AISLAMIENTO DE POLISACÁRIDOS A PARTIR DE CORDONES

Rev Cubana Farm 2002;36(3):182-8
Productos Naturales
Centro de Histoterapia Placentaria
AISLAMIENTO DE POLISACÁRIDOS A PARTIR DE CORDONES
UMBILICALES HUMANOS
Guillermo Lago,1 Gabriel Coto2 y Loida Oruña3
RESUMEN
Se realizó el aislamiento y caracterización de polisacáridos obtenidos a partir de
cordones umbilicales humanos mediante una modificación a la técnica de
Danishevsky y Bella. Se trataron los cordones con solución de cloruro de sodio
bajo condiciones de temperatura y agitación controlada y se precipitaron los
polisacáridos mediante la adición de una disolución de bromuro de
cetiltrimetilamonio al 1 %. Se resuspendió el sedimento obtenido en una solución
de cloruro de sodio 0,4 mol/L eliminando algunas impurezas que no se solubilizan
a esta fuerza iónica mediante centrifugación y se precipitó el producto de interés
mediante la adición de etanol al sobrenadante, caracterizándose por métodos
químicos. El producto puede ser empleado como materia prima para obtener un
gel cicatrizante en la Industria Médico-Farmacéutica.
DeCS: POLISACARIDOS/aislamiento & purificación; CORDON UMBILICAL;
TECNICAS PARA INMUNOENZIMAS; SULFATO DE AMONIO.
En la actualidad tiene gran importancia
el aislamiento de polisacáridos con actividad biológica a partir de fuentes naturales
entre las que se pueden mencionar el humor acuoso, humor vítreo, piel, fluido
pleural, crestas de gallo y del cordón
umbilical de donde se pueden extraer un
grupo importante de estos principios acti-
1
2
3
vos de elevado peso molecular de gran utilidad para el hombre.1,2
En años recientes se han logrado aislar estos principios activos de otras fuentes como puede ser la pulpa de mandíbulas
de ratas, ricas principalmente en ácido
hialurónico (AH) y otros proteoglicanos
(proteínas ligadas a polisacáridos).3
Investigador Auxiliar.
Licenciado en Bioquímica. Investigador Titular.
Doctora en Ciencias Veterinarias.
182
Los polisacáridos de cordón umbilical
conocidos también como glucosaminoglicanos, son polímeros lineales formados
por unidades de azúcares no reductores.1,4
A este grupo pertenecen la sal sódica del
AH. , sulfatos de condroitina (SCh),
sulfatos de heparina (SH), sulfato de
queratina (SQ) y la heparina (H).4
Se conoce que la mezcla de estos
azúcares y principalmente el AH tiene
acción cicatrizante. Algunos avances
recientes han demostrado que tienen
múltiples funciones en la migración de
queratinocitos y en la diferenciación durante la reepitelización, por tanto pueden
modular la acción cicatrizante.4-6 Los estudios morfométricos e histopatológicos
realizados en el Centro de Histoterapia
Placentaria empleando un modelo en ratas
con el uso de una formulación que contiene
AH y otros polisacáridos sulfatados han
demostrado la acción de estos como cicatrizantes; se conoce que los polisacáridos
sulfatados y la glucosamina pueden
sinergizar la promoción y síntesis de ácido hialurónico.7 Los glucosaminoglicanos
como el AH pueden ser utilizados en el
tratamiento de procesos reparadores
hísticos de evolución clínicamente tórpida,
por ejemplo en las úlceras venosas conocidas también como flebostáticas en las extremidades inferiores. Este último uso ha
sido poco estudiado y es de interés por su
novedad. Por otro lado se conoce que los
azúcares de pequeño tamaño u
oligosacáridos derivados del AH pueden
inhibir la maduración de los monocitos humanos que son los responsables de la producción de las citokinas como son las
interleukinas 1 ß (IL-1 α) y/o el factor de
necrosis tumoral (TNF α); por lo que se dice
que la presencia del AH solo o mezclado
aun en pequeñas dosis puede tener acción cicatrizante y antiinflamatoria.8
El presente trabajo tiene como objetivos
el aislamiento y caracterización de una
materia prima que contiene AH, la cual tiene
posibilidades de ser empleada en la elaboración de un gel cicatrizante de uso tópico.
MÉTODOS
Aislamiento del producto a partir de
cordón umbilical humano. Se tomó 500 g
de cordones umbilicales previamente
lavados a los cuales se le añadió 4 L de
solución de cloruro de sodio calidad farmacéutica al 0,2 % de la firma Quimivita, y
se agitó mecánicamente durante 24 h a
temperatura de 2-8 oC. Estos cordones
provienen de placentas humanas que son
debidamente evaluadas desde el punto de
vista de su control viral antes de su aprobación para su empleo. En el momento del
parto se recoge la sangre del cordón
umbilical y se obtiene el suero en dobles
bolsas de nylon para el control del VIH y
hepatitis B y C, mediante los correspondientes ensayos inmunoenzimáticos que se
desarrollan en el laboratorio de control viral
del Centro de Histoterapia Placentaria, como
son los procedimientos para la detección
del antígeno de superficie para la hepatitis
B en suero (ACI 10.001.99), el procedimiento
para la detección de anticuerpos al virus de
la hepatitis C, VIH 1 y VIH 2 en suero humano
(ACI 19.002.99) y el procedimiento para
realizar la prueba confirmativa de muestras
repetidas con el UMELISA HBsAg (ACI
19.003.99).
La solución salina se separó de los restos
de tejido con el empleo de gasa y más tarde
se le añadió 0,3 L de una solución de
bromuro de cetiltrimetilamonio (BCTA) p.a.
de la firma Readel D´ Haën al 1 %.
El producto sólido que se obtuvo en el
paso anterior se separó de la solución madre mediante centrifugación a 4 420 x g. Este
se resuspendió en solución de cloruro de
sodio también de calidad farmacéutica a
183
cha la fase acuosa para realizar el ensayo
de Blumerk cuyos resultados se expresan
en miligramo por mililitro pero por comodidad y con fines comparativos estos se
convierten en tanto por ciento según la
expresión:
concentración de 0,4 mol/L con el objetivo
de romper el complejo formado por el
BCTA-AH y se centrifugó a la misma velocidad. Al sobrenadante obtenido del paso
anterior se le añadió 3 volúmenes de etanol
al 96 % calidad comercial y después de 1 h
se centrifugó. El sedimento, de aspecto
pastoso, se sometió a diferentes ensayos
para su caracterización desde el punto de
vista químico mediante la determinación de
proteínas totales (proteínas libres y ligadas
a polisacáridos), hialuronato de sodio,
sulfatos, humedad y la identificación
cualitativa de hexosaminas.
% AH=(AH)*100/C
donde:
AH: concentración de AH (mg/mL).
C: concentración de muestra inicial (mg/mL).
Determinación de la humedad. Se
empleó la técnica para la determinación de
humedad según el manual del AOAC.14
Determinación de la concentración
proteica. Se empleó la técnica de Bradford15
la cual permite cuantificar el nivel de proteínas
totales (libres y ligadas a polisacáridos). Se
pesó 120 mg del producto y una vez disuelto
en 50 mL de agua desmineralizada y hervida
se le realizó la determinación. Los resultados
se expresan en miligramo por mililitro, pero
por comodidad y con fines comparativos
se llevan a tanto por ciento en peso según
la expresión:
TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTROL
Determinación de hialuronato de
sodio. La determinación de hialuronato de
sodio se realizó según la técnica de
Blumerk 9 empleando un patrón de
hialuronato de sodio p.a. de la firma Fluka.
El método se basa en la reacción de los
ácidos urónicos presentes en una muestra,
previamente tratada con metahidroxibifenilo
bajo condiciones de temperatura controlada.
Es necesario un tratamiento previo de la
muestra mediante extracciones con cloroformo o fenol/acetato de sodio para eliminar
el resto de los polisacáridos que pueden
formar asociaciones covalentes con las
proteínas.10,11 Este método fue postulado
primero por Balazcs12 en sus trabajos de
aislamiento de AH ultrapuro y más tarde
Brun13 lo utiliza como método auxiliar de
análisis de fluido sinovial.
Por lo anterior, se tomó 80 mg del producto en estudio obtenido a escala de banco
y se resuspendió en 100 mL de agua
desmineralizada y hervida. Estos se trataron 4 veces con cloroformo, desechando la
fase clorofórmica y la interfase en la que se
eliminan los lípidos, proteínas libres y
asociadas con polisacáridos.12 Se aprove-
% P = (Prot)*5000/(P. muestra)
donde:
% P: composición de proteínas libres y ligadas a polisacáridos expresada en tanto
por ciento.
Prot: composición de proteínas libres y ligadas a polisacáridos (mg/mL).
P. muestra: peso de la muestra.
Determinación cualitativa de hexosaminas. Se desarrolló el ensayo cualitativo
de Elson-Morgan16 basado en la reacción
de la fracción de hoxosaminas presente en
los polisacáridos con el N,N dimetilaminobenzaldehído en medio ácido a
temperatura entre 65-70 oC.
184
azúcares y es una medida de la posible
degradación de estos.
Determinación de sulfatos. Este análisis se realizó para determinar la presencia
y la concentración de posibles polisacáridos
sulfatados.17 La muestra (5 g) se secó en la
estufa a 80 oC hasta peso constante, para
eliminar el agua retenida en su estructura
molecular, y de estos residuos secos se tomó
0,1 g y se trató en la mufla a 800 oC durante
2 h para destruir la materia orgánica en
donde todo se convierte en sulfato.
El residuo de cenizas se pesó
cuantitativamente en un vaso de precipitado de 100 mL al cual se le añadió 50 mL
de agua desmineralizada y hervida. A
continuación se le añadió 0,3 mg de cloruro
de bario p.a. de la firma Readel D´ Haën y
10 mL de una solución acondicionadora
preparada previamente disolviendo 120 g
de NaCl p.a. de la misma casa comercial
que los anteriores en 400 mL de agua
desmineralizada, 10 ml de HCl concentrado
y 500 mL de glicerina se agitó por 1 min y se
dejó reposar 4 min leyendo la turbidez en
un espectrofotómetro UV/Vis modelo Pye
Unicam SP 1200 a una longitud de onda
de 420 nm contra una curva de calibración
de sulfato de sodio anhidro a diferentes
concentraciones y bajo similares condiciones experimentales.
Determinación de azúcares reductores.
Esta se realizó por la técnica del 2,4 dinitrofenol.18 Este reactivo reacciona con los
grupos reductores presentes en estos
RESULTADOS
Por cada kilogramo de cordón se logró
un rendimiento de 65 g que equivale al 6,5 %
con respecto a la materia prima de partida
(cordones umbilicales). Este puede considerarse novedoso por cuanto mediante una
tecnología relativamente sencilla se logró
una materia prima para ser empleada en
formulaciones cosméticas y geles con fines
cicatrizantes de uso tópico.
La muestra producida fue caracterizada
según las técnicas descritas en el procedimiento experimental, para ello se realizaron
15 determinaciones con el propósito de
estudiar estadísticamente cada uno de los
parámetros descritos, en los que se determinó el valor medio, la varianza, la desviación
estándar, los valores máximos y mínimos, y
el coeficiente de variación (CV), medida de
la precisión en la medición de los datos
analíticos que empleó en el procesamiento
de los datos el Statgrafic en su versión V.
En la tabla 1 se presentan los resultados de la caracterización del producto
obtenido mediante el método descrito y
en la tabla 2 los resultados procesados
estadísticamente.
TABLA. 1 Resultados analíticos de 15 muestras de extracto que contienen AH y proteínas que pueden estar libres o
ligadas a polisacáridos
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Humedad
( %)
Azúcares
reductores
(%)
Proteínas
(%)
AH
(%)
Sulfatos
p.p.m.
85
86
85
84
85
86
85
84
83
84
85
86
84
85
85
1,0
1,0
1,0
1,1
1,1
1,0
1,1
1,0
0,9
1,0
1,0
1,0
1,2
1,1
0,9
8
7
8
7
8
8
9
8
8
7
8
7
8
8
6
7
7
7
8
7
6
7
8
8
7
7
7
7
8
8
84
83
84
83
85
84
83
83
85
84
83
84
84
83
83
185
TABLA 2. Resultados estadísticos del análisis de la muestra según la data experimental que aparece en la tabla 1
Promedio (%)
Desviación estándar
Máximos
Mínimos
Coeficiente de
variación (%)
Humedad
Reductores
85
0,8
86,0
83,0
1,04
1
0,09
1,02
0,9
8,45
Proteínas
8
0,7
9,0
6,0
9,44
AH
8
0,6
8,0
6,0
8,16
Sulfatos
84 p.p.m.
0,7
85,0
83,0
0,86
Tejido 500 g
Extracción con disolución de NaCl 0,2 %
Extracto
Sólidos
CPC (1 %)
Sobrenadante
Precipitado
Extracción con solución
de NaCl 0,4 mol/L
Residuo
Extracto (AH)
Solución de
NaCl 1,2 mol/L
Residuo
Extracto (SH)
Solución de
NaCl 2,1 mol/L
Residuo
FIG. Metodología de aislamiento
de Danishevsky y Bella, donde
CPC: cloruro de cetilpiridinio,
AC: ácido hialurónico, SCh:
sulfato de condroitina, SH: sulfato
de heparina.
Extracto (SCh)
DISCUSIÓN
de diferentes fuentes. Estos pueden
clasificarse en métodos químicos como el
empleo del sulfato de amonio y piridina combinado con el uso de etanol.19 Los lípidos
Existen diferentes métodos para el aislamiento de AH a partir de extractos salinos
186
de estos extractos pueden ser extraídos
antes de precipitar los polisacáridos empleando filtros hidrofóbicos y las proteínas
pueden ser extraídas utilizando cloroformo
o mezclas de este con fenol.12,13
En el presente trabajo se discute un
método de aislamiento de AH basado en la
técnica conocida de Danishevsky y Bella20
(fig.) y se introduce una modificación a esta
en la que se cambia el cloruro de cetilpiridinio
(producto tóxico contaminante) por el BCTA,
se aprovecha solo la fracción rica en AH y
se le incorpora etanol grado comercial para
precipitar esta materia prima.
Analizando el procedimiento desarrollado en el presente trabajo ya descrito en la
sección de métodos, se puede decir que la
extracción salina al 0,2 % garantiza que se
obtengan las sustancias solubles en agua
como son algunas proteínas libres y ligadas
a polisacáridos, hialuronato de sodio, etc.
El empleo de sales de amonio cuaternaria
provoca la precipitación de los polisacáridos
en forma de complejos insolubles eliminando
otros posibles contaminantes como los
lípidos y la mayor parte de las proteínas.
Este complejo se rompe al aumentar la fuerza
iónica del medio añadiendo disolución de
cloruro de sodio 0,4 mol/L, pues la fuerza
iónica resultante puede romper principalmente el complejo AH-BCTA aunque no
se descarta la posibilidad de romper otros
posibles complejos con azúcares sulfatados,
lo cual no es un inconveniente para su posible empleo como cicatrizante sobre la base
de los criterios ya manejados de que la
presencia de los polisacáridos sulfatados
potencializa la acción cicatrizante.7
Se observa en todos los casos que los
CV son menores que 10 y pueden considerarse aceptables para estas muestras en las
cuales la mayor parte de estos polisacáridos
son de alto peso molecular y forman suspensiones. El nivel de AH oscila entre el 6 y
el 8 % con un valor medio del 7 %, estos
son relativamente altos en comparación con
otros métodos de aislamiento conocidos19,21
cuyos rendimientos son más bajos (< 5 %),
de ahí la novedad.
Los valores de “humedad” oscilan
alrededor del 84 al 85 %. Estos valores
relativamente altos pueden ser explicados
por la habilidad que tienen las moléculas de
dichos polisacáridos y especialmente el AH
de retener agua en su matriz cuando precipitan con el empleo de etanol.1
El procedimiento descrito permite
obtener un producto mediante una tecnología relativamente sencilla con altos
rendimientos en comparación con otros
métodos conocidos.
Las técnicas descritas son recomendadas
como control de rutina para el análisis del
producto a escala industrial.
El ensayo cualitativo de Elson Morgan
para la determinación cualitativa de
hexosaminas en este caso derivados
N-acetilados dio positivo, al aparecer un
color violeta púrpura que confirma la
presencia de estos tipos de azúcares.
El ensayo de azúcares reductores con
valores entre el 1 y 1,5 % se pueden considerar
aceptables para este método de aislamiento
empleado, pues se considera12 que son las
fracciones de glucosaminoglicanos de alto
peso molecular las insolubles en alcohol y
a ellas les corresponden valores de
reductores que se mueven en esos rangos.
El ensayo de la determinación de la
presencia de sulfatos se realizó y se encontró
en la muestra una concentración media de
84 p.p.m. Estos sulfatos son un indicador
de la presencia de heteropolisacáridos de
cordón sulfatados como son los SCh, SH,
etc., que como se discutió anteriormente
favorecen el empleo de esta materia prima
en la formulación de cicatrizantes.
187
SUMMARY
The polysaccharides obtained from human umbilical cords by a modification of
Danishevsky and Bella’s technique were isolated and characterized. The cords
were treated with a sodium chloride solution under controlled temperature and
agitation conditions. The polysaccharides were precipitated by adding a disolution
of cetyltrimethylammonium 1 %. The sediment obtained in a sodium chloride
solution 0.4 mol/L was resuspended, eliminating some impurities that were not
soluble at this ionic force by centrifugation. The product of interest was precipitated
by adding ethanol to the supernadant and it was characterized by chemical
methods. This product may be used as a raw material to obtain a healing gel in
the Medicopharmaceutical Industry.
Subject headings: POLYSACCHARIDES/isolation & purification; UMBILICAL
CORD; IMMUNOENZYME TECHNIQUES; AMMONIUM SULFATE.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 . Balazs EA, Band P. Hyaluronic acid: its structure and use. Cosmet Toilet 1984;99(3):65.
2 . Jeanloz RW. Mucopolisaccharides of higher animals in carbohydrates. Chem Biochem 1970;2B:400-20.
3 . Shibata S, Yaneda S, Yanagishita M, Vamashita Y. Isolation of proteoglycans (Versican) aggregate from
rat dental pulp. Arch Oral Biol 2000;45(7):563-8.
4 . Nakamura M, Nishida T. Recent developments in the use of hyaluronan in wound healing. Drugs
1995;4:117.
5 . Bertheim V, Helltrom S. The distribution of hyaluronan in human skin and nature hypertrophi and
keloid scar. Br J Plast Surg 1994;47:48.
6 . Casero R. Methods of treating dermatological conditions ITX Patent 5,340,579. 1994 Jun 25.
7 . Mc Carty MF, Russell M, Seed MP. Sulfated glycosaminoglycans and glucosamine may synergize in
promoting synovial hyaluronic acid synthesis. Med Hypoth 2000;54(5):798-802.
8 . Termeer C. Oligosacarides of hyaluronan are potent activation of dentritic cell. J Immunol
2000;165(4):1863-70.
9 . Blumerk AH. Colorimetric determination of uronic acid. Anal Biochem 1973;54:484.
10. Balazcs EA, Band P. Hyaluronic acid; Structure and use. Cosmet Toilet 1984;99:65.
11. Muir H, Hardigan L. Structure of proteoglycans in Biochemistry series one Biochemistry of Carbohydrate.
London: Butterworths; 1975:153.
12. Balazcs EA. Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof. Patent 414197. 1979 Jun 25.
13. Brun P. Analysis of hyaluronic acid and the use thereof. Patent 414197. 1979 Jun 25.
14. Sidney W. Official methods of analisis of the Association of Official Analytical Chemist. 5 ed. Virginia:
William Byrd Press Inc; 1984:20.
15. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram of protein. J Biol Chem
1976;72:248.
16. Shyrley C. Handbook of chromatography: carbohydrate 2 ed. New York: Academic Press; 1982:340.
17. Díaz I, Juanez M. Determinación colorimétrica de azúcares reductores en jugo mezclado, miel final y
azúcar crudo. Rev ATAC 1977;4:24.
18. Andrew D. Eaton standar methods for the examination of waste and wastewater, 19 ed. New York:
American Public Health Association; 1995:220.
19. Cassione M. Blends of synthetic and natural polymers as drug delivery systems for growth hormone.
Biomaterial 1995;16:569.
20. Danishevsky B. The suphates mucopolisaccharides from human umbilical cord. J Biol Chem
1966;241:147.
21. Nakano T, Nakano K, Sim JS. A rapid simple method to estimate hyaluronic acid concentrations in
rooster comb and watle using cellulose acetate electroforesis. J Agric Food Chem 1994;42:2766.
Recibido: 29 de mayo de 2002. Aprobado: 27 de junio de 2002.
Lic. Guillermo Lago. Calle 180 entre 5ta Ave. y 1ra, Edificio A-4, apto 17, municipio Playa, Ciudad de La
Habana, Cuba. E-mail: [email protected]
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