TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA

TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor
(ACARI: VARROIDAE)
Azadirachta indica TOXICITY AND REPELLENCE OF Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
Rebeca González-Gómez1, Gabriel Otero-Colina1, J. Antonio Villanueva-Jiménez2,
J. Alberto Pérez-Amaro3 y R. Marcos Soto-Hernández4
1
Entomología y Acarología. 4Botánica. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230.
Montecillo, Estado de México. 2Campus Veracruz. Colegio de Postgraduados. 91700. Predio Tepetates,
Veracruz, Veracruz. 3Universidad del Papaloapan. 68100. Campus Loma Bonita, Oaxaca.
RESUMEN
ABSTRACT
Se evaluó la toxicidad aguda del extracto crudo de dos cosechas
de semillas de neem (Azadirachta indica) y del producto comercial a base de neem, PHC Neem®, sobre Varroa destructor y Apis
mellifera, así como la repelencia de dichos productos sólo sobre
V. destructor (varroa). Para determinar toxicidad aguda se aplicaron diluciones 0.33, 0.67 y 1.32% de los productos citados
sobre hembras de varroa y abejas obreras, por aspersión mediante la torre de Burgerjon. Se les incubó a 32±2 °C y 70±10%
HR, provistas del alimento adecuado, y se registró su mortalidad
a 24 y 48 horas. En pruebas de repelencia se trató a pupas de
abejas con las diluciones anotadas y se determinó la capacidad
de las varroas para localizar y alimentarse de pupas con o sin
tratamiento. En la prueba de toxicidad aguda, ninguno de los
productos causó mortalidad de varroa ni de abejas. En las prueba de repelencia, los tres productos mostraron repelencia significativa, en relación directa entre concentración y efecto. El extracto crudo de neem cosecha 2003 a 1.32% presentó la repelencia
más alta y estable, que impidió que 98% de las varroas se posaran sobre pupas de abejas y causó 100% de mortalidad de varroa,
aparentemente por inanición, en 72 h.
Crude extract of two neem seed (Azadirachta indica) harvests
and the neem-based commercial product PHC NeemTM were
evaluated in terms of their acute toxicity on Varroa destructor
and Apis mellifera as well as their repellence only on V. destructor
(varroa mites). To determine acute toxicity, 0.33, 0.67, and 1.32%
dilutions of the above products were sprayed on varroa mites
and worker bees with a Burgerjon’s tower. They were incubated
at 32±2 °C and 70±10% RH and provided with sufficient food.
Mortality was recorded at 24 and 48 h. In repellency tests, bee
pupae were treated with the same dilutions, and the ability of
varroa mites to locate and feed on the pupae, with or without the
treatment, was determined. In the acute toxicity test, none of the
products caused varroa or bee mortality. In the repellency test,
the three products significantly repelled varroa, in a direct
relationship between concentration and effect. The 1.32% crude
neem extract, 2003 harvest, had the highest and most stable
repellency, impeding 98% of the varroa mites from settling on
bee pupae and caused 100% mortality of varroa mites, apparently
from starvation, in 72 h.
Key words: Apis mellifera, bees, azadirachtin, neem.
Palabras clave: Apis mellifera, abejas, azadiractina, neem.
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
T
he mite Varroa destructor (Anderson and
Trueman, 2000) is considered the major pest
of common Apis mellifera L. honey bees
worldwide (Sammataro et al., 2000). The indiscriminate
use of chemical products for the control of varroasis
has favored resistance in many countries (Milani, 1999;
Elzen et al., 1999a and b; Mathieu and Faucon, 2000;
Thompson et al., 2002). Mexico runs the same risk,
with only two synthetic pyrethroids: fluvalinate
(commercial name ApistanTM), and flumetrine
(commercial name BayvarolTM).
Botanical products for pest control are very
important at present. This is the case of the neem tree
Azadirachta indica A. Juss. (Meliaceae), from which
a broad diversity of secondary compounds are extracted.
E
l ácaro Varroa destructor Anderson y Trueman
(2000) se considera como la plaga más importante de la abeja común Apis mellifera L. en el
mundo (Sammataro et al., 2000). El uso indiscriminado de productos químicos para controlar la varroasis
ha favorecido la aparición de resistencia en muchos
países (Elzen et al., 1999a y b; Mathieu y Faucon,
2000; Thompson et al., 2002). México corre ese mismo riesgo porque sólo tiene dos piretroides sintéticos:
fluvalinato (nombre comercial Apistan®) y flumetrina
(nombre comercial Bayvarol®).
Recibido: Mayo, 2005. Aprobado: Agosto, 2006.
Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 40: 741-751. 2006.
741
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
Los productos botánicos para el manejo de plagas
tienen gran importancia en la actualidad. Así, del árbol de neem Azadirachta indica A. Juss. (Meliaceae)
se extraen diversos compuestos secundarios; la
azadiractina es el de mayor importancia, pues actúa
como repelente, antialimentario y retarda el crecimiento
de los insectos (Mordue y Blackwell, 1993). Las sustancias contenidas en el neem se pueden considerar
como una fuente potencial para el control de varroa;
su incorporación como producto natural alternativo al
uso de sustancias químicas podría contribuir a disminuir la contaminación de los productos de la colmena.
Los efectos subletales pueden ser útiles en el control de varroa; cualquier efecto en este ácaro que interfiera con su capacidad para localizar a su huésped puede tener un valor práctico como método de control.
Colin et al. (1994) desarrollaron una escuela en la
búsqueda de efectos subletales para controlar parásitos
de las abejas, y propusieron un protocolo para evaluar
productos vegetales.
Por tanto, los objetivos del presente trabajo fueron
evaluar la toxicidad aguda del extracto crudo de las
semillas de neem (A. indica) y el producto comercial a
base de neem, PHC Neem®, sobre V. destructor y A.
mellifera, y evaluar la repelencia de los mismos extractos sobre varroa.
MATERIALES
Y
MÉTODOS
Las varroas se recolectaron mediante el método del panal trampa (Maul, 1983), usando panales con celdas de tamaño de cría de
zánganos; se colocaron en cajas Petri de plástico (8 cm diámetro) y
cada tapa tenía un agujero (4.5 cm diámetro) cubierto con una malla. Las varroas se alimentaron con pupas de zánganos. Antes de su
uso y durante un máximo de 2 d, los panales y los ejemplares de
varroa se incubaron a 32±2 °C y 70±10% HR.
Las pupas de abejas obreras se obtuvieron de los panales de la
cámara de cría, se eligió aquéllas de los estados Pw y Pp según
Rembold y Kramer (1980). Pw significa literalmente Pupa white
(ojos blancos), y Pp significa Pupa purple (ojos morados), etapas
que se alcanzan 7-8 d después de que las obreras habían operculado
la celda. En todas las pruebas se utilizaron pupas recolectadas 1 h
antes de realizar los bioensayos.
Las abejas adultas se recolectaron en la cámara de cría y se
seleccionaron aquéllas localizadas a los lados de la cría, para evitar
la captura de abejas nodrizas jóvenes (Felton et al., 1986). Se pusieron en frascos de cristal de 500 mL cuyas tapas tenían un orificio de
ventilación cubierto con malla; se incubaron a 32±2 °C y 70±10%
HR y se les proporcionó miel y agua.
Se evaluó aceite crudo de neem, así como el producto comercial
a base de neem llamado PHC Neem®. El aceite crudo se obtuvo de
las semillas de neem recolectados del Campus Veracruz, Colegio de
Postgraduados, en Tepetates, Veracruz, en agosto de 2002 y 2003.
El aceite se obtuvo a temperatura inferiores a 35 °C, con un extractor
742
VOLUMEN 40, NÚMERO 6
Of these, azadirachtin is the most important, acting as
an insect repellant, feeding inhibitor, and insect growth
retarder (Mordue and Blackwell, 1993). The substances
contained in neem can be considered potentially useful
in varroa control; their incorporation as a natural
product alternative to the use of chemical substances
could contribute to reduce contamination of products
from the beehive.
Sublethal effects can be useful in controlling varroa.
Any effect that interferes in the mite’s ability to locate
its host may have a practical value as a method of
control. Colin et al. (1994) formed a school in the
search for sublethal effects to control bee parasites and
they proposed a protocol for assessing plant products.
Therefore, the objectives of the present study were
to evaluate acute toxicity of crude neem seed extract
(A. indica) and of the neem-based commercial product,
PHC NeemTM, on V. destructor and A. mellifera, and
to evaluate their repellence of varroa.
MATERIALS
AND
METHODS
Varroa mites were collected with the method of the honeycomb
trap (Maul, 1983), using honeycombs with drone-rearing-size cells.
The mites were placed in plastic Petri dishes, 8 cm in diameter, with
caps with a 4.5 cm diameter hole covered with a screen, and received
drone pupae as food. Before use, and for a maximum of 2 d, both
honeycomb and varroa specimens were incubated at 32±2 °C and
70±10% RH.
The worker bee pupae were obtained from rearing chamber
combs, and those in Pw and Pp stages, following Rembold and
Kramer (1980) were selected. Pw literally means pupa white (white
eyes), while Pp means pupa purple (purple eyes), stages that are
reached 7-8 d after worker bees have capped the cell. In all of the
tests pupae collected 1 h before performing the bioassays were used.
Adult bees were collected in the rearing chamber and those
that were found outside the brood zone were selected to avoid
capturing young nurses (Felton et al., 1986). The adults were
confined in 500 mL glass jars with caps with a ventilation orifice
covered with screen; they were incubated at 32±2 °C and 70±10%
RH and given honey and water.
Crude neem oil, as well as the commercial neem-based product
PHC NeemTM, was evaluated. The crude oil was obtained from
neem seeds collected in the Veracruz Campus of Colegio de
Postgraduados, Tepetates, Veracruz, in August, 2002 and 2003. Oil
was extracted at temperatures below 35 °C with a stainless steel
extractor by applying 3 t pressure and was stored at −3 °C. Mother
suspensions were prepared from the 2002 and 2003 crude oils and of
PHC Neem and mixed with water and Tween 20 (1:1:1, by weight).
From these, dilutions were made for application on bees and varroa
mites.
The products mentioned were sprayed on varroa or bees with a
Burgerjon’s (1956) pulverization tower, which nebulizes products to
15 µm drops. This tower was calibrated to apply 1 to 2 mg cm−2
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
de acero inoxidable, aplicando 3 t de presión, y se almacenó a −3 °C. Se
prepararon suspensiones madre de los aceites crudos de 2002 y 2003
y de PHC Neem, mezclándolos con agua y Tween 20 (1:1:1, por
peso); a partir de ellas se hicieron diluciones para aplicarlas a abejas
o varroas.
Los productos mencionados se aplicaron sobre varroas o abejas
usando la torre de pulverización de Burgerjon (1956), la cual nebuliza
los productos en gotas de 15 µm de diámetro. Esta torre se calibró
para aplicar 1 a 2 mg cm−2 (Colin et al., 1994). Esto se logró
aplicando 15 mL de la solución a una presión de 0.703 kg cm−2, y se
dejó 1 min más para permitir la sedimentación de las gotas sobre los
organismos.
Prueba de letalidad aguda en varroa y abejas
Con las suspensiones madre descritas se prepararon diluciones
1%, 2% y 4% (0.33, 0.67 y 1.32% del producto concentrado), que
corresponden aproximadamente a las recomendadas por el fabricante del PHC Neem. Para la aplicación en varroa, grupos de 10 hembras adultas se colocaron en una caja Petri (14 cm diámetro) con el
fondo cubierto con un círculo de papel filtro, y enseguida se aplicaron las suspensiones. Al terminar la aplicación se transfirieron las
varroas a cajas Petri (8 cm de diámetro) tratadas con una capa de
fluón (politetrafluoruro de etileno) en las paredes laterales, para
impedir que escaparan. Luego se adicionaron pupas de abejas de
ojos rosas a violeta como alimento, y se incubó a 32±2°C y 70±10%
HR. Paralelamente a los tratamientos, hubo grupos testigo, a los que
se aplicó agua destilada más emulsificante, en concentraciones correspondientes a las usadas para cada tratamiento de las diluciones
(1, 2 y 4%).
Las abejas, antes de la pulverización, se anestesiaron con CO2
durante 15 s. Se seleccionaron grupos de 30 obreras adultas, y se
aplicaron los mismos tratamientos que con los ácaros. Enseguida las
abejas fueron transferidas a jaulas de madera y malla de hierro
galvanizado, de 15×15×15 cm.
Tanto para varroas como para abejas, cada dilución, así como
los testigos, se realizaron en cuatro repeticiones; las lecturas de
mortalidad se registraron a las 24 y 48 h. En pruebas complementarias, sin repeticiones, las concentraciones aplicadas a varroa y a
abejas se elevaron hasta alcanzar 50% del producto concentrado.
Prueba de repelencia con elección
Las arenas de observación fueron cajas Petri de plástico de 8 cm
de diámetro, con tapa con orificio de ventilación como ya se describió. Cada caja estaba dividida en dos zonas principales (A y B), y
cada zona formada por tres subdivisiones (a, b y c). La zona cero (0)
correspondió al centro de la caja, en la cual se colocaron diez hembras de varroa, mientras que en los extremos de la caja (zonas Ac y
Bc) se colocaron tres pupas de abejas obreras (cuerpo blanco y ojos
rosa a violeta) en cada una (Figura 1). Sólo las pupas colocadas en la
zona Ac habían sido tratadas previamente con 15 mL de las concentraciones de 1%, 2% o 4%, mediante la torre de Burgerjon. Se
hicieron cuatro repeticiones por tratamiento y se tomaron lecturas
(Colin et al., 1994). This was accomplished by applying 15 mL of
solution at a pressure of 0.703 kg cm−2, and left for 1 min more to
allow drops to settle on the organisms.
Acute lethality tests in varroa and bees
With the mother suspensions described, 1, 2, and 4% dilutions
(0.33, 0.67, and 1.32% of the concentrated product), corresponding
approximately to those recommended by the manufacturer of PHC
Neem, were prepared. For application on varroa, groups of 10 adult
females were placed in a Petri dish (14 cm in diameter), the bottom
covered with a circle of filter paper, and immediately sprayed with
the solutions. After application, the varroa were transferred to 8 cm
Petri dishes which had been treated with a layer of ethylene
polytetrafluoride on the inner sides to prevent their escape. Later,
pink or purple eye bee pupae were introduced as food, and incubated
at 32±2 °C and 70±% RH. Parallel to the treatments, there were
control groups on which distilled water plus an emulsifier was applied
in concentrations corresponding to the dilutions (1, 2, and 4%) used
for the treatments.
Before being sprayed, the bees were anesthetized with CO2 for
15 s. Groups of 30 adult workers were selected and sprayed with the
same treatments in the same manner as with the mites. Bees were
immediately transferred to galvanized iron screen and wooden cages
15×15×15 cm.
For both varroa and bees, four replications were performed
with each dilution and control. Mortality was recorded after 24 and
48 h. In complementary tests, without replications, the concentrations
applied to varroa and bees were increased up to 50% of the
concentrated product.
Repellency test with choice
The observation arenas were 8 cm diameter plastic Petri dishes,
which had caps with ventilation orifices as described above. Each
dish was divided into two main sections (A and B) and each section
was composed of three subdivisions (a, b, and c). Section zero (0)
was the center of the dish in which ten varroa females were placed,
while three worker bee pupae (white body and pink to purple eyes)
were placed in the outermost parts of each dish (Ac and Bc) (Figure
1). Only the pupae placed in the Ac subdivision had been treated
previously with 15 mL of 1, 2, or 4% concentrations with the
Burgerjon’s tower. Each treatment was replicated four times, and
readings of mite location were taken at 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, and
72 h, quantifying the tendency of the mites to move from one section
to another.
To determine numerically whether the extracts repelled, or even
attracted, the following formula was used (Colin et al., 1994):
VR=100+{(Ba+2Bb+3Bc+4Pb)−(Aa+2Ab+3Ac +4Pa)}10/S
where, VR=repellency value; Aa, Ab and Ac=number of mites on
sections Aa, Ab, and Ac; Pa=number of mites on side A pupae
(treated); Ba, Bb, and Bc=number of mites on sections Ba, Bb, and
GONZÁLEZ-GÓMEZ et al.
743
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
de la ubicación de los ácaros a 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 y 72 h; en ellas
se cuantificó la tendencia de dichos ácaros a desplazarse de una zona
a otra.
Para determinar numéricamente si existió repelencia o atracción por los extractos, se usó la siguiente fórmula (Colin et al.,
1994):
Zona A
Pa
Ac
Ab
Aa
0
VR=100+{(Ba+2Bb+3Bc+4Pb)−(Aa+2Ab+3Ac +4Pa)}10/S
donde, VR=valor de repelencia; Aa, Ab y Ac=número de ácaros
sobre las zonas Aa, Ab y Ac; Pa=número de ácaros sobre las pupas
del lado A (tratadas); Ba, Bb y Bc=número de ácaros sobre las
zonas Ba, Bb y Bc; Pb=número de ácaros sobre las pupas del lado
B (no tratadas); S=número de ácaros sobrevivientes al momento de
la observación.
La notación citada da un valor ponderado superior a la posición
de un parásito sobre una pupa (×4) o en inmediata proximidad
(×3), en contraste con una posición más alejada de las pupas o más
central (×2 ó ×1). Si todas las varroas permanecen sobre la zona
cero o hay un reparto equitativo sobre ambas zonas, los valores de A
contrarrestarán a los de B; si todos los ácaros permanecen sobre las
pupas de la zona B, los valores de A serán cero y los valores de B
serán 40. El número 100 tiene por función desplazar el origen y
facilitar el análisis estadístico; entonces, los valores fluctuarán de 60
al 140; es decir, desde una fuerte atracción hasta una total repelencia.
El factor 10/S sirve para compensar la mortalidad de los ácaros al
momento de la observación.
Prueba de repelencia sin elección
La finalidad de esta prueba fue determinar el efecto repelente de
los tratamientos a evaluar, en ausencia de pupas no tratadas. En este
caso las pupas que se colocaron en la zona Ac y en la Bc fueron
tratadas con los productos y concentraciones correspondientes, así
como los testigos descritos. En esta prueba también hubo cuatro
repeticiones por tratamiento. El criterio de eficacia fue la posición
del ácaro sobre las zonas marcadas, el número de ácaros sobre las
pupas y la mortalidad de ácaros.
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar, en arreglo
factorial 4×4×8, con cuatro repeticiones. El factor A fue el producto aplicado, con cuatro niveles: a1=producto comercial formulado (PHC® Neem); a2=aceite de neem cosecha 2002; a3=aceite de
neem cosecha 2003 y a4=emulsificante (Tween 20). El factor B fue
la concentración, con cuatro niveles: b1=concentración 0%, ésto es,
testigos tratados con agua destilada; b2=concentración 1%;
b3=concentración 2%; b4=concentración 4%. El factor C fue el
tiempo, con ocho niveles: c1=30 min; c2=1 h; c3=2 h; c4=4 h;
c5=8 h; c6=24 h; c7=48 h; c8=72 h.
Los datos de analizaron con el procedimiento GLM (SAS, 2000)
y las medias se compararon mediante la prueba de Tukey (p≤0.05).
744
VOLUMEN 40, NÚMERO 6
Ba
Bb
Bc
Zona B
Pb
Figura 1. Zonas de distribución de la caja experimental, para las
pruebas de repelencia.
Figure 1. Distribution zones of the experimental dish for
repellency tests.
Bc; Pb=number of mites on pupae on side B (not treated); S=number
of surviving mites at the moment of observation.
The cited notation assigns a higher weighted value to the position
of a parasite on a pupa (×4) or in the immediate vicinity (×3), in
contrast with a more central position or farther from the pupae (×2
or ×1). If all of the varroa remain in Section 0, or there is an equal
distribution over the two sections, the A values counteract B values;
if all the mites remain on the pupae of section B, the values of A are
zero and the values of B are 40. The number 100 has the function of
moving the intercept and facilitating the statistical analysis. Therefore,
the values fluctuate between 60 and 140, that is, from strong attraction
to total repellence. The factor 10/S serves to compensate mortality
of the mites at the moment of observation.
Repellency test without choice
This test was conducted to determine the repellent effect of the
treatments to be evaluated in absence of untreated pupae. In this
case, the pupae that were placed in both sections Ac and Bc were
treated with the respective products and concentrations, as well as
the previously described controls. In this test there were also four
replications per treatment. The criteria of effectiveness were position
of the mite on the marked sections, number of mites on the pupae,
and mite mortality.
Experimental design and statistical analysis
The experimental design was completely randomyzed with a
factorial arrangement of treatments 4×4×8, with four replications.
Factor A was the applied product, with four levels: a1=commercially
formulated product (PHCTM Neem); a2=neem oil, 2002 harvest;
a3=neem oil, 2003 harvest; a4=emulsifier (Tween 20). Factor B
was concentration with four levels: b1=0% concentration, controls
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
También se realizaron análisis con una sola fuente de variación
de las variables de respuesta (valor de repelencia, ácaros sobre las
pupas y ácaros muertos) en cada uno de los tiempos (0.5, 2, 4, 8, 24
y 72 h) y concentraciones (1, 2 y 4%).
RESULTADOS
Y
DISCUSIÓN
Prueba de letalidad aguda en varroa y abejas
El producto comercial (PHC® Neem), aceite de neem
cosecha 2002 (neem1), cosecha 2003 (neem2) y Tween
20 (emulsificante), a concentraciones de 1%, 2% y
4%, así como el testigo, no causaron mortalidad de
varroa ni de abejas, a 48 h, ni con una concentración
de 50%, en pruebas complementarias. Estos resultados difieren de los citados por Melathopoulos et al.
(2000), quienes evaluaron aceite de neem y Neemaza®; el primero, al usar aplicación tópica, causó 45%
de mortalidad de varroa, mientras que el segundo, con
aplicaciones tópica, oral y como vapor causó mortalidad significativa del ácaro.
Se decidió no aumentar la concentración de los productos porque hubo problemas para la formación de
suspensiones estables; asimismo, se consideró que elevar la concentración haría poco práctico y económico
el uso de este producto. Para PHC Neem, la recomendación del fabricante para control de plagas de frutales
es 0.5-2 L concentrado 100 L −1 agua; contra plagas
de hortalizas es 50 mL 15 L−1 agua. Dichos valores
equivalen a 0.5-2% y 0.33% de producto concentrado; esto es, muy cercanos a las usadas en el presente
estudio.
El contacto directo de neem a concentraciones de
20 ppm sobre abejas adultas no produce efectos negativos y se puede lograr un control efectivo de las plagas con aplicaciones de 30 a 50 ppm de azadiractina
(Larson, 1990; Isman, 1995). Según Atkins (1992) la
azadiractina es una sustancia relativamente no tóxica
para las abejas, con una DL50 de 11 µg por abeja.
Naumann et al. (1994) encontraron que el extracto
de semillas de neem es un insecticida seguro cuando al
momento de usarlo hay abejas melíferas presentes. De
hecho, los tratamientos que ellos usaron no repelieron
las abejas, y sugieren que el neem puede usarse para
controlar plagas en cultivos en floración, incluso cuando se requieren abejas para la polinización.
Prueba de repelencia con elección
Hubo diferencias significativas en el valor de
repelencia, atribuibles a las interacciones dobles de las
variables tipo de producto, concentración y tiempo de
lectura, pero no a la triple interacción (Cuadro 1).
Además hubo diferencias significativas debidas a la
treated with distilled water; b2=1% concentration; b3=2%
concentration; b4=4% concentration. Factor C was time, with eight
levels: c1=30 min; c2=1 h; c3=2 h; c4=4 h; c5=8 h; c6=24 h;
c7=48 h; c8=72 h.
Data were analyzed with GLM procedure (SAS, 2000) and means
were compared with Tukey test (p≤0.05).
Analyses were also performed with a single source of variation
of the response variables (repellency value, mites on pupae and dead
mites) at each of the times (0.5, 2, 4, 8, 24, and 72 h) and
concentrations (1, 2, and 4%).
RESULTS
AND
DISCUSSION
Acute lethality test in varroa and bees
With the commercial product (PHCTM Neem), neem
oil 2002 harvest (neem1), 2003 harvest (neem2) and
Tween 20 (emulsifier), at concentrations of 1%, 2%,
and 4%, as well as 0% (control), no mortality of varroa
or bees was observed at 48 h, neither with a 50% in
complementary tests. These results differ from those
reported by Melathopoulos et al. (2000), who evaluated
neem oil and Neem-azaTM; the former, using topical
application, caused 45% mortality in varroa, while the
latter used topical, oral and vapor applications and
caused significant mite mortality.
It was decided not to increase the concentration of the
products because there were problems in forming stable
suspensions were encountered; also, it was considered
that elevating the concentration would make use of the
product impractical or costly. For PHC Neem, the
recommendation of the manufacturer for pest control on
fruit trees is 0.5-2 L concentrate 100 L−1 water, and on
vegetables 50 mL 15 L−1 water is recommended. These
values are equivalent to 0.5-2% and 0.33% of product
concentrate; that is, very close to those used in our study.
Direct contact of bees with neem at concentrations
of 20 ppm does not produce negative effects, and
effective pest control can be achieved with applications
of 30 to 50 ppm of azadirachtin (Larson, 1990; Isman,
1995). According to Atkins (1992), azadirachtin is a
relatively non-toxic substance for bees, with a LD50 of
11 µg per bee.
Naumann et al. (1994) found that neem seed extract
is a safe insecticide to use when there are honey bees
present at the moment of use. In fact, the treatments
they used did not repel the bees and suggest that neem
can be used for pest control in crops at the flowering
stage even when bees are required for pollination.
Repellency test with choice
There were significant differences in repellency
values attributable to double interactions of the variables
GONZÁLEZ-GÓMEZ et al.
745
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
Cuadro 1. Análisis de varianza de la prueba de repelencia de extractos de neem con elección, donde la variable de respuesta es el valor
de repelencia (VR).
Table 1. Analysis of variance of the repellency test of neem extracts with choice, in which the response variable is the repellency value
(RV).
Fuente de variación
GL
Producto
Concentración
Tiempo
Producto*concentración
Producto*tiempo
Concentración*tiempo
Producto*concentración*tiempo
3
3
7
9
21
21
63
Suma de cuadrados
24606.125
29805.750
3050.031
9572.812
4669.219
5654.094
3536.469
acción individual de cada variable. Por tanto, las variables producto y concentración son de interés en la
discusión, mientras que la variable tiempo, aunque fue
analizada, representa sólo la diferencia atribuible a las
fluctuaciones en las lecturas, por lo que es pertinente
omitirla de la discusión.
En la Figura 2 se muestra la tendencia en los valores de repelencia (VR) a lo largo del tiempo. Primero
puede apreciarse la tendencia estable (de 98 a 110.3)
que presentó el testigo (tratado con agua) durante las
72 h de observaciones. El tratamiento a base de
emulsificante pareció mostrar un ligero efecto repelente durante las primeras 4 h, pero sólo tuvo diferencia
significativa respecto al testigo a los 30 min y a concentración de 1%; el VR del emulsificante no fue superior a 114. Estos valores de repelencia concuerdan
con los citados por Colin et al. (1994), VR alrededor
de 100 para el agua y el emulsificante, los que muestran que las hembras de varroa se distribuyen uniformemente en las arenas de observación.
Para el aceite de neem el efecto repelente varió en
las dos cosechas; en la de 2002 (neem1), los VR en las
diferentes concentraciones fueron significativamente más
altos que en el testigo, con un valor máximo de 132 a
las 4 h (concentración 2%). Pero el efecto se redujo en
todas las concentraciones al pasar el tiempo, y a las
72 h el VR mínimo fue 101, igual al testigo. La
cosecha de 2003 (neem2) tuvo altos VR en todas las
concentraciones, que se separaron de los testigos (agua
y emulsificante); a la concentración más alta (4%) hubo
diferencias significativas (p≤0.05) desde 30 min hasta
72 h, y los VR oscilaron entre 128 y 139, lo cual está
muy cercano a la repulsión total (140). Colin et al.
(1994) encontraron que el extracto de Thymus vulgaris
tuvo el VR más alto, 124 a las 24 h, el cual disminuyó
con el tiempo. Estos resultados contrastan con los VR
y estabilidad que de neem2 en la presente investigación.
Dado que los extractos de neem de 2002 y 2003 se
obtuvieron de la misma plantación y se extrajeron de
746
VOLUMEN 40, NÚMERO 6
Cuadrados medios
8202.042
9935.250
435.719
1063.646
222.344
269.242
56.134
Fcal
109.87
133.08
5.84
14.25
2.98
3.61
0.75
Significancia F
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
0.92
type of product, concentration and observation time,
but not to triple interactions (Table 1). Besides, there
were significant differences due to the action of each
of the variables individually. Therefore, the variables
product and concentration are of interest in the
discussion, while the variable time, although it was
analyzed, represents only the difference attributable to
fluctuations in the observations, and so it is pertinent
to omit it in the discussion.
The trend of repellency values (RV) over time is
shown in Figure 2. Firstly, it can be seen that the
control (treated with water) maintained a stable trend
(98 to 110.3) over the 72 h that the observations lasted.
The treatment based on the emulsifier seemed to exhibit
a slight repellent effect during the first 4 h, even though
it was only significantly different from the control at
30 min at 1% concentration; the emulsifier RV was
not above 114. These repellency values coincide with
those reported by Colin et al. (1994), RV around 100
for water and emulsifier, showing that the female varroa
distribute themselves uniformly on the observation
arenas.
For neem oil, the repellant effect varied between
the two harvests: in the 2002 harvest (neem1) RV in
the different concentrations were significantly higher
than those of the control, with a maximum value of
132 at 4 h (2% concentration). But the effect decreased
with time in all of the concentrations and at 72 h, the
lowest RV was 101, the same as the control. The 2003
harvest (neem 2) had high RV in all of the concentrations
that differed from the controls (water and emulsifier).
At the highest concentration (4%) there were significant
differences (p≤0.05) from 30 min up to 72 h, and RV
oscillated between 128 and 139, which was very nearly
total repellency (140). Colin et al. (1994) found that
the extract of Thymus vulgaris had the highest RV,
124 at 24 h, decreasing over time. These results contrast
with the RV and stability of neem2 in this study.
The fact that the 2002 and 2003 neem extracts were
obtained from the same plantation and were extracted
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
140
Valor de repelencia
130
120
a
a
ab
ab
100
c
b
a
a
a
ab
b
b
110
A
a
a
b
b
b
ab
b
bc
a
ab
ab
b
b
90
c
80
140
a
120
110
100
B
a
a
130
Valor de repelencia
la misma forma, se sugiere que la diferencia en efecto
puede deberse a la degradación de los posibles ingredientes activos en el tiempo.
El producto comercial PHC Neem® presentó un
efecto similar al del neem1, pues VR no fue significativamente diferente entre ambos productos, si bien mostró un efecto más estable y a 4% fue significativamente diferente del testigo aun a 72 h.
En la Figura 3 se muestra la preferencia de las
hembras de varroa para elegir las pupas tratadas de las
no tratadas, y posarse en ellas, en todas las lecturas.
La tendencia de los ácaros para posarse en pupas tratadas con agua y con emulsificante fue indistinta o equivalente, es decir, no mostraron preferencia por una
zona particular. En contraste, fue clara la tendencia de
los ácaros a posarse sobre pupas no tratadas con cualquiera de los productos a base de neem; sin embargo,
destacó el neem2 porque se posaron significativamente
más hembras de varroa sobre las pupas no tratadas
(7.05 varroas/pupas).
a
a
ab
ab
a
a
b
bc
c
abc
bc
c
c
ab
ab
bc
bc
b
a
b
b
bc
c
c
90
80
Respecto al número de ácaros que se posaron sobre
las pupas, hubo efecto significativo de todas las fuentes de variación y sus interacciones (Cuadro 2). Como
en el experimento con posibilidad de elección, sólo se
discuten las variables de producto y concentración.
En la Figura 4 se muestra la tendencia de las hembras de varroa a posarse sobre las pupas de abejas,
todas tratadas, en el tiempo. Se aprecia que en las
pupas tratadas con agua y con emulsificante, aproximadamente 60% de las hembras de varroa pudieron
localizarlas y posarse sobre ellas 30 min después de la
aplicación; gradualmente este porcentaje aumentó a más
de 80%, lo cual se observó en la última lectura a las 72 h.
Sólo se contabilizaron las varroas que estaban sobre
las pupas en el momento de la observación, lo cual no
excluye que varroas cercanas pudieran tener acceso a
las pupas en otro momento.
Todos los tratamientos con neem tuvieron un nú≤0.05) de varroas
mero significativamente menor (p≤
sobre las pupas respecto al testigo. Sólo en la concentración 1%, en la lectura a las 4 h, no hubo diferencia
significativa respecto al testigo.
En el Cuadro 3 se presenta los promedios del número de varroas posadas sobre las pupas. Hubo un
efecto significativo del producto y de la concentración;
sorprendentemente, el neem2 a 4% sólo permitió que
un promedio de 0.2 varroas se posaran sobre las pupas
tratadas.
El número promedio de varroas muertas en las lecturas sucesivas; se muestra en la Figura 5. Se presentan sólo los valores observados a partir de las 24 h
140
Valor de repelencia
Prueba de repelencia sin elección
130
120
a
a
a
ab
bc
100
c
b
ab
b
b
b
90
80
PHC
0.5
a
a
ab
110
a
C
1
2
b
a
ab
ab
abc
abc
bc
bc
c
c
EMUL
Testigo
NEEM1
NEEM2
4
8
24
Tiempo (horas)
a
48
72
Figura 2. Valor de repelencia en los intervalos de tiempo. A)
concentración 1%; B) concentración 2%; C) concentración 4%. PHC=PHC® Neem (producto comercial);
NEEM1=extracto de aceite crudo de las semillas de
neem cosecha 2002; NEEM2=extracto de aceite crudo
de las semillas de neem cosecha 2003; EMUL= Tween
20; Testigo=agua. Las intersecciones marcadas con
diferente letra, para las lecturas tomadas en un mismo
≤0.05).
tiempo, son significativamente diferentes (p≤
Figure 2. Repellency value at of time intervals. A) 1%
concentration; B) 2% concentration; C) 4%
concentration. PHC=PHCTM Neem (commercial
product); NEEM1=extract of crude neem seed oil from
2002 neem harvest; NEEM2=extract of crude neem
seed oil from 2003 neem harvest; EMUL=Tween 20;
Control=water. The intersections marked with
different letter, for readings taken at the same time,
are significantly different (p≤0.05).
in the same way, suggests that the difference in effect
could be due to degradation of the possible active
ingredients over time.
GONZÁLEZ-GÓMEZ et al.
747
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
Número de ácaros sobre la pulpa
8
7
Pa
Pb
a
6
b
b
5
4
3
A
c
c
A
2
1
0
B
Testigo
EMUL
B
NEEM1
PHC
B
NEEM2
Figura 3. Número promedio de ácaros posados sobre las pupas
de abejas en la prueba de repelencia con elección, luego de la aplicación de los productos probados. Las
letras mayúsculas hacen comparaciones entre barras
grises, y las minúsculas entre barras negras. Pa=pupas
tratadas. Pb= pupas no tratadas.
Figure 3. Average number of mites settled on bee pupae in the
repellency test with choice, after application of tested
products. Upper case letters are comparisons between
bars and thin lines, and lower case letters between
bars and thick lines. Pa=treated pupae. Pb=nontreated pupae.
porque antes de esta lectura todas las varroas estaban
vivas. Tanto en el testigo como en el emulsificante
todas las varroas sobrevivieron hasta el final del estudio, mientras que en los tratamientos con neem se observó mortalidad desde 24 h. El PHC Neem no fue
diferente del testigo, aun a 72 h, mientras que el neem1
y el neem2 sí lo fueron. El efecto de neem2 fue más
rápido, pues la mortalidad de varroa se inició a las 24 h,
y a 2 y 4% murieron todos los ejemplares. Tanto en
neem1 como en neem2 hubo una relación positiva entre la concentración y la mortalidad.
Estos resultados concuerdan con los de Colin et al.
(1994), quienes evaluaron la efectividad biológica de
Thymus vulgaris, Salvia officinalis, Anonna spp. y
The commercial product PHC NeemTM had an effect
similar to that of neem1 since no significant differences
were found between the two products for VR, even
though the effect of the commercial product was more
stable and at 4% was significantly different from the
control even at 72 h.
Female varroa preference in selecting treated or
untreated pupae, and setthing in them in all readings,
is shown in Figure 3. The tendency of the mites to
settle on pupae treated with water and with emulsifier
was indistinct or equivalent, that is, they showed no
preference for a particular section. In contrast, the
tendency of the mites to settle on non-treated pupae
was clear, regardless of the neem-based product used;
however, the neem2 was outstanding because
significantly more female varroa settled on non-treated
pupae (7.05 varroa/pupa).
Repellency test without choice
Regarding the number of mites settled on pupae,
there was significant effect for all of the sources of
variation and their interactions (Table 2). As in the
experiment with choice, only the variables product and
concentration are discussed.
The tendency of female varroa to settle on bee pupae,
all treated, over time is shown in Figure 4. It can be
seen that approximately 60% of the female varroa were
able to locate and settle on the pupae treated with water
and with emulsifier as of 30 min after application; this
percentage gradually increased to over 80%, observed
in the last reading at 72 h. It should be noted that only
those varroa found on the pupae at the moment of
observation were counted, a fact that does not exclude
nearby varroa that could have had access to the pupae
at another time.
All of the neem treatments had a significantly lower
(p≤0.05) number of varroa on pupae than the control.
Only with the 1% concentration, in the reading taken at
4 h, there was no significant difference from the control.
Cuadro 2. Análisis de varianza de la prueba de repelencia de extractos de neem sin elección; la variable de respuesta es el número de
ácaros sobre las pupas.
Table 2. Analysis of variance of the repellency test of neem extracts without choice; the response variable is the number of mites on
pupae.
Fuente de variación
GL
Suma de cuadrados
Cuadrados medios
F
Pr > F
Producto
Concentración
Tiempo
Producto*concentración
Producto*tiempo
concentración*tiempo
Producto*concentración*tiempo
3
3
7
9
21
21
63
1388.687
2160.641
187.719
540.828
124.312
178.734
128.2969
462.896
720.213
26.817
60.092
5.920
8.511
2.036
474.64
738.48
27.50
61.62
6.07
8.73
2.09
<0.0011
<0.0011
<0.0011
<0.0011
<0.0011
<0.0011
<0.0011
748
VOLUMEN 40, NÚMERO 6
Núm. de varroas sobre las pupas
Núm. de varroas sobre las pupas
Núm. de varroas sobre las pupas
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
12
A
10
8
a
6
b
4
2
a
a
a
ab
a
a
b
ab
bc
bc
c
a
a
ab
bc
b
b
bc
b
b
c
c
c
0
12
B
10
a
a
6
2
a
a
a
b
ab
b
b
bc
c
0
12
b
bc
c
EMUL
Testigo
a
a
4
2
0
a
a
8
b
bc
c
0.5
b
1
b
b
NEEM1
NEEM2
PHC
ab
10
6
a
a
8
4
a
a
a
b
b
bc
2
A
b
C
a
a
b
b
bc
c
4
8
Tiempo (horas)
bc
c
24
c
48
c
72
Figura 4. Número de ácaros sobre las pupas en la prueba sin
elección en los intervalos de tiempo. A) concentración
1%; B) concentración 2%; C) concentración 4%.
PHC=PHC®
Neem
(producto
comercial);
NEEM1=extracto de aceite crudo de las semillas de
neem cosecha 2002; NEEM2=extracto de aceite crudo de las semillas de neem cosecha 2003;
EMUL=Tween 20; Testigo=agua. Las intersecciones
marcadas con diferente letra, para las lecturas tomadas en un mismo tiempo, son significativamente diferentes (p≤0.05).
Figure 4. Number of mites on pupae in the test without choice
at time intervals. A) 1% concentration; B) 2%
concentration; C) 4% concentration. PHC= PHCTM
Neem (commercial product); NEEM1=extract of crude
neem seed oil from 2002 neem harvest;
NEEM2=extract of crude neem seed oil from 2003
neem harvest; EMUL=Tween 20; Control=water.
Intersections marked with different letter, for readings
taken at the same time, are significantly different
≤0.05).
(p≤
The average numbers of varroa settled on pupae
are shown in Table 3. There was a significant effect of
both the product and the concentration can be seen;
surprisingly neem2 at 4% allowed an average of only
0.2 varroa to settle on treated pupae.
The average number of dead varroa in successive
readings is shown in Figure 5. Only values observed
as of 24 h are presented since before this reading all of
the varroa were alive. In both the control and the
emulsifier, all of the varroa survived to the end of the
study, while in the neem treatments mortality was
observed as of 24 h. PHC Neem was not different
from the control, even at 72 h, while neem1 and neem2
were. The effect of neem2 was more rapid; varroa
mortality began at 24 h and at 2 and 4% all of the
specimens died. In both neem1 and neem2 treatments
there was a positive relationship between concentration
and mortality.
These results coincide with those of Colin et al.
(1994), who evaluated the biological effectiveness of
Thymus vulgaris, Salvia officinalis, Annona spp. and
Chenopodium spp. These authors observed a repellency
effect that prevented the female varroa from settling
on bee pupae. As a result of the application of essential
oils of S. officinalis and Chenopodium spp., there was
90% mortality of varroa 16 h after application.
The effects of essential oils in the behavior of varroa
have been defined as attraction, repellency or toxicity
(Rickli et al., 1991). In the present experiment the
sum of the results of the tests of repellency with or
without choice proves that neem2 at 4% had the greatest
repellant effect and that, in the end, led to the death of
the varroa specimens. It is suggested that this was due
to the interference of the neem extracts in the behavior
of the varroa and in their ability to locate bee pupae to
feed on. Their death would therefore be from starvation.
CONCLUSIONS
At the concentrations used, there was no acute toxic
effect of any of the neem extracts on varroa or bees.
An important repellant effect was observed with neem
extracts, which interfered with the ability of female
varroa to locate bee pupae to feed on.
Neem-based products used in this study had a
persistent repellency effect that lasted at least 48 h.
Among these, the neem2, 2003 harvest, was outstanding;
this had an effect that persisted at least 72 h, sufficient
time to cause 100% mortality of the varroa.
It is postulated that death of female varroa was due
to starvation caused by the inability of the mites to
feed on the offered pupae.
—End of the English version—
GONZÁLEZ-GÓMEZ et al.
749
Tratamiento
Testigo
Emulsificante
Ácaros sobre las pupas
1%
2%
4%
7.8
7.3
7.0
7.1
a
a
a
a
PHC
1%
2%
4%
3.8 c
2.4 d
1.5 ef
Neem1
1%
2%
4%
3.7 c
1.9 de
1.0 f
Neem2
1%
2%
4%
2.5 d
1.9 de
0.2 g
Núm.de ácaros muertos
Cuadro 3. Promedio de varroas posadas sobre las pupas en la
interacción producto-concentración. Prueba de
repelencia de extractos de neem sin elección.
Table 3. Average number of varroa settled on pupae in the
interaction product-concentration. Test of repellency
of neem extracts without choice.
Núm.de ácaros muertos
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
Chenopodium spp. Dichos autores observaron un efecto de repelencia que impidió que las hembras de varroa
se posaran sobre las pupas de abejas. Como resultado
de la aplicación de aceites esenciales de S. officinalis y
Chenopodium spp., hubo 90% de mortalidad de varroa
16 h después de la aplicación.
Los efectos de los aceites esenciales en la conducta
de varroa han sido definidos como de atracción,
repelencia o toxicidad (Rickli et al., 1991). En el presente experimento la suma de los resultados de las
pruebas de repelencia con o sin elección comprueban
que el neem2 a 4% tuvo el mayor efecto repelente, y
condujo al final a la muerte de los ejemplares de varroa.
Se sugiere que esto se debió a la interferencia que
tuvieron los extractos de neem en el comportamiento
de varroa y en su incapacidad para localizar las pupas
de abejas y alimentarse de ellas. La muerte sería entonces por inanición.
Núm.de ácaros muertos
Medias con diferente literal son diferentes (p≤0.05).
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
A
A
a
1 b B
1 b B
Testigo
EMUL
1 b
AB
PHC
1 b
AB
NEEM1
1
NEEM2
A
B
a
1 b B
1 b B
Testigo
EMUL
1 b B
PHC
1 b
B
1
NEEM2
NEEM1
a A
A
C
24 h
48 h
72 h
1
2 b B
2 b B
Testigo
EMUL
2 b
B
PHC
2 b
NEEM1
NEEM2
CONCLUSIONES
Figura 5. Número de ácaros muertos en la prueba sin elección a
las 24, 48 y 72 horas. A) concentración 1%; B) concentración 2%; C) concentración 4%. Las comparaciones se hacen entre números, literales minúsculas y
mayúsculas para 24, 48 y 72 h.
Figure 5. Number of dead mites in the test without choice at 24,
48, and 72 hours. A) 1% concentration; B) 2%
concentration; C) 4% concentration. Comparisons are
made between numerals, lower case letters and upper
case letters for 24, 48 and 72 h.
A las concentraciones usadas, no hubo efecto tóxico agudo de ningún extracto de neem, sobre varroa y
abejas.
Se observó un importante efecto repelente de extractos de neem que interfirió con la capacidad de las
hembras de varroa para localizar las pupas de abejas y
alimentarse de ellas.
Los productos a base de neem usados en este estudio tuvieron un efecto persistente de repelencia que
duró al menos 48 h. Entre ellos destacó el neem2 cosecha de 2003; éste tuvo un efecto que persistió al menos
por 72 h, tiempo suficiente para causar la muerte de
100% de las varroas.
Se postula que la muerte de las hembras de varroa
se debe a inanición, causada por la incapacidad de los
ácaros para alimentarse de las pupas ofrecidas.
750
VOLUMEN 40, NÚMERO 6
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
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