determinación de capsaicinoides en extractos de pimientos

Avances de la Ciencia y Tecnología de los Alimentos en los inicios del siglo XXI
Análisis de alimentos
DETERMINACIÓN DE CAPSAICINOIDES EN EXTRACTOS DE PIMIENTOS
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS EMPLEANDO COLUMNAS
MONOLÍTICAS
Fernández Barbero, G.; Palma Lovillo, M.; García Barroso, C.
Dpto. de Química Analítica. Facultad de Ciencias. Universidad de Cádiz.
Apdo. 40, C.P. 11510. Puerto Real, Cádiz.
RESUMEN
En el presente trabajo se presentan los resultados del desarrollo de un método de análisis de
capsaicinoides en extractos de pimientos mediante el uso de columnas monolíticas además de la
comparación de este método con el método empleado con columnas C-18 convencionales. El
método finalmente desarrollado permite la separación efectiva y cuantificación de la
nordihidrocapsaicina, capsaicina, dihidrocapsaicina, un isómero de la dihidrocapsaicina y la
homodihidrocapsaicina, que han sido determinados en diversas variedades de pimientos.
Palabras clave: Capsaicinoides, columnas monolíticas, separación cromatográfica.
INTRODUCCIÓN
Los pimientos picantes son una fuente de aditivos muy utilizados en muchas partes del mundo y
son muy valorados por sus atributos de color, pungencia y aroma. Los capsaicinoides son los
compuestos responsables del sabor picante que presentan muchas variedades de pimientos. Los
dos capsaicinoides mayoritarios presentes en la mayoría de variedades picantes de pimientos
son la capsaicina (trans-8-metil-N-vanillil-6-nonenamida) y la dihidrocapsaicina (8-metil-Nvanillilnonanamida) (Laskaridou-Monnerville, 1999). Además de estos dos capsaicinoides
mayoritarios, en los pimientos picantes se encuentran otros capsaicinoides minoritarios como la
nordihidrocapsaicina,
norcapsaicina,
homocapsaicina,
homodihidrocapsaicina,
nornorcapsaicina, nornornorcapsaicina, nonivamida, entre otros (Constant y Cordell, 1996)
(Constant y Cordell, 1995).
En los últimos años un tipo especial de columnas en base sílice, de alta velocidad se ha
introducido en el mercado, denominándose columnas monolíticas (Ishizuka y col., 1998). Las
columnas monolíticas presentan una diferencia estructural con respecto a las columnas
convencionales de sílice. Mientras que las columnas convencionales están rellenas con pequeñas
partículas esféricas de sílice, las columnas monolíticas están formadas por una única pieza, en
base sílice en este caso, muy porosa, conteniendo macroporos y mesoporos en su estructura
(Novakova y col., 2004). Debido a este hecho, se pueden utilizar altos flujos de disolventes, no
afectándose la resolución cromatográfica en la separación de los compuestos. Otra ventaja
práctica es el pequeño tiempo que se necesita para equilibrar la columna cuando se utiliza un
método en gradiente como en nuestro caso.
En el presente trabajo se desarrolla un método de separación de capsaicinoides con columnas
monolíticas, comparándolo con un método de separación empleando una columna C-18
convencional.
MATERIAL Y MÉTODOS
El cromatógrafo empleado para la separación cromatográfica ha sido un equipo HPLC Dionex,
que cuenta con los siguientes módulos: Autoinyector automático ASI-100; Bomba HPLC P680;
Horno de columna TCC-100; Detector de fluorescencia RF 2000 y una interfaz cromatográfica
universal UCI-50.
La separación cromatográfica ha sido desarrollada con una columna monolítica Chromolith
Performance RP-18e (100 mm x 4.6 mm), (Merck, Darmstadt, Germany). El método
desarrollado para esta columna monolítica ha sido comparado con el método desarrollado para
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una columna de HPLC convencional de fase inversa C-18 (2) (Luna 5µ, 150 x 3 mm,
Phenomenex).
La separación cromatográfica se ha realizado con extractos del pimiento picante cayena
(Capsicum annuum), obtenidos mediante extracción con fluidos presurizados. Los
capsaicinoides han sido analizados mediante espectrometría de fluorescencia. Para ello se ha
utilizado una longitud de onda de excitación de 278 nm, recogiéndose la emisión a una longitud
de onda de 310 nm. Los capsaicinoides que han sido identificados en estas muestras de
pimientos mediante espectrometría de masas y que han sido observados mediante
espectrometría de fluorescencia han sido la nordihidrocapsaicina (n-DHC), la capsaicina (C), la
dihidrocapsaicina (DHC), un isómero de la dihidrocapsaicina (i-DHC) y la
homodihidrocapsaicina (h-DHC).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Inicialmente se ha desarrollado un método de separación cromatográfica para los 5
capsaicinoides mayoritarios encontrados en el pimiento cayena empleando una columna de
HPLC convencional de fase inversa C-18 (2) (Luna 5µ, 150 x 3 mm, Phenomenex). Se ha
utilizado para la separación cromatográfica un método en gradiente, usando agua acidificada
(0,1 % ácido acético, solvente A) y metanol acidificado (0,1 % ácido acético, solvente B),
trabajando a un flujo de 0.8 mL/min. El gradiente empleado fue el siguiente: 0 min, 0% B; 2
min, 55 % B; 7 min, 55 % B; 9 min, 60 % B; 15 min, 60 % B; 18 min, 65 % B; 20 min, 65 % B;
25 min, 70 % B; 30 min, 70 % B; 32 min, 100 % B; 38 min, 100 % B.
Los tiempos de retención que se han obtenido, para los 5 capsaicinoides presentes en el
pimiento cayena, empleando este método de separación vienen recogidos en la figura 1 donde se
representa el cromatograma resultante al emplear este método de separación de capsaicinoides
con una columna HPLC convencional.
Figura 1. Cromatograma empleando una columna HPLC convencional: 1 (n-DHC); 2 (C);
3 (DHC); 4 (i-DHC); 5 (h-DHC).
Una vez desarrollado el método de separación con la columna convencional C-18 (2) (Luna 5µ,
150 x 3 mm, Phenomenex), se ha desarrollado un método de separación cromatográfico con una
columna monolítica Chromolith Performance RP-18e (100 mm x 4.6 mm). Se ha utilizado para
la separación cromatográfica un método en gradiente, usando de la misma manera que en el
método anterior agua acidificada (0,1 % ácido acético, solvente A) y metanol acidificado (0,1 %
ácido acético, solvente B) como disolventes de separación, trabajando a un flujo de 7 mL/min.
El gradiente empleado fue el siguiente: 0 min, 0% B; 2 min, 50 % B; 3.5 min, 50 % B; 10 min,
70 % B; 12 min, 70 % B; 15 min, 100 % B; 20 min, 100 % B.
Los tiempos de retención que se han obtenido, para los 5 capsaicinoides presentes en el
pimiento cayena, empleando este método de separación vienen recogidos en la figura 2 donde se
representa el cromatograma resultante al emplear este método de separación de capsaicinoides
con una columna monolítica.
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Figura 2. Cromatograma empleando una columna monolítica: 1 (n-DHC); 2 (C); 3 (DHC);
4 (i-DHC); 5 (h-DHC).
En la tabla 1, se presentan los tiempos de retención de los 5 capsaicinoides presentes en el
pimiento cayena, en los dos métodos de separación desarrollados.
Tabla 1. Tiempos de retención de los capsaicinoides presentes en el pimiento cayena mediante
el empleo de una columna HPLC convencional C-18 y mediante el empleo de una
columna monolìtica.
Capsaicinoide
n-DHC
C
DHC
i-DHC
h-DHC
T.R. C-18
15,7 min
16,7 min
21,4 min
22,4 min
26,9 min
T.R. Monolìtica
4,3 min
4,6 min
5,8 min
6,1 min
7,3 min
A la vista de la tabla 1, se observa que se consiguen tiempos de retención mucho menores para
los capsaicinoides mediante el empleo de columnas monolìticas. Por tanto, mediante el empleo
de estas columnas, las cuales permiten utilizar un flujo muy superior al flujo que se utiliza con
las columnas de HPLC convencionales, se consiguen acortar enormemente los tiempos de
retención de los compuestos manteniendo una resolución entre picos similar, acortando por
tanto los tiempos de análisis.
CONCLUSIONES
En este trabajo se ha realizado una comparación entre dos métodos cromatográficos de
separación de capsaicinoides, uno empleando una columna HPLC convencional, y otro
empleando una columna monolítica. Los disolventes utilizados para la separación
cromatográfica han sido los mismos en ambos casos, variando únicamente el gradiente a
emplear. Las columnas monolíticas trabajan a un flujo muy superior al flujo de trabajo de una
columna HPLC convencional, pudiendo por tanto acortar bastante los tiempos de retención de
los compuestos de interés, manteniendo una resolución similar en el espectro. Por tanto se
recomienda el empleo de columnas monolíticas para la separación de capsaicinoides en
extractos de pimientos para acortar los tiempos de análisis, manteniendo la resolución de los
picos.
BIBLIOGRAFÍA
Constant, H.L. y Cordell, G.A. 1996. J. Nat. Prod. 59, 425-426.
Constant, H.L. y Cordell, G.A. 1995. J. Nat. Prod. 58, 1925-1928.
Ishizuka, N.; Minakuchi, H.; Nakanishi, K.; Soga, N. y Tanaka, N. 1998. J. Chromatogr. A. 797,
133-140.
Laskaridou-Monnerville, A. 1999. J. Chromatogr. A. 838, 293-302.
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Novakova, L.; Matysova, L.; Solichova, D.; Koupparis, M.A. y Solich, P. 2004. J. Chromatogr.
B. 813, 191-197.
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