formaldehído no
tamponado. No se tampona con hexaminas, porque ablandan las valvas.
Bivalvo de
agua dulce
Bivalvo
marino
Moluscos planctónicos: se narcotizan con
sales de cloruro de magnesio; 1 % de
acetona cloroformo (Pruvot-Fol, 1924); 1
parte de glicerina, 2 de alcohol etílico 70 %
y 2 de agua de mar; o hidrato de cloral,
0,1 %.
Un agente como el frío es muy útil en los
momentos previos a la fijación. Solamente
dejar a los animales en una heladera o con
hielo y agua que baja la temperatura a 4 °C
o 0 °C, respectivamente.
Limacina
Clio
.
Histología Especial:
Mollusca: (continuación)
18
La fijación para estudios sistemáticos
basados en las conchas: dejarlos en alcohol
etílico 70 % libre de ácidos y con glicerina,
o formaldehído al 3 o 4 % tamponada en
agua de mar y neutralizar la solución
fijadora.
Otra forma de preparar conchas de
moluscos es fijarlos en alcohol etílico al
75 %, en el campo; en el laboratorio
hervirlos y separar partes blandas de la
concha y poner ambas en alcohol etílico
60 %, luego de 24 o 36 horas y cambiar al
alcohol etílico 70 %. El opérculo se pega
con algodón y se ubica dentro del ultimo
anfracto (vuelta).
Los colores de las conchas se reavivan
mediante una solución de aceite para niños.
Para propósitos histológicos: formaldehído al 4 % en agua de mar y neutralizado;
Bouin; Newcomer [6 partes de alcohol etílico isopropílico; 3 de ácido propiónico; 1 de
éter de petróleo; 1 de dioxano y 1 de acetona]; solución de Perenyi [4 partes de ácido
nítrico al 10 %; 3 de alcohol etílico 70 % y 3 de ácido crómico al 0,5 %]; todos durante
5 horas.
Para histología de órganos específicos se recomienda retirar el órgano y fijarlo por
separado. En caso de animales grandes se deben inyectar fijador, especialmente en la
cavidad general.
.
Histología Especial:
Mollusca: (continuación)
19
Adicional: Para estudios anatómicos, sacar a los gasterópodos terrestres y de agua
dulce de sus conchas, mediante agua a 70 °C, o colocarlo en congelador durante unos
minutos. No servirían para histología, ya que no se protegen los tejidos.
Para rescatar sólo las conchas: se matan por mentol durante 24 o hasta 3 días en
invierno y hervirlo por 20 minutos a media hora; retirar con pinza las partes blandas, si
queda algo dejar uno o dos días en agua hasta que se pudra y sacar con chorro de agua.
Si no importa la concha, se puede fijar y descalificar con el líquido de Jenkins o se
puede usar un descalcificador por intercambio aniónico como el hexametafosfato de
sodio al 5, 10, 20 % durante 24 horas cada una de las soluciones.
Sistema nervioso de pulmonados: se fijan con 6 parte de ácido acético en 100 ml de
alcohol etílico 90 %, o 15 o 20 minutos de bicloruro de mercurio 5 % en ácido acético
al 5 %; se colorean con azul de metileno al 1 % de 12 a 24 horas.
Rádulas: se colocan la cabeza en hidróxido de potasio o sodio al 10 % una hora o
hervirlos. Se pueden colorear: Solución A: Ácido pícrico, 1 g; carmín, 0,5 g; agua
destilada, 100 ml. Hervir durante 10‘, enfriar y filtrar. Solución B: azul de anilina al 1 %
en ácido acético al 1 %. Uso: Acidificar mediante ácido acético al 1 % durante 20 o 30
minutos. Solución A durante 15' o 20‘ o a 60 °C. Diluir B en el momento de usar 1:1 con
agua destilada, de 30" a 1'. Deshidratar y montar. La Solución A se puede usar durante
30‘ y la B diluida 1:3, poner y sacar; diferenciar en alcohol 70 % y 96 % durante
mucho tiempo para que salga el color.
Rádulas
de
moluscos
.
20
Histología Especial:
Generalmente, tanto en gusanos como en
moluscos, se desarrollan técnicas histológicas para
estimar el grado de maduración de los animales,
por lo que se realizan cortes de las gonadas, uno
de los estudios más simples en histología. Para lo
cual, no se necesita una metodología específica, se
pueden seguir desde lo indicado para vertebrados,
hasta algunas cosas dichas aquí, en la parte de
Histología General. Se pueden medir los tamaños
de los huevos para inferir la etapa de maduración
en que se encuentran los animales.
Atención: hay que estimar el grado de
deshidratación para calcular el tamaño verdadero.
Con el peso de la gonada se puede estimar además, Gonada madura de un crustáceo;
Astacus, langostino.
la cantidad muy aproximada de huevos maduros.
Etapa juvenil
Etapa madura
Etapa prerreproductiva
Distintos
estados en
la
maduración
de la
gonada de
un quitón
.
Histología Especial:
Arthropoda: Insecta
21
Anestesiado: El alcohol etílico, el éter de petróleo, cloroformo, cianuro de potasio o
tetracloruro de carbono, son las drogas de mayor uso para anestesiar a insectos. OJO
con el cianuro de potasio y el tetracloruro de carbono.
Langostas
Grillos
Cucarachas
En muchos insectos es muy
necesario el anestesiado debido
a que muchos poseen apéndices
(antenas, patas, alas, ovipositor,
cercos, órganos sensoriales)
muy delicados, que en el proceso
de muerte pueden ser
eliminados o rotos. Muy
especialmente si se utiliza
alcohol etílico 70 %.
Mántidos
Fijación: Para los imagos (adultos) se puede utilizar alcohol etílico a 70 % es el mejor
de los fijadores. Para conservarlos es mejor agregar un 5 % de glicerina.
El siguiente método sigue dando muy buenos resultados; método de Hennings (1900):
acido nítrico concentrado, 16 ml; ácido crómico al 0,5 %, 16 ml; solución saturada de
sublimado en alcohol etílico absoluto, 24 ml; y saturada de ácido pícrico, 12 ml.
Tratamiento para que la quitina se ablande: a) agua de Javel (hipoclorito de sodio,
agua lavandina); b) agua o licor de Labarraque (hipoclorito de potasio) diluir de 4 a 6
veces y tratar de 10 a 24 horas.
.
Histología Especial:
22
Arthropoda: Crustacea
Anestesiado: Utilizar alcohol etílico al 10 %,
agregado gota a gota.
Fijación: En general se fijan con: 1) solución de 3 o 4
gramos de bórax en 100 ml formol (dura 1 o 2
meses) y se filtran. Se reserva. 2) solución anterior
(1), 5 ml; propilen fenoxetol, 0,5 ml; propilen glicol,
4,5 ml; agua de mar, 90 ml. pH 7,6 a 8,3; se debe
mantener la relación 1:9, entre animales y volumen.
Se preservan en alcohol etílico 70 %, pero subir
gradualmente desde el agua destilada con 30 %, 50
% y 70 %; durante 1 hora por cada solución.
Los animales grandes se anestesian y se les inyecta
el fijador. Siempre es mejor retirar los órganos por
disección y tratar aparte.
Para cladóceros, copépodos y, llevar la muestra
a formaldehído al 4 % de a poco, filtrar y pasar
a alcohol etílico 96 % con 40 ml de glicerina por
litro, para que no se sequen completamente, sí
se abren los frascos. Para contar o clasificar los
animales se puede pasar a formaldehído 2 %. Sí
es necesario disminuir la tensión superficial
usando detergente.
Los ostrácodos se pueden fijar en alcohol etílico
70 %; filtrar en gasa o criba de nylon y
sumergir durante unos segundos en agua
hirviendo, para que las conchas se abran y se
pueda determinar o censar.
cladócero
copépodo
ostrácodo
.
Histología Especial:
Arthropoda: Quelicerados
(arañas, ácaros, opiliones, escorpiones, etc.)
23
Anestesiado: Si hace falta utilizar éter o tetracloruro de carbono. No permitir que los
animales se lastimen entre ellos cuando se los coloca en el frasco matador. No dejar a
los animales capturados vivos durante mucho tiempo, anestesiarlos hasta la muerte o
fijarlos inmediatamente.
Fijación: alcohol etílico 70 % directo. Para ácaros
acuáticos (no parásitos): se usa únicamente la mezcla de
Koenike: 10 partes de glicerina; 3 partes de ácido acético;
6 partes de agua destilada.
Procedimiento para el montado de piezas: las parte
blandas de los animales se hidroliza con hidróxido de
potasio al 2 %, durante 24 horas, lavar bien y deshidratar
dejando 1 o 2 ml de agua y el ejemplar, y añadir alcohol
etílico 95 %, 3 cambios de 10 o 15 minutos; se coloca un
fondo de glicerina en el portaobjetos de acuerdo con el
ácaro
tamaño del animal y colocar el animal desde el alcohol
etílico 95 %. Sin hidrolizar fijar, dejar en formol o alcohol
opilión
etílico y montar en glicerina en todos los casos.
araña
escorpión
.
Histología Especial: Otros artrópodos:
24
Anestesiado: El éter de petróleo da excelentes
resultados cuando el material biológico se
encuentra en medio seco. Si esta en un medio
líquido como agua de alguna forma de extracción
Paurópodo
(embudo de Tullgren o luego de lavar tierra),
Notostracos
Tardígrados
agregar alcohol etílico en gotas, si es necesario.
Probar mezclando partes iguales del cultivo o
donde se encuentran los organismos y alguna de
estas soluciones: solución de cloruro de magnesio
hexahidratado, al 7,5 o sulfato de magnesio
heptahidratado al 20 %, en el agua de mar,
isotónica; solución de cloruro de manganeso
Bicho bolita
hexahidratado al 2,5 % en agua dulce, isotónica;
alcohol etílico al 10 %, agregar gota a gota hasta
que se queden quietos y agregar más; solución de
mentol en alcohol etílico (24 gramos en 10 ml de
alcohol etílico absoluto).
Ciempiés
Fijación: Se usa alcohol etílico 70, 85 o 96 %, caliente o no, o formaldehído 5 %.
Se aclara con creosota o hidróxido de potasio al 5 %.
De las muestras completas fijadas se pueden extraer los animales, limpiarlos bien,
porque generalmente están acompañado con partículas de sedimento. Se debe separar
el material biológico, bajo lupa de binocular y luego separar los distintos grupos.
Las larvas luego de anestesiadas puede ser fijadas en Bouin a 60 °C, adicionar de golpe
al recipiente con poca agua y los ejemplares, luego de muertos, pasarlos a Bouin a
temperatura ambiente, durante 1 a 3 horas y guardar en alcohol etílico 70 %. Las
pupas necesitan de más tiempo de fijación, 12 horas.
.
Histología Especial:
Un caso difícil
25
Los cirripedios son crustáceos, muy modificados, por estar adaptado a la vida
sésil. Con paredes de carbonato de calcio, muy espesas. Para hacer un estudio
sobre su maduración se deben cortar unos 30 animales, 5 mm de largo.
Partimos del formaldehído al 5 %; se los descalcifica (Jenkins); se refijan en
Bouin – Hollande; se los incluyen en parafina y se los corta sabiendo que la
gonada se encuentra en la parte basal del animal. Se diferencian machos de
hembras y se catalogan los distintos estados de maduración de las hembras.
Notobalanus
flosculus
1: tejido basal
(conectivo basal).
2: corte del ovisaco en
crecimiento.
3: ovisacos maduros.
4: oocitos maduros.
Gonada
Se detectaron 6 estados
del desarrollo; tres
relacionados con el
tejido basal y 3 basados
en los oocitos.
Se observan los daños
producidos por el ácido
clorhídrico durante la
descalcificación.
.
Histología Especial:
26
Echinodermata:
Anestesiado: Este proceso no es necesario, pero se puede pasar por un ligero
tratamiento con una solución de formaldehído al 2 % para tranquilizarlos. El agua
dulce puede actuar como tranquilizante. Cuidar los apéndices en crinoideos y erizos.
Fijación: estrellas, ofiuroideos, erizos y crinoideos se pueden fijar directamente en
formaldehído al 4 % neutralizado y tamponado, y luego se los conservan en
formaldehído al 2 %, recontraneutralizado y recontratamponado. Mejor se conservan
Ofiuro
en alcohol etílico neutralizado. También se recomienda fijar con Baker.
Una forma general de tratamiento para animales secos (menos
holoturoideos) es enjuagar muy bien con agua común de grifo, hasta
que se pierda la mucosidad y luego secar rápidamente al sol, en
estufa u horno, y envuelto en papel de diario. Se puede por disección
vaciar a los erizos y presentar sólo la carcaza, limpia y seca.
Pepinos de mar: se admite el anestesiado por pasaje por agua dulce,
fijación por formaldehído al 4 % neutralizado, o alcohol etílico libre
de ácido al 70 %, se puede conservar en esta última solución. Para
las espículas se debe tratar al material lo menos posible. Seguir la
metodología de espículas de esponjas.
Estrella
Erizo
Pepino de mar
.
Histología Especial:
Animales sésiles marinos: ejemplo briozoos.
27
Anestesiado: Se anestesian con sales de magnesio,
manganeso o mentol. También se puede añadir
formaldehído al 4 %, al agua donde están estirados
de forma muy lenta (peligro de contracción).
Ojo: existen
Sertella
beaniana membranosos y
de carbonato de
calcio.
Fijación: Se fijan con formaldehído 2 % tamponado y
cristales de mentol y tapar el recipiente, a las 24 horas,
fijar con Bouin, Helly, alcohol etílico 70 % o formaldehído
10 %, conservar en los dos últimos líquidos.
Estudios parasitológicos en general:
Anestesiado: Se pueden utilizar cloruro de magnesio al 7,5 %, hidroxilamina al 1 %,
alcohol etílico al 10 %, o hidrato de cloral al 2 %. Probar con gotas de ácido nítrico al 2
Fasciola
%. Seguir los procedimientos publicados; cada grupo tiene su tratamiento.
hepatica
Lobatostoma manteri, un
aspidogástreo parásito
de intestino de peces
Acantocéfalos,
parásitos intestinales
Nematodos (ver especial), trematodos,
acantocéfalos, monogeneos y
aspidogástreos, son los parásitos más
comunes de encontrar.
.
28
Histología Especial:
Estudios parasitológicos en general: (continuación)
Fijación: Para propósitos generales se puede usar el liquido de Lang
(1878) [agua destilada, 100 partes; cloruro de sodio, de 6 a 10 g; ácido
acético 5 a 8 ml; bicloruro de mercurio 3 a 12 g; alumbre, 0,5 g], de una a
24 horas. Se lava el mercurio con Lugol y luego pasarlo al formaldehído al
2 % o alcohol etílico al 60 %. En general, se puede utilizar fijadores que
contengan cloruro de mercurio, desublimar y pasar a alcohol etílico 70 %.
Los fijadores sin mercurio dan imágenes opacas luego de colorear.
La metodología para la obtención de los parásitos es muy variada
y algo complicada de exponer aquí. Se puede generalizar diciendo
que el origen del material puede ser derivado de tegumentos, de
vía intestinal, pulmonar y urogenital, y de disecciones.
Para los tegumentos sirve la metodología
Pulga del
dada para artrópodos y las de hirudíneos.
gato
Generalmente estos animales se
encuentran asociados a mucosidad,
secreciones, heces, etc., al realizar
frotis y en las muestras de heces,
mediante disgregación, concentración
por decantación o centrifugación.
No hay que
olvidarse de los
estados larvales
Huevos
en heces
Tenia
.
Histología Especial:
Animales de agua dulce:
29
Los animales como los gastrotricos y los rotíferos se anestesian en la solución de
Rouselet, modificada [eucaína o xilocaína al 2 %, 3 mililitros; alcohol etílico al 90 %, 1
mililitro; agua destilada, 6 mililitros]. Algunos productos farmacéuticos de uso externo
poseen xilocaína en distintas proporciones. También con formaldehído al 4 %, añadido
gota a gota a la muestra; cada 10 gotas (o menos) remover lentamente.
Se fijan con ácido osmio, solución saturada de cloruro de mercurio, formaldehído 10 %
o Bouin. Se conservan en alcohol etílico 70 % o formaldehído al 5 %.
Luego de anestesiados, seguir añadiendo gotas de formaldehído al 4 % hasta alcanzar
una concentración del 1 % aproximadamente y dejar actuar por una o dos horas.
Luego de fijarlos cambiar la solución mediante filtrado a la solución conservadora. Se
conservan en 2 a 5 % formaldehído y 2 % de glicerina.
Gastrotrico
Rotífero
planctónico
Rotífero
bentónico
De esta
manera
pueden ser
tratados otros
animales
minúsculos del
agua dulce,
como las
hydras.
.
Histología Especial:
Animales del suelo:
Muestras de tierra: Se anestesian y se fijan al mismo tiempo. red o
Directamente se pasan al formaldehído al 4 % neutralizado cedazo
con bórax o al alcohol etílico al 70 % libre de ácidos.
Luego se separan los animales. La fauna indicadora, como
artrópodos, anélidos y nematodos quedan bien preservados;
muchos animales pequeños, como protozoos y rotíferos, se
pierden.
Metodología para separar los animales vivos:
se utiliza el embudo de Tullgren.
Bentos y animales bentónicos:
Sedimento: Método 1: Anestesiado leve con separación, mediante
corriente eléctrica continua (12 voltios). Los animales de mayor
tamaño salen primero, también los de menor coberturas
cuticulares. Posteriormente se fijan los animales por separados.
Método 2: Los animales del sedimento se puede anestesiar en
forma profunda, mediante una alta concentración del
anestésico o largos tiempos de acción de ellos, y separación
de los animales por diferencia de densidad del medio acuoso.
Se colocan a las muestras en una solución de azúcar mayor al
30 % y se filtran los animales que flotan. Se recupera el
líquido denso para otra muestra y los animales se fijan.
Para la fijación se puede utilizar formaldehído al 4 %
adicionado con bórax, con un pH 8 aproximadamente
(tamponado). Conservar el alcohol etílico al 70 % libre de
ácidos.
En ambos casos se puede utilizar rosa de Bengala para visualizar
los organismos que estaban vivos en el momento de la fijación.
luz
30
muestra
Recipiente
con zona
húmeda
.
Histología Especial:
Bentos y animales bentónicos:
31
(continuación)
Existen taxones que generalmente son encontrados
directamente en las muestras de sedimentos
marinos como los quinorrincos (Kinorhyncha). Son
animales de muy pequeña talla por lo tanto muy
fáciles de perder en tratamientos posteriores. Si en
necesario se colorean con rosa de Bengala.
Muchos de estos animales deben ser anestesiados,
Quinorrínco
utilizar una solución de cloruro de magnesio al 7,5
Con rosa
Estado
%. Fijarlos y conservarlos en alcohol etílico al 70 %.
de Bengala
fresco
Si deben ser fijados con el sedimento marino,
utilizar formaldehído al 4 % tamponado y por
Loricíferos
supuesto con varios cambios del fijador.
Los Cephalocordata (anfioxos) se anestesian con una mezcla de
partes iguales de agua de mar y solución al 7,5 % de cloruro de
magnesio hexahidratado o solución al 20 % de sulfato de magnesio
monohidratado, o solución de hidrato de cloral al 0,2 %.
Se usa formaldehído al 2 % tamponado o alcohol etílico 70 %. Se
conservan en alcohol etílico al 70 %, con un 10 % de glicerina.
Anfioxo
Branchiostoma
.
Histología Especial:
Zooplancton:
32
Los poros de la red del plancton deben ser mayores a 100 micrones. Cuando se vacía el
colector de las redes de plancton, se coloca en el recipiente, de forma conjunta, la
muestra y el fijador.
Para que se noten los animales adicionar por cada litro de formol de 0,5 a 1 gramo de
rosa de Bengala. El fijador así preparado se diluye antes de usar en la proporción que
corresponda. Así los animales pueden ser encontrados perfectamente entre el
sedimento por su color rosado. Puede hacer falta una prueba de coloración.
Plancton en fresco
Plancton teñido con rosa de Bengala
Posteriormente los animales son separados por taxón, determinados
y cuantificados.
Como suele suceder que las muestras contengan gran cantidad de
animales, se debe cambiar el fijador las veces que sea necesario.
Si el fijador no es el suficiente, puede haber casos de pudrición o
liberación de grasas y aceites, que malogran la muestra. Por otro
lado, el exceso de formaldehído, deshidrata los organismos.
.
Histología Especial:
33
Otras comunidades:
Fitoplancton: por cada 100 ml de muestra, agregar de 2 a 3 gotas de una solución concentradas de
Lugol acético (10 g de yoduro de potasio en 20 ml de agua destilada, más 5 g de yodo bisublimado,
luego de disolución 50 ml de agua, más 7 ml de ácido acético o 5 g de acetato de sodio), luego
adicionar formaldehído hasta un 2 %.
Perifiton: se saca la vegetación litoral y sacudirla dentro de una red de plancton.
Colocar la vegetación en jarros de vidrio y observar si hay animales que se desplazan sobre las
paredes. También se puede colocar la vegetación dentro de una bandeja de fondo blanco y negro,
sacudirla y dejar reposar durante un día y luego buscar en el fondo. Colocar portaobjetos entre la
vegetación (con base de madera o telgopor) y dejar semanas o meses. Colocar trozos de la
vegetación bajo la lupa, o tomar muestras para observar en microscopio.
Pecton: Entre las rocas: lavar las rocas, cepillarlas, rasparlas y ver con lupa de mano.
Psammon: hacer un pozo en la arena o en la tierra y esperar que se acumule el agua, luego tomar
ese agua y pasarla por una red de fitoplancton.
Perifiton
Animales del
psammon
Pecton
Fitoplancton
Λ=Զ=Z
MATERIAL DE DOCENCIA PARA CONSULTA
No utilice este material didáctico fuera de contexto.
Si no es capaz de desarrollar algo semejante, cite la fuente.
.
Técnicas Especiales para grupos de Invertebrados
(Histología Especial):
Protistas con afinidad animal.
02
Porifera.
06
Cnidaria y Ctenophora.
07
Platyhelminthes.
08
Gusanos no segmentados marinos.
10
Nematoda.
12
Annelida.
13
Mollusca.
15
Grado de maduración.
20
Arthropoda: Insecta.
21
Arthropoda: Crustacea.
22
Arthropoda: Quelicerados.
23
Otros artrópodos.
24
Ejemplo: cirripedios.
25
Echinodermata.
26
Animales sésiles marinos: ejemplo briozoos.
27
Estudios parasitológicos en general.
27
Animales de agua dulce.
29
Animales del suelo.
30
Bentos y animales bentónicos.
30
Zooplancton.
32
Otras comunidades.
33
34
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