método de extracción y conservación de células madre
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MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA, INDUSTRIAL, DE ALIMENTOS, BIOMOLECULAR, BIOCOMBUSTIBLES Y BIOFARMACIA FACULTAD DE BIOFARMACIA MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE MONOGRAFÍA previa A la obtención del Título de Químico Farmaceuta. DIRECTOR: Ing. RENÉ MANUEL SARMIENTO CÁRDENAS INVESTIGTADOR: Juan diego Dávila Vásconez CUENCA - ECUADOR 2011 Juan Diego Dávila 1 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE AGRADECIMIENTO Agradezco a Dios por permitirme culminar esta etapa de mi vida, a la Universidad Católica de Cuenca, pero muy especialmente a la Unidad Académica de Ing. Química Industrial, de Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Quiero hacer extenso también mis agradecimientos al Señor Doctor Cesar Cordero Moscoso Rector; al Señor Ingeniero Santiago Gómez Decano de la facultad, al Honorable Consejo Directivo y a todos los catedráticos de la Unidad Académica ya que sin ellos no hubiera sido posible la realización de este informe. Pero muy especialmente a mi Madre quien ha sido mi apoyo fundamental tanto económico, espiritual y moral para que hoy finalice con éxito estos años de esfuerzo y estudio. Juan Diego Dávila 2 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE DEDICATORIA Dedico mi trabajo a Dios y a mi Madre por ser mi apoyo incondicional y estar en los momentos más difíciles dándome palabras de aliento y amor. Juan Diego Dávila 3 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE ÍNDICE PRELIMINARES Agradecimiento………………………….…………………………………………………………………………..I Dedicatoria……………………………………………..……………………………………………………………II Índice………………………………………….……………………..………………………………………………III Introducción………………………………..…………………………………….……………………………..…VI Objetivos…………………………………..…………………………………………………………….…………VII CAPITULO 1: NATURALEZA Y CARACTERISTICAS DE LA CÉLULA MADRE. DEFINICIÓN DE CÉLULAS MADRE…………………………………………….……………………1 TIPOS DE CÉLULAS MADRE…………………………………………………………………………….3 CÉLULAS MADRE TOTIPOTENTE…………………………………………………………………..3 CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTE……………………………………………………………..….5 CÉLULAS MADRE MULTIPOTENTES………………………………………………………………6 CÉLULAS MADRE UNIPOTENTES……………………………………………………………………7 FUENTES DE CÉLULAS MADRE……………………………………………………………………….7 CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS………………………………………………………………….8 CÉLULAS MADRE GERMINALES…………………………………………………………………...12 CÉLULAS MADRE FETALES…………………………………………………………………………...13 CÉLULAS MADRE ADULTAS…………………………………………………………………………..14 Juan Diego Dávila 4 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE CAPITULO 2: PREPARACIÓN Y CONDICIONES DEL PACIENTE PARA LA EXTRACCIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE. PRELIMINARES………………………………………………………………………………………………..18 ANÁLISIS PREVIO DEL PACIENTE A EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE Y ANTECEDENTES………………………………………………………………………………………..……19 EXÁMENES DE LABORATORIO PERTINENTES PARA LA EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE…………………………………………………………………………………………….19 PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD…………………………………………………………………..19 PRUEBA DE HISTOCOMPATIBILIDAD HLA……………………………………………………19 PREPARACIÓN PARA EL EXAMEN…………………………………………………………………21 PROCEDIMIENTO……………………………………………………………………………………………21 VALORES NORMALES……………………………………………………………………………………..22 POSIBLES RIESGOS………………………………………………………………………………………….22 PUNCIÓN DE LA MÉDULA ÓSEA…………………………………………………………………..22 RECOMENDACIONES A DONANTES DE CÉLULAS MADRE………………………..24 CAPITULO 3: CUIDADOS A SEGUIR EN EL PROCESO DE EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE. RECOLECCIÓN DE LAS CÉLULAS MADRES: AFERESIS……………………………….25 EFECTOS SECUNDARIOS………………………………………………………………………………..26 MAQUINA DE AFERESIS………………………………………………………………………………….27 TIPOS DE TRASPLANTES DE CÉLULAS MADRES…………………………………………28 TRASPLANTE CÉLULAS MADRE AUTÓLOGO……………………………………………..29 TRASPLANTE DE CÉLULAS MADRE SINGÉNICO…………………………………………30 TRASPLANTE CÉLULAS MADRE ALOGÉNICO…………………………………………….30 ADICIÓN DE ADITIVOS EN EL EXTRAÍDO DE CÉLULAS MADRE……………..32 FACTORES DE CRECIMIENTO……………………………………………………………………….32 Juan Diego Dávila 5 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE CAPITULO 4: MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE DIVERSAS FUENTES…………………………………………………………………………………………………………..35 EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE EMBRIONES…………………………………37 EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE PLACENTA…………………………………...38 EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DEL CORDÓN UMBILICAL………………39 MATERIALES……………………………………………………………………………………………………40 PERSONAL…………………………………………………………………………………………….………..41 RECOMENDACIONES PARA UNA BUENA EXTRACCIÓN………………..…………41 EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE LA SANGRE……………………………..…..42 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE LA MÉDULA ÓSEA…………………..……43 POSIBLES EFECTOS SECUNDARIOS DE LA INTERVENCIÓN………………..…..44 CAPITULO 5: PREPARACIÓN Y MANTENIMIENTO DE LAS CÉLULAS MADRE PARA SU CONSERVACIÓN A LARGO PLAZO. PREPARACIÓN IMPORTANTE DE LAS CÉLULAS MADRE PARA LA PRESERVACIÓN…………………………………………………………………………………………….46 CRIOPRESERVACIÓN……………………………………………………………………………………47 BANCOS DE CÉLULAS MADRE…………………………………………………………………….49 KIT PARA LA EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DEL CORDÓN UMBILICAL……………………………………………………………………………………….…….…….51 MATERIALES BÁSICOS DEL KIT…………………………………….……………………...…….52 CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE MEDIANTE NITRÓGENO LÍQUIDO A -196 GRADOS……………………………………………………………………………………………….………..54 Juan Diego Dávila 6 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE CONCLUSIONES……………………………………………………………………………………………58 BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………..…………62 Juan Diego Dávila 7 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE INTRODUCCIÓN Puesto que hoy en día el concepto de Células Madre empieza a estar muy extendido y a veces escuchamos hablar de él sin tener muy claro para qué sirve, en qué consiste y sobre todo cuáles son sus ventajas es por eso que mediante el presente informe lo que deseo resaltar es que las células madre por su cualidad única pueden convertirse en cualquier tipo de tejido: hueso, musculo, grasa, células hepáticas e incluso neuronas, de allí su radical importancia en su extracción y conservación ya que es vital para su posterior uso en diversas enfermedades ya sea en quemaduras, para regenerar la piel con mayor eficacia y rapidez que los injertos de piel, en enfermedades neurodegenerativas, en enfermedades coronarias que se haya destruido parte del tejido, etc. Por esta razón creo que es de suma importancia la investigación sobre la extracción y conservación de células madre tanto por su punto ético ya que sus principales fuentes son embriones, también pueden ser obtenidas de las placentas o cordones umbilicales de los neonatos, es necesario que se obtenga un amplio conocimiento del correcto procedimiento en extracción y conservación, debido a su importancia en la actualidad y en el futuro pudiendo ayudarnos con distintas enfermedades que no pueden ser curadas ni tratadas adecuadamente. A partir de la investigación de la Extracción y Conservación de Células Madre pude determinar cuáles son los métodos más eficaces correctos y los más adecuados sin atentar con problemas de tipo ético y siendo de beneficio así para las distintas enfermedades que pueden ser tratadas con las células madre. Para lograr los objetivos propuestos en esta monografía he consultado varios libros, técnicas, lecturas complementarias y el internet. A través de la lectura científica he podido investigar, cuales son las clases de Células Madre, de donde se obtienen, los métodos, técnicas, procesos de obtención y conservación de las Células Madre y que tipos de trasplantes existen y cuáles son los procesos que estas sufren y los beneficios que brindan a los pacientes. Este informe es de suma importancia ya que se podría afirmar que la utilización de las Células Madre serán la solución de muchas enfermedades que hoy no tienen curación. Juan Diego Dávila 8 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Y gracias a estas nuevas técnicas la medicina avanzará mucho en pocos años, para con la ayuda de todos podamos lograr un mundo un poco mejor. OBJETIVOS Objetivo general: Establecer las formas de extracción y conservación de las Células Madre. Objetivos Específicos: Determinar la naturaleza y características de la célula madre. Establecer la preparación y condiciones del paciente para la extracción de las células madre. Determinar los cuidados a seguir en el proceso de la extracción de las células madre. Investigar los métodos de extracción de las células madre. Analizar sobre la preparación y mantenimiento de las células madre para la conservación a largo plazo. Juan Diego Dávila 9 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Capítulo 1 NATURALEZA Y CARACTERISTICAS DE LA CÉLULA MADRE Juan Diego Dávila 10 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE 1. NATURALEZA Y CARACTERISTICAS DE LA CÉLULA MADRE 1.1. DEFINICIÓN DE CÉLULAS MADRE: “Como su propio nombre lo indica las células Madre son células que pueden dan lugar a otras células. También se la llaman células Troncales”1 Las células madre se caracterizan principalmente por ser células indiferenciadas. Al dividirse dan lugar a células hijas que pueden permanecer como células madre y perpetuarse así durante un período ilimitado, o bien, iniciar el proceso de diferenciación dando lugar a un tipo celular específico con una función también específica. Las células madre poseen dos características sumamente importantes que las distinguen de otros tipos de células. En primer lugar, las mismas son células no especializadas o no específicas y en segundo lugar, bajo ciertas condiciones fisiológicas o experimentales, pueden ser inducidas a convertirse en células que posean funciones especiales. Figura # 1.1 1 2 Diccionario de Medicina Océano Mosby, MMIX Editorial Océano Milanesat, pag. 1181, 1193 Andrew Leonard www.aplmicro.com Juan Diego Dávila 11 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Imagen de Microscopio de barrido de una célula madre de médula ósea. 2 Todas las células madre poseen tres propiedades generales: No son especializadas ni específicas; Pueden crear tipos de células especializadas o específicas; Son capaces de dividirse y de renovarse durante extensos períodos de tiempo. Las células madre pueden duplicarse varias veces mediante un proceso conocido con el nombre de proliferación. Si las células resultantes continúan siendo no especializadas, se dice que las mismas son capaces de autorenovarse por extensos períodos de tiempo. Además, las células madre no poseen ninguna clase de tejido estructural específico, y es por ello que los células madre no especializadas pueden crear células madre especializadas, entre las que se incluyen: células musculares cardíacas, células sanguíneas, o células nerviosas; mediante un proceso conocido con el nombre de diferenciación. Las células madre sanguíneas son uno de los variados tipos de células madre. Las células madre sanguíneas sanas son vitales para reemplazar o crear glóbulos rojos, glóbulos blancos, y plaquetas. Los glóbulos rojos o eritrocitos transportan oxígeno a través del organismo, los glóbulos blancos o leucocitos se encargan de combatir infecciones, y las plaquetas se encargan de la coagulación. Cuando las células sanguíneas se vuelven cancerígenas, la única esperanza para curar esta enfermedad es mediante un trasplante de células madre sanguíneas, el cual se encargará de reemplazar las células enfermas del paciente por células nuevas y saludables. Para que el trasplante sea exitoso, dichas células deben ser lo más compatibles posible con las células del paciente en cuestión. Las células utilizadas para realizar trasplantes de células madre sanguíneas provienen de tres fuentes principales: la médula ósea, la sangre periférica y la sangre contenida en el cordón umbilical de los bebés recién nacidos. En los casos de células madre provenientes de la médula ósea y de la sangre periférica, un adulto puede llegar a donar dichas células. Pero en el caso de las células madre del cordón umbilical, las mismas deberán ser recolectadas en el momento del nacimiento del bebé y almacenadas para usos futuros. Juan Diego Dávila 12 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE 1.2. TIPOS DE CÉLULAS MADRE Los principales tipos de potencia de las células madre en las que se han centrado las recientes investigaciones sobre células madre incluyen a los siguientes: Totipotenciales. Pluripotenciales. Multipotenciales. Unipotentes. Éstas, a su vez, pueden dividirse en categorías específicas, dependiendo del tipo de células en las que puedan llegar a convertirse las células madre. Por ejemplo: las células madre estromales pueden diferenciarse para formar huesos, cartílagos, grasa y células de tejido conectivo. Por otra parte, las células madre hematopoyéticas se diferenciarán y formarán glóbulos rojos o eritrocitos y glóbulos blancos o leucocitos, así como también plaquetas a pesar de que las investigaciones llevadas a cabo sobre las células madre también han demostrado que este tipo de células madre (encontradas en la sangre del cordón umbilical) poseen el potencial para convertirse en otros tipos de células. 1.2.1. CÉLULAS MADRE TOTIPOTENTE: Son capaces de transformarse en cualquiera de los tejidos de un organismo. Puede crecer y formar un organismo completo, tanto los componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (placenta). Es decir cualquier célula totipotente colocada en el útero de una mujer tiene la capacidad de originar un feto y un nuevo individuo: El zigoto (óvulo fertilizado) es una célula totipotente, capaz de dar origen a todo el organismo. Juan Diego Dávila 13 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Durante las primeras divisiones el embrión es una esfera compacta (mórula), en la que todas las células son totipotentes, y de hecho esto se refleja de modo natural en los gemelos monozigóticos. A los pocos días comienza una primera especialización, de modo que se produce un blastocisto, con una capa superficial que dará origen al trofoblasto, del que deriva la placenta, y una cavidad casi “hueca” (rellena de fluido) en la que está la masa celular interna (m.c.i.). Las células de esta m.c.i. son pluritotentes, porque aunque por sí solas no pueden dar origen al feto completo (necesitan el trofoblasto), son el origen de todos los tejidos y tipos celulares del adulto. Figura # 1.2 Foto de un cigoto, dividido en varias células madre totipotentes 3 3 www.dfarmacia.com Juan Diego Dávila 14 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Hay que aclarar un punto: aunque las células de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes, no son en sí mismas células madre dentro del embrión, porque no se mantienen indefinidamente como tales in vivo, sino que se diferencian sucesivamente en los diversos tipos celulares durante la fase intrauterina. Lo que ocurre es que cuando se extraen del embrión y se cultivan in vitro bajo ciertas condiciones, se convierten en células “inmortales” dotadas de esas dos propiedades de las que hablábamos: Autorrenovación Pluripotencia. Figura # 1.3 Juan Diego Dávila 15 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Las células madre totipotentes tienen la capacidad de desarrollar un embrión completo 4 1.2.2. CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTE: Pluripotencia: Las células madre pueden diferenciarse in vivo e in vitro en una gran diversidad de tipos celulares. In vivo dicha multipotencia se manifiesta cuando al incorporar células madre en blastocistos pueden dar origen a cualquier tejido u órgano, In vitro pueden contribuir igualmente, con las señales adecuadas, a diferentes líneas celulares de las tres capas embrionarias (ecto-, meso- y endodermo). Este es el campo donde más se está investigando actualmente, por su relevancia para la clonación terapéutica, como veremos Tienen la propiedad de generar célula maduras especializadas integrantes de diferentes tejidos orgánicos tales como corpúsculos sanguíneos, musculo cardiaco tejido cerebral o hepático. Son las verdaderas células madre, y son capaces de derivar en cualquier célula del cuerpo a excepción de membranas extraembrionarias, a demás puede producir la mayor parte de los tejidos de un organismo. Aunque pueden originar cualquier tipo de célula del organismo, no pueden generar un embrión. a) Células Madre Embrionarias: Las cuales se pueden aislar de la masa celular interna del bastocito (etapa embrionaria del feto). En humanos, se están usando el excedente de embriones que no se han usado para fertilización in vitro. Esto ha causado mucha controversia, pues al querer obtener las células madre embrionarias del blastocito, se destruye el embrión, el cual se podría implantar para dar lugar a un bebé. b) Células Embrionarias Germinales: Estas pueden ser aisladas del precursor de los órganos sexuales en fetos abortados. c) Células Embrionarias Cancerosas: Las cuales se aíslan de teratocarcinomas, es decir, de tumores ocurridos en el feto. Todas estas células se pueden aislar solamente de tejido embrionario o del feto mismo. Se pueden hacer crecer en medio de cultivo y se puede prevenir su diferenciación en células específicas (neuronas, piel, músculos, etc) mediante tratamientos específicos. 4 www.sobrecélulasmadre.com Juan Diego Dávila 16 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE 1.2.3. CÉLULAS MADRE MULTIPOTENTES: Las células madre multipotenciales poseen la capacidad de diferenciarse en un limitado tipo de células que se encuentran en el organismo, ósea son aquellas que sólo pueden generar células de su propia capa o linaje embrionario de origen, y las cuales están estrechamente relacionadas entre sí. Por ejemplo: las células madre hematopoyéticas, que producen diferentes tipos de células sanguíneas, son consideradas células madre multipotenciales. Éstas también llamadas células madre órgano-específicas son capaces de originar las células de un órgano concreto en el embrión y también en el adulto. Las células madre Multipotentes existen en muchos más órganos del cuerpo humano como la piel, grasa subcutánea, músculo cardíaco y esquelético, cerebro, retina y páncreas. Se han logrado cultivar estas células tanto en in-vitro, como in-vivo, utilizándolas para la reparación de tejidos dañados. Sin embargo la aplicación de estas técnicas todavía se encuentra en sus comienzos. 1.2.4. CÉLULAS MADRE UNIPOTENTES: Pueden formar únicamente 2 tipos de células madres: Laquilosis: Célula madre muy rugosa que contienen ribosomas. Embofilosis: Célula lisa que contiene un líquido especial llamado vasiofelina, que ayuda a que el cuerpo no endurezca en la reproducción de las células madre. 1.3.- FUENTES DE CÉLULAS MADRE Existen diferentes tipos de células madres, aunque las más empleadas en biología son las células madres embrionarias y las adultas. Juan Diego Dávila 17 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Figura # 1.4 Clases de Células Madre 5 5 Andrew Leonard www.aplmicro.com Juan Diego Dávila 18 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE 1.3.1.- CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS (pluripotentes): Las células madre embrionarias sólo existen en las primeras fases del desarrollo embrionario. Figura # 5: Embrión humano de 8 células, bajo microscopio óptico 6 Bajo las condiciones adecuadas, estas células conservan la capacidad de dividir y hacer copias de sí mismas indefinidamente. Se encuentran en la masa celular interna del blastocisto. Un espermatozoide y un óvulo cada uno tiene la mitad del complemento normal de cromosomas humanos. Cuando el espermatozoide fecunda al óvulo se emparejan sus cromosomas homólogos y comienza la división celular. El zigoto fecundado se convierte a esta célula en dos células, luego cuatro, ocho, 16 y así sucesivamente. El blastocisto está formado por una capa externa denominada trofoblasto, formada por unas 70 células, y una masa celular interna constituida por unas 30 células que son las células madres embrionarias que tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares que aparecen en el organismo adulto, dando lugar a los tejidos y órganos. Un adulto está formado por cerca de 10 billones de células. 6 Andrew Leonard www.aplmicro.com Juan Diego Dávila 19 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Figura # 1.6 Espermatozoide fecundando al óvulo 7 La división celular sigue hasta la mórula, donde empiezan a diferenciarse las células para formar el blastocisto. En tres a cinco días después de la fecundación, si el desarrollo embrionario continúa con normalidad, esta colección de células se considera un embrión, aunque no tiene ningún tipo de tejidos diferenciados. Ha asumido una forma esférica hueca, llamada blastocito, y es mucho más pequeño que la cabeza de un alfiler. Dentro de cada blastocito de 4 a 5 días de edad, ha comenzado una sutil diferenciación de las células. Dentro de la pelota, a un lado, se encuentra un grupo de células llamado la "masa celular interna." Estas células, que siguen siendo no-especializada, son las células que pueden ser cultivadas para formar líneas de células madre embrionarias. Figura # 7 Células Embrionarias 7 8 8 www.ibercajalav.net www.sobrecélulasmadre.com Juan Diego Dávila 20 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Los embriones que no se implantan en el útero de una madre son congeladas, y pueden ser utilizadas para generar células madre embrionarias con el consentimiento de los donantes. Cada una de estas células madre embrionarias, si se le da las señales químicas adecuadas, tiene el potencial de convertirse en cualquier tipo de célula en el cuerpo. En la actualidad se utilizan como modelo para estudiar el desarrollo embrionario y para entender cuáles son los mecanismos y las señales que permiten a una célula pluripotente llegar a formar cualquier célula plenamente diferenciada del organismo. Las células embrionarias obtenidas de fetos abortados o de óvulos fertilizados sobrantes de procedimientos de fecundación asistida son especialmente útiles para procedimientos médicos o para investigación porque pueden producir células para casi todos los tejidos del cuerpo. Existen muchas áreas de la medicina en las que la investigación con células madre podrían tener un impacto significativo como, por ejemplo el tratamiento de enfermedades y lesiones en la cuales la células o tejido del paciente se destruye y deben ser remplazado por un trasplante de tejido y de órganos. En estos casos la célula madre pueden generar un nuevo tejido e incluso curar enfermedades para las cuales actualmente no existe una terapia adecuado en las que destaca la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, diversas lesiones neurológicas, enfermedades cardiacas y cáncer. Figura # 1.8. Células Madre Embrionarias Invitro 9 9 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 21 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Como la mayor parte de los científicos utilizan las células madre de los embriones obtenidos por fertilización in vitro, se ha intentado obtener células embrionales por clonación. Con esta técnica se toma el núcleo de una célula, por ejemplo de una célula de la piel y se introduce en un cigoto al que se le ha retirado el núcleo. Una vez que se han cumplido tres a cinco días de la clonación, el complejo que contiene alrededor de 40 células se introduce en placas de cultivo con medios adecuados para su desarrollo. Al cabo de meses las células madres originales se han dividido en millones de células saludables sin diferenciarse en células especializadas, obteniendo una línea de células madre embrionarias. Un hecho trascendente es que las células madre embrionarias tienen capacidad para convertirse en cualquier tipo de células, lo que representa un desafío para los investigadores. El reto está en controlar y dirigir la diferenciación celular: complejas combinaciones de factores de crecimiento y señales químicas y genéticas que hoy recién se empiezan a descifrar. Factores de crecimiento, citoquinas, señales químicas y genéticas están involucrados en un proceso que requiere cuantiosos recursos para su evolución y desarrollo. Figura # 1.9 Células Madre Embrionarias 10 Una diferencia clave entre las células madres embrionarias y células madre adultas es que las células madre embrionarias se dividen y crecen de forma indefinida. La mayoría de las células madre adultas tienen una limitada, aunque extensa, capacidad de proliferar. 10 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 22 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE 1.3.2.- CÉLULAS MADRE GERMINALES. Las células germinales son aquellas que se especializan en la producción de gametos o células sexuales que permitirán la formación de un nuevo individuo. Cada célula germinal es diferente genéticamente por la recombinación genética durante la meiosis. Estas células están situadas en las gónadas de los aparatos reproductores femenino y masculino. Los gametos contienen la mitad de la información genética de un individuo: 23 cromosomas. Se dice que son células haploides: 23 cromosomas. Estas células necesitan unirse al gameto complementario (fecundación), para completar así la información para dar lugar a un individuo humano completo. Como sabemos los gametos son dos: espermatozoides, que se forman en el testículo y el óvulo, que se forma en el ovario. El óvulo es la célula sexual femenina o gameto femenino. Los óvulos son sintetizados en los ovarios, desde antes del nacimiento de la mujer. Por tanto cada mujer posee un número concreto de ellos que van madurando cíclicamente desde la menarquía hasta la menopausia. El óvulo con su gran abundancia de citoplasma, es una de las células más grandes del cuerpo y está diseñada únicamente para aportar nutrientes para el rápido desarrollo del embrión hasta su implantación en el útero. Los espermatozoides se encuentran entre las células más pequeñas y más altamente especializadas del cuerpo. Todas las características que un niño heredará de su padre se en la fertilización encuentran en el material nuclear condensado que se encuentra en la cabeza del espermatozoide. Su principal función es llegar al óvulo y ser capaz de fecundarlo rompiendo la barrera exterior del óvulo, de forma que la fusión de ambos gametos de lugar al cigoto, que mediante el proceso de multiplicación celular irá desarrollándose en lo que conocemos como el proceso del embarazo. Las células madre Germinales se tratan de células madres embrionarias pluripotenciales que se derivan de los esbozos gonadales del embrión. Estos esbozos gonadales se encuentran en una zona específica del embrión denominada cresta gonadal, que dará Juan Diego Dávila 23 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE lugar a los óvulos y espermatozoides. Tienen una capacidad de diferenciación similar a las de las células madres embrionarias, pero su aislamiento resulta más difícil. 1.3.3.- CÉLULAS MADRE FETALES. Estas células madre aparecen en tejidos y órganos fetales como sangre, hígado, pulmón y poseen características similares a sus homólogas en tejidos adultos, aunque parecen mostrar mayor capacidad de expansión y diferenciación. Su procedencia no está del todo clara. Podrían tener origen embrionario o bien tratarse de nuevas oleadas de progenitores sin relación con las células madres embrionarias. Figura #1.10 Bebe en gestación 11 Los tejidos fetales son, por tanto, una fuente de células madre cualitativamente mejores que las obtenidas del tejido adulto. Pero son menos multipotentes que las CM embrionarias. Una ventaja significativa de las células fetales sobre las CM embrionarias es que su utilización provoca menos debate ético ya que pueden ser aisladas de fetos cuyo desarrollo ha sido interrumpido por razones médicas, o debido a un aborto natural. Las células madre del cerebro de fetos humanos han sido usadas para tratar pacientes con la enfermedad de Parkinson y en algunos casos se ha conseguido una mejora clínica sostenida. A pesar de este aparente nivel de éxito, las células madre fetales tienen un inconveniente fundamental: el material de origen es extremadamente limitado. Una limitación adicional es que las células fetales no tienen casi ningún uso para terapias de 11 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 24 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE paciente idéntico (a menos que se desarrollen técnicas in útero que permitan que el mismo feto sea tratado). Por estas razones, el uso de células fetales tiene limitaciones tanto en el abanico de enfermedades como en el número de pacientes que pueden tratar. Por ello es improbable que contribuyan de forma significativa a la batería de terapias celulares utilizadas para luchar contra las enfermedades. 1.3.4.- CÉLULAS MADRE ADULTAS. Casi todas las células del cuerpo contienen el conjunto completo de genes necesarios para construir y mantener un ser humano. Pero a medida que las células se vuelven más especializadas, se apagan los genes que ya no necesitan las células. Debido a que algunos de sus genes ya han sido silenciadas, las células madre adultas son menos versátiles que las células madre embrionarias. Pero todavía pueden ser usadas para tratar a los pacientes. Su capacidad es más limitada para generar células especializadas. Son células no diferenciadas que se encuentran en tejidos y órganos adultos y que poseen la capacidad de diferenciarse para dar lugar a células adultas del tejido en el que se encuentran, por lo tanto se consideran células multipotenciales. En un individuo adulto se conocen hasta ahora alrededor de 20 tipos distintos de células madre, que son las encargadas de regenerar tejidos en continuo desgaste (como la piel o la sangre) o dañados (como el hígado). La célula madre por excelencia es el cigoto, formado cuando un óvulo es fecundado por un espermatozoide. El cigoto es totipotente, es decir, puede dar lugar a todas las células del feto y a la parte embrionaria de la placenta. Conforme el embrión se va desarrollando, sus células van perdiendo esta propiedad (totipotencia) de forma progresiva, llegando a la fase de blástula o blastocisto en la que contiene células pluripotentes (células madre embrionarias) capaces de diferenciarse en cualquier célula del organismo salvo las de la parte embrionaria de la placenta. Conforme Juan Diego Dávila 25 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE avanza el desarrollo embrionario se forman diferentes poblaciones de células madre con una potencialidad de regenerar tejidos cada vez más restringida y que en la edad adulta se encuentran en "nichos" en algunos tejidos del organismo. Un tipo de células madre adulta se encuentra en la médula ósea y dan lugar a todas las células de la sangre y las células del sistema inmunológico. Figura # 1.11 Células Madres Adultas obtenidas de la medula ósea 12 Otro tipo de célula madre que se encuentra en la médula ósea puede convertirse en músculo, tendón, cartílago, grasa y hueso. Por ejemplo, cuando los pacientes de cáncer reciben un trasplante de médula ósea, reciben células madre formadoras de la sangre que regeneran la sangre y las células del sistema inmunológico. Las células madre hematopoyéticas de médula ósea (encargadas de la formación de la sangre) son las más conocidas y empleadas en la clínica desde hace tiempo. En la misma médula, aunque también en sangre del cordón umbilical, en sangre periférica y en la grasa corporal se ha encontrado otro tipo de célula madre, denominada mesenquimal que puede diferenciarse en numerosos tipos de células de los tres derivados embrionarios (musculares, vasculares, nerviosas, hematopoyéticas, óseas, etc). 12 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 26 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Aunque aún no se ha podido determinar su relevancia fisiológica se están realizando abundantes ensayos clínicos para sustituir tejidos dañados (corazón) por derivados de estas células. Figura # 1.12 Estas células pueden especializarse para sólo uno o dos tipos diferentes de tejido, como la médula espinal, el cerebro o los músculos, son más especializadas y más limitadas que las células madre embrionarias 13 Las células Madre Adultas tienen la característica única de auto-renovación y la capacidad de convertirse en distintos tipos de células especializadas maduras que emociona a los científicos acerca de la posibilidad de utilizar todo tipo de células madre para crear células de reemplazo y para desarrollar medicamentos más seguros y eficaces. Recientes investigaciones lograron, mediante partenogénesis, activar óvulos humanos no fecundados, lo cual podría ser en futuro próximo una fuente sin controversias éticas para la consecución de células madre. 13 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 27 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Figura # 1.13 Células Madre embrionarias y adultas 14 Figura # 1.14 Diferenciación entre células Madre Embrionarias y Adultas 14 15 15 www.biologíamolecular.com www.biologíamolecular.com Juan Diego Dávila 28 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Capítulo 2 PREPARACIÓN Y CONDICIONES DEL PACIENTE PARA LA EXTRACCIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE Juan Diego Dávila 29 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE 2.- PREPARACIÓN Y CONDICIONES DEL PACIENTE PARA LA EXTRACCIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE 2.1.-PRELIMINARES. Para la extracción de células madre es importante las condiciones de salud del paciente que en su situación de donante debe disfrutar de una buena forma física. Se pueden resertar donantes voluntarios tomando en cuenta que ellos deben disfrutar de buena salud y comprender una edad de entre los 18 y 55 años. No puede padecer enfermedades que se transmitan por la sangre (por ejemplo, la hepatitis), ya que se puede afectar gravemente al estado de salud del paciente. Si hubiera varios donantes posibles dentro de su familia, se elegirá al más adecuado en base a los exámenes realizados, sexo, edad y estado de salud de los donantes. Figura # 2.1 Extracción de Células Madres 16 Hay que tomar en cuenta que no todas las madres pueden donar. Como ocurre con la donación común de sangre, una embarazada deberá cumplir con ciertos requisitos específicos para poder donar. Por ejemplo ser mayor de 18 años, con una edad gestacional mayor a 34 semanas en el momento de la colecta y no tener historia médica de enfermedades neoplásicas (cáncer) así como hematológicas (anemias hereditarias por ejemplo), entre otras. 16 www.ibercajalav.net Juan Diego Dávila 30 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Se requiere de igual forma hacerle a cada donante una serie de preguntas y tomar eere3muestras para realizar estudios. Todo ello es realizado por el personal capacitado de manera tal que tanto donantes como pacientes reciban la atención que se merecen. Tampoco pueden donar las mujeres con antecedentes personales de alguna enfermedad genética, SIDA, Chagas, Sífilis. Tampoco si está infectada con VIH, Hepatitis B o C. 2.2.- ANÁLISIS PREVIO DEL PACIENTE A EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE Y ANTECEDENTES Antes de la donación, el donante debe realizarse un examen clínico para confirmar su buen estado de salud. No hay exigencias con respecto al cambio de hábitos de vida, trabajo o alimentación. 2.2.1.- EXÁMENES DE LABORATORIO PERTINENTES PARA LA EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE. Es indispensable realizar: Prueba de embarazo. Análisis de sangre: se toman varias muestras de sangre para realizar el examen complementario, como son hepatitis, herpes, VIH, ya que ningún donante debe tener ninguna enfermedad infecciosa. Se realizan estudios más detallados de los tejidos, determinación del grupo sanguíneo y el cuadro hematológico general. 2.3.- PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD PRUEBA DE HISTOCOMPATIBILIDAD HLA. En la pared de las células de toda persona se encuentran unos marcadores que son únicos de cada individuo. Estos marcadores son una especie de huella dactilar de la célula y se denominan moléculas HLA (abreviatura de Antígeno del Leucocito Humano). La estructura de las moléculas HLA pasa de padres a hijos. La posibilidad de que su HLA sea idéntico al de uno de los hermanos es de un 25%. En el transplante de células Juan Diego Dávila 31 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE madre es de vital importancia que las células madre a transplantar tengan el mismo HLA. De este modo, se reduce al mínimo la posibilidad de rechazo en el paciente de las células donadas. Podrá leer más al respecto en el apartado sobre la enfermedad del injerto contra el huésped. Para saber si su HLA es idéntico al de su hermano o hermana debemos hacerle un análisis de sangre. El que dos personas sean compatibles es posible ser detectado a través del análisis del antígeno leucocitario humano, conocido como HLA. Consistes en identificar una serie de proteínas que exhiben los leucocitos en su superficie, que son específicas de cada persona y se heredan del padre y de la madre. Otros nombres como se conoce a la prueba son: Tipificación tisular; Tipificación de HLA En definitiva la prueba de HLA es aquella que evalúa unas proteínas llamadas antígenos leucocitarios humanos (HLA, por sus siglas en inglés), los cuales se encuentran en la superficie de casi toda célula en el cuerpo humano. Estos antígenos se encuentran en grandes cantidades en la superficie de los glóbulos blancos y le ayudan al sistema inmunitario a establecer la diferencia entre los tejidos corporales y las sustancias extrañas. Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio se limpia con un desinfectante (antiséptico). El médico envuelve una banda elástica alrededor de la parte superior del brazo con el fin de aplicar presión en el área y hacer que la vena se llene de sangre. Luego, el médico introduce suavemente una aguja en la vena y recoge la sangre en un frasco hermético o en un tubo adherido a la aguja. La banda elástica se retira del brazo. Una vez que se ha recogido la muestra de sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de punción para detener cualquier sangrado. En bebés o en niños pequeños, se puede utilizar un instrumento puntiagudo llamado lanceta para punzar la piel y hacerla sangrar. La sangre se recoge en un tubo pequeño de Juan Diego Dávila 32 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE vidrio llamado pipeta, en un portaobjetos o en una tira reactiva. Finalmente, se puede colocar un vendaje sobre el área si hay algún sangrado. Figura # 2.2 Placas para pruebas HLA 17 PREPARACIÓN PARA EL EXAMEN No se requiere de ninguna sugerencia específica para realizar el examen, ni horarios determinado, se puede realzar a cualquier hora y si el paciente ésta o no en ayunas. Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, se puede sentir un dolor moderado o experimentar sólo una sensación de pinchazo o picadura. Después, puede haber algo de sensación pulsátil. PROCEDIMIENTO Se añade la muestra uniéndose durante la incubación los Ac con el Ag fijado. Se añade anti IgG humana conjugada con fosfatasa alcalina a cada pozo. Una segunda incubación permite que el conjugado se una a los Ac. Se añade un sustrato cromogénico PNPP y tras incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado. Se evalúa fotometricamente. 17 www.biologíamolecular.com Juan Diego Dávila 33 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE VALORES NORMALES Cada persona tiene una pequeña serie de antígenos HLA relativamente únicos que hereda de sus padres. Los niños, en promedio, tendrán la mitad de sus antígenos HLA compatibles con la mitad de los antígenos HLA de su madre y la otra mitad compatible con los de su padre. Es improbable que dos personas sin ningún parentesco presenten la misma estructura de HLA, aunque los gemelos idénticos pueden tener compatibilidad entre sí. Algunos tipos de HLA son más comunes en ciertas enfermedades autoinmunitarias. Por ejemplo, el antígeno HLA-B27 se encuentra en muchas personas (pero no en todas) con espondilitis anquilosante y síndrome de Reiter. POSIBLES RIESGOS Las venas y arterias varían de tamaño de un paciente a otro y de un lado del cuerpo a otro, razón por la cual obtener una muestra de sangre de algunas personas puede resultar más difícil que de otras. Otros riesgos asociados con la extracción de sangre son leves, pero pueden ser: Sangrado excesivo Desmayo o sensación de mareo Hematoma (acumulación de sangre debajo de la piel) Infección (un riesgo leve cada vez que se presenta ruptura de la piel) 2.4. –PUNCIÓN DE LA MÉDULA ÓSEA Se trata de una prueba médica mínimamente invasiva que permite estudiar la medula ósea. La medula ósea es un tejido situado en el interior de algunos huesos en los adultos cuya finalidad básica es la fabricación de las células sanguíneas. Habitualmente, se llaman células sanguíneas a los leucocitos (glóbulos blancos), hematíes (glóbulos rojos o eritrocitos) y plaquetas (o trombocitos). Los estudios básicos que se pueden realizar son un estudio citológico (punción-aspirado, medulograma) y un estudio histológico (biopsia de cilindro medular). Juan Diego Dávila 34 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE El material líquido obtenido se puede someter a múltiples estudios según requiera la situación patológica que ha llevado a la realización de la prueba. Hoy en día, estos estudios especiales son prácticamente imprescindibles para la tipificación de muchas enfermedades que afectan a la medula ósea. El inmunofenotipo o estudio mediante citometría de flujo, los estudios citogenéticos (cariotipos, FISH), los cultivos celulares, los estudios moleculares de genes específicos y los cultivos microbiológicos son algunos de estos estudios especiales frecuentemente realizados con el material medular extraído. El estudio citológico se realiza sobre una gota del material obtenido extendida en un portaobjetos y teñido mediante colorantes específicos que nos permitirán identificar observando bajo el microscopio las características y linaje de las células normales y patológicas existentes en la medula ósea. El uso de diferentes tipos de colorantes y técnicas, (Ej: tinciones de Wright, mieloperoxidasas) permite distinguir mejor algunas estirpes de células. La realización de varias tinciones permitirá afinar el diagnóstico. El estudio histológico se realiza sobre un fragmento de hueso una vez descalcificado. Se obtienen mediante cortes múltiples muy finos unas laminillas que se fijan en un portaobjetos y se tiñen de forma similar a las preparaciones anteriores. En el estudio microscópico histológico, se puede identificar la situación de las diferentes poblaciones de células de la medula ósea normales y patológicas respecto a las trabéculas óseas. Figura # 2.3 Trasplante Células Madre 18 18 www.dfarmacia.com Juan Diego Dávila 35 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE La punción de la médula habitualmente se realiza en el mango o cuerpo del esternón en los estudios únicamente citológicos (punción-aspiración). El estudio histológico requiere la punción de la cresta ilíaca habitualmente la posterior, si bien no es infrecuente la punción en cresta ilíaca anterior. 2.5.- RECOMENDACIONES A DONANTES DE CÉLULAS MADRE. El procedimiento de donación de médula ósea es totalmente seguro para el donante. El trasplante convencional, cuando hay aspiración en el hueso de las células de la médula ósea, es un procedimiento quirúrgico que necesita anestesia general, siendo retirada del donante la cantidad de células progenitoras en el volumen necesario para el paciente: de 10 a 15 ml/kg. La intervención no deja secuelas. En un intervalo de 4 a 6 semanas, la médula ósea del donante estará completamente recuperada. Un chequeo pré-operatorio detallado evalúa las condiciones clínicas y cardiovasculares del donante, con el objetivo de orientar el equipo involucrado en esta operación. Ya en la coleta de células madres de la sangre periférica del donante, el uso de una medicación denominada factor de crecimiento (G-CSF) puede ocasionar dolor óseo, un poco de fiebre y, en casos raros, aumento del hígado y del bazo. Es posible que sienta dolor en la parte inferior de la espalda durante unos días o más. Muchos donantes regresan a su rutina normal en unos pocos días. La aféresis casi siempre causa muy poca molestia. Durante la aféresis, la persona puede tener mareos, escalofríos, entumecimiento en los labios o calambres en las manos. A diferencia de la donación de médula ósea, la donación no requiere anestesia. El medicamento que se administra para estimular que la médula libere un mayor número de células madre hacia el torrente sanguíneo puede causar dolores musculares y de los huesos, dolores de cabeza, fatiga, nausea, vómitos o dificultad al dormir. Estos efectos secundarios dejan de presentarse 2 o 3 días después de que se administra la última dosis del medicamento Con respecto a la aféresis también pueden ocurrir alteraciones en la presión arterial cuando el donante está en el equipo de leucaféresis. Por eso, durante toda la colecta hay acompañamiento médico. Juan Diego Dávila 36 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Capítulo 3 CUIDADOS A SEGUIR EN EL PROCESO DE EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE Juan Diego Dávila 37 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE 3.- CUIDADOS A SEGUIR EN EL PROCESO DE EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE. 3.1.- RECOLECCIÓN DE LAS CÉLULAS MADRES: AFERESIS Las células madre se recolectan utilizando una máquina de aféresis. La aféresis es la técnica mediante la cual se separan los componentes de la sangre, siendo seleccionados los necesarios para su aplicación en medicina y devueltos al torrente sanguíneo el resto de componentes. Figura # 3.2 Recolección de Células Madre de la sangre periférica 19 La finalidad de la aféresis es la extracción de un componente sanguíneo destinado a la transfusión o para el tratamiento de algunas enfermedades que precisen la eliminación de un componente patológico de la sangre. 19 www.fundacionannavazquez.wordpress.com Juan Diego Dávila 38 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE El procedimiento de la aféresis consiste en conectar por vía venosa a través de uno o dos accesos al donante o al paciente, a una máquina separadora de células (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas), mediante un equipo de bolsas y tubos de recolección estériles. La sangre llega al separador celular, donde se procesa y se selecciona el producto a recolectar, el resto de la sangre es devuelta al paciente o al donante. Según el tipo de máquina de recolección y el producto que se pretende obtener, la aféresis puede durar entre 30 minutos y dos horas. Los criterios de selección del donante son los mismos establecidos para la donación de sangre. Este procedimiento se realiza bajo la supervisión de personal médico y de enfermería con experiencia en este tipo de donación. Periódicamente, durante la aféresis, se realizan una serie de controles de la donación como pulso, tensión arterial y estado general del donante o paciente. La finalidad de la aféresis es la extracción de un componente sanguíneo destinado a la transfusión o para el tratamiento de algunas enfermedades que precisen la eliminación de un componente patológico de la sangre. 3.1.1.- EFECTOS SECUNDARIOS El procedimiento de aféresis tiene efectos secundarios similares a aquellos que se presentan cuando las personas donan sangre entera. Los efectos secundarios más comunes incluyen náuseas, desmayos, mareos y hematomas en el lugar en el que se colocó la aguja. El citrato agregado puede provocar efectos colaterales que incluyen calambres, entumecimiento, una sensación de frío, de hormigueo y de ansiedad. A veces se administra calcio, ya sea por boca o por vena, para evitar o tratar estas reacciones. Es posible que después de la aféresis, el recuento de plaquetas y de glóbulos blancos del donante sea más bajo de lo que era antes del procedimiento. Generalmente, esta Juan Diego Dávila 39 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE disminución es baja. Sin embargo, tomar aspirinas cuando el recuento de plaquetas es bajo puede incrementar la posibilidad de sangrado. Se recomienda que los donantes no tomen aspirinas ni medicamentos que contengan aspirinas mientras se les administre G-CSF y durante 2 semanas después de la donación de células madre de sangre periférica sin consultar al médico. 3.1.2.- MAQUINA DE AFERESIS Esta máquina extrae sangre periférica de una vena en el brazo del donante y separa las células madre de otros tipos de células que se encuentran en la sangre del donante. La máquina separa las células madre y regresa los contenidos restantes de sangre a través de la aguja en el otro brazo. Figura #3.3 Conexión de la máquina de Aferesis al brazo del paciente 20 Esta máquina es del mismo tipo que se utiliza para las donaciones de plaquetas. Generalmente, este proceso se administra de forma intravenosa temporal en los brazos. Durante la aféresis, el citrato anticoagulante se administra para evitar que la sangre coagule mientras está fuera del cuerpo. 20 www.sobrecelulasmadre.com Juan Diego Dávila 40 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Figura #3.4 Máquina de Aferesis 21 El proceso de aféresis requiere que el donante permanezca sentado de 3 a 8 horas por día hasta que se hayan recolectado suficientes células madre para el transplante. Esto generalmente tarda de 1 a 3 días. Figura # 3.5 Transplantes 22 3.2.-TIPOS DE TRASPLANTES DE CÉLULAS MADRES El éxito de cualquier trasplante radica en que el receptor no rechace las células, el tejido o el órgano trasplantado desde el donante. Por eso hay que conseguir el mayor grado de compatibilidad entre el donante y el receptor. La compatibilidad se relaciona 21 22 www.sobrecelulasmadre.com www.infocelulasmadre.com Juan Diego Dávila 41 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE estrechamente con la similitud genética, por ello se pueden distinguir los siguientes tipos de trasplantes: Autólogo Singénico Alogénico 3.2.1.- TRASPLANTE CÉLULAS MADRE AUTÓLOGO Es el trasplante de células, tejido u órgano del propio Individuo. Dado que no se produce respuesta inmune, nunca hay rechazo. Cuando los pacientes donan sus propias células madre (autólogos), los antígenos de “lo propio” encuentran antígenos de “lo propio” y hay la suficiente similaridad para disminuir el riesgo de guerra de parte de las células inmunes. El uso autólogo en un niño con cáncer o un desorden inmune puede no estar recomendado debido a que se supone que esas enfermedades tienen una base genética. Figura # 3.6 Autodonación de Células Madre 23 23 www.fundacionannavazquez.wordpress.com Juan Diego Dávila 42 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Los trasplantes autólogos son más comunes en adultos con cáncer, pero en ese caso las células se obtienen generalmente de la sangre del mismo paciente. Una vez colectadas, las células troncales por lo general se infunden inmediatamente al paciente, en donde ellas migran a la médula ósea y se establecen o se injertan. Una vez ahí, las células madre pueden repoblar el torrente sanguíneo con glóbulos rojos normales y células inmunes que rescatan al paciente. Para algunos tipos de cáncer, esta proeza es curativa. 3.2.2.- TRASPLANTE DE CÉLULAS MADRE SINGÉNICO "Relativo a un individuo o tipo de célula que tiene el mismo genotipo que otro". Es el trasplante de células, tejido u órgano de un gemelo idéntico. Entre los gemelos univitelinos tampoco se produce rechazo porque tienen los mismos genes. 3.2.3.-TRASPLANTE CÉLULAS MADRE ALOGÉNICO Es el trasplante de células, tejido u órgano de un miembro de una especie a otro miembro de la misma especie pero genéticamente diferente. El donante puede ser un familiar del receptor (emparentado) o no estar relacionado con él (no emparentado). Debido a las diferencias genéticas, es en este tipo de trasplantes donde es esencial conseguir la máxima compatibilidad entre donante y receptor. Figura # 3.7 Células Madre provenientes del donador 24 24 www.fundacionannavazquez.wordpress.com Juan Diego Dávila 43 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE El éxito de un trasplante de la sangre depende de las interacciones de los marcadores en la superficie de todas las células del cuerpo, incluyendo las células inmunes tanto del paciente como del donador. Normalmente, todas las células del cuerpo del paciente coexisten pacíficamente en un estado conocido como autotolerancia debido a que todas ellas portan las mismas proteínas automarcadoras. Estas proteínas también se conocen como antígenos debido a que, si ellas se introducen a un nuevo ambiente, son capaces de estimular una reacción inmune poderosa. Esto es lo que ocurre cuando una preparación de células madre de la sangre con antígenos extraños es trasplantada en un paciente cuyos antígenos de lo propio son muy diferentes. La sangre donadas traen consigo sus propios antígenos. El sistema inmunológico del paciente, el cual es conocido como huésped, detecta que estos antígenos no hacen juego o son extraños. Esto provoca que las células inmunes del paciente ataquen a las células donadas, las cuales se conocen como un injerto y este asalto puede conducir al rechazo del trasplante por parte del paciente. Sin embargo, más frecuentemente, algunas células inmunes donadoras maduras que se mezclan entre las células madre de la sangre trasplantada reconocen a los antígenos en las células del cuerpo del paciente como extraños. Esto causa que el trasplante ataque a los tejidos y órganos del paciente. El éxito en el trasplante depende de encontrar un apareamiento compatible de los antígenos en las células y tejidos del donador con aquéllos del paciente. En la mayoría de los casos, esto significa encontrar juegos que sean levemente diferentes, pero no demasiado diferentes. Los donadores no necesitan estar relacionados con el paciente, pero ellos deben tener una cantidad razonable de compatibilidad. Una prueba de la sangre conocida como tipificación de tejido se utiliza para encontrar buenas combinaciones. Cuando se realizan los trasplantes alogénicos, surge a veces la enfermedad injerto contra huésped (GVHD). La GVHD ocurre cuando los glóbulos blancos del donante (injerto) identifican las células en el cuerpo del paciente (el huésped) como foráneas y las atacan. Los órganos más afectados incluyen la piel, el hígado y el intestino. Esta complicación puede surgir en las primeras semanas tras el trasplante (GVHD aguda) o mucho más Juan Diego Dávila 44 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE tarde (GVHD crónica). Para evitar esta complicación, el paciente recibe medicamentos para suprimir el sistema inmune. Además, se tratan las células madre del donante para remover los glóbulos blancos que causan la GVHD en un proceso llamado “depleción de células T.” Si surge la GVHD, puede ser un problema muy grave que se trata con esteroides o con otros agentes inmunosupresores. 3.3.- ADICIÓN DE ADITIVOS EN EL EXTRAÍDO DE CÉLULAS MADRE. 3.3.1.- FACTORES DE CRECIMIENTO La obtención de células madre de sangre periférica requiere administrar 4 ó 5 inyecciones subcutáneas de unas sustancias denominadas factores de crecimiento hematopoyético, que hacen que las células madre de la médula ósea pasen a la sangre El primer paso en el proceso de recolección de células madre se denomina movilización. La movilización de las células madre de la sangre aumenta la cantidad de células madre que circulan para obtener la muestra de sangre periférica del donante. El donante recibirá un factor de crecimiento de sangre denominado factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en inglés). Se administra una (1) vez por día en forma de inyección hasta que se recolecta la cantidad suficiente de células madre de la sangre. Generalmente tarda de 3 a 5 días. Los efectos secundarios del G-CSF generalmente son leves y temporales. Los efectos secundarios más comunes son síntomas similares a los de la gripe (fiebre baja, escalofríos, dolor de huesos, dolores de cabeza y problemas para dormir). Es posible que el médico le recete Tylenol para aliviar estos síntomas. Estos efectos secundarios generalmente terminan cuando se recolectan las células madre. Los donantes que sean mujeres en edad de quedar embarazadas deberán hacerse una prueba de embarazo antes de tomar G-CSF. GCSF o factor estimulador de colonias de granulocitos es una citoquina que controla la producción, diferenciación y función de los granulocitos. El GCSF pertenece a la familia de las hematopoyetinas. Dentro de esta familia de proteínas el GCSF pertenece a la misma Juan Diego Dávila 45 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE subfamilia que la IL-3, la IL-4, la IL-5 y la IL-13. Todas ellas están relacionadas estructuralmente, sus genes están cercanos en el genoma y son producidas fundamentalmente por las células de tipo Th2. Figura # 3.8 Maduración de células sanguíneas en la médula ósea. La maduración de las diferentes células sanguíneas es regulada por diversas citoquinas y hormonas, por ejemplo G-CSF, IL-3 (interleuquina 3), eritropoyetina y trombopoyetina 25 www.cienciahoy.org.ar Juan Diego Dávila 46 25 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE El GCSF es el regulador más importante de la producción de granulocitos, es sintetizado por las células estromales de la médula ósea, por las células endoteliales, por los macrófagos y por los fibroblastos. Su producción es inducida por estímulos inflamatorios. GCSF actúa a través del receptor GCSFR que es expresado por células mieloides progenitoras, por neutrófilos maduros, monocitos, macrófagos, células endoteliales y linfocitos T y B. GCSF incrementa la producción y la liberación de neutrófilos, la movilización de células madre hematopoyéticas y modula la diferenciación, vida media y la función efectora de los neutrófilos maduros. También parece ejercer efectos sobre los macrófagos expandiéndolos en número y reforzando su capacidad fagocítica y regulando la producción de citoquinas y chemoquinas de la inflamación. Juan Diego Dávila 47 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Capítulo 4 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE Juan Diego Dávila 48 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE 4.- MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE 4.1.- MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE DIVERSAS FUENTES Existen diferentes técnicas para la obtención directa de células Madre a si también se pueden obtener de tres niveles diferentes: DEL CIGOTO: que es la primera fase del desarrollo tras la fecundación del óvulo por el espermatozoide. Estas células se reproducen por mitosis y cada una de las células hijas tienen las mismas características que sus progenitoras. Tienen la capacidad de especializarse en todo tipo de células, incluso de la placenta y el cordón. Son células Totipotentes. DEL BLASTOCITO: periodo del cigoto comprendido entre los 7 y 13 días de su existencia. Se compone de dos capas: Externa: Donde se hallan las células que darán origen a la placenta y al cordón umbilical. Interna: Producirán todos los tejidos del feto. Estas células son pluripotentes ya que pueden generar células con una función concreta, como son células de la piel; pero, no son capaces de especializarse en células de la placenta o del cordón umbilical. Figura # 4.1 Juan Diego Dávila 49 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Extracción de las Células Madre 26 DE LA MEDULA OSEA DEL ADULTO: son órgano-específicas. A partir de ellas pueden obtenerse células sanguíneas como eritrocitos (glóbulos rojos) o leucocitos (glóbulos blancos), y del sistema linfático. Estas son células multipotentes. Ante una situación de un paciente concreto lo primero que precisamos es saber la enfermedad que deseamos curar y por tanto qué tipo de células precisamos para ello, y de dónde debemos obtenerlas. En el caso de que sean embrionarias, es decir, provenientes del cigoto o del blastocito, nos encontramos con un problema ético legal. Coger células del embrión implicaría la destrucción del mismo. Desde el punto de vista científico la muerte del embrión sería razonable porque lo que persigue es un beneficio consistente en la curación de una enfermedad grave. Desde el punto de vista religioso y ético no es correcto puesto que sacrificas un ser vivo con un alma única que le hace único y según la religión el fin no justifica los medios. Por eso, el mayor número de investigaciones se llevan a cabo con células madre desechadas de forma natural en el momento del parto. Nos referimos a la placenta y el cordón umbilical que no son necesarios para el crecimiento del ser humano una vez nacido. También se pueden obtener de la medula ósea de los niños y adultos, aunque con mayor dificultad, debido a su menor concentración. Lo malo de usar estas células es que son pluripotentes y multipotentes, respectivamente. Por ello, no pueden dar lugar a células de la placenta, o en el caso de una célula de la medula ósea de un adulto, no se puede crear tejido muscular. Por ello, las células madre que se usan para la experimentación son las provenientes del cigoto recién fecundado, ya que poseen la totipotencia. 26 www.sobrecelulasmadre.com Juan Diego Dávila 50 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Pero si cogemos estas células, destruimos al embrión. Por esta razón, se utilizan las células sobrantes de los procesos de fecundación In-Vitro, o sea óvulos fecundados en el laboratorio. Como se fecundan muchos óvulos y solo unos pocos se implantan en la mujer, los demás se conservan congelados para su posterior utilización. 4.2.1.- EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE EMBRIONES Las células madre se extraen normalmente de un embrión en el quinto día de su desarrollo preimplantatorio, lo que implica necesariamente la destrucción del embrión. La criopreservación o crioconservación es un método que utiliza nitrógeno líquido (196 °C) para detener todas las funciones celulares y así poderlas conservar durante años. Estos embriones son procedentes de los tratamientos de reproducción humana asistida, que cuando se fecundan más de los necesarios pueden ser donados por los pacientes que se someten a este tratamiento. Estos embriones criopreservados en fase de blastocisto pueden conservarse durante cinco años Figura # 4.2 Juan Diego Dávila 51 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Células Madre Embrionarias 27 4.2.3.- EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE PLACENTA. La placenta es un órgano efímero presente en la mayoría de los mamíferos y que relaciona estrechamente al bebé con su madre y atiende las necesidades de respiración, nutrición y excreción del feto durante su desarrollo. La placenta se desarrolla de las mismas células provenientes del espermatozoide y el óvulo que dieron desarrollo al feto y tiene dos componentes, una porción fetal, el corion frondoso y una porción materna o decidua basal. Figura # 4.3 Placenta 28 Es el último descubrimiento para el tratamiento de padecimientos hematológicos. Durante la gestación, la placenta y la circulación sanguínea del bebé a la placenta, cubren un importante número de funciones imprescindibles para el correcto desarrollo del bebé. A pesar de ello, hasta hace poco, tanto la placenta como la sangre contenida dentro de ella, han sido consideradas como productos de desecho después del alumbramiento. En la década de los 80, entre otras cosas, se descubrió que la sangre de 27 28 www.fundacionannavazquez.wordpress.com www.umm.edu Juan Diego Dávila 52 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE la placenta posee cualidades diferentes a las de la sangre adulta e incluso diferentes a las de las sangre de un recién nacido varios días después del parto. Dos de estas cualidades son de especial relevancia: 1. La sangre placentaria posee una concentración relativamente elevada de células madre hemopoyéticas (generadoras de las células que conforman la sangre) de gran capacidad proliferativa y 2. Casi no existen células responsables de la respuesta inmune: Esto puede ser debido a la tolerancia entre el bebé y la madre y la falta de contactos previos con antígenos (substancias que provocan la formación de anticuerpos) externos. Estas características convirtieron la sangre del cordón umbilical (SCU) en una fuente de progenitores hemopoyéticos potencialmente útil en transplantes. Estas células se obtiene cuando la placenta está "in utero" y el recién nacido ha sido separado de la placenta. Una vez recogido el máximo volumen posible, se espera al alumbramiento de la placenta cuyas venas se puncionan para obtener sangre para las pruebas complementarias. Así mismo, se guarda un pedazo del cordón umbilical. 4.2.2.- EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DEL CORDÓN UMBILICAL. Las células madre del cordón umbilical se consideran como células madres adultas. Éstas son células hematopoyéticas, ósea que crean células de la sangre y del sistema inmunológico. Juan Diego Dávila 53 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Figura # 4.4 Células del Cordón Umbilical 29 El beneficio del empleo de la sangre del cordón umbilical es la vida extendida para renovar hematíes normales en personas con anemias falciformes o reponer el sistema inmunitario en niños con inmunodeficiencias graves. En deficiencias enzimáticas hereditarias como el síndrome de Hurler, que conduce a una degeneración neurológica progresiva y con evolución mortal, las células troncales del cordón regeneraron hematíes normales, leucocitos y células cerebrales de sostén de la microglia que reponen la enzima clave ausente. Igualmente en el síndrome de Toni Debré Fanconi, conocido como anemia de Fanconi, se obtuvo la curación por la transfusión de la sangre del cordón umbilical de un hermanito del paciente afectado. Figura # 4.5 Extracción de la sangre del Cordón Umbilical 30 29 30 www.epigenome.com www.sobrecelulasmadre.com Juan Diego Dávila 54 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Son mucho más fáciles de obtenerse en comparación con las células de la médula ósea. A pesar de que las células de la médula ósea actúan más rápido que las células del cordón umbilical, las células del cordón umbilical no necesitan una compatibilidad al 100% con el paciente en cambio las células de la médula ósea sí. Otras ventajas de las células de cordón umbilical son que su extracción no es dolorosa, se pueden usar con otros miembros de la familia sin ningún problema y son inmunológicamente inmaduras, es por esto que no necesitan una compatibilidad al 100% con el paciente. MATERIALES Una bolsa especial para la recogida de las Células Madre. Gasas, guantes y un paño verde estériles. Materiales para clampar el cordón. Antiséptico para desinfección del cordón (la más recomendada es povidona yodada en solución alcohólica). Material para sellar la bolsa y para los controles de la madre y de la SCU. Etiqueta y forma de identificación. PERSONAL El personal encargado de realizar este procedimiento debe estar formado y capacitado en los siguientes puntos: Pre-parto.- Promover la donación, información a la donante, criterios de inclusión y exclusión, firma del consentimiento. Todo esto puede llevarse a cabo tanto en las áreas primarias como en las unidades obstétricas. Parto.- Sobre la obtención de la sangre de cordón, la madre y realizar documentos correspondientes. Post-parto.- Conocimientos sobre el almacenaje momentáneo hasta el envío al Banco de Cordón para su procesamiento. RECOMENDACIONES PARA UNA BUENA EXTRACCIÓN Recoger la mayor cantidad posible de células durante el parto. Juan Diego Dávila 55 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE El diseño del dispositivo de almacenamiento y recogida pueda mantener una temperatura entre 4º y 10ºC. Que el tiempo de extracción y el de procesamiento sea el menor posible. Que el laboratorio que procese la muestra cumpla los mejores protocolos. Debe haber biovigilancia y trazabilidad de la muestra. Almacenar una seroteca materno-fetal en un centro de almacenamiento paralelo. 4.2.4. EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE LA SANGRE Es la extracción de células madre circular en el flujo sanguíneo. El llamado factor de crecimiento: G-CSF (por ejemplo, Neupogen) actúa, de esta forma, sobre las células madre. Figura # 4.6 Sangre 31 31 www.umm.com Juan Diego Dávila 56 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Durante los cinco días anteriores al trasplante deberá inyectarse, por vía subcutánea, una o dos veces al día el G-CSF. Posteriormente, se procede a retirar, durante unos dos días, las células madre de su sangre. A este procedimiento también se le denomina leucaféresis. Las células madre se obtienen con ayuda de un equipo de leucaféresis. Por medio de una aguja en un vaso sanguíneo de uno de los brazos, se extrae la sangre que va a parar al equipo donde se separan las células madre, mientras que por el otro brazo, va recibiendo la sangre de vuelta. Dependiendo del equipo de que se disponga, este procedimiento se puede realizar también con una única aguja. El procedimiento a seguir para la obtención de las células madre depende de las normas del centro. La obtención de células lleva, por lo general, unas cuatro horas. En dos días se suelen obtener células suficientes, pero a veces puede ser necesario dedicar un tercer día a este procedimiento. En algunos casos no se puede colocar una aguja en ambos brazos. En este supuesto, la aguja se colocará en la ingle. A fin de evitar que la sangre no coagule en el aparato se le administrará también un anticoagulante. Posibles efectos secundarios de la intervención El G-CSF puede provocar ligeras molestias en los músculos y en los huesos. Puede tomar paracetamol. No utilice aspirina porque este medicamento tiene efectos anticoagulantes. El anticoagulante que se administra durante la leucaféresis puede causar sensación de hormigueo en torno a la boca y en los dedos, dado que se produce una deficiencia (provisional) de calcio en la sangre. Esta deficiencia desaparece, normalmente, después de beber un vaso de leche. En la obtención de las células madre puede que disminuya el número de plaquetas en la sangre, lo que puede provocar que la sangre se coagule algo peor y las heridas se mantengan abiertas durante más tiempo de lo normal. El número de plaquetas vuelve a su valor inicial en un par de días. 4.2.5. OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE LA MÉDULA ÓSEA Juan Diego Dávila 57 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Por lo general, se le ingresará un día antes en el mismo departamento en el que se encuentre su familiar. Dado que la extracción de células madre de la médula ósea se hace con anestesia total, el anestesista hablara al paciente el día de su ingreso en el hospital. En algunos centros, podrá optar por anestesia local o total. En la anestesia local solo se anestesia la parte inferior del cuerpo y el donante estará consciente durante toda la intervención. En algunos centros, las células madre se extraen en la policlínica. En cualquier caso, se debe tener en cuenta que este procedimiento deberá hacerse antes de que la persona que necesita la donación sea sometido a un posible tratamiento de radioterapia. Figura # 4.7 En un trasplante de Células Madre las células de la médula ósea del donante pueblan la médula ósea del receptor 32 La intervención tiene lugar en el quirófano. Durante la misma el paciente está boca abajo. De la parte derecha e izquierda superior de la pelvis (cresta iliaca) se extrae la médula ósea (mezclada con sangre). Durante el procedimiento se cuentan continuamente el número de células obtenidas. La cantidad de células de la médula ósea obtenida es, como ya hemos dicho, una mínima parte de la totalidad de sus células. Además, estas células se reproducen rápidamente. 32 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 58 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE La intervención dura aproximadamente una hora. POSIBLES EFECTOS SECUNDARIOS DE LA INTERVENCIÓN Debido a la anestesia puede sentir náuseas. Tensión arterial baja en las primeras horas tras la intervención. Por ello, se le administran líquidos a través del gota a gota. Pequeñas molestias en el lugar de la intervención (sensación de “tener un cardenal” al caminar). Esta sensación se puede mantener durante un par de días. La toma de paracetamol puede aliviar las molestias. Anemia, a consecuencia de la extracción de glóbulos rojos. A fin de que se recupere bien, puede que se le recete pastillas de hierro. En algunos casos excepcionales se hará una transfusión de sangre. Dependiendo de su porcentaje de hemoglobina y después de que le haya visitado el hematólogo, se le dará de alta el mismo día de la intervención o un día más tarde. Dada la anestesia que ha recibido y el bajo nivel de hemoglobina de la sangre del paciente, es recomendable que no conduzca. Puede que se sienta más cansado de lo normal durante la semana siguiente a la intervención. Transcurridas algunas semanas deberá acudir a control en la policlínica Juan Diego Dávila 59 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Figura # 4.8 En la foto se ve el proceso que sigue la célula madre desde su obtención, hasta su posible transplante en el paciente 33 wwwsobrecelulasmadre.com Juan Diego Dávila 60 33 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Capítulo 5 PREPARACIÓN Y MANTENIMIENTO DE LAS CÉLULAS MADRE PARA SU CONSERVACIÓN A LARGO PLAZO Juan Diego Dávila 61 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE 5.- PREPARACIÓN Y MANTENIMIENTO DE LAS CÉLULAS MADRE PARA SU CONSERVACIÓN A LARGO PLAZO Figura # 5.1 Trabajos en el Laboratorio 34 En el laboratorio es donde se procede a extraer de la sangre los glóbulos rojos, y es un paso científico recomendado por los doctores, ya que así las células madre son aisladas para tres objetivos específicos: Reducir las posibilidades de incompatibilidad con el grupo sanguíneo en los casos que se necesite la sangre para algún familiar del bebé. Disminuir el volumen de hemoglobina libre que se desprende de los eritrocitos que se fragmentan en la descongelación. Acortar notablemente el uso de DMSO (Monóxido de Azufre DiMetil), que se utiliza como protector en la crio-conservación para impedir daños en las células en la conservación en nitrógeno líquido. 5.1.- PREPARACIÓN IMPORTANTE DE LAS CÉLULAS MADRE PARA LA PRESERVACIÓN. Tras la obtención de las células madres se lleva a cabo una especialización de las mismas hacia el tejido que precisamos. 34 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 62 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE En la especialización, las células madres sufren una serie de transformaciones morfológicas y fisiológicas hacia una función específica concreta. Es importante remarcar que dicha diferenciación es irreversible, por lo que una célula madre ya especializada nunca podrá comportarse nuevamente como célula originaria capaz de producir otro tipo de tejido. La especialización es inducida y dirigida en el laboratorio. El proceso evolutivo de diferenciación celular es estricto y rigurosamente controlado para lograr un determinado tipo de tejido. De ésta forma se consigue multitud de células que se organizarán dando origen a un tejido concreto (histogénesis) y que, posteriormente, constituirá un órgano (organogénesis) que realizará la función encomendada en el receptor. A veces, nuestro sistema inmunológico se activa al detectar un cuerpo extraño en el organismo, por lo que puede producirse un rechazo del órgano recibido. También es verdad que las células madre reducen mucho éste riesgo Figura # 5.2 Estudio de Células Madre en el laboratorio 35 5.2.- CRIOPRESERVACIÓN Es el proceso mediante el cual se enfrían y almacenan células, órganos o tejidos para preservar sus cualidades ante posibles reacciones biológicas. Para ello, su preservación debe ser a temperaturas criogénicas (bajas). 35 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 63 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Ya que la congelación incontrolada de células puede crear formaciones de hielo intracelular nocivos para las mismas, hay formas para evitarlas. Uno de ellos es la congelación controlada a través de congeladores programables que utilizan nitrógeno líquido para ello. La preservación de material biológico a temperaturas criogénicas (criopreservación) consigue detener completamente las reacciones biológicas, lo que permite el almacenamiento indefinido del citado material. Gracias a la criobiología (La ciencia de conservar material biológico), los procesos de criopreservación pueden controlarse de forma que el daño que sufran las células sea mínimo y, por tanto, la recuperación sea máxima. La congelación incontrolada de células puede producir la formación de hielo intracelular o daños osmóticos, pero existen diversas formas para intentar evitar estos daños. Figura # 5.3 Preservación de material biológico 36 36 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 64 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE La más eficiente es la congelación controlada mediante congeladores programables alimentados por nitrógeno líquido. La preservación del material biológico tiene por objeto mantenerlo en estado viable para que pueda ser utilizado en trasplantes y pueda llevar a cabo su función fisiológica después de la misma. La crioconservación biológica se utiliza para almacenar a largo plazo materiales biológicos que deben ejercer sus funciones fisiológicas normales después de descongelados. Es particularmente útil para mantener viable el material entre su obtención y su utilización cuando hay un período de tiempo largo entre ambos procesos. EL procedimiento de criopreservación biológica se realiza en centros sanitarios, como hospitales, centros de transfusión sanguínea, bancos de tejidos o clínicas de reproducción asistida. Estos centros cuentan con personal especializado, habitualmente médicos y biólogos, que son los responsables de la correcta aplicación de las técnicas de criopreservación. 5.3.- BANCOS DE CÉLULAS MADRE Un banco de Células Madre es un lugar dónde los padres pueden almacenar las células madre de sus recién nacidos mediante la criopreservación congelación a temperaturas de 195°C negativos para guardar material genético importante que puede ayudarlo a tratar enfermedades que se pueden presentar en un futuro. Se realiza un seguimiento clínico y analítico de la madre y del recién nacido durante la estadía hospitalaria, después de la cuarentena y, si es posible, a los seis meses; registrándose todas las incidencias que presentan ambos. El procesamiento de esta sangre comprende varias fases. De cada unidad criopreservada, se conservan muestras paralelas para controles posteriores: Células y plasma de la madre del día del parto. Juan Diego Dávila 65 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Plasma de la sangre del cordón umbilical. Fragmentos del cordón umbilical. Células obtenidas de las venas placentarias. Todas las unidades son registradas, respetando la confidencialidad, con un código interno y son incluidas en dos bases de datos con la información mínima necesaria para la búsqueda: Figura # 5.4 Procesamiento de Células Madre el laboratorio Código. Células Nucleadas criopreservadas. Volumen inicial obtenido. 37 A través de estos registros, se puede consultar las unidades. Si existe alguna compatible con el paciente que la necesita, el centro de trasplante puede ponerse en contacto directo con el banco de células placentarias para realizar el contacto directo con el banco de células placentarias para realizar las gestiones necesarias para el envío de la muestra. La facilidad de contar con un número mayor de donantes ya que solamente se necesita que nazca bien y que se almacenes correctamente. El almacenamiento puede ser por un mínimo de 10 años. 37 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 66 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Figura # 5.5 Almacenamiento de la Células Madre 38 Por esta razón la congelación de las células madre de cordón permite a los padres brindarle a su hijo (y probablemente a sus hermanos) una fuente de células madre con gran capacidad de diferenciación y proliferación y totalmente compatible genéticamente pues son propias. Esto sin someterlo para nada a un riesgo pues la sangre se toma del cordón umbilical una vez el bebe ha nacido, sangre que de otra forma iría a la basura con este material tan precioso incluido. 5.4.-KIT PARA LA EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MADRE DEL CORDÓN UMBILICAL El kit es el lugar donde debe conservarse la sangre hasta su llegada al laboratorio, por lo que debe ser adecuado para que las células madre se mantengan en perfecto estado. No todos los kits son iguales. Los padres que decidan almacenar la sangre de sus hijos deben fijarse en que reúna una serie de condiciones que harán que la muestra llegue en perfectas condiciones a su destino. Es fundamental que el kit cuente con geles termoprotectores de gran tamaño (es decir, deben cubrir y arropar perfectamente la bolsa con la muestra, creando un nido que la aísle y proteja), que garanticen una temperatura óptima y sin oscilaciones. 38 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 67 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Debe tener, además, un termómetro exterior, que permite ver a qué grados se encuentra el kit en todo momento; un chip de registro interior para poder saber a qué temperatura se ha encontrado la muestra durante el transporte y poder así realizar pruebas adicionales en caso de que se haya sobrepasado el límite inferior o superior. La bolsa de extracción debe ser estéril y contener una solución que impida que la sangre se coagule durante el transporte. Además, esta bolsa debe llevar tres pinzas de seguridad para garantizar el cierre hermético y evitar la contaminación o que se derrame la sangre. Debe contener, por una parte el protocolo de extracción, fundamental para obtener la información necesaria sobre el bebé y el proceso de obtención de la sangre de cordón umbilical; por otra, el protocolo de transporte, imprescindible para la trazabilidad de la muestra. Figura # 5.6 Bolsa y Geles protectores para la extracción de Células Troncales 39 Por supuesto, una vez se lleve a cabo la extracción, lo mejor es que todo sea revisado por un profesional para garantizar un traslado seguro. MATERIALES BÁSICOS DEL KIT: 39 Caja de polipropileno y bolsas de gel de gran tamaño para reforzar la protección de la muestra y una temperatura óptima y controlada. www.ibercajalav.net Juan Diego Dávila 68 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Elementos para desinfectar y limpiar el cordón. Jeringa para la extracción de sangre materna. Códigos para garantizar la trazabilidad. Normas de transporte y extracción. Chip de registro de temperatura. Pinzas de seguridad, para impedir contaminaciones y así asegurar el cierre hermético. Figura # 5.7 Materiales del Kit para Extracción de Células Madre 40 Semanas previas al nacimiento de la criatura, un kit esterilizado y especialmente diseñado para la recolección de la sangre, es enviado a los padres por parte del banco de almacenamiento. Luego, una vez nacido el bebé, se corta el cordón umbilical y la sangre que este contenga en su interior se deposita en la bolsa estéril que posee el kit. En su traslado a las inmediaciones de almacenamiento, es importante que se haya conservado entre 4º y 10º en unos contenedores especiales para ello. 40 www.ibercajalav.net Juan Diego Dávila 69 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Al llegar al laboratorio, las células madre que contiene la sangre son aisladas e inmediatamente congeladas a menos 196 grados Celsius para que puedan conservarse por años. Para evaluar su estado sanitario se les realizan análisis especiales. Figura # 5.8 Células Madre almacenadas 41 De acuerdo a investigaciones científicas de instituciones europeas y norteamericanas, las células madre que contiene la sangre del cordón umbilical pueden ser más viables si no pasan las 48 horas desde el momento de recogimiento hasta llegar al laboratorio del centro de almacenamiento. Al llegar a este último, son aisladas y procesadas en un embalaje especial para ser crio-preservadas 5.5.- CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE MEDIANTE NITRÓGENO LÍQUIDO A -196 GRADOS. El nitrógeno líquido es nitrógeno puro en estado líquido a una temperatura igual o menor a su temperatura de ebullición, que es de –195,8 °C a una presión de una atmósfera. El nitrógeno líquido es incoloro e inoloro. Su densidad en el punto triple es de 0,707 g/ml. 41 www.crio-cord.com Juan Diego Dávila 70 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Figura # 5.9 Nitrógeno Líquido 42 Se produce industrialmente en grandes cantidades por destilación fraccionada del aire líquido. A la hora de manipular es recomendable leer la HDSP (hoja de seguridad del producto) debido a que es un gas inerte (desplaza el oxígeno) y debido a su baja temperatura puede producir quemaduras. Figura # 5.10 Nitrógeno Embasado 43 La criopreservación o crioconservación es un método que utiliza nitrógeno líquido (-196 °C) para detener todas las funciones celulares y así poderlas conservar durante años. El 42 43 www.ibercajalav.net www.ibercajalav.net Juan Diego Dávila 71 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE procesamiento se realiza por reducción de volumen como para aislar las células madre de otros componentes de la sangre antes de procedes a la criocongelación, este sistema es más eficaz en la preservación de células troncales porque implica un menos uso de DMSO (Dimetil Sulfoxido) crioprotector que rompe las paredes de los glóbulos rojos y libera su contenido que libera su contenido que a largo plazo el tóxico para la células madre. El proceso de crioconservación se realiza a través de modernos equipos especiales y a una velocidad de enfriamiento de -1 grado centígrado por minuto. El almacenamiento en nitrógeno líquido asegura una temperatura constante de menos 196 grados centígrados limitándose así la pérdida de células madre por cambios bruscos de temperatura. Figura # 5.11 Almacenamiento de las Células Madre en Nitrógeno Líquido 44 5.6.- PROCESO QUE SUFREN LAS CÉLULAS MADRE EN LA MANTENCIÓN A LARGO PLAZO. A la temperatura del nitrógeno líquido a presión atmosférica (-196 ºC), las reacciones bioquímicas se paran y no se producen procesos biológicos que puedan dar lugar a daños o envejecimiento de las Células Madre. 44 www.crio-cord.com/com Juan Diego Dávila 72 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE Se considera que el único factor limitador del tiempo de almacenamiento es la radiación cósmica, que puede llegar al material almacenado y dañar el ADN. El tiempo necesario para que estos daños sean significativos ha sido estimado entre 5.000 y 11.000 años. Es decir, a efectos prácticos, el almacenamiento puede considerarse como indefinido. Juan Diego Dávila 73 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE CONCLUSIONES Una vez finalizado el trabajo monográfico concluyo que: a) Mediante la investigación bibliográfica efectuado he podido determinar que las formas de extracción y conservación de las células madre se hacen a través diversas fuentes y que el proceso de conservación se realiza guardando la muestra en un recipiente hermético y se crioniza para conservarlo hasta 20 años, el tiempo que se estima cauto que pueden darse uso ya que la congelación a estas temperaturas pueden hacer que estas células madre duren mucho tiempo en estado de preservación. Entre los estudios investigados he llagado a la conclusión que las células madres obtenidas presentan varias ventajas ya que según estudios son utilizadas para trasplantes de medula ósea puesto que pueden reproducir con mayor velocidad células productoras de sangre así mismo son utilizadas incluso para producir nuevos órganos y ayudar a tratamientos de parálisis. A demás su obtención no presenta ningún tipo de riesgo para la madre ni para el bebe y ni para el donante que no sufren en el proceso de extracción. b) Las células madre son células que pueden dan lugar a otras células estas se caracterizan principalmente por ser células indiferenciadas, poseen dos características: son células no especializadas y pueden ser inducidas a convertirse en células que posean funciones especiales; entre sus propiedades generales tenemos que no son especializadas ni específicas, pueden crear tipos de células especializadas o específicas y son capaces de dividirse y de renovarse durante extensos períodos de tiempo. A si mismo puede encontrar que los tipos de Células Madre son Totipotenciales, Pluripotenciales, Multipotenciales y Unipotentes y que las fuentes más confiables son las células madre embrionarias las cuales sólo existen en las primeras fases del desarrollo embrionario y su utilización está en discusión ya que implica la muerte de un nuevo ser, tenemos de igual forma las células madre germinales que son aquellas que se especializan en la producción de gametos o células sexuales que permitirán la formación de un nuevo individuo. Las Células fetales aparecen en tejidos y órganos fetales como sangre, hígado, pulmón y poseen características similares a sus homólogas en tejidos adultos, aunque parecen mostrar mayor capacidad de expansión y Juan Diego Dávila 74 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE diferenciación y para terminar tenemos las células Madre adultas también conocidas como células madre específicas de tejido son más limitadas y especializadas que las células madre embrionarias porque tienen la capacidad para hacer sólo uno o dos tipos de tejido, como por ejemplo células de sangre y del sistema inmunológico, células cerebrales, o células musculares. Las células madre adultas también tienen una capacidad más limitada para reemplazarse que las células madre embrionarias. c) Para la extracción de células madre es importante las condiciones de salud del paciente que en su situación de donante debe disfrutar de una buena forma física, no puede padecer enfermedades que se transmitan por la sangre, ya que se puede afectar gravemente al estado de salud del paciente. Se requiere de igual forma hacerle a cada donante una serie de preguntas y tomar muestras para realizar estudios. Antes de la donación, este debe realizarse un examen clínico para confirmar su buen estado de salud. No hay exigencias con respecto al cambio de hábitos de vida, trabajo o alimentación. Es indispensable realizar prueba de embarazo, análisis de sangre. A demás se realizan estudios más detallados de los tejidos, determinación del grupo sanguíneo y el cuadro hematológico general. Y pruebas de Histocompatibilidad, igualmente la punción de la médula ósea que permite realizar estudios de compatibilidad. d) Los cuidados a seguir en el proceso de la extracción de las células madre varían según cada proceso entre estos tenemos la punción de medula ósea aquí el paciente se boca abajo si la punción va ser realizada en cresta ilíaca posterior o boca arriba si va a realizarse en esternón o cresta ilíaca anterior, se introduce el trócar de aspiración con el fiador puesto hasta la cavidad medular y aspirar la sangre medular entre 3-5 ml según los estudios a realizar. La ejecución de la punción-aspiración requiere un tiempo de 5-10 minutos. La aféresis es el proceso en el cual Las células madre se recolectan utilizando una máquina de aféresis esta máquina extrae sangre periférica de una vena en el brazo y separa las células madre de otros tipos de células que se encuentran en la sangre del donante, para todos estos procesos de extracción se debe adicionar aditivos en el extraído de células madre uno de estos son los factores que son estimuladores de colonias. Es de suma importancia todos estos procesos ya que existen diferentes tipos de Juan Diego Dávila 75 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE trasplantes de Células Madre y entre estos tenemos los trasplantes autólogo, singénico y alogénico. e) Existen diversas técnicas para la obtención directa de células Madre a si también se pueden obtener de tres niveles diferentes: del cigoto, del blastocito y de la médula ósea del adulto, el método más utilizado y con mayor efectividad en la extracción de células madre de embriones estas se extraen normalmente de un embrión en el quinto día de su desarrollo, lo que implica necesariamente la destrucción del embrión por estas razón este método se encuentra en discusión, extracción de células madre de placenta es el último descubrimiento para el tratamiento de padecimientos hematológicos. Durante la gestación, la placenta y la circulación sanguínea del bebé a la placenta, cubren un importante número de funciones imprescindibles para el correcto desarrollo del bebé. A pesar de ello, hasta hace poco, tanto la placenta como la sangre contenida dentro de ella, han sido consideradas como productos de desecho después del alumbramiento. La sangre placentaria posee una concentración elevada de células madre hemopoyéticas y casi no existen células responsables de la respuesta inmune. Estas características convirtieron la sangre una fuente de progenitores hemopoyéticos potencialmente útil en trasplantes. La extracción de células madre de cordón umbilical se consideran como células madres adultas, estas son células hematopoyéticas, el beneficio del empleo de la sangre del cordón umbilical es la vital para renovar hematíes normales en personas con anemias falciformes o reponer el sistema inmunitario en niños con inmunodeficiencias graves. Otro método es la extracción es la extracción de células madre circular en el flujo sanguíneo y la obtención de células madre de la médula ósea. f) En el laboratorio es donde se procede a extraer de la sangre los glóbulos rojos, y es un paso científico recomendado por los doctores, ya que así las células madre son aisladas y preparadas para la preservación, hay que tomar encueta que la especialización es inducida y dirigida en el laboratorio y la criopreservación es el proceso mediante el cual se enfrían y almacenan células, órganos o tejidos para preservar sus cualidades ante posibles reacciones biológicas, esto se realiza a temperaturas criogénicas (bajas). Otro aspecto importante son los Bancos de Células Madre ya que son lugares dónde los padres pueden almacenar las células Juan Diego Dávila 76 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE madre de sus recién nacidos mediante la criopreservación congelación a temperaturas de 195°C con la utilización de nitrógeno líquido e inmediatamente después de la extracción las células madre deben ser almacenadas en un Kit para extracción células madre del cordón umbilical para su buen traslado al laboratorio, no todos los kits son iguales de ahí el éxito de una buena conservación y así se evita que las células sufran proceso negativos en la mantención a largo plazo. Juan Diego Dávila 77 MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE BIBLIOGRAFÍA Diccionario de Medicina Océano Mosby, MMIX Editorial Océano Milanesat. Biología Molecular, Dr. Alfonso Castro – Dr. Carlos Guarderas, Quito – Ecuador, sexta edición. Revista Médica de Chile, versión impresa ISSN 0034-9887, Santiago, Abril 2001. CÉLULAS MAGRE: preguntas y respuestas sobre la donación y conservación de la sangre del cordón umbilical/ Luis T Mercé Buenos Aires, Madrid; Medicina Panamericada 2009. LA MEDICINA DEL FUTURO / José Javier; Vengoechea Aragoncillo Zaragoza www.sobrecelulasmadre.com www.scielo.org.ar www.epigenome.eu www.dfarmacia.com www.ibercajalav.net www.crio-cord.com www.umm.edu www.dicciomed.es/php/diccio.php www.geneticamolecular.net Juan Diego Dávila 78
