Taxonomía bacteriana - Facultad de Ciencias Agropecuarias UNER

Cátedra Microbiología Agrícola
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
FACULTAD DE
CIENCIAS AGROPECUARIAS
Unidad Temática 5
Taxonomía bacteriana
(Guía de estudio)
Benintende, S; Sánchez, C., Sterren, M. Y Musante, C
Objetivo
El objetivo de la Taxonomía bacteriana es dar un ordenamiento de las unidades taxonómicas
básicas (especies).
Especie bacteriana: Es un conjunto de poblaciones clonales que presentan un
elevado grado de similitud fenotípica entre sí y que a su vez difieren de otros
conjuntos de poblaciones clonales.
Caracterización
Ideal: caracterización completa del genotipo (es decir de su constitución genética).
Real: caracterización parcial del fenotipo (apariencia).
Pero además de utilizar propiedades estructurales, se debe recurrir a las propiedades
bioquímicas y fisiológicas para la caracterización de especies; es decir que las bacterias se
clasifican no solo por su apariencia sino también por lo que pueden hacer.
Denominación: uso del sistema binomial de nomenclatura: formado por 2 palabras.
Ejemplos:
Bacillus subtilis
Bradyrhizobium japonicum
Bacillus subtilis
La segunda palabra cita la
especie
La primer palabra indica el rango
taxonómico inmediato superior, el
Género
Manual Bergey de Bacteriología
Volumen I Bacterias gram (-) de importancia médica e industrial
Volumen II Bacterias gram (+) de importancia médica e industrial
Volumen III Bacterias gram (-) restantes
Volumen IV Actinomicetes y bacterias relacionadas
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Taxonomía clásica
La taxonomía clásica está basada en la caracterización: morfológica, fisiológica y
bioquímica.
Entre los caracteres taxonómicos morfológicos:
Coloración de gram
Negativo: se observan bacilos aislados de Positivo: se observan cocos agrupados en
color rosado (coloración dada por la
estafilos (estafilococos) de color violeta,
safranina).
típico de una coloración de Gram (+).
Agrupamientos
Estructuras especiales
Esporas
Cápsulas
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Entre los caracteres bioquímicos y fisiológicos
Pruebas de: Rojo de metilo, Voges Proskauer, Catalasa.
Rojo de Metilo
Principio: fermentadores ácido-mixtos que
producen una descenso de pH por debajo
de 4,3.
Se agrega el indicador Rojo de Metilo al
medio de cultivo, luego de la incubación. Si
ocurre un descenso de pH por debajo de 5,
se produce un viraje al color rojo y la prueba
se considera (+). Resultados (-) se observan
por lo general de color amarillo.
Se utiliza para diferenciar Escherichia sp. (+)
de Enterobacter sp. o Klebsiella sp. (-)
Voges-Proskauer
Principio: producción de 2 – 3 butanodiol
(fermentadores butanodiólicos).
Reactivo: α-naftol.
Resultados: reacción color rojo (+)
reacción color amarillo (-)
Se utiliza: para separar bacterias de los
géneros Klebsiella y Enterobacter (+) de
Escherichia (-).
Catalasa
Principio: propiedad de la enzima catalasa
de descomponer el peróxido de hidrógeno
(H2O2).
Se añade al cultivo unas gotas de H2O2
para observar la formación de burbujas. La
observación de burbujas (tubo +) indica la
presencia de la catalasa.
+
Se utiliza para diferenciar los géneros
Bacillus (+) de Clostridium (-),
Stresptococcus (-) de Staphylococcus (+)
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Existen sistemas comerciales que permiten la rápida identificación de una bacteria en base
a la capacidad de utilización de determinados sustratos, presencia de determinadas
enzimas, etc.
Técnicas
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Técnicas serológicas
Utilización in vitro de las reacciones antígeno-anticuerpo para la identificación de un
microorganismo (virus, bacterias, hongos).
Testigo
Antígeno
(cepas de rizobio)
Placas de
inmunodifusión
Agar
Antígeno
( cepas de rizobio)
Testigo
Antisuero
Enzima
Test de ELISA
Anticuerpo
Microorganismo
Sustrato
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Antígeno
Célula bacteriana
Anticuerpo antibacteriano
marcado
fluorescentemente
Anticuerpos
fluorescentes
Aplicaciones de la biología molecular a la identificación bacteriana
1.- Composición de bases del ADN: Determinado por la cantidad de G+C respecto del total
de bases.
2.- Técnicas basadas
- en la hibridación del ADN-ADN y ADN-ARN: Permite evaluar el grado de homología
genética entre bacterias
- en la amplificación de sectores del ADN (por ejemplo PCR): Permite ver si existe o
no homología entre sectores del genéforo bacteriano aumentando del número de copias de
un determinado sector de ADN.
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Amplificación de sector de ADN (PCR) (Ver movie pcwin en material complementario)
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Complemento Teórico Práctico
Identificación de Bacterias
El trabajo en microbiología se basa en el estudio de poblaciones microbianas debido a la
dificultad en la manipulación y la limitada información que se puede obtener a partir de los
individuos microbianos.
Los pasos que se siguen para determinar la identidad de un microorganismo es la
IDENTIFICACIÓN. Un microorganismo se identifica adecuadamente cuando se encuentra
que la descripción de una especie es idéntica a las características observadas en dicho
microorganismo.
La unidad taxonómica de clasificación que comúnmente se utiliza es la especie. Esta
categoría sistemática se define como el conjunto de poblaciones clonales1 de elevada
similitud fenotípica2 que a su vez difieren de otras poblaciones clonales.
Una característica de los microorganismos es que en un corto período de tiempo ocurren
considerables aumentos de las poblaciones, lo que determina que se puedan establecer
cambios genéticos que adquieren continuidad. Ello hace problemático diferenciar especies
sobre la base de un pequeño número de caracteres.
La esencia de la identificación la integran dos clases de operaciones:
Aislamiento, que es el tipo de siembra que permite la separación de microorganismos a
partir de una población mixta (constituida por más de una clase de microorganismos)
Cultivo, que es el crecimiento de la población microbiana en ambientes artificiales
(medios de cultivo), bajo condiciones de laboratorio.
Estas operaciones son las mismas independientemente de los microorganismos con los que
se trabaje.
Para comenzar la identificación se parte de un cultivo puro3, lo que previamente ha implicado
el aislamiento del microorganismo a partir de una población microbiana natural mixta (leche,
suelo, etc.). Para obtener un cultivo puro se utilizan técnicas como el enriquecimiento
selectivo y la siembra en placas.
El aislamiento para la obtención de un cultivo puro por métodos de siembra en placa implica
la separación e inmovilización de las células individuales sobre un medio nutritivo solidificado
con agar. Cada viable da origen, al crecer, a una colonia cuya transferencia puede hacerse
fácilmente con ansa. La siembra en estría para la purificación de cultivos es el método
empleado.
El inóculo4 tomado con el ansa se va agotando progresivamente con cada sucesiva estría.
Así las estrías iniciales proporcionan un crecimiento confluente y a lo largo de las últimas
estrías se van desarrollando colonias aisladas.
Pero, si toma material de una de estas colonias y se transfiere a un medio apropiado a esto
no se le puede denominar un cultivo puro, ya que por cada colonia visible en la primera
placa puede haber células de otros microorganismos que quedaron depositadas en el agar y
no lograron dar un crecimiento macroscópico a pesar que son viables. Por lo tanto nunca se
debe tomar la colonia de la primera placa para preparar un cultivo puro, sino que a partir de
esta se hace una segunda siembra denominada purificación. Si todas las colonias de esta
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Un clon es una población de células bacterianas derivadas del crecimiento de una sola célula parental convenientemente
aislada.
2
Fenotipo es el conjunto de caracteres hereditarios que se expresan, mientras que se conoce como genotipo a toda la
información contenida en el genoma de los individuos de una determinada especie, y que no necesariamente siempre se
expresa.
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4
Cultivo que contiene una sola clase de microorganismos
Material microbiano utilizado para sembrar
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segunda placa resultan idénticas, una colonia bien aislada puede utilizarse para establecer
un cultivo puro.
Es necesario que una vez que se logró el aislamiento se mantenga al microorganismo y a
su descendencia en un ambiente artificial que impida el acceso de otros microorganismos.
Este ambiente se puede crear en la caja de petri o en el tubo de ensayo.
Obtenido el cultivo puro es posible hacer la identificación del microorganismo utilizando los
caracteres morfológicos y bioquímicos y fisiológicos.
Lo ideal sería una descripción completa de su fenotipo (expresión de los caracteres), o mejor
aún por su genotipo (información genética).
Como metodología habitual se utilizan criterios de fácil determinación como los morfológicos,
por su practicidad. Algunos de ellos son forma, tamaño, movilidad, reproducción, tinción a
colorantes especiales como la de Gram, presencia o ausencia de estructuras como esporas,
cápsulas y flagelos, crecimiento en medios geleficados en los que se puede observar forma,
tamaño, color y aspecto de las colonias producidas. Sin embargo este criterio ofrece
elementos de juicio insuficientes para la caracterización definitiva y por lo tanto se tienen en
cuenta otros criterios como son los mecanismos fisiológicos y bioquímicos, entre los cuales
se incluyen información sobre crecimiento, muerte y supervivencia en diferentes condiciones
de cultivo (temperatura de crecimiento, pH, concentración de sales, etc.), ausencia o
presencia de enzimas (catalasa, amilasa, etc.), como toman, utilizan y /o almacenan la
energía.
Prueba
diagnóstica
Crecimiento a
diferentes
temperaturas
Crecimiento
anaeróbico
Producción de
ácidos a
partir de
carbohidratos
Reducción de
nitrato a nitrito
Hidrólisis de
almidón
Utilización de
citrato
Principio
Detectar la habilidad para crecer a distintas temperaturas determinando la
óptima para el crecimiento. También permite verificar la plasticidad para
crecer a diferentes temperaturas
Intenta comprobar los requerimientos de oxígeno de los microorganismos
Se fundamenta en la producción de ácido durante el crecimiento por la
fermentación de azúcares o alcoholes azucarados del medio de cultivo
Se fundamente en que algunas bacterias utilizan el NO3- como aceptor
alterno de electrones, reduciéndolo a NO2- o N2
Detecta la presencia de la enzima amilasa, por la formación de un
complejo azul en el medio de cultivo al combinarse el yodo con el almidón
Se basa en la capacidad de las bacterias para utilizar el citrato como única
fuente de carbono, pudiendo además utilizar el N de la sal de amonio del
medio, con la producción de amoníaco. Este último compuesto se
convierte OHNH4 que alcaliniza el medio por arriba de pH 6.7 virando el
indicador de medio de verde a azul
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