Problema del rellenado de los extremos

© Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga)
http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/
Problema del rellenado de los extremos
5’
3’
5’
3’
∂
5’
RNAsa H1
Fen1p
5’
3’
3’
5’
3’
3’
5’
a
RNA
5’
3’
3’
5’
Acortamiento del
DNA tras una ronda
de replicación
RNAsa H1
Fen1p
5’
3’
3’
5’
5’
3’
e
3’
5’
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Extensión de los extremos
5’
3’
5’
3’
Telomerasa
Síntesis de repeticiones teloméricas
(C. Greider, 1984)
Repeticiones
teloméricas
Síntesis de fragmentos de Okazaki
a
5’
3’
e,
Rellenado y cierre
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Organización del DNA del telosoma: DNA telomérico
3’
Centrómero
Secuencias asociadas a los
telómeros (TAS) o
“subteloméricas”
Repeticiones
teloméricas
Protuberancia G
La longitud del DNA telomérico varía según las especies:
12-50 pb en ciliados
200-400 pb en levaduras (fase S)
20.000-75.000 pb en plantas
150.000 pb en ratón
300.000 pb en células vegetales en cultivo
La longitud del DNA telomérico puede variar en un organismo multicelular:
etapa de desarrollo (edad)
tejidos
transformación celular (tumor)
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Composición del DNA telomérico
5’ TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG 3’
3’ AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC
• Está sesgada: rica en C y G
• Las G se encuentran en la cadena 5’->3’ desde el
centrómero hacia el extremo (cadena G)
• La cadena complementaria es rica en C (cadena C)
• Las G se encuentran juntas en la secuencia y no
dispersas
• Los motivos principales están muy conservados
¿Razones funcionales o estructurales?
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DNA-G4: la estructura base
Cuarteto de G
H
H
R
N
R
N
N
N
N
N
N
H
N
O
O
N
H
H
N
O
N
N
R
H
N
H
H
N
H
N
N
N
O
H
N
N
H
H
N
R
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Comparación de DNA-G4 paralelo y antiparalelo
Paralelo
Antiparalelo
anti
syn
Ribosa
Cuartetos G
Na+
Ribosa
Cuartetos G
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Lazos t
Protuberancia G
2-50 kb de repeticiones teloméricas
DNA no
telomérico
Gran lazo bicatenario
asociado a proteínas
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Proteínas telosómicas de levaduras
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Proteínas telosómicas de mamíferos
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Unión del dominio telocaja al DNA telomérico
90°
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Formación de lazos-t (I) : Trf1p y Trf2p
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Formación de lazos-t (II) : tanquirasa
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Importancia de la integridad del telosoma
Parada transitoria
• Reparación de dsDNA dañado
• Reparación por recombinación
Fusiones cromosómicas
Activación telomerasa
Pérdida del cromosoma
Muerte celular prematura
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Subunidad TR
Estructura secundaria
Translocación de
TERT
III
V
IV
I
5’
Actividad catalítica de
TERT
3’
II
Fin
Molde para repetición telomérica
Molde
Tetrahymena/Glaucoma
Paramecium
3' UCUAAAAACCCCAA
3'UUACCAAAGACCCCAA
Euplotes aediculatus
Euplotes crassus
Oxytricha/Stylonychia
3'
3'
3'
CCAAAA
CCAAAA
CCAAAA
Fin
CUUacugA 5'
CAUacugA 5'
CCCCAAAACGAacugUC 5'
CCCCAAAACAAacugUC 5'
CCCCAAAA NAacugUC 5'
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Probable estructura de TERT
T 12
HIV
Pulgar
Dedos
Sitio
catalítico
Motivo T
Palma
A
B’ CD E
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Modelo tridimensional propuesto para la estructura
mínima de la telomerasa
Telomerase
protein
(TERT)
(TR)
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Especificidad de sustrato y sitios de reconocimiento
3’
5’
TERT
TR
ssDNA
5’
Sitio de
anclaje
(-20)
Sitio -12
3’-OH
2’-H
Sitio
catalítico
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Mecanismo de reacción
Unión
Elongación
TERT
TR
AA
AA
AC
TT CC CA
G C
CC CAA
TTG C
GG
C
DNA
5’
AA
C
A
TT CC CA
G C
Relajación sitio -20
AA
C
A
CC CA
C T
TTGGGG
Función sitio -12
Translocación
AA
A
AC
TTGGGGT AC
A
TG C C
C
dGDP dGTP
C
CC CAATG
C T
GG
TTGG
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Síntesis de DNA telomérico sin telomerasa
• Uso de reparación/recombinación
– Habitual
• Mosquito Anopheles y cebollas.
– Ocasional
• Levaduras y tumores de mamíferos
– Mecanismo ALT
• Uso de retrotransposones
– Drosophila y otros dípteros
• HeT-A y TERT
– Gusano de seda (Bombyx mori)
• SART1 y TRAS1
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Regulación de la longitud
Rifp
OnTEBP
Rap1p
n
Trf1p
Represión
Sitio de
reconocimiento
3’
Replicación incompleta,
degradación,
recombinación ...
Síntesis de
repeticiones
teloméricas
5’
Exoucleasas
n-2
Activación
3’
5’
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Regulación de la actividad telomerasa
(especificidad de tejido)
––
++
Gen del
cromosoma 3
humano
Transcripción de TERT
MYC
(Activación en tumores)
AAAAAA
TERT
Subunidades de
la holoenzima
++
Oligomerización
++
++
TR
++
Fosforilación
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Otros factores que regulan la telomerasa
• Estructura del telosoma
– Telomerasa inhibida por DNA-G4 y lazos t
(Trf y Tanquirasa)
– Est4p (Cdc13p) favorece acceso de la telomerasa
• Ciclo celular
– TR se expresa constitutivamente
– TERT suele expresarse en fase S
• Especificidad de tejido
– Inactiva en tejidos adultos (tert-, TR+)
– Activa en tejidos jóvenes, germinales, o con alto recambio
– Activa en células cancerosas
Relación con senescencia y
transformación celular
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Longitud de los telómeros
Relación entre longitud de telómeros y senescencia:
reloj biológico
Células germinales (TERT+)
Células somáticas (tert-)
TERT
Transformación
(malignización)
>250
TERT+ / ALT
30 - 50
50
Senescencia
Células inmortales
Crisis
Duplicaciones celulares in vitro
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Telomerasa y cáncer
Transformación
TERT+ / ALT
• Telómeros cortos pero estables
• Actividad telomerasa en células cancerosas (>90%)
– Inducción tardía y variable
– Mecanismo ALT si no hay telomerasa (<10%)
• Células sin telomerasa son difíciles de transformar
– Sólo hay vía ALT para mantener telómeros
La ausencia de telomerasa es una defensa natural
contra el cáncer
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Telomerasa y biotecnología: Dr Jekyll y Mr Hyde
• Expresión ectópica de TERT
– Evita degeneración celular
• Diseño de fármacos
– Inhibidores de telomerasa
• Diagnóstico
– Detección de telomerasa en
células somáticas
• Terapia génica
– Cromosomas artificiales
Inmortalización de tumores
¿Inducción del oncogén c-myc?
Inhibición de células somáticas con
telomerasa
Ineficaz contra tumores con ALT
Presencia de telomerasa en
ciertas enfermedades benignas
Inducción tardía
Estabilidad tras varias
duplicaciones celulares