NGS en el estudio de predisposición genética al desarrollo de
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NGS en el estudio de predisposición genética al desarrollo de arritmias en pacientes en tratamiento antipsicótico o antidepresivo. Martinez-Matilla M1,2, Gil R1,2, Blanco-Verea A1,2, Tajes M3, Bermejo A4, Lucena J5, Sanz P6, Carracedo A1, Brion M1,2. 1Grupo de Medicina Xenómica, Universidade de Santiago de Compostela. Fundación Pública Galega de Medicina Xenómica; 2Grupo de Medicina Xenómica, Instituto de Investigación Sanitaria, SERGAS. Red de investigación Cardiovascular; 3 Servicio de Psiquiatría, Complexo Hospitalario Universitario de Santiago; 4Instituto de Ciencias Forenses, Universidade de Santiago de Compostela; 5 Servicio de Patología Forense, Instituto de Medicina Legal de Sevilla; 6 Universidad Pablo Olavide, Sevilla Introducción y objetivos Muestra Determinados medicamentos antipsicóticos y antidepresivos se asocian con efectos adversos cardiovasculares que aumentan el riesgo de sufrir arritmias ventriculares graves (Torsade de Pointes) y muerte súbita, incluso a dosis terapéuticas (Ray et al. 2004). Estos eventos cardiacos pueden aparecer en individuos aparentemente sanos que desarrollan trastornos arritmogénicos inducidos por la exposición al fármaco (Behr et al, 2012, Scott et al, 2013). Se han establecido marcadores que infieren el aumento de riesgo de padecerlos, como el intervalo QT que es el más comúnmente utilizado. Una prolongación del intervalo QT indicaría un mayor riesgo de sufrir Torsade de Pointes y muerte súbita. El objetivo principal del proyecto es evaluar la posible predisposición genética al desarrollo de arritmias en dos grupos de individuos a tratamiento antipsicótico o antidepresivo: pacientes recuperados de una arritmia ventricular o con intervalo QT prolongado, e individuos fallecidos por muerte súbita cardiaca. Muestra APs1 Gen Cambio aminoacídico CACNA2D1 KCNE2 APs3 APs4 c.T1166C:p.V389A c.T170C:p.I57T rs74315448 0.000233 D FBN1 c.G1547A:p.R516Q B PKP2 c.A1460G:p.Q487R c.C233T:p.T78M rs72546668 0.004419 P c.C2870G:p.T957S rs193922380 0.001328 P rs112084407 0.000931 B FBN1 c.G6700A:p.V2234M APs16 EYA4 c.C1087A:p.P363T APs18 GLA c.G427A:p.A143T APs19 MYBPC3 c.A1814G:p.D605G MYBPC3 c.G1321A:p.E441K MYBPC3 c.G836C:p.G279A Criterio de inclusión H 41 Trastorno esquizoafectivo Nordiazepam 0,03 mg/L. Quetiapina y su metabolito. Tratamiento previo conocido APs3 H 43 Trastorno bipolar, obesidad mórbida Hidroclorotiazida, Lorazepam Tratamiento previo conocido APs4 M 28 APs5 M 40 APs10 M 27 M 48 Biperideno, Loprazolam, Haloperidol, Ziprasidona y Lorazepam. Esquizofrenia Obesidad, EPOC, síndrome ansioso depresivo, asma Depresión. Asma alérgico persistente Psicofármacos,antidepresivos y tranquilizantes mayores. Síndrome ansioso depresivo Esquizofrenia. Akineton,Zyprexa,Haloperidol, Sinogan,Dormodor,Tranxilium Tratamiento para la depresión. Escitalopram APs13 H 43 APs14 M 60 APs16 H 43 Esquizofrenia. Neurolépticos y ansiolíticos APs18 H 54 Tranxilium,haloperidol APs19 H 48 Esquizofrenia APs20 H 33 Esquizofrenia. Potomania, hiponatremia Tratamiento previo conocido Etanol, benzodiacepinas opiáceos, metadona Tratamiento previo conocido Loracepam 0,48ug/ml, etanol 0,56g/l Tratamiento previo conocido Venlafaxina0,08ug/ml Tratamiento previo conocido; análisis toxicológico Metadona:0,24ug/ml, nordiazepan0,103ug/ml Tratamiento previo conocido Tratamiento previo conocido Ac.valproico Nordiazepam: 0,39ug/ml, oxazepam:0,21ug/ml, gabapentina diazepam:0,022ug/ml, olanzapina:0,214ug/ml Olanzapina:0,027ug/ml Tabla 1. Datos de las muestras seleccionadas para el estudio y razón por la que se incluyeron. Tratamiento previo conocido Tratamiento previo conocido Tratamiento previo conocido; análisis toxicológico Tratamiento previo conocido; análisis toxicológico Metodología Un total de 12 muestras han sido analizadas (Tabla 1): 11 casos recogidos en los Institutos de Medicina Legal de Galicia y Sevilla de individuos bajo tratamiento con antidepresivos y/o antipsicóticos que fallecieron de muerte súbita –todos ellos con concentraciones terapéuticas de los medicamentos en sangre- y un caso de una paciente recuperada de una arritmia ventricular grave, con un patrón de Síndrome de Brugada inducido por un medicamento hasta ahora no asociado con este patrón arritmogénico. c.A57344G:p.Y19115C APs12 Análisis toxicológico D P MYBPC3 Tratamiento previo conocido APs1 APs12 Polyphen2 c.G3947A:p.G1316E CAV3 APs20 ESP6500_ EA1 FBN1 TTN APs5 rs dbSNP137 Sexo Edad P rs104894845 0.001338 B 0.000120 B rs193922377 0.000236 P MYLK2 c.C260T:p.A87V rs121908107 0.000117 P MYLK2 c.C284A:p.A95E rs121908108 0.000117 D El estudio se está llevando a cabo en la plataforma de Next-Generation Sequencing (NGS) 5500 SOLiDTM System (Life Technologies) utilizando el sistema SureSelect Custom Target Enrichment System kit (Agilent Technologies). Se secuenció un panel 500K de genes asociados a muerte súbita cardiaca para buscar variantes genéticas raras que puedan relacionarse con una mayor predisposición a sufrir arritmias. Las 7 primeras se incluyeron en un panel diseñado con 81 genes, mientras que las 5 siguientes se incluyeron en un panel actualizado con un total de 86 genes. Las variantes fueron identificadas mediante GATK version 2.1 (Genome Analysis Toolkit, Broad Institute, Cambridge, MA, USA), Picard tools version 1.77 y LifeScope version 2.5.1 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). La anotación fue realizada mediante ANNOVAR version 2012Mar08. Tabla 2. Variantes genéticas priorizadas. 1ESP: Exome Sequencing Project, población americana de origen europeo. 2Polyphen: B: Benigna, P: Probablemente dañina, D: Dañina. Resultados A Tal y como se muestra en la tabla 3, los resultados de ambos paneles de secuenciación fueron muy satisfactorios y robustos, con solamente un 0.39% de media de la secuencia blanco no cubierta. La cobertura media por muestras superó con creces los estándares de calidad mínimos, con una cobertura media de 400X y más de un 98% de la secuencia blanco cubierta al menos 20X. Tamaño de la % lecturas en región blanco el blanco (bp) T78M % del blanco no cubierto % del blanco cubierto 1X % del blanco cubierto 5X % del blanco cubierto 10X % del blanco cubierto 20X Cobertura media del blanco 425364 0.47% (2011 bp) 99,53% 99,18% 98,82% 98,19% 227,35 72,01% 425364 0.36% (1530 bp) 99,64% 99,30% 99,08% 98,76% 446,46 500K Vs.1 67,29% 425364 0.29% (1216 bp) 99,71% 99,50% 99,19% 97,57% 247,61 APs5 500K Vs.1 77,93% 425364 0.38% (1603 bp) 99,62% 99,30% 99,08% 98,69% 498,28 APs10 500K Vs.1 73,41% 425364 0.53% (2268 bp) 99,47% 99,02% 98,18% 94,85% 121,38 APs12 500K Vs.1 77,63% 425364 0.4% (1682 bp) 99,60% 99,35% 99,12% 98,81% 379,21 APs13 500K Vs.1 76,67% 425364 0.38% (1631 bp) 99,62% 99,35% 99,19% 98,79% 456,46 Aps14 500K Vs.2 78,09% 458707 0.56% (2564 bp) 99,44% 99,14% 98,97% 98,62% 710,46 APs16 500K Vs.2 77,62% 458707 0.39% (1799 bp) 99,61% 99,43% 99,29% 99,01% 503,04 APs18 500K Vs.2 70,67% 458707 0.34% (1549 bp) 99,66% 99,52% 99,42% 99,23% 289 APs19 500K Vs.2 60,05% 458707 0.27% (1240 bp) 99,73% 99,57% 99,48% 99,34% 386,77 APs20 500K Vs.2 72,16% 458707 0.33% (1514 bp) 99,67% 99,42% 99,26% 99,06% 535,6 PROMEDIO 71,08% 439256,92 0,39% 99,61% 99,34% 99,09% 98,41% 400,135 Muestra Panel APs1 500K Vs.1 49,44% APs3 500K Vs.1 APs4 B Tabla 3. Resultados de cobertura obtenidos con la plataforma 5500 SOLiDTM System (Life Technologies). Figura 1. A. Confirmación de la variante rs72546668 en el gen CAV3 de la muestra APs5. 1A. Electroferograma en el que se muestra la mutación en heterocigosis. Se observa la lectura del alelo C ,de referencia y T, mutado, produciéndose un cambio de aminoácido de Treonina (ACG) a Metionina (ATG). B. Imagen de la misma mutación con el visor genómico IGV en la que se ve el alineamiento de las sondas en esa región y el número de lecturas de cada alelo para la posición. Tras la priorización de variantes detectadas en cada muestra siguiendo protocolos previamente establecidos (Hoischen et al. 2011), se encontró un total de 16 variantes no sinónimas en regiones codificantes en 9 de ellas (Tabla 2). 8 de las variantes resultaron ser mutaciones hasta la fecha no descritas en la bibliografía ni presentes en las bases de datos consultadas, mientras que las 8 restantes están catalogadas en dbSNP137, con frecuencias inferiores a 0.0005 y hasta ahora no han sido asociadas a ninguna patología. Además de estas variantes raras, dos polimorfismos previamente asociados a incremento de riesgo de Síndrome de QT largo y Síndrome de Brugada se ven representados en nuestras muestras con una frecuencia superior a la de la población general, a pesar de las pocas muestras analizadas: K897T (rs1805123) en KCNH2 (gen que codifica el canal de potasio dependiente de voltaje), se encuentra en un 58,33% del total de muestras analizadas, con respecto al 23,26% descrito en población general; H558R (rs1805124) en SCN5A (gen que codifica el canal de sodio dependiente de voltaje) aparece con una frecuencia de 41,67%, casi el doble de la frecuencia descrita en población general, de un 23,21%. Las posibles variantes patogénicas fueron confirmadas por secuenciación convencional (Figura 1) y valoradas mediante herramientas "in silico“. Su presencia se evaluó en bases de datos específicas de locus (LSDB) y en el Exome Sequencing Project (ESP). Conclusiones Referencias La principal limitación del estudio es la dificultad para obtener muestras (tanto forenses como clínicas) que cumplan los criterios de inclusión. A pesar de ello, los primeros resultados obtenidos en el estudio parecen indicar que los genes asociados a trastornos arritmogénicos son buenos candidatos para la búsqueda de variantes raras que expliquen la predisposición a sufrir arritmias o muerte súbita en ciertos individuos en presencia de fármacos antidepresivos y antipsicóticos. Ray et al. (2004) Cyclic antidepressants and the risk of sudden cardiac death. Clin Pharmacol Ther ;75:234 Asimismo, a la vista de los datos de cobertura y confirmación de variantes resultantes de la secuenciación, se confirma que la tecnología de secuenciación empleada es muy robusta y adecuada para este tipo de estudios. Behr et al. (2012) Drug-induced arrhythmia: pharmacogenomic prescribing? Eur Heart J. 34(2) 89-95 Scott et al, (2013) QTc prolongation, torsades de pointes, and psychotropic medications. Psychosomatics 54:1-13 Hoischen et al. (2011) De novo nonsense mutations in ASXL1 cause Bohring-Opitz syndrome. Nat Genet 43(8):729-731 Agradecimientos Fondo de Investigación Sanitaria (FIS. PI10/00851 and PI11/01081) , Red de Investigación Cooperativa de las Enfermedades Cardiovasculares y Fundación Botin.
