1. OBJETIVO Describir el método para

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Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial – República de Colombia
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Determinación de Glifosato en Suelos por Cromatografía Líquida de Alto Desempeño (HPLC) con
Derivatización Postcolumna y Detector de Fluorescencia
1.
OBJETIVO
Describir el método para determinación de glifosato en suelos por Cromatografía Líquida
de Alto Desempeño.
2.
ALCANCE DE LA APLICACIÓN
Este método es aplicable a la determinación de glifosato en suelo por cromatografía
líquida de alto desempeño (HPLC) con derivatización postcolumna y detección por
fluorescencia. Para confirmación de resultados se puede usar una columna
cromatográfica de fase diferente a la analítica o una técnica de cromatografía de gas con
detector selectivo de masas.
3.
FUNDAMENTO TEÓRICO
El glifosato es oxidado en un reactor post columna con cloruro de calcio para formar
glicina, luego la glicina reacciona o-phthalaldehyde (OPA) en la presencia de
mercaptoetanol (MERC) en un segundo reactor para formar un derivado fluorescente que
luego es determinado en un detector de fluorescencia.
3.1 INTERFERENCIAS
El glifosato se degrada por contacto con aguas cloradas. El glifosato también se absorbe
fuertemente en minerales y superficies de vidrio.
4.
ASPECTOS DE SALUD Y SEGURIDAD LABORAL
Manipúlese con precaución muestras y reactivos, evitando el contacto con piel y ropa.
Utilícese, bata, guantes de protección, gafas de seguridad, cabinas de extracción y
máscara para vapores.
5.
EQUIPOS
5.1
5.2
Agitador shaker.
Cromatógrafo Líquido de Alto Desempeño (HPLC), Detector de fluorescencia,
reactor Post-Columna.
5.2.1. Cromatógrafo Líquido libre de pulsos o con sistema atenuador de pulsos que
incluya bomba, inyector, horno calentador de columnas y sistema integrador de
datos.
5.2.1 Detector de fluorescencia capaz de proveer 340 nm de longitud de onda de
excitación y 425 a 455 nm de longitud de onda de emisión.
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5.2.2. Columna cromatográfica con fase de intercambio aniónico 5 µm, 250 mm * 4 mm
id).
5.2.3. Reactor Post-columna: Sistema de derivatización dual que incluya dos reactores.
5.3.
Centrifuga que permita realizar operaciones hasta 10000 rpm.
5.4.
Rotavapor.
5.5.
Placa de calentamiento.
5.6.
Balanza analítica.
6.
REACTIVOS
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
6.8.1
6.8.2
Hidróxido de Potasio, grado analítico.
Cloruro de Sodio, grado analítico.
Ortofosfato de Hidrógeno Dipotasio, grado analítico
Hipoclorito de Calcio, grado analítico.
Acido Bórico, grado analítico
Acido Clorhídrico, grado analítico
Acido Ortofosfórico, grado analítico.
Estándar certificado de Glifosato 98% pureza.
Solución intermedia: prepare una solución de 250 mg/l.
Prepare 5 estándares de calibración en un rango de 5 a 50 mg/l, que es el rango
esperado de trabajo.
6.9.
O-phthaldehyde (OPA), grado analítico.
6.10. 2-mercaptoetanol (MERC), grado analítico.
6.11. Resina de intercambio catiónico del 8% unida a styrene divinylbenzene, malla seca
100 - 200, Dowex 50 W, Bio-Rad Laboratories.
6.11.1. Preparación y acondicionamiento de las columnas de intercambio catiónico: La
resina de Dowex 50W fuertemente (50 g) fue introducida en una columna
cromatográfica (19 mm de diámetro) como una suspensión con ácido clorhídrico
0,01 M y acondicionada con 200 mL de ácido clorhídrico 0,01 M a una velocidad
de 2,5 ml/min.
6.12. Fase móvil: ácido Fosfórico 0,08 M
6.13. Reactivo de oxidación: Pese 0,2 g de hipoclorito de calcio, 17 g de Ortofosfato de
Hidrógeno y Potasio y 11,6 g de Cloruro de Sodio y disuélvalos en 1000 ml de
agua desionizado y filtre a través de membrana de 0,22 ó 0,45 µm.
6.14. Reactivo de derivatización: Disuelva 100 g de ácido Bórico y 72 g de hidróxido de
Potasio en 700 ml de agua desionizada en un matraz volumétrico de 1000 ml (esto
tarda 1 a 2 horas). Añada 0,8 g de OPA disueltos en 5 ml de Metanol. Añada 2 ml
de MERC y disuelva bien.
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7.
MATERIALES E INSUMOS
7.1.
7.2.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
Vidriería volumétrica de diferentes volúmenes.
Pipetas volumétricas de diferentes volúmenes.
Columna cromatográfica para limpieza de 19 mm ID * 220 mm.
Tubos de centrífuga
Recipientes plásticos para preparación de estándares.
Transferpipetas con puntas desechables.
Embudos de separación.
8.
CONSIDERACIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA
Véase protocolo “Toma y Preservación de Muestras y Limpieza de Material para
Determinación de Plaguicidas”.
8.1.
8.2.
Colecte en recipientes de polipropileno y refrigere a 4ºC.
Las muestras deben ser analizadas dentro de las dos semanas siguientes a la
toma de muestra.
9.
LIMPIEZA DE MATERIAL
Véase protocolo “Toma y Preservación de Muestras y Limpieza de Material para
Determinación de Plaguicidas”.
NOTA: el glifosato se absorbe en las superficies del vidrio. Este fenómeno es
especialmente pronunciado con las soluciones estándar, pero menos pronunciado
cuando la matriz está presente y después de la derivatización. Prepare las
soluciones con base a peso usando una balanza analítica. Use pipetas
automáticas con puntas plásticas desechables, para el manejo adecuado de
muestras y estándares. Calibre las pipetas automáticas como lo recomienda el
fabricante.
10.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
10.1.
Extracción
a. Tome una porción de muestra de 20g en un recipiente con tapa de 250 ml.
b. Añada 150 ml de Hidróxido de Potasio acuoso y llevar a agitación en shaker por 16 h,
para desagregar el suelo.
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c. Decante el extracto en un beaker de 400 ml haciendo lavados con porciones de 10 ml
de Hidróxido de Potasio 0,1 M al suelo remanente.
d. Caliente el extracto por 1 minuto.
e. Permita que se enfríe, y transfiera a tubos de centrifuga y centrifugue por 20 minutos a
7500 rpm.
f. Filtre el sobrenadante a través de papel de fibra de vidrio para remover los sólidos
suspendidos.
g. Para muestras con alto contenido de material orgánico haga lavados con 2 porciones
de 50 ml de Cloroformo en un embudo de separación y descarte los lavados.
h. Nuevamente re-extraiga el remanente de suelo de la extracción por 6 horas aplicando
el mismo procedimiento.
i. Si espera una concentración baja de cationes extraíbles se pueden mezclar los dos
extractos para realizar la limpieza. Si espera una concentración alta de cationes que
supera la capacidad de intercambio de la columna se deben limpiar el primer y el
segundo extracto separadamente.
j. Evapore el extracto combinado a 50 ml en placa de calentamiento.
k. Ajuste el pH a 2 con ácido clorhídrico 6 M.
l. Centrifugue esta solución a 2500 rpm durante 10 minutos.
m. Decante el sobrenadante claro en matraz de evaporación para rotavapor.
n. Lave el sedimento del tubo de centrifuga con una porción de 25 ml de ácido
Clorhídrico 0,01M y centrifugue a 2500 rpm por 10 minutos.
o. Combine los extractos en el matraz de evaporación para rotavapor.
p. Concentre el extracto a 5 ml en rotavapor a vacío a una temperatura de 60ºC.
q. Ajuste el concentrado a pH 1,8 -2,0 con ácido Clorhídrico 0,01 M, luego transfiéralo a
un tubo de centrifuga y centrifugue a 2500 rpm por 10 minutos.
10.1
Limpieza
a. Transfiera el extracto concentrado a la columna de intercambio catiónico
acondicionada como se explicó previamente. Haga pasar el extracto a una velocidad
de 2,5 ml/min.
b. Lave la columna con porciones de ácido Clorhídrico 0,01 M hasta completar 45 mL y
luego descártela.
c. Eluya el Glifosato usando 2 porciones de 55 ml de ácido Clorhídrico 0,01 M.
d. Lleve el extracto a sequedad en rotavapor a 60 ºC.
e. Redisuelva el residuo en ácido Fosfórico 0,08 M y transfiéralo a un matraz volumétrico
de 10 ml y llévelo a volumen.
f. Pase la solución a través de papel filtro de acetato de celulosa de 0,45 µm antes de la
determinación en HPLC.
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11.
11.1
PROCEDIMIENTO ANALÍTICO
Condiciones Cromatográficas
Volumen de inyección: 50 µl
Longitud de onda de emisión: 455 nm
Longitud de onda de excitación: 340 nm
Columna cromatográfica mantenida a 55 °C.
La fase móvil es ácido fosfórico 0,08 M a una tasa de flujo 0,5 ml/min.
Reacción de oxidación post-columna a amina primaria a 55 °C a un flujo de reactivo de
oxidación de 0,3 ml/min
Reacción de derivatización con OPA-MERC en un tubo de reacción de acero inoxidable
(1m * 0,5 mm). 0,5 ml/min
12.
METODOLOGÍA DE CÁLCULO
Para calcular el contenido de glifosato en la muestra se aplica la siguiente ecuación:
concentrat ion g / kg  
xs Vt D 
Ws
 Vi
xS : masa del analito (ng) calculada en la alícuota de la muestra introducida en el
instrumento.
Vt : Volumen total del extracto concentrado (µL). Para purga y trampa Vt es 1.
D : Factor de dilución, si la muestra o extracto fue diluido antes del análisis, si no se hizo
dilución, el valor es 1.
Vi : Volumen de extracto inyectado en µL. El volumen de inyección nominal para las
muestras y estándares de calibración deben ser la misma.
Nota: si se usan unidades de concentración en el cálculo del factor de calibración,
el factor Vi no debe ser tenido en cuenta en la ecuación.
Ws : Peso de la muestra extraída o purgada en g. Se puede usar tanto el peso seco como
el peso húmedo, dependiendo de la aplicación que se le va a dar a los datos.
13.
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD ANALÍTICA
Ver el documento “Aseguramiento de la Calidad y Estandarización de Métodos
Cromatográficos”.
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13.1. El límite de detección del método fue establecido por la referencia como 0,04
mg/kg.
13.2. En el desarrollo del método se probaron muestras (contenido de arcilla entre 25 87%) fortificadas en un rango de concentración 0,56 a 11,25 mg/kg para las cuales
se obtuvo recuperaciones por encima del 80%.
14.
PROPUESTA DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO
Ver el documento “Aseguramiento de la Calidad y Estandarización de Métodos
Cromatográficos”.
15.
BIBLIOGRAFÍA
Pesticide Science, 40, 41-48. The determination of Glyphosate in soils with moderate to
High Clay Content. 1994.
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