MODULO REPRODUCCION ANIMAL AVANZADA EDWIN

MODULO REPRODUCCION ANIMAL AVANZADA
EDWIN MANUEL PAEZ BARON
Médico Veterinario Zootecnista
Esp. en Sanidad Animal
MSc en Educación Superior
Estudiante Doctorado en Desarrollo Sostenible
Universidad Nacional Abierta y a Distancia
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
CEAD TUNJA
2012
TABLA DE CONTENIDO
UNIDAD 1. CONTROL DE LA ACTIVIDAD REPRODUCTIVA.
CAPITULO 1. CONTROL DE LA ACTIVIDAD OVARICA.
Lección 1. Ovogénesis.
Lección 2. Foliculogénesis.
Lección 3. Ondas de desarrollo folicular. Reclutamiento.
Lección 4. Selección.
Lección 5. Dominancia
CAPITULO 2. INDUCCIÓN Y SINCRONIZACIÓN DE CELO.
Lección 6. Técnicas de sincronización del celo
Lección 7. Inducción y sincronización del celo en bovinos.
Lección 8. Inducción y sincronización del celo en equinos.
Lección 9. Inducción y sincronización del celo en ovinos.
Lección 10. Inducción y sincronización del celo en porcinos.
CAPITULO 3. PROGRAMAS DE INSEMINACON ARTIFICIAL A TIEMPO FIJO
Lección 11. Aspectos generales
Lección 12. Protocolo de sincronización de celo mediante el uso de GnRH
(ovsynch).
Lección 13. Variantes del protocolo Ovsynch.
Lección 14. Protocolo de sincronización de celo mediante el uso de dispositivos
intravaginales.
Lección 15. Protocolo de sincronización de celo para IATF y resincronización para
una segunda IATF.
UNIDAD 2. INSEMINACION ARTIFICIAL Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
CAPITULO 1. COLECTA Y EVALUACION DE SEMEN.
Lección 16. Aspectos generales.
Lección 17. Evaluación de la libido.
Lección 18. Colecta y evaluación de semen.
Lección 19. Colecta y evaluación de semen bovino y ovino.
Lección 20. Colecta y evaluación de semen porcino.
CAPITULO 2. INSEMINACION ARTIFICIAL.
Lección 21. Historia de la inseminación artificial
Lección 22. Técnica de Inseminación artificial.
Lección 23. Técnica de Inseminación artificial en equinos.
Lección 24. Técnica de Inseminación artificial en ovinos.
Lección 25. Técnica de Inseminación artificial en porcinos.
CAPITULO 3. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
Lección 26. Selección y manejo de donantes y receptoras.
Lección 27. Colecta y evaluación de embriones
Lección 28. Transferencia de embriones
Lección 29. Criopreservación de embriones.
Lección 30. Transferencia de embriones en equinos.
UNIDAD 3. ULTIMAS BIOTECNOLOGIAS REPRODUCTIVAS APLICADAS A LA
PRODUCCION ANIMAL.
CAPITULO 1. FERTILIZACION IN VITRO.
Lección 31. Aspectos generales.
Lección 32. Obtención de ovocitos.
Lección 33. Maduración de ovocitos in vitro
Lección 34. Fertilización in vitro.
Lección 35. Maduración y transferencia de embriones.
CAPITULO 2. CLONACION Y TRANSGENESIS.
Lección 36. Aspectos generales
Lección 37. Métodos de clonación.
Lección 38. Técnica de clonación.
Lección 39. Transgénesis.
Lección 40. Técnicas de obtención de animales transgénicos.
CAPITULO 3. SEXAJE DE SEMEN, QUIMERAS, ICSI, CELULAS MADRE
Lección 41. Aspectos generales
Lección 42. Sexaje de semen.
Lección 43. Producción de quimeras.
Lección 44. Inyección intracitoplasmática de semen.
Lección 45. Producción de células madre
LISTADO DE FIGURAS
Fig 1. Folículo primordial.
Fig. 2. Folículo primario.
Fig. 3. Folículo secundario.
Fig. 4. Folículo terciario.
Fig 5. Dinámica folicular durante un ciclo estral bovino.
Fig. 6. Protocolo Ovsynch.
Fig. 7. Protocolo Cosynch.
Fig. 8. Órganos internos del aparato reproductor masculino.
Fig. 9. La libido representa el impulso sexual del macho.
Fig. 10. La evaluación morfológica del semen.
Fig. 11. Anormalidades espermáticas.
Fig. 12. Medición de la concentración espermática.
Fig. 13. Hemotocitómetro o cámara de Neubauer.
Fig. 14. Colecta de semen de carnero.
Fig. 15. Colecta de semen del verraco.
Fig. 16. Determinación del tiempo de monta o inseminación.
Fig. 17. Selección de la pajilla.
Fig. 18. Proceso de inseminación artificial.
Fig. 19. Seguimiento ecográfico de la ovulación.
Fig. 20. Inseminación artificial en la yegua.
Fig. 21. Inseminación artificial en la oveja.
Fig. 21. Inseminación artificial laparoscópica en la oveja.
Fig. 22. Inseminación artificial laparoscópica en la oveja.
Fig. 23. Inseminación artificial en la cerda.
Fig. 24. Lubricación del catéter.
Fig. 25. Inserción del catéter.
Fig. 26. I.A en la Cerda.
Fig. 27. Diversos tipos de catéter utilizados en la I.A porcina.
Fig. 28. Termos de inseminación.
Fig. 29. Ovarios superovulados.
Fig. 30. Proceso de colecta de embriones.
Fig. 31. Embriones en diferentes etapas de desarrollo.
Fig. 32. Embriones colectados.
Fig. 33. T.E en equinos.
Fig. 34. Proceso de FIV.
Fig. 35. Proceso de clonación.
Fig. 36. Clonación por transferencia nuclear.
Fig. 37. Enucleación.
Fig. 38. Transferencia nuclear.
Fig. 39. Ovocito con núcleo.
Fig. 40. Electrofusión.
Fig. 41. Cultivo.
Fig. 42. Transferencia embrionaria.
Fig. 43. Clonación en las diferentes especies.
Fig. 44. Oveja Dolly y su creador.
Fig. 45. Lady, la primera ternera clonada.
Fig. 46. Pampa mansa.
Fig. 47. Manuel.
Fig. 48. Victoria.
Fig. 49. Prometea y su progenitora.
Fig. 50. Snuppy.
Fig. 51. El primer cachorro clonado comercial.
Fig. 52. Caninos clonados.
Fig. 53. Citómetro de flujo.
Fig. 54. Citometría de flujo en la producción de semen sexado.
Fig. 55. Inyección del espermatozoide.
Fig. 56. ICSI.
Fig. 57. Producción de células madre.
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1. Protocolo Ovsynch.
Tabla 2. Protocolo Cosynch.
Tabla 3. Protocolo Cosynch 72 horas.
Tabla 4. Protocolo para novillas.
Tabla 5. Protocolos para vacas en lactancia.
Tabla 6. Dispositivo intravaginal + GnRH.
Tabla 7. Protocolos de sincronización de celo para IATF y resincronización
Novillas.
Tabla 8. Protocolos de sincronización de celo para IATF y resincronización Vacas
en lactancia.
Tabla 9. Protocolos de sincronización de celo para IATF y resincronización de los
retornos al celo para una segunda IATF Novillas.
Tabla 10. Protocolos de sincronización de celo para IATF y resincronización de los
retornos al celo para una segunda IATF Vacas en lactancia.
Tabla 11. Protocolo de superovulación y sincronización del celo (vacas).
Tabla 12. Protocolo de superovulación y sincronización del celo (Novillas).
Tabla 13. Protocolo de superovulación con eCG.
Tabla 14. Desarrollo del embrión.
Tabla 15. Escala de clasificación embrionaria.
Tabla 16. Avances de la transgénesis.
INTRODUCCION
El curso de reproducción avanzada comprende el conocimiento de las
biotecnologías de la reproducción aplicada a la producción de las especies
domesticas. Se hace un recorrido desde los inicios de la biotecnología con los
procesos de conocimiento de la fisiología ovárica y su manipulación, pasando por
la inseminación artificial, la sincronización de celo, la transferencia de embriones,
la fertilización in vitro y las últimas biotecnologías disponibles en el mercado, tales
como el semen sexado, la inyección intracitoplasmática de semen, la clonación, la
transgénesis y la producción de células madre embrionarias.
El objetivo del curso es que el estudiante conozca, aplique y verifique las diversas
técnicas disponibles para el mejoramiento de la eficiencia y la rentabilidad de las
explotaciones pecuarias.
Se pretende brindar un conocimiento acerca de la
evolución de las biotecnologías y su aplicación en los diversos campos de la
producción animal, en este sentido, el estudiante debe conocer las herramientas
disponibles y con base en su propio criterio definir cuáles pueden ser aplicadas en
la producción animal.
El estudiante es el responsable de su proceso de aprendizaje, y en tal sentido el
curso brinda las herramientas necesarias para el desarrollo de las habilidades y
destrezas que requiere para su futuro desempeño como profesional de las
ciencias pecuarias. El curso involucra actividades individuales y grupales,
desarrollas en las tres fases de aprendizaje (reconocimiento, profundización y
transferencia) que permitirán al estudiante explotar sus diversas capacidades y
habilidades de conocimiento con el fin de dar solución práctica a los casos que va
a tener que enfrentar en su vida profesional.
Es importante señalar que la educación a distancia involucra la participación de
múltiples medios y mediaciones pedagógicas, entre las cuales se destacan: los
videos,
las presentaciones, las animaciones, los encuentros sincrónico y
asincrónico (foros, chat), las prácticas pedagógicas, las visitas, las lecciones, los
cuestionarios, entre otros.
El curso pretende brindar al estudiante la guía para desarrollar su proceso de
aprendizaje, y con base en este pueda investigar, conocer, aplicar y desarrollar un
conocimiento profundo en las biotecnologías de la reproducción aplicadas a la
producción animal.
UNIDAD 1. CONTROL DE LA ACTIVIDAD REPRODUCTIVA
OBJETIVOS
•
•
•
Comprender los cambios fisiológicos ocurridos en el ovario y sus
estructuras durante el ciclo estral.
Identificar las hormonas y los elementos que producen dichos cambios
durante el ciclo estral.
Identificar los protocolos y productos utilizados en los programas de
sincronización de celo e inseminación artificial a tiempo fijo.
ESTRUCTURA
CAPITULO 1. CONTROL DE LA ACTIVIDAD OVARICA.
Lección 1. Ovogénesis.
Lección 2. Foliculogénesis.
Lección 3. Ondas de desarrollo folicular. Reclutamiento.
Lección 4. Selección.
Lección 5. Dominancia
CAPITULO 2. INDUCCIÓN Y SINCRONIZACIÓN DE CELO.
Lección 6. Técnicas de sincronización del celo
Lección 7. Inducción y sincronización del celo en bovinos.
Lección 8. Inducción y sincronización del celo en equinos.
Lección 9. Inducción y sincronización del celo en ovinos.
Lección 10. Inducción y sincronización del celo en porcinos.
CAPITULO 3. PROGRAMAS DE INSEMINACON ARTIFICIAL A TIEMPO FIJO
Lección 11. Aspectos generales
Lección 12. Protocolo de sincronización de celo mediante el uso de GnRH
(ovsynch).
Lección 13. Variantes del protocolo Ovsynch.
Lección 14. Protocolo de sincronización de celo mediante el uso de dispositivos
intravaginales.
Lección 15. Protocolo de sincronización de celo para IATF y resincronización para
una segunda IATF.
UNIDAD 1. CONTROL DE LA ACTIVIDAD REPRODUCTIVA
CAPITULO 1. OVOGÉNESIS Y DINÁMICA FOLICULAR .
Lección 1. Ovogénesis.
La ovogénesis consiste en el proceso de formación y desarrollo del ovocito. Este
proceso inicia en las fases tempranas de la vida fetal de la hembra bovina,
aproximadamente entre los 120 y 140 días de gestación y finaliza con la formación
de un determinado número de folículos primordiales. La ovogénesis involucra tres
fases: una fase proliferativa en que las ovogonias (OO) se dividen activamente,
una fase meiótica que permite la formación de los ovocitos primarios y una tercera
fase de intensa degeneración de las células germinales primordiales (CGP). Los
ovocitos que sobreviven a ésta fase degenerativa son detenidos en el estado de
diploteno de la primera división meiótica y están rodeados por una simple capa de
células de la granulosa (CG), ésta estructura recibe el nombre de folículo
primordial (Peña, Góngora y Estrada, 2007). De acuerdo a lo reportado por Gigli,
Russo y Agüero (2006), las ovogonias se diferencian en ovocitos cuando
comienzan la meiosis, en embriones de ratón la división por mitosis comienza
alrededor del día 14-16 de gestación y culmina el día 20, dando lugar a la división
meiótica; en el bovino se observan figuras meióticas a partir del día 82 de
gestación; en el equino, la multiplicación de las ovogonias por mitosis comienza
alrededor del día 50 de gestación y continúa hasta el día 150-160. A partir del día
102 se observan en el ovario de embrión equino todos los estadios de división
meiótica si bien son pocos los folículos primordiales que se forman, ya que la
mayoría de los ovocitos se degeneran antes de rodearse de las células de la
granulosa.
Por otro lado, Fernández (2003) plantea que en casi todas las especies de
mamíferos no se produce división mitótica de la célula germinal femenina después
del nacimiento, de manera que, el número de ovocitos presentes al nacimiento
representa el total disponible durante la vida del animal. A diferencia del macho
en el cual se puede producir celular sexuales en la vida posnatal. En el feto
bovino, la ovogonia se desarrolla de las células primordiales germinales que han
migrado hasta el ovario durante la embriogénesis temprana y prolifera alrededor
del día 50 hasta el día 130 de la gestación. Un proceso de degeneración ovogonial
comienza alrededor del día 95 de la vida fetal y la mayoría de los ovocitos
producidos durante este período (60% o más) son eliminados del ovario antes del
parto. Un segundo evento de desarrollo se inicia a los 80 días de la vida fetal
cuando la ovogonia inicia la meiosis. Este proceso se detiene en todos los
ovocitos en el estadio diploteno de la profase meiótica. Acompañando estos
cambios nucleares están la formación del folículo primordial, la diferenciación de
una capa de células aplanadas que lo envuelven conocida como células de la
granulosa, el establecimiento de una lámina basal rodeando la granulosa y la
diferenciación de una capa de células de teca exteriores a la lámina basal. La
población de folículos primordiales puede considerarse como una cuenta en la
cual la foliculogénesis es un retiro, comenzando al inicio de la vida fetal y
continuándose en la pubertad y en los períodos reproductivos de la vida del animal
(Fernández, 2003).
Lección 2. Foliculogénesis
La foliculogénesis o desarrollo folicular es un proceso continuo que se da en las
hembras de todas las especies domésticas, y que da como resultado la ovulación
de un folículo maduro o la regresión o involución del mismo. Este proceso es el
resultado de la interacción de múltiples componentes celulares que constituyen el
folículo y de múltiples factores que son producidos en el ovocito, en las células de
la granulosa (CG) o en las células de la teca (CT), y que son controlados bajo el
influjo de diferentes factores autocrinos, paracrinos o endocrinos (Velásquez y
Mendieta, 1999).
En la foliculogénesis, un folículo primordial entra al grupo de crecimiento, y es
conducido a uno de dos hechos:
la degeneración por atresia (sufrida por el 99%
o más) o la ovulación alcanzada por muy pocos (menos del 1%). El periodo de
tiempo que se requiere desde la activación de un folículo primordial durmiente
hasta su ovulación, es de aproximadamente 180 días en los bovinos.
Los
folículos primordiales, se caracterizan por el ovocito I detenido en la profase de
su primer división meiótica (diploteno) rodeado por una capa plana de células de la
granulosa. Estos folículos forman la reserva gametogénica o población de folículos
de reserva, que una hembra va a utilizar en toda su historia reproductiva, a partir
de estos folículos de reserva se originan los folículos de crecimiento, en las
potrancas se estima la existencia de entre 36.000-46.000 folículos primordiales en
el ovario, en los bovinos de 25.000 a 42.000 folículos primordiales (Gigli, Russo y
Agüero 2006).
Fig 1. Folículo primordial. Este se encuentra rodeado por una capa plana de células de la
granulosa.
Fuente: http://www.telmeds.org/AVIM/Aembrio/Imagenes/Foliculo%20primordial.jpg
Posteriormente el folículo primordial continúa su desarrollo a los denominados
folículos preantrales: folículo primario y folículo secundario. En el folículo
primario las células planas de la granulosa antes de comenzar a dividirse por
mitosis se diferencian en una capa de células de forma cúbica que rodea al
ovocito I y la teca interna comienza su diferenciación. El folículo secundario, es
aquel en el cual se completa la proliferación de las células de la granulosa y las
mismas aumentan de tamaño.
Fig. 2. Folículo primario. Las células planas se convierten en células de forma cubica.
Fuente: http://virtual.ujaen.es/atlas/ovario/ova rio100x1foliculos1.jpg
Fig. 3. Folículo secundario. En este las células de la granulosa aumentan de tamaño.
Fuente: http://lh4.ggpht.com/_1tDfjMtTyDc/Ro76fLp5srI/AAAAAAAAABQ/dq3 -PMEe-cA/ foliculo+primario2.jpg
Posteriormente, se produce la formación de la cavidad del folículo, y el folículo se
denomina antral o terciarios, estos folículos antrales se pueden encontrar en el
ovario bovino con diámetros comprendidos en el rango de 0.1 a 20 mm
(Fernández, 2003). Los folículos terciarios se caracterizan por estar rodeados de
varias capas cúbicas de células de la granulosa que comienzan a secretar un
trasudado que se denomina líquido folicular, que al acumularse produce un
reordenamiento de las mismas en células del cúmulo y murales (Gigli, Russo y
Agüero 2006).
Fig. 4. Folículo terciario. Las células de la granulosa comienzan a secretar un trasudado que
se denomina líquido folicular.
Fuente: http://www.telmeds.org/AVIM/Aembrio/foliculo_de_De_Graaf.gif
Por último se encuentran los folículos preovulatorios o folículos de De Graaf,
los cuales son los folículos que se encuentran listos para ovular. En la yegua el
folículo preovulatorio es mayor a 35 mm, en la vaca entre 10 a 20 mm y en la
llama entre 10 a 18 mm (Gigli, Russo y Agüero, 2006).
En los mamíferos, la hembra cuenta con una reserva de ovocitos que han
interrumpido su crecimiento en los folículos primordiales, única fuente de ovocitos
para ser ovulados durante su vida reproductiva. Los folículos primordiales se
forman durante la vida fetal en bovinos (130 días), ovinos y porcinos (70 días), o
alrededor del nacimiento en roedores (Espinoza y col, 2007).
Dentro de este marco, es válido señalar que gracias
a la utilización de la
ultrasonografía, se logró determinar que el desarrollo folicular se produce de
manera periódica en las denominadas ondas de desarrollo folicular.
Lección 3. Ondas de desarrollo folicular
Una onda de desarrollo folicular
se define como el desarrollo armónico y
simultáneo de un pool de folículos antrales (terciarios) pequeños, en promedio 24
por onda con un rango de 8 a 41, funcionando en tres fases a saber:
reclutamiento, selección y dominancia folicular (Fernández, 2003). En los
bovinos durante un ciclo estral normal se puede observar la presencia de dos o
tres ondas foliculares por ciclo.
A continuación se detallan las fases que
componen las ondas de desarrollo folicular:
Reclutamiento:
Esta
fase
es un proceso regulado por
la Hormona
foliculoestimulante (FSH), consiste en que un conjunto de folículos antrales
tempranos (2-3 mm de diámetro) comienzan a crecer en un medio con suficiente
soporte gonadotrófico que les permita progresar a la ovulación. El reclutamiento
folicular se refiere a la formación de una población de folículos antrales de donde
uno o varios, dependiendo de la especie (monotoca o politoca), es seleccionado
para la ovulación. En cada ciclo ovárico es reclutado un grupo de folículos
primordiales que crecen de manera continua debido a los incrementos en las
concentraciones de FSH. Cuando la FSH alcanza el pico de concentración, los
folículos más grandes de la onda tienen un diámetro de aproximadamente cuatro
(4) mm (Espinoza, et al, 2007).
Lección 4. Selección.
En este proceso uno de los folículos que ha iniciado su crecimiento, evade la
atresia y adquiere la competencia para alcanzar la ovulación. La selección folicular
ocurre al final de la fase común de crecimiento. El folículo dominante crece a una
tasa constante y el resto de los folículos subordinados sufren atresia o
temporalmente crecen a una velocidad menor y posteriormente dejan de hacerlo.
A este fenómeno se le ha denominado desviación. La desviación durante la oleada
folicular en bovinos empieza con una reducción en la tasa de crecimiento de los
folículos subordinados; en contraste, se presenta una tasa de crecimiento
constante en el folículo dominante (Espinoza, et al, 2007).
Lección 5. Dominancia.
En esta fase el folículo seleccionado inhibe o impide el reclutamiento de una
nueva serie de folículos. La dominancia folicular en la vaca se caracteriza por dos
fenómenos: la divergencia en el crecimiento entre el folículo mayor y el segundo
mayor; y una disminución del número de folículos perqueños correlacionada con el
crecimiento del folículo mayor.
Fuente: http://www.scielo.org.ve/img/fbpe/inci/v32n2/art06fig1.jpg
Fig. 5. Dinámica folicular durante un ciclo estral bovino
El desarrollo folicular es controlado por diversas hormonas y proteínas
provenientes de la hipófisis, el cuerpo lúteo y de los folículos. De acuerdo con Bó
(2006), se ha observado que cada onda folicular está siempre precedida por un
pico de FSH, razón por la cual se cree que este pico es fundamental para que los
folículos antrales pequeños ingresen al pool de folículos grandes que se observan
en la onda folicular. Una vez se ha dado inicio a la onda, el folículo dominante
comienza a producir grandes cantidades de estradiol e inhibina que actuarán a
nivel hipotalámico-hipofisiario inhibiendo la liberación de FSH, con poca FSH
circulante los folículos subordinados comienzan a regresar. Al mismo tiempo, el
folículo dominante puede seguir creciendo debido a que es más eficiente en la
utilización de la baja FSH circulante y la adquisición de receptores de Hormona
luteinizante (LH) en las células de la granulosa (además de los que se encuentran
en la teca).
CAPITULO 2. INDUCCIÓN Y SINCRONIZACIÓN DE CELO EN LAS
ESPECIES DOMÉSTICAS.
Lección 6. Técnicas de sincronización de celo.
El conocimiento de la dinámica folicular es importante para la aplicación y el éxito
de sincronización de celos. Actualmente existen tres (3) tipos de técnicas de
sincronización: Prostaglandina F2 alfa (PGF2∞) y sus análogos; Progesterona o
progestágenos sintéticos combinados con estrógenos y gonadotropina coriónica
equina (eCG o PMSG); Hormona liberadora de Gonadotropinas (GnRH).
Técnicas de sincronización mediante el uso de prostaglandinas y sus
análogos. Las técnicas de sincronización de celos con PGF2∞ o sus análogos; se
emplean rutinariamente en las diversas especies domésticas. Se basan en la
capacidad de las prostaglandinas para provocar la regresión morfológica y
funcional del cuerpo lúteo del ciclo (luteolisis); como consecuencia de su acción
sólo se puede aplicar en animales cíclicos y durante la fase luteal del ciclo.
(Fernández, 2003). El tiempo que tarda en producirse el celo y la ovulación desde
que baja el nivel de progesterona es inversamente proporcional al tamaño del
folículo dominante en el momento de aplicación de la prostaglandina.
Técnicas de sincronización mediante el uso de progestágenos. Este método
de inducción y sincronización de celos se desarrolló a principios de los años
setenta, mucho antes de tener un conocimiento exacto de la dinámica folicular. La
mayoría de productos viene en forma de dispositivo (Intravaginal o auricular). Su
mecanismo de acción se basa en la simulación de la acción del cuerpo lúteo, por
ende, el progestágeno o progesterona tiene como misión producir un bloqueo del
hipotálamo, de manera que impedirá, independientemente de la existencia de un
cuerpo lúteo, que se produzcan ovulaciones mientras que los animales conserven
el dispositivo. Además provoca una repleción de gonadotrofinas hipofisarias que
se liberan bruscamente al retirarlo.
Técnicas de sincronización mediante el uso de GnRH. La propuesta básica de
este método consiste en lograr sincronizar eficientemente una onda folicular para
llevarla a la ovulación en un momento esperado, permitiendo inseminar los
animales aún sin presencia de celo evidente, ya que lo que interesa es tener un
óvulo en el útero y no un celo en el animal (Fernández, 2003).
A continuación se describen los programas de sincronización de celo en las
principales especies domésticas.
Lección 7. Sincronización de celo en bovinos.
La sincronización de celo en bovinos, ha sido un tema de varios estudios
encaminados a estandarizar una técnica que permita la manipulación del ciclo
estral con el objetivo de programar los eventos reproductivos del hato o de la
explotación y con ello contribuir a mejorar la eficiencia reproductiva.
Los primeros intentos y ensayos de manipulación del ciclo estral en bovinos fueron
realizados en 1948, en ese entonces Christian y Casida utilizaron la progesterona
con el fin de bloquear la función reproductiva de los animales tratados, una vez
suspendieron su aplicación, un gran número de los animales presentaron
síntomas de celo Posteriormente, Wiltbank y Kasson en el año de 1968,
adicionaron
al inicio del tratamiento con progesterona, la aplicación de un
estrógeno: el Valerato de estradiol, el cuál cumplia una función de efecto
luteolítico, con lo cual se incrementó el porcentaje de presentación de celos en los
animales tratados, además de permitir una reducción en el tiempo de aplicación de
la progesterona (Becaluba 2007).
Posteriomente, en el año de 1972, Rowson y col. (citado por Becaluba, 2007)
ensayaron un protocolo para la
sincronización de celo en bovinos utilizando
Prostaglandina F2α, la cual gracias a un efecto luteolítico inducia la regresión del
cuerpo lúteo, y permitía el inicio de un nuevo ciclo estral.
Con base en estos estudios previos, es que se han establecido una gran variedad
de protocolos encaminados a la manipulación del ciclo estral y a su duración, ya
sea acortando la fase luteal (agentes luteolíticos) o alargando la fase luteal
(agentes progestágenos).
Sincronización con Prostaglandina F2α. La utilización de la PGF2α y sus
análogos en los programas de sincronización de celo, ha sido ampliamente
desarrollada en los últimos años, en gran parte debido a los bajos costos que
representa su uso. Su efecto fisiológico consiste en causar la regresión del Cuerpo
lúteo (CL) a partir del día 5 del ciclo estral y su efecto luteolítico es máximo entre
los días 12 y 17 del ciclo. Sin embargo, el estadio del folículo dominante en el
momento de la aplicación de la PGF2α va a producir una variación del momento
del celo y la ovulación de 2 a 7 d.
Los tratamientos tradicionales con PGF2α
utilizan dos dosis con 11 a 14 días de intervalo y detección por 5-7 días después
de la segunda aplicación de PGF2α. Teóricamente, estas dos aplicaciones de
PGF2α son efectivas cuando hay una gran proporción de hembras ciclando y un
80% de ellas deberían ser observadas en celo, pero los problemas de detección
de celos hace que el porcentaje real de hembras detectadas en celo, no superen
el 50% (Bó, et al, 2004).
Sincronización con GnRH y PGF. Protocolo Ovsynch. La utilización de GnRH
ha sido un tratamiento hormonal muy popular de control del desarrollo folicular en
los últimos tiempos. Se ha demostrado que la GnRH inducirá la ovulación del
folículo dominante presente al momento del tratamiento, y se han desarrollado
protocolos que utilizan GnRH y PGF2α para IATF en ganado de carne o leche.
Este protocolo es conocido con el nombre de Ovsynch, y se explicará en en
capitulo de Inseminación a tiempo fijo (IATF).
Sincronización con Progestágenos. Los progestágenos son compuestos
similares a la progesterona que están en el mercado desde hace varios años y se
usan para sincronizar el celo en programas de IATF. El uso de estrógenos y
progestágenos para controlar el desarrollo folicular se basa en el potente efecto de
la combinación de estos esteroides sobre las gonadotrofinas. El protocolo más
utilizado, consiste en administrar 2 mg de benzoato de estradiol (BE) por vía
intramuscular (IM) en el momento de la inserción del dispositivo intravaginal con
progesterona (P4; día 0), para sincronizar el desarrollo folicular. En el día 7 se
retira el dispositivo intravaginal y se administra PGF2α (para inducir la luteólisis), y
en el día 8 se coloca 1 mg de BE para sincronizar la ovulación. Se realiza la IATF
entre las 52 y 56 h del retiro del dispositivo ya que la mayoría de los animales
ovulan en promedio a las 66 h (Bó, et al, 2004).
Lección 8. Inducción y sincronización de celo en equinos.
En los equinos la sincronización de celo, se realiza con el fin de suprimir el estro
en aquellas yeguas de exposición o competencia. Así como para inducir en celo,
en yeguas con problemas de anestro o celos silentes.
Sincronización de celo mediante el uso de progestágenos. La sincronización
de celo en las yeguas se puede hacer mediante el uso de progestágenos de usos
oral, uno de los progestágenos más utilizados es el altrenogest, la dosis a
administrar es de 0.044 mg/kg una vez al día. La duración del tratamiento depende
del objetivo que se quiera lograr mediante el mismo (Intervet, 2009).
Si se desea adelantar o acelerar la presentación del celo regular, la yegua debe
estar en celo contar con uno o varios folículos de 20 mm o más de diámetro en
alguno de sus ovarios, si esto es así, se suministra altrenogest, durante un periodo
de 15 días. Para la sincronización del celo en yeguas cíclicas, se debe suministrar
altrenogest, durante 10 días, posteriormente
al día 11 se aplica una dosis de
prostaglandina con el fin de causar la lisis de algún cuerpo lúteo que produzca
progesterona endógena. Si se desea suprimir la presentación del celo, en yeguas
que van a participar en
eventos deportivos (salto, carreras, etc.). Existen dos
protocolos de tratamiento:
1. Administrar altrenogest durante 15 días y luego permitir a la yegua entrar en
calor. Después de la ovulación, se presenta el diestro, que dura aprox. 2
semanas y durante el cual no se requiere la administración de altrenogest.
Después de transcurridas las 2 semanas se inicia nuevamente el
tratamiento durante 15 días. Este tratamiento puede adaptarse a cada
yegua en particular.
2. Si
se
quiere
suprimir
el
celo
una
sola
vez:
Se debe iniciar el tratamiento por lo menos 4 días antes de la competencia
(0.044
mg/kg
p.v.)
e
interrumpirlo
después
de
la
misma.
O se puede administrar altrenogest durante 60 días seguidos e interrumpir
el tratamiento para permitir a la yegua entrar en calor. Una vez terminado
éste,
se puede iniciar nuevamente la administración del producto.
El tratamiento puede iniciarse en cualquier día, sin importar si la yegua está
en calor o no. Si la yegua esta en calor cuando se empieza a administrar
altrenogest, tardará por lo menos 3 días después de iniciado el mismo, en
salirse de calor (Intervet, 2009).
Sincronización de celo mediante el uso de dispositivos intravaginales. Se
han realizado diversos estudios para evaluar el uso de dispositivos intravaginales
en los programas de sincronización de celo en yeguas, y estos han tenido diversos
resultados. Uno de los protocolos más utilizados es aquel en el que se utiliza el
dispositivo intravaginal de uso bovino que contienen progesterona de lenta
liberación (PRID®, DIV-B®, TRIUB®) ya que no existen comercialmente
dispositivos para uso en equinos. El dispositivo debe insertarse via vaginal de la
manera más higiénica posible, y se mantiene por un tiempo de doce (12) días, al
cabo al cabo de los cuales es retirado. El celo puede observarse a partir de las 24
hasta las 94 horas después del retiro del dispositivo (Wilde, De la Vega y Cruz,
2002).
Lección 9. Inducción y sincronización de celo en ovinos
En Colombia, la explotación ovina se ha desarrollado de una manera tradicional,
con un manejo de tipo extensivo y poco tecnificado, sin embargo, gracias al
avance de la biotecnología y a la búsqueda de nuevas alternativas y nuevos
mercados, este tipo de explotación ha adquirido gran
importancia durante los
últimos años, conllevando a las búsqueda de alternativas para incrementar la
eficiencia y productividad de la explotación.
En este sentido, la sincronización de celo se constituye en una herramienta
biotecnológica que recién se está implementando en nuestro país, aunque está es
una práctica tradicional en otros países con vocación ovina, tales como Uruguay y
México.
A continuación se describen los principales métodos de sincronización de celo en
ovinos.
Sincronización mediante el uso de prostaglandinas. Consiste en la aplicación
de dos dosis de prostaglandina F2alfa (PGF2∞) con un intervalo de 10 días entre
la primera y la segunda aplicación. La presentación del celo se puede dar entre las
40 y 70 horas posteriores a la última dosis aplicada (Raso, Buratovich y Villa,
2004).
.
Sincronización mediante el uso de progestágenos. Consiste en la aplicación
intravaginal
de
dispositivos
o
esponjas
impregnados
con
acetato
de
medroxiprogesterona (MAP), el cual es un analógo sintético de la progesterona,
estos se deben dejar durante 12 días consecutivos, al cabo de los cuales se retira
el dispositivo y se aplican 300 Unidades internacionales (UI) de Gonadotropina
coriónica equina (eCG o PMSG). La presentación del celo se dará entre las 24 y
72 horas posteriores a la aplicación de la eCG (Raso, Buratovich y Villa, 2004). En
nuestro país no se encuentran disponibles comercialmente este tipo de
dispositivos, por lo cual muchas veces son elaborados con espuma y nilón, y luego
son impregnados con el MAP.
Lección 10. Inducción y sincronización de celo en porcinos
La sincronización de celo en cerdas se pretende utilizar al máximo las
instalaciones de una granja porcina, sobre todo en aquellas de ciclo completo, ya
que al sincronizar en celo y por ende que entren en calor un grupo de cerdas para
que se les de servicio, permitirá conocer con anticipación algunos eventos tales
como: fecha probable de parto, fecha probable de destete, fecha probable de
venta (Ángeles, 1999). A continuación se señalan algunos de los protocolos de
inducción de celo en las cerdas:
Sincronización de celo mediante el uso de progestágenos por vía oral. En los
programas de sincronización de celo en cerdas prepuberes se ha utilizado el
altrenogest, el cual es un progestágeno sintético de uso oral (Mazarri, 1984). En
cerdas nulíparas que se encuentren ciclando la dosis a suministrar es de 20 mg
diarios durante 18 días consecutivos, al cabo de los cuales se suspende su
suministro y se dará lugar a la presentación del celo de 3 a 5 días después. En
cerdas multíparas el tratamiento se inicia en el momento del destete,
suministrando 20 mg diarios durante 5 días consecutivos, el celo se podrá
presentar entre los 2 y 3 días después de que se suspende el tratamiento.
Es importante señalar que la presentación del celo podrá variar de acuerdo a las
condiciones medioambientales y al manejo productivo y reproductivo de cada
explicación (Intervet, 2009).
Sincronización de celo mediante el uso de agentes luteolíticos. El uso de la
prostaglandina como sincronizador de celo en los porcinos es muy limitado. Lo
anterior, debido a que en la cerda, el cuerpo lúteo solo es sensible a la
prostaglandina a partir del día 12. Si se aplica prostaglandina en cerdas la
respuesta dependerá de la fase del ciclo estral en la que se encuentre el animal.
Sincronización de celo mediante el uso de gonadotropinas. Para la
sincronización del celo en cerdas también se pueden utilizar productos de origen
esteroidal, tales como eCG o PMSG (gonadotropina coriónica equina) que
contiene FSH (Hormona folículo estimulante). La dosis es de 400 UI por vía
parenteral y 96 horas después se aplican 200 UI (misma vía) de hcG
(gonadotropina coriónica humana que contiene LH (hormona luteinizante) . La
presentación del estro ocurrirá de 40 a 42 horas después del tratamiento (Ángeles,
1999). Otro protocolo mediante el uso de gonadotropinas, se realiza mediante la
aplicación de 1250 Unidades Internacionales (UI) de gonadotropina coriónica
equina (eCG) (Folligon®; Novormon®) 24h después del destete. Posteriormente, a
las
72 horas de aplicación de esa primera inyección se administran 750UI de
Gonadotropina Coriónica Humana (hCG). A partir de los dos días después de la
inyección con eCG se procede a detectar el celo. (Martínez y cols. 2002)
CAPITULO 3. PROGRAMAS DE INSEMINACION ARTIFICIAL A
TIEMPO FIJO
Lección 11. Aspectos generales.
El entorno actual en el que se desarrolla la ganadería, con la globalización de los
mercados y el alto grado de competitividad, exigen al productor el mejoramiento
en sus condiciones de productividad y eficiencia. Asimismo, la declaración de país
libre de aftosa, da lugar a la apertura de nuevos mercados y por consiguiente es
necesaria la búsqueda de alternativas para mejorar e incrementar la rentabilidad
de las explotaciones. De acuerdo a lo señalado por Cutaia (2006), la optimización
de la eficiencia reproductiva es uno de los principales factores que contribuyen
para mejorar las ganancias. A pesar de haber consenso general entre los
productores y técnicos de que la Inseminación Artificial (IA) es la técnica más
apropiada para acelerar el avance genético, el porcentaje de las explotaciones
bovinas incluidas en estos esquemas en el mundo continúa siendo bajo. Las
principales limitaciones para el empleo de la IA en el ganado manejado en
condiciones extensivas son fallas en la detección de celos, anestro posparto y
pubertad tardía.
Ventajas de la IATF
LA IATF presenta muchas ventajas entre las cuales se resaltan (Ben, Goitia y
Mujica, 2006):
 Una concentración del trabajo reproductivo y mayor aprovechamiento del
personal de manejo en otras labores.
 Manejo de lotes homogéneos al mercado.
 Proyección y programación de partos.
 Permite la utilización de toros de alta genética
 Permite la disminución del número de reproductores a tener en la
ganadería.
 Evita las labores de detección de celo y las perdidas consecuentes por la
falla en la detección del mismo.

Disminución del pisoteo de los potreros y del movimiento de los lotes.
Lección 12. Protocolo de sincronización de celo mediante el uso de GnRH
(protocolo Ovsynch).
Uno de los protocolos de sincronización e IATF de mayor uso a nivel mundial es el
Ovsynch, el cuál se basa en la utilización de GnRH.
Tabla 1. Protocolo Ovsynch
DIA 0
Aplicación GnRH
DIA 7
Aplicar 1 dosis de PGF2∞
DIA 9
Aplicación GnRH
DIA 10
IATF (16 a 24 horas de la segunda aplicación de GnRH
retirado el dispositivo)
GnRH: Hormona liberadora de gonadotropinas
La primera dosis de GnRH se da para inducir la ovulación y promover la formación
de un nuevo cuerpo lúteo (CL) y una nueva onda folicular, es decir, lo que se hace
es devolver a la vaca al comienzo de un nuevo ciclo estral. La prostaglandina
suministrada el día 7, causa la luteolisis o regresión de ese CL, y la GnRH
suministrada la día 9, induce la ovulación del nuevo folículo. La inseminación se
lleva a cabo alas 16 o 24 horas posteriores a la última dosis de GnRH (López,
2007).
El protocolo “Ovsynch” ha sido más eficaz en vacas lecheras en lactancia que en
novillas, siendo aún desconocida la causa de estas diferencias pero la ovulación
en respuesta a la primera aplicación de GnRH ocurrió en el 85% de las vacas y en
solo el 54% de las vaquillas (Pursley et al., 1995, citado por Huanca, 2001). Sin
embargo, este protocolo de sincronización ha sido ampliamente usado en diversos
establecimientos ganaderos de EEUU y de América latina.
Fuente: http://www.abspecplan.com.br/upload/imagens/06-02-2007_iatf_figura01.jpg
Fig. 6. Protocolo Ovsynch
Con el protocolo Ovsynch, la mayoría de los animales no muestran celo durante el
tratamiento.
Lección 13. Variantes del protocolo ovsynch
Se han realizado diversos estudios para evaluar las tasas de preñez, mediante la
modificación del tiempo en que se realiza la IATF, uno de estos es el denominado
protocolo “Cosynch”, en el cual la IATF se realiza al tiempo que se aplica la
segunda dosis de GnRH al día 9. Sin embargo, las tasas de preñez obtenidas
mediante este protocolo han sido menores, que las obtenidas con el protocolo
“Ovsynch”.
Tabla 2. Protocolo Cosynch
DIA 0
Aplicación GnRH
DIA 7
Aplicar 1 dosis de PGF2∞
DIA 9
Aplicación GnRH e IATF
Asimismo se ha evaluado, otra variante del Cosynch, con la aplicación de la
inseminación y la segunda dosis de GnRH 72 horas después de la aplicación de la
Prostaglandina. El objetivo es dar lugar a un día mas para el desarrollo del folículo
y dar lugar a una mayor maduración del ovocito y la ovulación de un folículo mas
grande. Sin embargo se debe estar en observación de los animales que entren en
celo durante el protocolo para proceder a inseminarlos.
Tabla 3. Protocolo Cosynch 72 horas
DIA 0
Aplicación GnRH
DIA 7
Aplicar 1 dosis de PGF2∞
DIA 10
Aplicación GnRH e IATF (72 horas después de la PGF2∞
Fuente: http://www.abspecplan.com.br/upload/imagens/06-02-2007_iatf_figura04.jpg
Fig. 7. Protocolo Cosynch
Lección 14. Protocolo de sincronización de celo, mediante el uso de
dispositivos intravaginales.
Existe en el mercado una gran variedad de dispositivos intravaginales, los cuales
varían en forma, concentración de progesterona, y numero de usos. Algunos son:
DIV-B®, TRIUB®, CIDR®, PRID®. Asimismo se han experimentado múltiples
portocolos, sin embargo, datos reportados en la bibliografía indican son dos los
protocolos que han arrojado mejores resultados a la IATF en vacas en lactancia
(Veneranda et al., 2006, citado por Cutaia, 2006).
Tabla 4. Protocolo para novillas.
DIA 0
Dispositivo + 2mg de BE + 1 dosis de PGF2∞
DIA 8
Retirar dispositivo + 1 dosis de PGF2∞
DIA 9
1 mg de BE
DIA 10
IATF (52 a 56 horas de retirado el dispositivo)
DIA 28
Inicio de la detección de celos e I.A
DIA 38
Fin de la detección de celos
DIA 42
Diagnóstico de preñez a las que no retornaron al celo
(reinicio del tratamiento a las que quedaron vacías)
BE: Benzoato de estradiol
Resultados Esperados:
 Porcentaje de preñez esperado a la IATF:
50 a 60 %
 Porcentaje de retorno/vacías:
60%
 Porcentaje de concepción 2da IA:
50%
 Porcentaje de Preñez General (2 ciclos):
70 a 80 %
 Días destinados a la detección de celos:
10
Tabla 5. Protocolos para vacas en lactancia.
DIA 0
Dispositivo + 2mg de BE
DIA 8
Retirar dispositivo + 1 dosis de PGF2∞ + 400 UI eCG
DIA 9
1 mg de BE
DIA 10
IATF (58 a 62 horas de retirado el dispositivo)
DIA 28
Inicio de la detección de celos e IA
DIA 38
Fin de la detección de celos
DIA 42
Diagnóstico de preñez a las que no retornaron al celo
(reinicio del tratamiento a las que quedaron vacías)
BE: Benzoato de estradiol
eCG: Gonadotropina coriónica equina.
Resultados Esperados:
 Porcentaje de preñez esperado a la IATF:
35 a 45 %
 Porcentaje de retorno/vacías:
40%
 Porcentaje de concepción 2da IA:
40%
 Porcentaje de Preñez General (2 ciclos):
45 a 55 %
 Días destinados a las detección de celos:
10
Otro protocolo experimentado hace uso de la GnRH.
Tabla 6. Dispositivo intravaginal + GnRH.
DIA 0
Dispositivo + 2mg de BE
DIA 7
Retirar dispositivo + 1 dosis de PGF2∞
DIA 9
Aplicar GnRH y 12 horas después I.A
DIA 27
Inicio de la detección de celos e IA
DIA 37
Fin de la detección de celos
DIA 41
Diagnóstico de preñez a las que no retornaron al celo
(reinicio del tratamiento a las que quedaron vacías)
GnRH: Hormona liberadora de Gonadotropinas
Resultados Esperados:
 Porcentaje de preñez esperado a la IATF:
30 a 40 %
 Porcentaje de retorno/vacías:
40%
 Porcentaje de concepción 2da IA:
40%
 Porcentaje de Preñez General (2 ciclos):
40 a 50 %
 Días destinados a las detección de celos:
10
Protocolos de sincronización de celo para IATF y resincronización de los
retornos al celo.
Tabla 7. Protocolos de sincronización de celo para IATF y resincronización Novillas
DIA 0
Dispositivo + 2mg de BE + 1 dosis de PGF2∞
DIA 7
Retirar dispositivo + 1 dosis de PGF2∞
DIA 9
Aplicar 1 mg de BE
DIA 10
IATF (52 a 56 horas de retirado el dispositivo)
DIA 23
Reinserción del Dispositivo
DIA 30
Retirar dispositivo
DIA 31
Inicio de la detección de celos e IA
DIA 35
Fin de la detección de celos
DIA 42
Diagnóstico de preñez a las que no retornaron al celo
(reinicio del tratamiento a las que quedaron vacías)
BE: Benzoato de estradiol
Resultados Esperados:
 Porcentaje de preñez esperado a la IATF:
50 a 60 %
 Porcentaje de retorno/vacías:
80%
 Porcentaje de concepción 2da IA:
50%
 Porcentaje de Preñez General (2 ciclos):
75 a 85 %
 Días destinados a las detección de celos:
5
Tabla 8. Protocolos de sincronización de celo para IATF y resincronización Vacas en
lactancia.
DIA 0
Dispositivo + 2mg de BE
DIA 7
Retirar dispositivo + 1 dosis de PGF2∞ + 400 UI eCG
DIA 9
Aplicar 1 mg de BE
DIA 10
IATF (58 a 62 horas de retirado el dispositivo)
DIA 23
Reinserción del Dispositivo + 1 mg de BE
DIA 30
Retirar dispositivo
DIA 31
Inicio de la detección de celos e IA
DIA 35
Fin de la detección de celos
DIA 42
Diagnóstico de preñez a las que no retornaron al celo
(reinicio del tratamiento a las que quedaron vacías)
BE: Benzoato de estradiol
eCG: Gonadotropina coriónica equina.
Resultados Esperados:
 Porcentaje de preñez esperado a la IATF:
35 a 45 %
 Porcentaje de retorno/vacías:
50%
 Porcentaje de concepción 2da IA:
40%
 Porcentaje de Preñez General (2 ciclos):
50 a 55 %
 Días destinados a la detección de celos:
5
Lección
15.
Protocolos
de
sincronización
de
celo
para
IATF
y
resincronización de los retornos al celo para una segunda IATF.
Tabla 9. Protocolos de sincronización de celo para IATF y resincronización de los retornos
al celo para una segunda IATF Novillas
DIA 0
Dispositivo + 2mg de BE + 1 dosis de PGF2∞
DIA 8
Retirar dispositivo + 1 dosis de PGF2∞
DIA 9
Aplicar 1 mg de BE
DIA 10
IATF (52 a 56 horas de retirado el dispositivo)
DIA 26
Reinserción del Dispositivo
DIA 31
GnRH
DIA 38
Diagnóstico de preñez por Ultrasonografía + 1 dosis de
PGF2∞ a las novillas vacías
DIA 40
GnRH + IATF (12 horas después de la GnRH)
BE: Benzoato de estradiol
GnRH: Hormona liberadora de gonadotropinas
Resultados Esperados:
 Porcentaje de preñez esperado a la IATF:
50 a 60 %
 Porcentaje de retorno/vacías:
100%
 Porcentaje de preñex 2da IATF:
50%
 Porcentaje de Preñez General (2 ciclos):
75 a 85 %
 Días destinados a las detección de celos:
0
Tabla 10. Protocolos de sincronización de celo para IATF y resincronización de los retornos
al celo para una segunda IATF Vacas en lactancia.
DIA 0
Dispositivo + 2mg de BE
DIA 8
Retirar dispositivo + 1 dosis de PGF2∞ + 400 UI eCG
DIA 9
Aplicar 1 mg de BE
DIA 10
IATF (58 a 62 horas de retirado el dispositivo)
DIA 26
Reinserción del Dispositivo
DIA 31
Aplicación de GnRH
DIA 38
Inicio de la detección de celos e IA
DIA 40
Diagnóstico de preñez por Ultrasonografía + 1 dosis de
PGF2∞ a las novillas vacías
DIA 42
GnRH + IATF (12 horas después de la GnRH)
BE: Benzoato de estradiol
GnRH: Hormona liberadora de gonadotropinas
eCG: Gonadotropina coriónica equina.
Resultados Esperados:
 Porcentaje de preñez esperado a la IATF:
35 a 45 %
 Porcentaje de retorno/vacías:
100%
 Porcentaje de concepción 2da IA:
40%
 Porcentaje de Preñez General (2 ciclos):
65 a 65 %
 Días destinados a las detección de celos:
0
Por último, es importante señalar que la sincronización de celo en ganado bos
indicus, muestra resultados muy variables, tal como lo reporta Salgado, González
y Simanca (2007),
según los cuales los porcentajes de preñez mediante IATF
pueden variar desde 31,4% hasta 62%. Lo anterior, debido a la intervención de
múltiples variables (Técnica, operario, animales, etc) que pueden afectar el
resultado final del programa de sincronización.
UNIDAD 2. INSEMINACION ARTIFICIAL Y
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
OBJETIVOS
•
•
•
Identificar el proceso de colecta y evaluación del semen.
Conocer y aplicar el proceso de inseminación artificial en las principales
especies domésticas.
Comprender las técnicas, los procesos, las ventajas, las desventajas, los
elementos y los procesos de la transferencia de embriones.
ESTRUCTURA
CAPITULO 1. COLECTA Y EVALUACION DE SEMEN.
Lección 16. Aspectos generales.
Lección 17. Evaluación de la libido.
Lección 18. Colecta y evaluación de semen.
Lección 19. Colecta y evaluación de semen bovino y ovino.
Lección 20. Colecta y evaluación de semen porcino.
CAPITULO 2. INSEMINACION ARTIFICIAL.
Lección 21. Historia de la inseminación artificial
Lección 22. Técnica de Inseminación artificial.
Lección 23. Técnica de Inseminación artificial en equinos.
Lección 24. Técnica de Inseminación artificial en ovinos.
Lección 25. Técnica de Inseminación artificial en porcinos.
CAPITULO 3. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
Lección 26. Aspectos generales
Lección 27. Selección y manejo de donantes y receptoras.
Lección 28. Técnica de transferencia de embriones.
Lección 29. Criopreservación de embriones.
Lección 30. Transferencia de embriones en equinos.
UNIDAD 2. INSEMINACION ARTIFICIAL Y
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
CAPITULO 1. COLECTA Y EVALUACION DE SEMEN.
Lección 16. Aspectos generales.
Los programas de inseminación artificial fundamentan su técnica en la
transferencia de semen (fresco, congelado o refrigerado) al tracto reproductivo de
la hembra. En tal sentido, se requiere de una adecuado proceso de colecta y
evaluación de la calidad del semen, con el fin de garantizar que el mismo pueda
lograr la fertilización del ovulo de la hembra.
Todo programa de colecta de semen, requiere la evaluación del reproductor
(evaluación Andrológica), con el fin de descartar problema de tipo sanitario y
reproductivo que puedan disminuir o afectar el éxito del programa reproductivo.
La evaluación andrológica
involucra tres pasos fundamentales: la evaluación
física (conformación general, órganos sexuales internos y externos), la evaluación
de la libido, y la colecta y evaluación de semen.
Evaluación física
El examen físico incluye la observación del toro en movimiento, la conformación
de las patas y la condición corporal general. Una vez que el toro es confinado, la
evaluación física continúa con una observación general y un examen de los
órganos sexuales internos y externos de los ojos. Durante la época reproductiva,
los machos tendrán que caminar mucho (especialmente los toros cebuinos
manejados en explotación extensiva), por lo que la sanidad de las patas y manos
es esencial para una monta exitosa o para un proceso de colecta adecuado.
(Larson, 2007).
Ojos. Los ojos son otro factor importante en el proceso de evaluación, ya que el
macho, especialmente el toro, se guía por el estimulo visual para identificar las
hembras en celo.
Saco escrotal y cordón espermático. Se debe observar la forma e integridad del
escroto, su suavidad al tacto, verificar la presencia de cicatrices que evidencien
traumatismos o daños severos causados por garrapatas o gusaneras. El cordón
espermático se debe palpar en toda su longitud,
no debe ser muy corto de
manera que acerque los testículos al abdomen ni tan largo y colgante que los
predisponga a constantes traumatismos. Lo recomendable es que el fondo del
escroto no sobrepase la línea de los corvejones (Vilanova y Ballalares, 2005).
Testículos y epidídimos. Se exploran mediante palpación minuciosa. Los
testículos deben mostrarse lisos y firmes al tacto, no presentar focos de
endurecimiento ni reblandecimiento, y su exploración no debería causar molestias
al animal. Se debe comprobar su capacidad de desplazarse hacia arriba y abajo
dentro del saco escrotal, lo cual descarta adherencias y demuestra una buena
regulación de la temperatura testicular. Este aspecto es muy importante ya que
testículos sometidos durante ciertos períodos a temperaturas elevadas como
resultado de infecciones crónicas febriles podrían desarrollar un cuadro de
degeneración testicular, lo cual podría ser motivo de descarte del macho. Con
relación a los epidídimos, se deben verificar y examinar cuidadosamente sus tres
porciones (cabeza, cuerpo y cola), las cuales deberán presentar una consistencia
firme y homogénea. Debe descartarse la presencia de calor, dolor, aumentos de
volumen, adherencias, etc (Vilanova y Ballalares, 2005).
Medidas testiculares. Están representadas por el perímetro escrotal o
circunferencia escrotal y la altura testicular. Ambas medidas representan un
elemento muy importante a la hora de seleccionar un toro, ya que el tamaño de los
testículos ha sido asociado positivamente con la producción de espermatozoides.
El tamaño testicular medido a través de la circunferencia escrotal se constituye en
el principal elemento para la selección de los toros. El tamaño de los testículos se
correlaciona positivamente con la producción espermática e influye en la
maduración sexual más temprana de sus hijos (machos y hembras), lo que
determina que sea el factor de mayor importancia en evaluación y selección de
reproductores. En este sentido, las hembras hijas de machos con un mayor
tamaño testicular, alcanzarán más temprano la pubertad, tendrán un parto con una
edad menor y por ende llegaran más temprano a la producción. la bolsa escrotal
debe observarse para identificar que no haya lesiones o traumatismos.
Pene y prepucio. El pene se explora por palpación bajo la piel del abdomen,
desde la inserción del escroto y en dirección al ombligo, siendo muy importante
observarlo directamente en el momento de la erección o cuando se exterioriza
para la colección de semen. Se debe observar la conformación del prepucio, lo
ideal es que o esté muy penduloso, ya que puede lesionarse y causar problemas
de infección o inflamación que pueden causar el cierre del orifico prepucial
causando irritación por acumulación de la orina.
Posteriormente debe realizarse un examen de los órganos sexuales internos,
mediante
palpación rectal.
Mediante
este examen es posible identificar
anormalidades en las estructuras internas palpables (uretra pelviana, próstata,
vesículas seminales). En estos órganos deberá descartarse la presencia de focos
de endurecimiento o reblandecimiento, así como calor o aumentos de tamaño
dolorosos o no a la palpación
(Vilanova y Ballalares, 2005). Cuando existen
problemas infecciosos (actinomyces, brucelosis, entre otras) a nivel reproductivo,
casi siempre se produce inflamación de las vesículas seminales (vesiculitis). Es
necesario identificar este tipo anormalidades y en caso de confirmarse con un
examen de laboratorio debe tratarse medicamente o eliminarse estos animales.
Fuente: Boletín informativo del Serida N° 2
Fig. 8. Órganos internos del aparato reproductor masculino.
Asimismo se debe realizar la toma de muestras para el envío al laboratorio, con el
fin de descartar enfermedades que puedan afectar la reproducción, tales como:
leucosis,
brucelosis,
Diarrea viral bovina, Rinotraqueitis infecciosa bovina,
tricomoniasis, leptospirosis, neospora, etc. Para esto se toma una muestra de
sangre en un tubo sin anticoagulante, y se hace un lavado prepucial
(tricomoniasis, vibriosis), estas muestras deben ser enviadas al laboratorio antes
de 8 horas para evitar el daño de las mismas y falla en el diagnóstico.
Lección 17. Evaluación de la libido
La evaluación de la libido se realiza en animales que van a servir como
reproductores para monta directa. Es necesario con el fin de evaluar sin el macho
va a servir para montar a las hembras en celo.
Fuente: http://www.serbiotec.com.ar/images/Celo.JPG
Fig. 9. La libido representa el impulso sexual del macho.
La libido ó impulso sexual, es una característica de comportamiento que se puede
medir. Las pruebas se basan generalmente en la explotación de varias ó más de
los siguientes hallazgos (Chenowet, 2003):
1. La libido en toros tiene un gran componente genético.
2. Los toros son polígamos y tienden a distribuir sus servicios entre
hembras receptivas.
3. El más grande estímulo único para que un toro trate de montar y
servir es el tren posterior inmóvil de una hembra, ó algo que el
perciba como similar.
4. La preestimulación de los toros incrementa su respuesta sexual.
5. La competencia entre toros puede incrementar su respuesta sexual.
La prueba reportada por Chenowet (2003), está conformada por los siguientes
pasos:
 En un corral dos hembras se sujeta un grupo con hembras atadas, que no
se encuentren en celo.
 La proporción toro: vaca es de 5:2 ó 5:3.
 Se dejan en el corral por por 40 a 60 minutos.
 Se califica con base en los servicios realizados durante el período de
observación.
De acuerdo a lo observado en la prueba, los toros son clasificados en cuatro
grupos:
Grupo 1: Toros que sirven satisfactoriamente
Grupo 2: Toros que hicieron intentos de monta pero no culminaron en servicio,
debido a inexperiencia, falta de técnica de apareamiento o factores patológicos.
Grupo 3: Toros que montaron pero que no llegaron al servicio debido a falta de
cooperación de la hembra. Puede reflejar factores tales como inexperiencia baja
libido o uso de una hembra inadecuada.
Grupo 4: Toros en los que no existe registro de habilidad de monta debido a falta
de suficiente actividad para hacer una estimación.
Lección 18. Colecta y evaluación de semen
Colecta de semen.
La tercera fase en el proceso de evaluación andrológica es la colecta y la
evaluación del semen, una vez finalizada la exploración genital se procede a la
recolección de semen, la cual puede hacerse por medio de una vagina artificial o
por electroeyaculación. La vagina artificial es el método de preferencia, aunque
para usarla es necesario que el toro haya sido entrenado previamente, este es un
método fisiológico ya que imita el proceso de la monta natural. Se debe contar con
vaginas artificiales en muy buen estado de higiene y conservación, lo cual
garantiza por una parte la calidad de la muestra recogida, y por la otra, que el toro
no rechace este método. En equinos, este es el único método de colecta
disponible. En ovinos, caprinos y bovinos es muy común el uso de este método de
colecta.
El otro método es a través del electroeyaculador, el cual es un aparato que consta
de un electrodo de uso transrectal (llamado bala) conectado a una batería que
genera pequeños pulsos eléctricos, los cuales estimulan los órganos genitales
internos produciendo la emisión del semen. Antes de aplicar la electroeyaculación
se deben eliminar las heces presentes en el recto y seguidamente introducir el
electrodo debidamente lubricado. Las descargas eléctricas deben ser aplicadas
rítmicamente cada 3 a 5 segundos, seguidas de un reposo de otros 3 a 5
segundos. Debe tenerse presente que la respuesta de cada animal a la
electroeyaculación es muy particular, la cual se observa en el tiempo de
estimulación y en la cantidad de pulsos eléctricos necesarios para recolectar el
semen (Vilanova y Ballalares, 2005).
Evaluación del semen.
Una vez se ha colectado el semen se procede a realizar el análisis en laboratorio,
en el mismo se evalúan algunas características macroscópicas y microscópicas.
Características macroscópicas
 Olor: No debe tener mal olor, si lo hubiese puede ser indicativo de algún
tipo de infección.
 Color: Varía de acuerdo a la concentración espermática: puede ir desde un
líquido blanquecino claro, hasta un líquido lechoso oscuro.
 Volumen: Varía de acuerdo a la especie, en los bovinos puede obtenerse
de 2 a 12 ml por eyaculado, en los porcinos, hasta 350 ml, en
Características microscópicas
 Motilidad: masal e individual
 Morfología
 Concentración
Motilidad: La motilidad es uno de los parámetros más importantes de la analítica
seminal. Hasta hace pocos años el estudio de la motilidad espermática se hacía
exclusivamente mediante métodos semicuantitativos. Estos métodos evalúan el
porcentaje
de espermatozoides móviles, así como el tipo de movimiento que
presentaba la media de una población espermática. (Hidalgo, Tamargo y Diez,
2006).
La motilidad masal se observa colocando una pequeña gota de semen sobre una
placa portaobjetos a temperatura de 37°C y observándola en el microscopio en
aumento de 10X o 40X, allí se observa la formación de “olas”. Esta motilidad está
directamente relacionada con la concentración espermática, así a mayor cantidad
de espermatozoides, se formara una mayor cantidad de olas. Se expresa en una
escala de calificación de 1 a 5.
La motilidad individual se determina colocando una pequeña gota de semen
sobre una placa portaobjetos y sobre ella se coloca una placa cubreobjetos, y
observándola en el microscopio, en aumento de 40X. La motilidad individual mide
el porcentaje de espermatozoides que presentan un movimiento rectilíneo y
continuo. El valor se expresa en porcentaje, el valor mínimo aceptado es de 50%.
Hoy en día también existen sistemas automáticos de medición de imágenes, los
cuales se basan en la captura sucesiva de espermatozoides en movimiento
provenientes de un microscopio. Estas imágenes se digitalizan identificando las
células espermáticas que contienen la primera imagen. Luego se procede al
seguimiento de estas células en imágenes sucesivas y al establecimiento de
trayectorias
definitivas.
Las
trayectorias
se
procesan
matemáticamente,
obteniendo así resultados numéricos precisos (Hidalgo, Tamargo y Diez, 2006).
Morfología y viabilidad:
El análisis morfológico de los espermatozoides es uno de los principales
componentes de la evaluación de las características de una muestra seminal. La
valoración de la morfología del espermatozoide se basa en la relación directa que
haya entre la proporción de espermatozoides anormales en el eyaculado, el tipo
de defecto morfológico y su relación con la fertilidad in vivo de los machos
(Hidalgo, Tamargo y Diez, 2006). La evaluación se realiza a través de una tinción
con eosina-nigrosina o con tinta china.
Fuente: http://www.ansc.purdue.edu/swine/porkpage/repro/sp200204.jpg
Fig. 10. La evaluación morfológica del semen.
En la evaluación morfológica es necesario determinar la cantidad y el tipo de
anormalidades, se aceptan máximo un 30% de anormalidades.
Fuente: http://www.ivf.com/images/mb61.gif
Fig. 11. Anormalidades espermáticas.
Concentración: Existe una alta correlación significativa entre el número de
espermatozoides inseminados y la fertilidad del toro. La presencia de un mayor
número de espermatozoides, siempre y cuando sus características sean normales,
incrementa la posibilidad de fertilización. Existe una variabilidad muy grande en la
concentración de un eyaculado a otro, y de un toro a otro, siendo importante
conocer el número de espermatozoides por eyaculado, ya que de este parámetro
depende el número de hembras a inseminar (Hidalgo, Tamargo y Diez, 2006).
La concentración puede medirse por varios métodos: la espectrofotometría, la
colorimetría, la citometría de flujo y el uso de cámara de recuento celular, como
las de Bürker, Neubauer o Thoma. En nuestro país el método mas utilizado es el
de la cámara de Neubauer.
Fuente: www.thepigsite.com/.../09-03SwineConf5.jpg
Fig. 12. Medición de la concentración espermática.
Fuente: www.digilablaboratorio.com.br/.../neubauer2.jpg
Fig. 13. Hemotocitómetro o cámara de Neubauer
Lección 19. Colecta y evaluación del semen bovino y ovino
Colecta de semen por vagina artificial
La vagina artificial es una imitación de la vagina de la vaca y de la oveja, que
proporciona el estimulo térmico y mecánico para la erección del pene del macho y
que son, igualmente, necesarios para producir la eyaculación. La vagina artificial
consiste de una caperuza externa (de 50 cm x 5,5 cm para el toro, de 20 x 5,5 cm.
para el carnero y 15 x 5,5 cm. para el macho cabrío) fabricada con goma fuerte,
plástico u otro material sintético que tenga propiedades aislantes, y un conducto
interno fabricado de goma o material sintético apropiado. Después de cada uso se
debe lavar, enjuagar con agua destilada y secarla profundamente; si se pasa, por
el interior, una delgada película de alcohol al 70% en agua destilada, se secará,
luego, mejor. A continuación se llena la mitad del depósito con agua a 48-50°, a
través del tampón colocado en el lateral y con la ayuda de un embudo o jeringa de
100 ml (el calor del agua contribuirá a evaporar el alcohol). Si se llena demasiado
de agua, se saldrá, cuando se deje la vagina en posición vertical. Se debe evitar
que el agua penetre en el tubo interno ya que puede ser la causa de mortalidad de
los espermatozoides. La temperatura de la vagina artificial, deberá ser de 42-45
°C, lo que se puede controlar mediante la inserción de un termómetro limpio. Si la
vagina se encuentra demasiado fría, se debe rellenar con agua más caliente con
el fin de evitar el shock por frio.
Fuente: http://www.agrovetmarket.com/Library/Images/sawdc.jpg
Fig. 14. Colecta de semen de carnero.
Antes de la recogida de semen, se debe limpiar, cuidadosamente, el prepucio del
macho, para evitar cualquier contaminación de aquel, en los bovinos se realiza un
lavado prepucial con solución salina.
En los ovinos y caprinos, los movimientos vigorosos hacia arriba y hacia delante
significan que se ha producido la eyaculación. Se debe dejar que el macho retire el
péne de la vagina antes de intentar retirar esta (Bearden y Fuquay, 1982;
Salamón, 1990). En el bovino, se produce el denominado “golpe de riñón”, el cual
es indicativo de que la eyaculación se produjo.
Colecta de semen por electroeyaculador (estimulador eléctrico)
Existen diferentes tipos de electroeyaculadores, El aparato más comúnmente
utilizado en nuestro país es el “electrojac”. Se trata de un estimulador accionado
por baterías que proporciona una salida de 10 ó 15 voltios. Para la colección de
semen, el macho ovino y caprino se debe colocar en decúbito lateral, sobre una
mesa o en el suelo, siempre que este limpio. Se deben cortar el pelo o lana que
bordee la vaina y el prepucio se debe limpiar correctamente. La sonda se
humedece o lubrica con vaselina y se inserta en el recto a una profundidad de 1520 cm. procurando no lesionar la mucosa (Bearden y Fuquay, 1982; Salamón,
1990; Mejia y Hernández, 1996). En los bovinos, el macho debe inmovilizarse en
un brete y se debe realizar el lavado prepucial, la zona o bala se introduce vía
rectal.
En ovinos y caprinos el pene se debe extender por enderezamiento de la flexura
sigmoidea de tal forma que el glande del péne se pueda sujetar con la mano,
limpia, y liberar el péne del prepucio. Por detrás del glande se coloca una pieza de
gasa y se introduce el glande y el proceso uretral en un tubo de ensayo estéril. Lo
mejor es sujetar el péne y el tubo de ensayo con la misma mano dejando la otra
libre para dar masaje en el péne en dirección hacia delante entre para cada
estimulo eléctrico (Bearden y Fuquay, 1982; Salamón, 1990; Mejia y Hernández,
1996). Un ayudante debe presionar sobre la sonda hacia el suelo de la pelvis,
aplicándose luego cortos estímulos (3-8 segundos) a intervalos de 15-20
segundos. Después de unos cuantos estímulos fluirá la secreción de las glándulas
accesorias y luego el semen. Cuando se obtenga inicialmente grandes cantidades
de liquido claro, se deben desechar para evitar diluciones innecesarias del semen
(Bearden y Fuquay, 1982; Salamón, 1990; Mejia y Hernández, 1996).
Lección 20. Colecta y evaluación del semen porcino.
Se debe contar con una área de 9 a 15 metros cuadrados para la extracción del
semen, este lugar debe estar alejado de las instalaciones de alojamiento de los
otros animales, se debe evitar los factores de distracción para el animal. Asimismo
debe existir una superficie no deslizante para evitar golpes y fracturas de los
reproductores (IMV (2000).
Se debe utilizar el potro de monta, lo suficientemente robusto para soportar el
peso del animal. Este puede untarse con secreciones vaginales de la hembra con
el fin de estimular la monta.
Una vez el macho realiza la monta se debe tomar el pene y sostenerlo de una
manera firme y con presión, sin llegar a causar lesiones en el mismo. Para esto el
operario debe utilizar guantes de vinilo o plástico, y no utilizar guantes de caucho o
látex, porque estos tienen efecto espermicida.
Fuente: http://cdn.wn.com/o25/ph//2009/05/01/ddb84ae6fac97f10ed67095f347727e6-grande.jpg
Fig. 15. Colecta de semen del verraco.
La recogida del semen se debe hacer en un termo o recipiente con filtro, para
evitar la mezcla del material seminal con la fracción postespermática. Una vez
acaba la extracción, el material debe ser enviado al laboratorio para su evaluación.
La criopreservación
de semen porcino no es una técnica nueva; sin embargo,
esta tecnología reproductiva no se ha desarrollado lo suficiente como para estar
disponible a nivel comercial como en la ganadería bovina. Esto ha sido causado
por diversos factores entre los cuales se encuentran: escasos rendimientos
reproductivos,
elevada variabilidad entre verracos en la respuesta a la
congelación, y alta concentración espermática en las dosis de inseminación
(Martín, 2000, citado por Roa et al, 2005).
El proceso de criopreservación y descongelación del semen se ha adoptado una
tecnología que presenta pocas modificaciones, por lo que varios investigadores
(Fuentes, 2000; Pacheco, 2001 y Echegaray, 2003, citados por Roa et al, 2005),
aseguran que la base de los protocolos actuales de congelación siguen siendo las
siguientes:
Proceso de criopreservación.
 Colecta de semen, tomando la fracción rica del eyaculado y mezclando con
diluyente a 32º C.
 Evaluación de la calidad y concentración seminal (a partir de esta cifra, las
dosis que se pueden obtener del eyaculado y cantidad de diluyente de
congelación a emplear).
 Equilibrio previo a la centrifugación (23º C y 15º C).
 Centrifugación a 800 revoluciones por 10 minutos en centrifuga refrigerada
a 15º C.
 Resuspensión y eliminación de plasma seminal.
 Adición de diluyente a 15º C para evitar shock térmico.
 Equilibrio térmico a 5º C (Durante un periodo de 3 horas).
 Adición de diluyente con 3% de glicerol.
 Envasado.
 Congelación.
 Almacenamiento en nitrógeno líquido a - 196º C.
Proceso de Descongelación:
Junto con el proceso de descongelación, es necesario restituir el volumen de las
dosis antes de la inseminación, para lo cual se utiliza un diluyente capaz de
proteger las células espermáticas de daños durante la descongelación y proveer
de sustancias que aumenten la supervivencia, viabilidad y poder fecundante (Roa,
2005)
CAPITULO 2. INSEMINACION ARTIFICIAL
Lección 21. Historia de la inseminación artificial.
Los primeros reportes no registrados de la inseminación artificial datan de los
Árabes,
de
quienes
se
dice
utilizaban la
inseminación artificial
desde
aproximadamente el año 1300, a través de la inseminación de las yeguas con
semen que robaban de garañones de tribus vecinas.
Posteriormente, en Europa,
se encuentra el primer reporte escrito, el fisiólogo
italiano Lázaro Spallanzani, hacia el año de 1780 realizó el experimento de
colectar semen de un perro y depositarlo en el tracto reproductor de la hembra,
con lo cual obtuvo la preñez de la misma. En 1782, Rossi y un profesor llamado
Branchi repitieron con éxito el experimento de Spallanzani (Hafez y Hafez, 2000).
Hacia el año de
1900, en Rusia se empezaron a realizar experimentos de
inseminación en animales domésticos. El Dr. Ivanoff inició sus experimentos en
equinos, sin embargo, fue el primero en inseminar con éxito a los bovinos y a los
ovinos. Asimismo, se realizaron trabajos de inseminación en yeguas en Japón
hacia el año de 1913. En el año de 1936 en Dinamarca se formó la primera
asociación cooperativa de inseminación artificial.
La inseminación artificial en los porcinos tuvo su desarrollo en Rusia a comienzos
del siglo XX, posteriormente entre los años 1956 y 1966 se difunde esta técnica,
gracias al desarrollo del catéter en forma de espiral por Melrose y Cameron (Calle,
et al, 2006). Sin embargo, es hasta la década de los 90 del siglo pasado que se
difunde de manera comercial, gracias a la aparición de la evaluación seminal,
dando lugar a la implementación comercial de esta biotecnología.
Hoy en día la inseminación artificial es una práctica común sobre todo en los
países industrializados, en donde su utilización puede alcanzar hasta el 95% en el
ganado bovino y el 80% en los porcinos (Calle, et al, 2006).
La I.A en Colombia se inició en el año de 1937 con los doctores José Velásquez y
Milciades
Martínez,
quienes
inseminaron
perras
con buenos
resultados.
Posteriormente, en el año de 1946 el Ministerio de Economía Nacional adelanto
trabajos de inseminación artificial en la granja de la Picota y preparó el primer
grupo de
profesionales en esta disciplina. A partir de esta época se empezó a
inseminar ganado en diferentes regiones del país. El promedio nacional de
inseminación artificial es de un porcentaje del 4%, siendo las zonas de Antioquia,
altiplano Cundíboyacense y Eje Cafetero las de mayor implementación de la
técnica y los llanos orientales y costa atlántica las de menor utilización (Alvarado,
2008).
Ventajas y desventajas de la inseminación artificial
Ventajas:
La inseminación artificial presenta diversas ventajas entre las cuales se
encuentran:
 Rápido mejoramiento genético, mejorando los rendimientos al utilizar
reproductores sementales de alto valor genético.
 Disminución del riesgo de transmisión de enfermedades infectocontagiosa
por vía de transmisión sexual.
 Permite la utilización de machos de alta calidad genética que se encuentran
en áreas geográficas lejanas (Utilización de semen de toros alemanes o
franceses de alta genética, utilización de semen de garañones de las zonas
de vocación equina, como por ejemplo, Antioquia y Cundinamarca).
 Disminución de los costos de manejo y operario por mantenimiento de los
reproductores en la explotación y por la disminución de los mismos.
 Producción de lotes homogéneos al mercado.
 Permite prescindir de machos difíciles de manejar.
 Es útil para realizar test o pruebas de progenie en machos.
 Evita la introducción de machos de otras explotaciones los cuales pueden
trasmitir enfermedades infectocontagiosas.
Desventajas:
Algunas de las desventajas que se menciona son:
 Se requiere de personal capacitado en las técnicas y los procedimientos a
desarrollar en la inseminación artificial.
 Los costos iniciales pueden ser elevados, estos incluyen la adquisición del
equipo de inseminación, el termo de mantenimiento del material seminal,
las pajillas, el nitrógeno líquido, entre otros.
 Si el material seminal utilizado no fue colectado y evaluado, se puede correr
el riesgo de transmitir enfermedades de tipo infectocontagioso.
 Es necesario establecer un programa para la detección del celo.
 Cuando la intensidad de la selección es muy alta pueden surgir problemas
de consanguinidad.
Lección 22. Técnica de inseminación artificial.
Técnica de inseminación artificial en bovinos.
La inseminación artificial solo será efectiva si el espermatozoide se encuentra en
"el lugar adecuado en el momento oportuno". Es necesario que en el momento
que ocurra la ovulación, existan espermatozoides disponibles para fertilizar el
óvulo. El celo, tiene una duración promedio de 6 a 10 horas. La ovulación en la
vaca ocurre aproximadamente entre 10 a 14 horas luego de la finalización de los
signos del celo y el óvulo puede sobrevivir infértil por 6 a 12 horas. A diferencia
del espermatozoide, el cual
puede vivir hasta 24 horas en el aparato
reproductivo de la vaca (Infocarne, 2005). Por lo anterior, lo ideal es que la
inseminación se realice entre las 8 y 12 horas después del inicio del celo.
Fuente: http://www.infocarne.com/bovino/inseminacion_artificial2.asp
Fig. 16. Determinación del tiempo de monta o inseminación
Una práctica común para el mejor momento de realizar la inseminación artificial
es la regla de "mañana-tarde": En esta, las vacas observadas en celo en la
mañana se inseminan la misma tarde, y vacas observadas en celo durante la
tarde se inseminan la mañana siguiente. Este protocolo es muy utilizado en
ganaderías bos taurus, sin embargo en ganadería bos indicus puede
no
funcionar con la misma eficiencia, explicado por el hecho de que en este tipo de
ganado, los celos generalmente son más cortos, y por ende la viabilidad del
ovocito disminuye mas rápidamente. Por lo general en este tipo de ganaderías se
utilizan animales receladores (machos desviados, hembras androgenizadas,
machos con vasectomía) para determinar el celo, y una vez la vaca deje de
manifestar la sintomatología del celo, es inseminada.
La técnica de inseminación más utilizada en la vaca es la rectovaginal, los pasos
que involucra esta técnica son (CENIAP, 1999):
 Identificar el animal que está apto para la inseminación.
 Inmovilizar la vaca a un brete o manga. Revisar los registros del animal
con el fin de identificar y seleccionar el materila seminal a utilizar.
 Ubicar el semen a utilizar. Preparar el termo de descongelación con agua
potable a 35 a 37°C. Extraer la pajilla de semen congelado del termo y
sumergirla en el agua del termo de descongelación inmediatamente (allí
debe permanecer por un tiempo de 40 segundos). Extraer y secar
cuidadosamente la pajilla con una toalla de papel desechable (se debe
eliminar cualquier resto de humedad, porque el agua es espermicida).
Fuente: http://park.org/Netherlands/pavilions/typical_dutch/cows/cattle/nrs/picture s/plaat4.gif
Fig. 17. Selección de la pajilla.
 Preparar la pistola de inseminación, la misma se debe frotar con una toalla
de papel (esto con el fin de que la misma, se encuentre a una temperatura
similar a la del semen, es decir 37°, y con ello evitar el choque térmico y la
consecuente mortalidad espermática). Asimismo se debe retirar el émbolo
de la pistola hacia atrás (15 a 20 cm).
 Se debe cortar el extremo de la pajilla, e insertar la misma en la pistola
(debe evitarse el corte que deje puntas en la pajilla, porque estas puede
lacerar el aparato reproductor de la hembra). Puede utilizarse fundas
plásticas protectoras para evitar la contaminación del semen, durante su
paso por el tracto reproductor de la hembra.
 Proteger la pistoleta cargada, del sol y del medio ambiente, envolviendo el
extremo con una toalla de papel desechable (evitar la mortalidad
espermática).
 Colocarse un guante de plástico desechable sobre el brazo de palpar
(comúnmente el izquierdo). Lubricar ligeramente el guante de plástico, con
lubricante, agua o estiércol de la misma vaca.
 Introducir la mano enguantada vía rectal con los dedos en forma de cuña.
Eliminar el exceso de estiércol para limpiar el recto sin sacar la mano del
recto, ya que de lo contrario se llenaría de aire. Si esto ocurre tratar de
formar un pliegue del recto (mucosa) y proceder a halarlo hacia el ano.
 Localizar el cérvix, limpiar la zona vulvar una o más toallas de papel
desechable (secas). Sólo en caso necesario lavar con agua, ya que el agua
tiene efecto espermicida.
 Separar los labios vulvares, presionando hacia abajo y hacia atrás con el
antebrazo desde el recto. Introducir la punta de la pistoleta de inseminación
a través de la vulva en ángulo de 45°, dirigiéndola hacía el techo de la
vagina, evitando penetrar por error el divertículo suburetral o la uretra,
ubicada en el piso del vestíbulo vulvo-vaginal.
 Deslizar la pistola horizontalmente hacia delante, siguiendo la dirección de
la vagina. Con la mano que se fija el cervix empujar ésta hacia adelante
para estirar y eliminar los pliegues de la mucosa vaginal hasta llegar a la
cervix.
 Localizar el orificio posterior de la cervix, cerrar los dedos (pulgar, índice y
medio) en forma de círculo por detrás de la cervix, sirviendo como embudo,
ubicándose el orificio hacia el centro, evitando los fondos del saco ciego
alrededor del orificio del cervix. Si el método descrito falla, asegurar la
cervix con sus dedos índice, medio y anular, abajo sobre el piso de la
cavidad (sobre el pubis) o hacia el lado derecho (ileon). Usar el dedo pulgar
para ubicar el orificio, sentir con el dedo la punta de la pistoleta, retirar el
dedo e introduzca la pistola en el cervix.
 Al penetrar el cervix, se puede retraer el brazo con el cervix hacia atrás y
manipularlo. No mover la pistola y mantenerla fija con una ligera presión,
aplicar movimientos suaves de rotación al cervix para vencer los anillos
internos (3-5 anillos), los cuales pueden sentirse al paso de la pistola.
 El punto blanco del inseminador puede ser fácilmente ubicado, colocando la
yema del dedo índice por delante de la cervix y en el orificio anterior, donde
podrá sentirse la punta de la pistola, una vez pasados los distintos pliegues
de la cervix. Este punto se localiza a un centímetro de la salida del cérvix,
en el cuerpo del útero.
 Se deposita el semen en el punto blanco del inseminador, presionando
lentamente el émbolo de la pistoleta, teniendo cuidado de no halarla. Si el
animal se mueve, esperar hasta que se tranquilice y asegúrese que la
pistoleta se encuentre en el blanco del inseminador antes de proseguir
depositando el semen.
Fuente: http://www.partners-in-reproduction.com/images/ai.jpg
Fig. 18. Proceso de inseminación artificial.
 Retirar la pistola, mantener el cervix con la mano y retirar la pistola
suavemente. Inspeccionar la pistola y asegurarse que la pajilla esté
completamente vacía, que no tenga trazas de sangre, pus o suciedad y que
la identificación de la pajilla corresponda al toro asignado para el servicio de
la vaca.
 Anotar el servicio, asegurándose que la fecha, identificación de la vaca, el
semen utilizado y cualquier otra observación queden correctamente
anotadas.
Lección 23. Técnica de inseminación artificial en equinos
La técnica de inseminación artificial en equinos, debe contar con la participación
de personal capacitado que determine el momento preciso en el cual se debe
realizar la inseminación. Para esto se debe realizar el seguimiento ecográfico al
desarrollo folicular
con el fin de determinar el momento exacto para realizar la
inseminación.
Fuente: http://albeitar.portalveterinaria.com/noticia.asp?ref=728
Fig. 19. Seguimiento ecográfico de la ovulación. En la izquierda se puede observar el
folículo, 24 horas antes de la ovulación, en el centro el folículo ovulando, y en la derecha 24
horas después de ocurrida la ovulación.
Lo anterior es muy importante debido a que es muy difícil conseguir
semen
criopreservado de garañones, debido a la alta tasa de variabilidad
en los
resultados del proceso de criopreservación, razón por la cual, se utiliza el semen
refrigerado la mayoría de veces. Este semen refrigerado puede sobrevivir hasta 72
horas, en el medio de dilución, por lo tanto es necesario conocer el momento
exacto de la ovulación con el fin de hacer el respectivo pedido y garantizar la
llegada del material seminal a la explotación.
Cuando
se
decide
realizar
la
inseminación
artificial
la
yegua
es sometida a un examen reproductivo previo con el fin de valorar la integridad
anatómica y funcional de su aparato reproductor y descartar aquéllas que
presenten alteraciones que reduzcan la fertilidad. En los programas de IA se
deberá ser más estricto en este sentido, para así obtener todos los beneficios que
conlleva la técnica. Así, se deben descartar las hembras con anomalías
congénitas o adquiridas, como las que presenten alteraciones del útero
(Rodríguez, 2009).
Es conveniente, contar con
instalaciones adecuadas que permitan el manejo
adecuado y seguro de la yegua, para esto se debe contar con un brete de
inmovilización que permita desarrollar el proceso de seguimiento ecográfico y de
inseminación de la yegua.
Una vez se ha determinado el momento óptimo para la inseminación (este
dependerá del tipo de material seminal utilizado, con semen refrigerado se realiza
normalmente por exploración rectal ecográfica del aparato reproductor para
identificar en un ovario la presencia de un folículo preovulatorio (FP), de tal
manera que si está en celo y/o tiene un FP se insemina por primera vez y se repite
a las 24 horas hasta que termine el celo o se observe la ovulación. Si el material
utilizado es semen congelado conviene que la dosis se deposite en el útero entre
las 6-8 horas anteriores a la ovulación o las 6 posteriores a la misma) se deben
realizar los siguientes pasos para la técnica de inseminación vaginal:
 Inmovilizar a la yegua, para evitar que se lesione durante el proceso de la
I.A.
 Se debe limpiar la totalidad del área vulvar, para ello se puede utilizar
toallas de papel humedecidas o agua y papel periódico.
 El inseminador toma una manga de plástico y se aplica lubricante estéril no
espermicida, a lo largo del guante.
 Tomar el catéter o la pipeta de inseminación (generalmente se utilizan
catéteres rígidos de plástico unidos a una jeringa o botella). Introducirlo vía
vaginal en dirección al techo de la vagina, con el fin de evitar que se dirija al
meato urinario y se contamine el material seminal. Con el dedo índice se
guía el catéter hasta el cérvix.
 En la entrada del cérvix se introduce el dedo aproximadamente 0.5 a 1 cm,
con el fin de guiar el recorrido del catéter, luego se introduce el catéter
aproximadamente 5 a 10 centímetros mas hasta llegar al cuerpo del útero.
 Allí se debe depositar el semen mediante la presión de la botella del
material seminal o la inserción con la jeringa.

Fuente: http://inseminacionequina.com/images/tecnicadeinseminacion.jpg
Fig. 20. Inseminación artificial en la yegua
Actualmente existe otra técnica de inseminación, y es la variante
intrauterina
profunda, esta técnica permite incrementar los porcentajes de fertilidad y reducir la
concentración de espermatozoides de la dosis. Esta variante de inseminación está
más indicada cuando se emplea esperma congelado. En este caso se pueden
emplear catéteres largos semirigidos de pequeño volumen o se puede usar un
endoscopio flexible adaptado que permite “regar” la papila tubárica con la dosis
(Rodríguez, 2009).
Lección 24. Técnica de inseminación artificial en ovinos
La inseminación de la oveja puede ser vaginal, cervical ó intrauterina. Estos
métodos presentan variaciones e cuanto su complejidad y tasas de preñez.
La oveja presenta un ciclo estral con una duración aproximada de 17 días y la
ovulación ocurre aproximadamente de 24 a 27 horas después del inicio del celo
(Mejia y Hernández, 1996, citado por Bedoya et al, 2005). Cuando se deba
inseminar artificialmente, por vía vaginal o cervical, se obtendrán mejores
resultados si la inseminación se hace lo más cercano a la ovulación, por lo cual se
recomienda que el
momento óptimo para inseminar ovejas es 12-18 horas
después de la aparición del estro (Hafez y Hafez, 2000).
Inseminación vaginal. La inseminación vaginal en los ovinos consiste en la
deposición del semen en la vagina anterior sin ningún intento de localizar el cervix.
Los pasos que involucra esta técnica son:
 Inmovilización de la oveja y limpieza del área vulvar, esto con el fin de evitar
la contaminación de la vagina al introducir la pipeta de inseminación.
 La pistola, pipeta o jeringa con catéter, se debe cargar con la dosis de
semen requerida, luego de dejar una cámara de aire de 0,2 ml en la jeringa.
La cámara de aire sirve que para las dosis completas de semen sea
depositada en la vagina durante la inseminación.
 La punta de la pistola o catéter se introduce en la vagina a lo largo de la
pared superior facilitando su entrada por la apertura suave de la válvula con
la mano libre.
 Se deposita el semen en la vagina.
Inseminación cervical. En la inseminación cervical, la disposición del semen se
realiza en el cervix hasta una profundidad de 3 cm. Los paso a seguir son los
siguiente:
 Inmovilización de la oveja, limpieza del área vulvar.
 Se introduce un vaginoscopio hasta una profundidad de 10-13 cm. Una vez
que el cervix es localizado, la pistola de inseminación se introduce hasta la
mayor profundidad posible, sin forzarla.
 Antes de descargar el semen, se retirara un poco el vaginoscopio hacia
atrás a fin de facilitar el cierre de la vagina anterior evitando que el semen
se derrame. Posteriormente se retirara primero la pistola y luego el
vaginoscopio.
 Es importante limpiar la vagina de contaminación o mucus antes de
depositar el semen.
Fuente: http://www.cuencarural.com/img/varias/img7373.jpg
Fig. 21. Inseminación artificial en la oveja
Inseminación intrauterina. Cuando se va a realizar la inseminación intrauterina
por laparoscopia, se debe realizar un ayuno de 12 horas o más (generalmente por
una noche). Esto reduce el contenido del rumen, y facilita la localización de los
ovarios y los úteros, evitando además la regurgitación desde el rumen durante la
laparoscopia. Los pasos a seguir son:
 La oveja se presenta al inseminador, con el tren posterior levantado y la
camilla inclinada de un ángulo de 45 grados.
 En primer lugar se introduce en la cavidad peritoneal el trocar de 7 ml y
cánula a la izquierda de la línea media. Se debe tener especial cuidado de
no perforar ningún órgano ni vena principal.
 Antes de introducir el trocar y cánula a la derecha de la línea media, es
conveniente insuflar aire dentro del abdomen. La cavidad abdominal puede
examinarse con posterioridad retirando el trocar y reemplazándolo por el
endoscopio. El útero se localiza justo delante de la vejiga.
 A través de la cánula de 5 ml. se introduce la pistola de inseminación, con
una cámara de aire de 0,3 ml. y el volumen requerido de semen.
Fuente: http://www.inta.gov.ar/actual/ant/2004/insemina_1g.jpg
Fig. 21. Inseminación artificial laparoscópica en la oveja
Fuente: http://www.ceniap.gov.ve/ceniaphoy3/articulos/n9/arti/vasquez_b/imagen/image014.jpg
Fig. 22. Inseminación artificial laparoscópica en la oveja
Lección 25. Técnica de inseminación artificial en porcinos.
El ciclo del estro en cerdos promedia 21 días, pero puede estar entre 17 a 25 días.
El primer día cuando la cerda es receptiva al macho y se queda parada para ser
montada es lo que llamamos día 0. A los dos o tres días en que la hembra es
sexualmente receptiva se le llama Celo. Aunque la ovulación (liberación de los
óvulos de los folículos del ovario) ocurre generalmente de 23 a 48 horas después
de la iniciación del estro, este acontecimiento es extremadamente variable. En
realidad, una cerda puede ovular antes de que ocurra el estro. Por esta razón es
que los productores suelen inseminar a las hembras más de una vez.
Inseminación artificial tradicional. La inseminación artificial en los porcinos es
una técnica relativamente fácil, en la misma se debe garantizar todas las medidas
de higiene con el fin de evitar la contaminación del material seminal. Los pasos a
seguir para realizar esta técnica son (Calle, et al, 2006):
 El inseminador debe ubicarse sobre el dorso de la hembra con el fin de
hacer presión y realizar un masaje en el flanco, para imitar la acción del
macho durante la cópula. Esto permite que la hembra aumente sus
contracciones uterinas, y con ello mejora el transporte del semen. También
es posible conseguir en el mercado, dispositivos “manos libres, los cuales
se componen de dos mochilas laterales que ejercen la función de la presión
en los flancos y el dorso, y cuentan con un dispositivo para el sostén de la
botella o bolsa con el material seminal.
Fuente: www.avparagon.com/.../anatomia_aplicada _inseminacion_artificial.pdf
Fig. 23. Inseminación artificial en la cerda
 Se debe limpiar la totalidad del área vulvar, para ello se puede utilizar
toallas de papel humedecidas o agua y papel periódico.
 Tomar el catéter o la pipeta de inseminación y aplicar lubricante no
espermicida en el extremo, se debe tener cuidado de no obstruir el orificio
del catéter con el lubricante.
Fuente: www.avparagon.com/.../anatomia_aplicada_inseminacion_artificial.pdf
Fig. 24. Lubricación del catéter. Se debe aplicar lubricante no espermicida en la punta del
catéter.
 Introducir la pipeta o el catéter vía vaginal, en ángulo de 45% dirigido hacia
el techo de la vagina dirigiéndolo hasta el cérvix, esto con el fin de evitar
que la pipeta o el catéter se vayan a través del meato urinario y se
contamine con la orina.
Fuente: www.avparagon.com/.../anatomia_aplicada_inseminacion_artificial.pdf
Fig. 25. Inserción del catéter. El catéter debe insertarse en un ángulo de 45° dirigido hacia el
techo vaginal.
Al llegar al cérvix, se debe hacer una rotación del cateter en el sentido contrario a
las agujas del reloj, esto permitirá que el mismo penetre en el cérvix. Par
comprobar que está en el cérvix, se puede halar suavemente hacia atrás el catéter
y allí se comprobará cierta resistencia.
En este momento se debe conectar al catéter o pipeta la bolsa o botella que
contiene el semen diluido, previa dilución del mismo con fin de homogenizar el
material seminal. Luego se debe descargar lentamente el material seminal. En un
comienzo puede ser necesario oprimir ligeramente la botella o bolsa para iniciar el
proceso, pero después se debe dejar que el semen sea extraído por las
contracciones del útero.
El proceso de inseminación puede tardar entre 3 y 8 minutos. Si el material
seminal es depositado de una manera rápida, puede causarse reflujo con la
consecuente pérdida del semen, aunque generalmente se puede observar la
pérdida de una pequeña cantidad de semen durante la I.A. En caso de que se
observe la pérdida de una gran cantidad de semen, se debe verificar que la pipeta
o el catéter este correctamente introducido en el cérvix.
Fuente: www.avparagon.com/.../anatomia_aplicada_inseminacion_artificial.pdf
Fig. 26. I.A en la Cerda. El proceso de inseminación puede tardar entre 3 y 8 minutos.
Todo el proceso de inseminación debe hacerse con el menor estrés
hacia la
cerda, porque esto puede influir en los resultados finales de las tasas de preñez y
en la prolificidad.
Una vez se haya depositado todo el semen, se debe extraer el cateter o la pipeta
haciéndola girar en el sentido de las agujas del reloj mientras se hala suavemente.
Una vez se ha extraído el catéter se debe mantener a la hembra en un sitio
tranquilo por 20 a 30 minutos, lejos de factores estresantes.
Fuente: www.avparagon.com/.../anatomia_aplicada_inseminacion_artificial.pdf
Fig. 27. Diversos tipos de catéter utilizados en la I.A porcina
Inseminación artificial postcervical (IPC) intrauterina profunda (IIP). Gracias a
los avances de la biotecnología en los últimos años, se han desarrollado nuevos
sistemas de inseminación artificial en la especie porcina. Esto ha permitido la
reducción de las dosis a utilizar en los proceso de inseminación artificial,
contribuyendo a la obtención de un número mayor de dosis por colecta y con ello
mejorar la productividad de las explotaciones.
La inseminación post-cervical (IPC) consiste en la introducción de una cánula
transcervical a través del cervix para alcanzar la porción anterior del cuerpo del
útero, donde los espermatozoides son depositados (Watson y Behan, 2002, citado
por Calle, et al, 2006). La dosis inseminante en el caso de esta técnica es de
aproximadamente 750- 1000 millones de espermatozoides.
La inseminación intrauterina profunda consiste en la deposición del semen en la
parte anterior del cuerno uterino, en proximidades de la unión útero-tubárica. Este
tipo de inseminación permite disminuir la cantidad de espermatozoides utilizados
por I.A, asimismo disminuyendo la pérdida de material seminal por
reflujo. La
dosis inseminante en el caso de esta técnica es de aproximadamente 150 millones
de espermatozoides (Cáceres, 2008).
Por último es necesario hacer unas recomendaciones referentes al manejo de los
termos de conservación de las pajillas de semen criopreservado. Los termos de
nitrógeno con boca ancha, presentan el inconveniente de que presentan una tasa
mayor de evaporación y pérdida de nitrógeno. Este tipo de termos son más
recomendados para las casas productoras de pajillas, ya que facilitan la
manipulación de las pajillas. Para las explotaciones ganaderas se recomienda el
uso de termos de boca angosta, con el fin de disminuir la pérdida del nitrógeno, y
por ende disminuir los costos de manejo de los mismos.
Fuente: http://www.reproduccionanimal.com.mx/Galeria_RASA/Galeria45.jpg
Fig. 28. Termos de inseminación. Los termos de boca ancha presentan una mayor tasa de
pérdida de nitrógeno por evaporación.
CAPITULO 3. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
La transferencia de embriones es una biotecnología que ha crecido a un ritmo
constante durante los últimos años, en Colombia se ha intensificado su uso,
especialmente en el ganado bovino durante los últimos 18 años (Bolívar y
Maldonado, 2008). Este es un método de reproducción artificial que consiste en la
producción de varios embriones generados por una hembra donante y que serán
posteriormente transferidos a hembras receptoras.
Lección 26. Selección y manejo de donantes y receptoras
Quizá uno de los aspectos mas importantes dentro de la transferencia de
embriones es la adecuada selección de las donantes y receptoras. En la selección
de donantes, es necesario tener en cuenta dos criterios fundamentales:
 Animales de alta genética, superiores a los otros.
 Excelente estado reproductivo
Donantes:
La selección de donantes debe hacerse de manera estricta, las donantes deben
estar reproductivamente sanas y en un balance nutricional adecuado, de lo
contario el programa podría fracasar, las vacas demasiado flacas o muy gordas
(condición corporal menor de 2.5 o mayor de 4.5 en escala 0 a 5).
Las vacas no deben estar con ternero, si en el momento del inicio del programa
tiene ternero, el mismo debe ser separado. De igual manera no es aconsejable
utilizar vacas con menos de 60 días posparto, ya que estas pueden presentar ciclo
irregulares (Albeiro, 2001).
Receptoras:
La selección de unas buenas receptoras es otro de los puntos críticos dentro del
programa e T.E. Las receptoras deben estar clínicamente sanas, libres de
cualquier enfermedad, y con un tracto reproductivo en óptimas condiciones, se
requieres que tengan buena habilidad materna y capacidad productora láctea.
Estas receptoras serán las encargadas de mantener el embrión desde el día 7
hasta su nacimiento y posterior amamantamiento. Por lo anterior deberá ser una
hembra que no sea propensa a partos distócicos y que tenga una buena
producción láctea.
El tamaño de la receptora depende del tipo de embrión que se transferirá. En
cuanto a la edad, se difiere aún en lo recomendable, algunos autores piensan que
es mejor novillas y otros en vacas que ya hayan parido al menos una vez. Las
novillas permiten obtener tasas de preñez mayores a las vacas, sin embargo
pueden presentar problemas durante la gestación, el parto y la lactancia. Mientras
que el uso de vacas con historia de parto permitirá conocer el comportamiento que
tendrá la receptora durante y después de la gestación y el parto (Albeiro, 2001).
Programa de Sincronización del celo entre la donante y la receptora y
superovulación de la donante
En condiciones normales, las vacas tienen una
ovulación por ciclo, aunque
algunas pueden alcanzar hasta dos ovulaciones (hasta un 8% según la raza). Lo
que se busca con esta biotecnología es incrementar el número de ovulaciones
consideradas fisiológicas para la especie, a través de la aplicación de hormonas
exógenas que estimulen el desarrollo y la ovulación de un numero amplio de
folículos (Cyagra, 2008).
Para los programas de superovulación en bovinos se puede hacer uso de dos
hormonas que ejercen este efecto: la Hormona foliculoestimulante (FSH, la cual
viene en combinación con LH) y la Gonadotropina Coriónica equina (eCG, o
PMSG).
Protocolo mediante el uso de Hormona foliculoestimulante (FSH).
La hormona foliculoestimulante ha sido la hormona de predilección en los
programas de superovulación en bovinos. La dosis de aplicación varía de acuerdo
con la raza, algunas son más susceptibles a la acción de la hormona y responden
a su acción con menos dosis. Los productos disponibles comercialmente son
hormonales de origen porcino u ovino, los cuales contienen FSH en combinación
con LH. La presencia de LH se explica de acuerdo a lo expresado por Calier
(2008) en lo siguiente: a grandes dosis la LH provoca la ovulación; a pequeñas
dosis, actúa en sinergia con la FSH en el desarrollo folicular. Los folículos
menores de 9 mm de diámetro son FSH-dependientes, lo que se evidencia por la
presencia de receptores FSH en las células de la granulosa, pero cuando superan
los 9 mm, adquieren receptores de LH, y el crecimiento folicular pasa a depender
de la LH. Por lo tanto, la LH es necesaria para los estadios finales del desarrollo
folicular.
Las dosis comúnmente empleadas en la superovulación de vas varia de acuerdo a
la siguiente relación:
 Ganadería bos taurus (Razas lecheras):
800-1000 UI
 Ganadería bos taurus (Razas cárnicas):
600-800 UI
 Ganadería bos taurus (Novillas):
500 UI
 Ganadería bos indicus:
250 UI
En dosis decrecientes, cada 12 horas, durante 4 días, aplicando una PG al 3º o 4º
día por la mañana.
Protocolo de superovulación y sincronización del celo (vacas)
Tabla 11. Protocolo de superovulación y sincronización del celo (vacas).
DIA
HORA
DIA 0
08:00 horas
DOSIS
DONANTE
RECEPTORA
Dispositivo intravaginal
1ª Dosis PGF2α
o auricular +
progesterona +
benzoato de estradiol
DIA 4
DIA 5
DIA 6
08:00 horas
3.0 ml
150 UI
20:00 horas
3.0 ml
150 UI
08:00 horas
2.5 ml
125 UI
20:00 horas
2.5 ml
125 UI
08:00 horas
1.5 ml
75 UI + PGF2α +
2ª Dosis PGF2α
Retiro del dispositivo
DIA 7
DIA 8
20:00 horas
1.5 ml
75 UI
08:00 horas
1 ml
50 UI
20:00 horas
1 ml
50 UI
Detección de celo
Inseminación artificial
Detección de celo
08:00 horas
(I.A) + GnRH
DIA 15
20:00 horas
I.A
08:00 horas
Colecta de embriones
Transferencia de
embriones
Protocolo de superovulación y sincronización del celo (novillas)
Tabla 12. Protocolo de superovulación y sincronización del celo (Novillas).
DIA
HORA
DIA 0
08:00 horas
DOSIS
DONANTE
RECEPTORA
Dispositivo intravaginal
1ª Dosis PGF2α
o auricular +
progesterona +
benzoato de estradiol
DIA 4
DIA 5
DIA 6
08:00 horas
2.0 ml
100 UI
20:00 horas
2.0 ml
100 UI
08:00 horas
1.5 ml
75 UI
20:00 horas
1.5 ml
75 UI
08:00 horas
1 ml
50 UI + PGF2α +
2ª Dosis PGF2α
Retiro del dispositivo
DIA 7
DIA 8
20:00 horas
1 ml
50 UI
08:00 horas
0.5 ml
25 UI
20:00 horas
0.5 ml
25 UI
Detección de celo
Inseminación artificial
Detección de celo
08:00 horas
(I.A) + GnRH
DIA 15
20:00 horas
I.A
08:00 horas
Colecta de embriones
Transferencia de
embriones
Protocolo mediante el uso de Gonadotropina Coriónica equina (eCG, o
PMSG). La eCG (Folligon®, Novormon®) es una hormona producida en las copas
endometriales de la yegua durante los días 42 a 150 de la gestación. Esta
hormona tiene una acción FSH y LH,
con una vida media larga de
aproximadamente 5 días. Debido a su vida media larga, puede desencadenar una
sobreestimulación ovárica la formación de quistes foliculares. La dosis empleada
para inducir la superovulación es de 2000 UI en novillas y de 3000 UI en vacas.
Tabla 13. Protocolo de superovulación con eCG.
DIA
HORA
DIA 1
08:00 horas
DOSIS
OBSERVACION
Dispositivo intravaginal o auricular +
progesterona + benzoato de estradiol
DIA 7
2000 UI
Aplicación IM de eCG
Retiro dispositivo + aplicación de PGF2α
DIA 9
1000 μG
DIA 10
I.A + Aplicación de anti-PMSG (anti-eCG)
Progesterona: 50mg, benzoato de estradiol: 2.5μ
Fuente: www.avparagon.com/.../anatomia_aplicada_inseminacion_artificial.pdf
Fig. 29. Ovarios superovulados.
Lección 27. Colecta y evaluación de embriones
Los embriones bovinos, pueden ser recuperados a través de métodos no
quirúrgicos. Inicialmente, la recuperación de embriones se hacía por medios
quirúrgicos, y se requería de anestesia general y/o local, para luego realizar una
incisión a nivel de la línea media y extraer los cuernos uterinos con los ovarios y
se realizaba el lavado de los cuernos para extraer los embriones (Palma, 2001).
Sin embargo estas técnicas producían
lesiones con formación de fibrina y
adherencias de los varios y cuernos a las paredes de la cavidad abdominal,
produciendo la pérdida reproductiva del animal.
Hoy en día es posible realizar la extracción de los embriones, por medio de
técnicas no quirúrgicas (método transvaginal). Para la colección no quirúrgica de
embriones se han inventado variedades de instrumentos pero los más comunes
son los catéteres Foley de 2 vías y el modelo Neustadt/. Las diferencias
fundamentales entre ellos redica en el largo y en la consistencia. El modelo
Neustadt/Aish es 27 cm. más largo y es más duro que el Foley (Del campo, 2000).
La sonda Foley es el elemento utilizado en nuestro país para la recuperación de
los embriones.
Técnica
En el proceso de lavado y colecta de embriones se debe contar con los siguientes
elementos:
 Circuito de lavado
 Sonda Foley (Con estilete)
 Medio de lavado (PBS)
 Dilatador de cérvix
 Mangas de palpación
 Filtro de recolección
 Jeringas
 Lidocaína al 2%, agujas 16G o 18G
 Cajas de petri
 Microestereoscopio
 Medio holding
 Pajillas
 Congeladora de embriones
 Pistola de transferencia
Se debe inmovilizar a la donante en un brete o carral, se realiza la palpación rectal
o la evaluación ecográfica para determinar el número de cuerpos lúteos presentes
en cada ovario.
Se limpia y desinfecta la región perineal y vulvar. Se aplica la anestesia epidural
baja (5 ml, de lidocaína al 2%).
Se introduce un brazo por vía rectal y con el otro se introduce la sonda Foley (con
el estilete) vía vaginal, se pasa el cérvix y se infla el balón o globo con 10-15 ml de
aire o de solución salina o PBS, esto con el fin de evitar la salida de la sonda y/o
líquido de lavado durante el proceso (En algunas vacas será necesario producir
una dilatación del cérvix para facilitar el paso de la sonda, esto se realiza con el
dilatador de cérvix).
La sonda debe ser ubicada de forma tal que no exista perdida de líquido durante el
proceso, y se procede a introducir el medio de lavado (Este medio debe
introducirse a temperatura corporal, 37°C, en volúmenes de 20 a 100 ml, luego se
procede a realizar el masaje por todo el cuerno con el fin de arrastrar los
embriones, luego este liquido debe ser colectado y pasa a través de un filtro en
donde van a ser colectados los embriones. Este procedimiento se repite entre 3 y
6 veces en cada uno de los cuernos.
Una vez se ha terminado de colectar los embriones se deba aplicar una dosis de
prostaglandina, con el fin de inducir la luteolisis y así evitar que ocurra una preñez
de embriones que hayan podido quedar dentro del tracto reproductivo posterior al
lavado.
Fuente: Guzmán et al, 2008
Fig. 30. Proceso de colecta de embriones
Los embriones colectados en el filtro son llevados al laboratorio, para allí realizar
la búsqueda, evaluación y clasificación de los mismos.
A nivel de laboratorio se realiza la búsqueda de embriones (Viables y no viables) y
estructuras no fertilizadas en el estereoscopio, para esto se extrae el contenido del
filtro en cajas de petri. Los embriones viables son separados en otra caja de petri
mas pequeña que contiene medio PBS, posteriormente se realiza el lavado de los
embriones por medio del pase de los mismos en medio durante 8 a 10 veces.
Evaluación de embriones
La evaluación morfofológica es un aspecto importante para definir cuáles son
aptos para la transferencia y/o crio preservación. Por lo anterior es importante
realizar un repaso por los estadios de desarrollo del embrión durante los 9
primeros días.
Desarrollo del embrión en los bovinos
Tabla 14. Desarrollo del embrión.
TIEMPO
DESARROLLO
36-48 horas
2 células
3 día
4 – 8 células
4 día
8 – 16 células
4-5 día
Mórula temprana
5-6 día
Mórula compacta
6-7 día
Blastocisto temprano
7-8 día
Blastocisto expandido
8-9 día
Blastocisto eclosionado
A nivel del laboratorio se procede a realizar la clasificación de los embriones de
acuerdo a su calidad, para esto se establece una escala de clasificación de 1 a 5.
Escala de clasificación de la sociedad internación de Transferencia de embriones
Tabla 15. Escala de clasificación embrionaria.
Fuente: Evangelista et al, 2007.
Los embriones aptos para criopreservación son los tipo 1, los aptos para la
transferencia en fresco son los tipo 1, 2 y 3. Y los demás no son viables. Si se va a
realizar la criopreservación son empajillados en medio de Etilenglicol, si van a ser
transferidos en fresco se empajillan en medio PBS.
Fuente: http://artbreeding.com/Graphics/BovineFlush.jpg
Fig. 31. Embriones en diferentes etapas de desarrollo.
Fuente: http://www.hamiltonthorne.com/products/lasers/xyclone/images/hatched -bovine-embryos.JPG
Fig. 32. Embriones colectados.
Lección 28. Transferencia de embriones
La transferencia es no quirúrgica. Las pajuelas conteniendo al embrión son
cargadas en un pistolete de transferencia, el cual es cubierta con una camisa
sanitaria de plástico. La receptora es ubicada en un brete, encepada y
anestesiada con una inyección epidural. Luego de ser palpada en búsqueda del
cuerpo lúteo, el pistolete es insertado hasta la mitad del cuerno uterino (lo más
profundo posible) y el embrión es depositado allí. Los porcentajes de preñez
esperados son de un 60 al 65 %, cuando se transfieren embriones en fresco, y del
50 al 55%, cuando los embriones transferidos son congelados (Cyagra, 2008).
Tomar una pajilla de 0,25 ml y cargar en ella el embrión en el siguiente orden:
1. 1ra. columna de PBS con suero fetal al 10%.
2. 2da. columna, pequeña burbuja de aire.
3. 3ra. columna de PBS con medio de congelación.
4. 4ta. columna, pequeña burbuja de aire.
5. 5ta. columna, cargar el embrión en su medio.
6. 6ta. columna, pequeña burbuja de aire.
7. completar el resto de la pajuela con medio de congelación.
La pajilla se carga en la pistola de transferencia de embriones y ésta dentro de la
pipeta plástica estéril. Introducir una mano vía y sujetar el cérvix a través de la
pared del recto. La pistola se introduce vía vaginal en el canal cervical y su
extremo se ubica, con ayuda de la mano izquierda, en el cuerno ipsilateral al
Cuerpo lúteo. Una vez en la posición deseada (un poco más allá del cuerpo del
útero) el embrión es depositado suavemente y la pistola se retira lentamente. Todo
este procedimiento debe realizarse lo más rápido y delicadamente posible. El
exceso de manipulación producirá daño a la mucosa del útero, que se traducirá en
una baja en los resultados (Del campo, 2000)
Lección 29. Criopreservación de embriones
De acuerdo a lo expresado por Celestinos y Gatica (2002), el empleo de
embriones congelados posibilita la utilización eficiente de las donantes y
receptoras; permite la incorporación de alta genético a bajo costo (comparando los
valores del embrión y el de su transporte frente a los animales en pie), permite la
transferencia de algunos embriones y la conservación del resto hasta poder
analizar los registros de producción de la descendencia; facilita el control de
enfermedades exóticas (reemplazando la importación de animales en pie por la de
embriones congelados libres de ellas), y permite la creación
de bancos de
embriones de valor pecuario, entre otras ventajas. Los registros de la Sociedad
Internacional de Transferencia de Embriones revelan que más del 50% de 500.000
embriones de bovino transferidos en los últimos años han sido usados después de
ser congelados y descongelados (Thiber, 1997). La conservación de los
embriones a temperaturas extremadamente bajas (-196 °C en nitrógeno líquido)
permite detener casi por completo la actividad enzimática intercelular, respiración
celular,
metabolismo,
crecimiento,
multiplicación,
etc.;
es
decir,
reducen
drásticamente la actividad fisiológica de la célula, así es posible almacenar
embriones durante un largo período sin afectar su viabilidad y sin causarles
cambios genéticos.
En la actualidad, la crioconservación de embriones de mamíferos ha llegado a ser
un procedimiento rutinario en biología, ganadería y medicina, pudiendo lograrse
por procedimientos de congelación estándar y por vitrificación. La principal
diferencia que tiene la vitrificación con el método estándar es que en este último la
concentración de crioprotectores es menor y el descenso de temperatura se
realiza de manera controlada mediante equipos programables (Fahning y García,
1992, citado por Celestinos y Gatica, 2002).
Crioprotectores
Durante el proceso de criopreservación, los embriones deben ser deshidratados
parcialmente a fin de evitar la formación de cristales que lesionan las estructuras
citoplasmáticas. Esta deshidratación se logra incorporando un agente crioprotector
al medio de congelación. Existen dos clases de Crioprotectores: intracelulares o
permebales y extracelulares o impermeables.
Permeables o intracelulares: presentan bajo peso molecular, estos compuestos
deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma.
Entre estos se encuentran:
Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2
propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y
otros alcoholes.
Impermeables
o
extracelulares:
Presentan
alto
peso
molecular,
estos
compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión
osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y
estructura de las membranas a baja actividad de agua; deshidratan junto con el
crioprotector
las células de
los embriones.
Entre estos se encuentran:
polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa,
lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares
Los crioprotectores previenen la deshidratación total y la degeneración proteica,
causada por la congelación del agua intra y extracelular durante el proceso. La
etapa del desarrollo más apropiada para la vitrificación en etilenglicol es la mórula
compacta y blastocisto temprano de embriones producidos in vivo o in vitro
(Celestinos y Gatica, 2002).
Técnica de criopreservación
El método de congelación estándar fue desarrollado por Wilmut y Rowson en
1973, en este método
la exposición de los embriones al medio de congelación
(PBS + G) debe realizarse a temperatura ambiente (20 - 22 °C), en un solo paso,
de 10 a 30 minutos de duración. Este período incluye el envasado de los
embriones en pajillas plásticas. Esto permite realizar más rápidamente y con
mayor precisión la inducción de la cristalización o “seeding”. Las pajillas deben ser
colocadas en un equipo de congelación a -7 °C durante 5 minutos para equilibrar
la temperatura de las pajillas con la del equipo; el seeding se realiza poniendo en
contacto la superficie de la pajilla con una placa metálica enfriada con nitrógeno
líquido (NL2); el agente refrigerante del equipo puede ser nitrógeno líquido alcohol
o etanol enfriado por medio de un compresor (El no inducir la cristalización
conduce a la formación de cristales de hielo bajo un estado de superenfriamiento y
a una elevación repentina de temperatura (se genera calor latente de –10º a –15
ºC), resultando un severo trauma físico que puede dañar las células (Niemann,
1995, citado por Celestinos y Gatica, 2002). Una vez efectuado el seeding, se
mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (período de estabilización) y
luego se desciende a una velocidad de entre 0.1 y 0.5 °C hasta -30 ó -35 °C para
establecer un adecuado balance entre deshidratación y formación de hielo
intracelular, en este momento las pajuelas pueden ser retiradas del equipo de
congelación y sumergidas en nitrógeno líquido. La descongelación se realiza de
manera rápida, sumergiendo las pajillas en baño María a 30 ó 35 °C durante 20–
30 segundos (Celestinos y Gatica, 2002).
Existe otro método de congelación rápida que fue desarrollado por Chupin (1986).
Los embriones son deshidratados parcialmente como ocurre en el método
estándar, luego se les deshidrata nuevamente colocándolos en una solución mixta
de glicerol y sucrosa. Esta segunda deshidratación deja a los embriones en
condiciones de ser enfriados rápidamente. Las pajuelas son colocadas en el cuello
del termo de nitrógeno, durante 5 minutos, posteriormente son sumergidas al NL.
Por último, existe un proceso denominado vitrificación, el cual consiste en
un
proceso físico de solidificación utilizado para conservar órganos, tejidos y
embriones. La solución vitrificante (SV) lleva incorporado crioprotectores en alta
concentración. Al ser enfriada no cristaliza, sino que se torna viscosa y pasa del
estado líquido a un estado sólido no estructurado similar al vidrio, tomando de ahí
su nombre. Todo el procedimiento desde el equilibrio hasta la inmersión en NL no
requiere más de 10 minutos
Por otro lado De Luca (2007) describe la técnica de criopreservación de embriones
bovinos de una manera más detallada:
 Selección del embrión. Separar mórulas de blastocistos.
 Lavar 10 veces con una solución de Dulbecco® modificado, con 10% de
suero fetal bovino (Mórulas: sumergir durante 10 minutos el embrión en una
solución de Dulbecco®, con 1,5 molar de glicerol, más 0,1 molar de
sucrosa. Blastocistos: sumergir durante 10 minutos el embrión en una
solución de Dulbecco®, con 1,5 molar de glicerol, más 0,2 molar de
sucrosa).
 Tomar una pajilla de 0,25cc y cargar en ella el embrión en el siguiente
orden:
8. 1ra. columna de Dulbecco® con suero fetal al 10%.
9. 2da. columna, pequeña burbuja de aire.
10. 3ra. columna de Dulbecco® con medio de congelación.
11. 4ta. columna, pequeña burbuja de aire.
12. 5ta. columna, cargar el embrión en su medio.
13. 6ta. columna, pequeña burbuja de aire.
14. completar el resto de la pajuela con medio de congelación.
 Llevar los embriones a la congeladora con una temperatura de entre -6°C a
-7°C, donde permanecerán 10 minutos en stand by, hasta alcanzar los 35°C.
 A su término tocar la pajuela a la altura de la 3ra. columna con una pinza
hemostática, previamente sumergida en nitrógeno líquido para que alcance
en su extremo los -196°C. Este método (Seeding) evitará la muerte del
embrión por sobrefusión.
 La corrida de temperatura será de 0,5°C por minuto hasta alcanzar los 35°C, momento en que se introducirá la pajuela en nitrógeno líquido
(Plunging)
Proceso de descongelación de las pajillas
 Tomar la pajilla con una pinza y exponerla a temperatura ambiente durante
1 segundo.
 Sumergir la pajuela en agua a 35°C durante 1 minuto.
 Sacar la pajilla del agua y secarla sin agitarla.
 Cortar el extremo con un cortador especial evitando agitarla.
 Cargar la pajilla en la pipeta de transferencia e implantar el embrión sobre el
cuerno en que se presenta el cuerpo lúteo.
Lección 30. Transferencia de embriones en equinos
La técnica de transferencia de embriones en equinos es el procedimiento por el
cual se recolecta uno o más embriones a través de un lavaje uterino transcervical
de una yegua donante inseminada o servida por monta natural, 6 a 10 días postovulación, y se transfiere de manera no quirúrgica al útero de otra yegua receptora
sincronizada previamente (Losinno 2007).
La primera transferencia de embriones en
equinos realizada con éxito fue
comunicada por Oguri y Tsutsumi en 1972, pero no fue aceptado como
procedimiento en la industria equina hasta comienzos de los años 80. En 1984 se
realiza el 1° Simposio Internacional Equino en la Universidad de Cornell (U.S.A.),
el 2° en Canadá en el año 1989, y el 3° en Argentina en 1992. Actualmente, a 11
años de este evento, en nuestro país se realiza con éxito el trasplante de
embriones y cada día se acrecenta más la utilización de este método en la
reproducción equina. Hoy día esta técnica es considerada a nivel mundial, como
una de las técnicas de Reproducción Asistida más utilizada.
Indicaciones de la T.E en equinos
La T.E es una técnica que presenta mucho potencial en la explotación equina, en
aras del mejoramiento de la eficiencia reproductiva, algunas de las indicaciones
para la implementación de esta biotecnología son:
 Disminuir el intervalo generacional.
 Obtención de crías de hembras en exposición o competencia deportiva
 Obtención de crías de hembras con problemas o lesiones de tipo no
reproductivo.
 Obtención de crías de hembras de avanzada edad o hembras muy jóvenes
(entre dos y tres años de edad).
 Incrementar la producción de crías por hembra, lo cual permite la rápida
multiplicación de crías por hembra.
 Disminuir los riesgos de la gestión y el parto en yeguas de alto valor.
Fuente: http://www.transbio.com/images/trans0.jpg
Fig. 33. T.E en equinos.
Sin embargo la transferencia embrionaria en el equino no ha tenido el mismo éxito
que en el bovino, ya que no existe un método seguro de superovulación en la
yegua, esto implica que solo se puede obtener un embrión por ciclo si la yegua es
preñada. (Losinno 2007). Sin embargo, esta técnica permite la obtención de 6 a 8
crías por año, pero aquí existe una limitante, y es que algunas asociaciones
criadores restringen el número máximo de crías por año.
Técnica
Selección de Yeguas Receptoras. La selección de receptoras es uno de los
factores que inciden en mayor proporción en el éxito de la técnica. Se debe
seleccionar yeguas con una edad entre los 3 y 10 años, con buna condición
corporal y conformación, deben tener un peso y tamaño igual o superior al de las
yeguas donantes para poder llevar a buen término la gestación. Usualmente se
eligen yeguas de razas pesadas o sus cruzas para aprovechar rusticidad, tamaño,
temperamento y aptitudes maternas que facilitaran la cría del potro.
Las
receptoras seleccionadas son sometidas a un examen reproductivo en el cual se
examina la integridad de los órganos sexuales, asimismo se realiza un
seguimiento ecográfico de al menos dos ciclos para determinar la ciclicidad
(actividad folicular, ovulación) y se someten a un régimen alimentario que les
permita ganar peso después de la gestación.
Selección de Yeguas donantes. Las yeguas donantes son yeguas seleccionadas
por su alta genética, las mismas son sometidas a un completo examen
reproductivo que incluye tamaño, tono y forma del útero. El cervix, se examina por
vía vaginal y se realiza un cultivo cervical para obtener información del estado del
mismo, si se identifican anormalidades deben ser tratadas antes de su
introducción al programa de transferencia (Losinno 2007, Campos, 2007).
Sincronización de celo (Donante – receptora)
Es importante realizar un adecuado proceso de sincronización del celo entre la
yegua donante y las receptoras. Una buena alternativa es la utilización de un
progestágeno de suministro oral o alguno de los métodos alternativos, tal como se
explicó en el capítulo de sincronización. Durante el celo de la yegua donante se la
observa por ecografía para conocer el momento óptimo del servicio o
inseminación artificial. Luego de éste se procede a la selección, también mediante
ecografía, de 2 o más yeguas receptoras (de acuerdo a la disponibilidad de las
mismas), y de éstas se elige una, que de acuerdo al crecimiento folicular y
ovulación se encuentre mas sincronizada con la donante (Losinno 2007, Campos,
2007).
Colecta y transferencia de embriones
Al séptimo u octavo día post inseminación de la donante se realiza la colecta del
embrión o embriones mediante lavado uterino transcervical. Para esto se debe
seguir los siguientes pasos (Losinno 2007, Campos, 2007):
 Se coloca la yegua donante en un brete se venda la cola y se lava la región
perineal con abundante agua y un detergente suave, se enjuaga y seca.
 El operador se coloca un guante de tacto estéril, con gel lubricante estéril, y
procede a la introducción de un catéter (sonda Foley) de 80 cm de longitud,
con un balón inflable de 30-60 cc.a través del cervix, ubicando en el cuerpo
del útero el balón del catéter, que una vez allí es inflado con aire o suero.
 Se comprueba que esté en el sitio adecuado traccionando hacia atrás para
que no haya reflujo de líquido.
 Se lava el útero introduciendo por el catéter 3 litros de PBS (phosphate
buffer saline) o PBS modificado tibio a 30 a 35 °C. Luego se permite al
liquido salir y pasar a través de un filtro para embriones.
 Mediante masajeo del útero vía rectal se logra obtener el 80% del total del
líquido prefundido el cual si la yegua no tiene problemas uterinos debería
ser claro, libre de restos celulares y sangre. La recuperación de líquido
turbio indica endometritis.
 Al finalizar el lavado el contenido del filtro se vacía en una placa de petri
para buscar el embrión bajo lupa estereoscópica con un aumento de 15X.
 Luego de localizado el embrión se lava 3 o 4 veces con líquido de
enriquecimiento y se observa a mayor aumento para clasificarlo de acuerdo
a una escala que va de 1 (excelente) a 4 (pobre) de acuerdo a las
características de viabilidad embrionaria.
 Se introduce en una pajuela 0.5 o 0.25, (mediante aspiración a través de
una pipeta dosificadora para embriones o una pajuela adosada a una
jeringa) con medio de enriquecimiento y se mantiene a temperatura de 37
°C hasta el momento de la transferencia, preferentemente antes de 2 horas
de su recolección.
 Se coloca la pajuela dentro de un inyector de Inseminación Artificial
descartable, se protege éste con una camisa sanitaria estéril para evitar la
contaminación durante el pasaje de la misma por la vagina.
 El operador, con un guante de tacto estéril, con lubricante también estéril,
previo lavado y secado de los genitales de la yegua receptora, introduce la
mano en la vagina con la punta del inyector protegida en la palma de la
mano, rompe la camisa sanitaria y lo introduce a través del cervix en el
cuerpo uterino. Se deposita el embrión lentamente.
 Es imprescindible siempre administrarle a la yegua donante Prostaglandina
F2a para que esta retorne al estro, y asegurarnos que no se establezca la
preñez en aquellas yeguas en la que no se pudo recolectar embrión.
 A los 7 días de realizada la transferencia, se realizan ecografías en las
receptoras para diagnosticar preñez, que se repiten a los 20, 35, 50 y 60
días.
La tasa de recuperación de embriones por cada intento de colecta varía entre un
20% a un 160%. La variabilidad de estas obtenciones se debe, entre otros
factores, a la cantidad y calidad del semen utilizado, la edad y estado reproductivo
de la donante, el día post-ovulación en el que se intente obtenerlo, el número de
ovulaciones, la técnica de lavaje utilizada y el entrenamiento del operador
(Lossino, 2007).
UNIDAD 3. ULTIMAS BIOTECNOLOGIAS
REPRODUCTIVAS APLICADAS A LA PRODUCCION
ANIMAL
OBJETIVOS
 Conocer la técnica y los procesos desarrollados en la Fertilización in vitro.
 Identificar las ultimas biotecnologías aplicadas a la reproducción y su
estado actual a nivel mundial y a nivel local.
ESTRUCTURA
CAPITULO 1. FERTILIZACION IN VITRO.
Lección 31. Aspectos generales.
Lección 32. Obtención de ovocitos.
Lección 33. Maduración de ovocitos.
Lección 34. Fertilización in vitro.
Lección 35. Maduración y transferencia de embriones.
CAPITULO 2. CLONACION Y TRANSGENESIS.
Lección 36. Aspectos generales
Lección 37. Clonación.
Lección 38. Últimos avances en clonación.
Lección 39. Transgénesis.
Lección 40. Últimos avances en transgénesis.
CAPITULO 3. SEXAJE DE SEMEN, QUIMERAS, ICSI, CELULAS MADRE
Lección 41. Aspectos generales
Lección 42. Sexaje de semen.
Lección 43. Producción de quimeras.
Lección 44. Inyección intracitoplasmática de semen.
Lección 45. Producción de células madre
UNIDAD 3. ULTIMAS BIOTECNOLOGIAS
REPRODUCTIVAS APLICADAS A LA PRODUCCION
ANIMAL
CAPITULO 1. FERTILIZACION IN VITRO
Lección 31. Aspectos generales
La biotecnología de la Fertilización in vitro (FIV) ofrece una nueva dimensión en la
reproducción animal,
esta
técnica supera la inseminación artificial y
la
transferencia de embriones, lo cual permite ampliar las posibilidades de
mejoramiento de la productividad y eficiencia de las explotaciones bovinas
(Fernández, Bastidas y Trocóniz, 1997).
La FIV es una biotecnología que durante los últimos 10 años se ha venido
implementando de manera paulatina en ganaderías de alto valor genético. Su
valro está representado en un mayor número de embriones obtenidos durante
cada uno de los tratamientos, sin embargo su principal inconveniente radica en
los costos, pues requiere de un equipamiento especial, para los procesos de
maduración de ocovitos, fertilización in vitro y maduración embrionaria.
Sin embargo, si se cuenta con animales de alta genética es una buena alternativa
y puede implementarse en animales que no podrían ser utilizados en otras
biotecnologías, tales como (Cyagra, 2008):
 Vacas refractaria a tratamientos superestimulatorios.
 Vacas que no dan embriones transferibles en programas de Superovulación
y Transferencia de Embriones.
 Vacas con alteraciones anatómicas que impiden una correcta fecundación o
anidación del embrión. (Ej: adherencias post-cesárea)
 Vacas de desecho (por enfermedad o accidente)
 Vacas o Novillas hasta el primer tercio de gestación
 Vacas en puerperio
 Terneras Prepúberes
La fertilización in vitro comprende varias etapas, relacionadas de la siguiente
forma:
 Obtención de ovocitos.
 Maduración de ovocitos.
 Fertilización in vitro.
 Maduración in vitro.
 Transferencia de embriones.
Lección 32. Obtención de ovocitos.
Durante el ciclo estral es posible encontrar un elevado número de folículos que
inicia su desarrollo (Fase de reclutamiento) , sin embargo solo uno va a alcanzar la
ovulación, los demás involucionan o se atresian e inicia un nuevo ciclo estral. Esto
ocurre durante toda la vida reproductiva del animal, ocurriendo que solo unos
pocos folículos llegaran a la ovulación y miles involucionaran.
En este sentido, la recolección de ovocitos permite recuperar y aprovechar
folículos no ovulatorios, que bajo condiciones fisiológicas se tornarían en folículos
atrésicos, con el fin de aprovechar el máximo potencial genético de una donadora
por procedimientos in vitro. La recolección de ovocitos para el procedimeitno de
FIV se puede realizar en dos formas (Ramírez y Jiménez, 1999):
 Recolección en animales post-mortem.
 Recolección en animales vivos
Recolección en animales post-mortem: los ovarios pueden provenir de vacas de
alta genética que sufrieron algún accidente o trauma y requieren ser sacrificadas.
En otros países estos ovarios pueden ser obtenidos de vacas de matadero, para
obtener animales comerciales, sin embargo en nuestro país esto no es viable por
el elevado valor de la técnica. Los ovocitos se pueden recoger por aspiración de
folículos visibles o mediante el método de corte de la superficie e interior del
ovario. La temperatura a la cual se deben transportar los ovarios desde el
matadero o el sitio de colecta hasta el laboratorio, oscila entre 35 y 37 oC, y en esta
temperatura pueden permanecer hasta 8 horas, sin llegar a afectar su maduración
y fertilización.
En la técnica de corte (Ramírez y Jiménez, 1999) se corta la superficie y el interior
de los ovarios a lo largo y se hace remoción del tejido adyacente, del cuerpo lúteo
y de sangre con lavados de solución salina y alcohol. En la técnica de aspiración
los folículos superficiales visibles de 2 a 5 mm son aspirados mediante el uso de
jeringas y agujas de 16G.
Recolección en animales vivos: En animales vivos la recolección de ovocitos se
puede realizar por aspiración trasvaginal guiada por ultrasonido (OPU, por sus
siglas en inglés, Ovum Pick Up) y por laparoscopia / laparotomía. La técnica más
común y menos traumática es la de OPU, y se puede realizar hasta 2 veces por
semana y repetida durante 5 a 6 meses, y con una periodicidad de dos
aspiraciones por semana o una semanal, sin ningún efecto adverso sobre la
reproducción o sobre el bienestar del animal. Se ha demostrado que al final del
periodo de aspiraciones los animales pueden retornar a sus ciclos estrales
normales y ser incorporados a programas de cría (Rodríguez, 2006). Para el
procedimiento, se debe aplicar anestesia epidural, con el fin de evitar
contracciones abdominales y
las
facilitar la manipulación de los ovarios, se debe
vaciar el recto y limpiar la región perineal. Se utiliza un ecógrafo con transductor
de 5 ó 7.5 MHz que posee una aguja en la parte superior con punta ecogénica
conectado a una bomba peristáltica de vacío que es introducido por vía vaginal.
Se hace manipulación rectal de los ovarios y se colocan contra el transductor, se
visualizan los folículos (mayores de 2 mm) y una vez localizados, la aguja
atraviesa la pared vaginal y se recoge el aspirado folicular en tubos que contengan
el medio de cultivo. En cada pasaje de la aguja se punciona solamente un folículo
(Ramírez y Jiménez, 1999)
Mediante aspiración folicular se pueden obtener de 4 a 20 oocitos por donante, los
cuales se maduran, fertilizan y cultivan in vitro hasta el momento de la
transferencia. Se ha visto, además, que después de la aspiración de los folículos
terciarios, una nueva cohorte de folículos se desarrolla. La viabilidad de los
embriones producidos a partir de oocitos obtenidos por aspiración es similar a la
alcanzada por embriones producidos por otros procedimientos in Vitro, pero un
poco más baja que la obtenida para embriones producidos por lavado,
obteniéndose porcentajes de preñez que varían desde un 25 hasta un 45%
(Rodríguez, 2006).
Lección 33. Maduración de ovocitos in vitro
Para el proceso de maduración es necesario realizar una buena selección de los
ovocitos a madurar, en tal sentido se deben seleccionar aquellos con el citoplasma
homogéneo, no granular, ni polarizado y con células del cúmulo intactas rodeando
al gameto, ya que ellos representan los mayores porcentajes de maduración. Los
ovocitos rodeados por un cúmulo compacto formado por varias capas de células,
presentan mayores porcentajes de maduración, fecundación y de desarrollo hasta
blastocistos, que los que carecen de cúmulo o los que están rodeados solamente
por la corona radiata.
La selección de los ovocitos se realiza generalmente en base a tres criterios: el
diámetro del ovocito, el aspecto de su citoplasma y las características del cúmulo
que los rodea. El diámetro de los ovocitos condiciona su capacidad para madurar,
de tal forma que los ovocitos bovinos con un diámetro inferior a 110 μm se
encuentran todavía en fase de crecimiento y no han adquirido aun la capacidad
para madurar (Herradon et al, 2007).
La maduración in vitro constituye una etapa decisiva en el rendimiento del proceso
de producción de embriones in vitro. El medio de maduración en el que
tradicionalmente se han madurado los ovocitos incluye TCM-199, suplementado
-estradiol
(Herradon et al, 2007). No obstante, los ovocitos bovinos reinician la meiosis en
una gran variedad de medios que van desde una solución salina simple hasta
medios más complejos, sin embargo, se prefiere estos últimos ya que se ha
comprobado que el medio utilizado afecta no solamente la capacidad posterior de
fecundación, sino que también el desarrollo embrionario (De los Reyes, 1994).
El medio de maduración más comúnmente utilizado es el medio 199 (TCM199),
adicionalmente se hace suplementación del medio con gonadotrofinas y estradiol,
las cuales tienen un efecto favorable, especialmente en lo que se refiere al
desarrollo post maduración. Las gonadotrofinas provocan un aumento significativo
en la cantidad de AMPc en las células de la granulosa e inducen la maduración
ovocitaria. La LH mejora las condiciones de maduración in vitro, modificando el
ambiente nutricional ya que aumenta la energía disponible para el ovocito;
adicionalmente impide los efectos inhibitorios que actúan sobre el gameto,
logrando de ese modo la ruptura de la vesícula germinal. Por otro lado, la FSH
induce la expansión de las células de cúmulo en bovinos, a través de la síntesis de
piruvato y ácido hialurónico. Se ha sugerido además que la FSH y el estradiol
participarían en el bloqueo a la poliespermía durante la fecundación, a través de la
síntesis previa de los gránulos corticales (De los Reyes, 1994).
La adición de esteroides no afectaría la maduración nuclear in vitro, ni la
penetración espermática posterior de los ovocitos bovinos, lo que puede indicar
que la maduración no sería mediada a través de los esteroides; sin embargo, los
ovocitos
que son madurados sin estradiol disminuyen su capacidad de
segmentarse normalmente y lograr un desarrollo posterior (Sirotkin, 1992, citado
por De los Reyes, 1994).
El tiempo de incubación como también la temperatura, son parámetros
importantes a considerar en los protocolos de maduración ovocitaria, la
temperatura de incubación debe estar entre 37 y 39°C. La duración del proceso de
maduración está entre 22 y 26 horas.
Lección 34. Fertilización in vitro
Este proceso dura aproximadamente 18 horas, se requiere inducir la capacitación
espermática
en los espermatozoides que van a ser utilizados para la
fecundación, lo anterior debido a que la capacitación espermática ocurre
normalmente a nivel del tracto reproductivo de la hembra, entonces se requiere
imitar los efectos ocurridos normalmente durante el proceso de fecundación
natural. Durante este proceso de capacitación el gameto sufre una serie de
fenómenos que lo conducen a la hiperactivación y reacción acrosómica, procesos
considerados vitales para la penetración espermática a la zona pelúcida y para la
posterior fusión del espermatozoide con la membrana plasmática del ovocito.
Para lograr el proceso de capacitación y reacción acrosómica, se han utilizado
diverso métodos, uno de ellos es la separación celular previa mediante "swim up",
hace que se recuperen los espermatozoides con mejor motilidad y la posterior
incubación de éstos con heparina, mediante esta técnica se han obtenido altos
porcentajes de fecundación in vitro. Otra alternativa de separación espermática es
el gradiente de percol, que es equivalente a un "swim down", ya que se recuperan
del fondo del tubo los espermatozoides más motiles (De los Reyes, 1994).
La fecundación va a depender de que haya ocurrido una adecuada maduración
nuclear y citoplasmática de los ovocitos bovinos, y una eficiente capacitación de
los espermatozoides. Esta técnica se realiza en gotas de 50-100 µl de medio
Tyrode tamponado (pH 7,8), utilizando una proporción de 10-15 ovocitos intactos o
previamente denudados de las células del cúmulo, ya que ello podría favorecer la
penetración espermática (Hawk y col., 1992, Herradon et al, 2007), con una dosis
aproximada de 1 millón de espermatozoides por ml de medio. El medio para el
desarrollo de esta técnica debe contener una atmósfera de CO 2 del 5% y una
temperatura adecuada (39°C), durante un periodo comprendido entre 18 y 20
horas.
Lección 35. Maduración de embriones (Cultivo in vitro)
Los medios utilizados para el cultivo de los embriones bovinos han sido
clasificados en tres categorías:
 Indefinidos, cuando se utiliza suero y cocultivo con células somáticas;
 Semidefinidos, cuando se omite el cocultivo y el suero se reemplaza por
albúmina sérica;
 Definidos, cuando el suero se reemplaza por macromoléculas como el
polivinil alcohol o la polivinil pirrolidona.
Para la maduración de los embriones se procede a denudar los ovocitos que
consiste en desprender del mismo a las células de la granulosa, las cuales lo
rodean como si fuera una corona. De esta forma el ovocito fecundado, en el medio
especifico, se lleva a una estufa cuya característica principal es el bajo porcentaje
de oxigeno en su ambiente. Se inicia así la etapa que se denomina “Cultivo” en la
cual, durante 6-7 días se llevará a cabo la división celular hasta llegar al estadio de
mórula o blastocisto, evolución que denominamos desarrollo embrionario (Cyagra,
2008).
Transferencia de embriones
Finalmente los embriones obtenidos pueden ser criopreservados o transferidos en
fresco a receptoras sincronizadas.
Fuente: Hernández, Hugo (2004).
Fig. 34. Proceso de FIV.
CAPITULO 2. CLONACION Y TRANSGENESIS.
Lección 36. Aspectos generales
Desde que se produjo la primera clonación de un mamífero el año de 1996, con la
oveja Dolly, se han realizado muchos experimentos en diversas especies, sin
embargo aún se discute mucho en los aspectos legales, éticos, sociales y
económicos que trae como consecuencia la implementación de esta biotecnología
en la producción animal.
La clonación puede definirse como el proceso por el que se consiguen copias
idénticas de un organismo ya desarrollado, de forma asexual. Estas dos
características son importantes:
 Se parte de un animal ya desarrollado, porque la clonación responde a un
interés por obtener copias de un determinado animal que nos interesa, y
sólo cuando es adulto conocemos sus características.
 Por otro lado, se trata de hacerlo de forma asexual. La reproducción sexual
no nos permite obtener copias idénticas, ya que este tipo de reproducción
por su misma naturaleza genera diversidad.
Este proceso de clonación a partir de células adultas ya diferenciadas ha sido el
resultado de mínimo 40 años de investigación en diferentes áreas del
conocimiento, como la genética y la biología reproductiva. El sincronizar tanto la
célula donante como la receptora permitió el éxito final de un procedimiento que se
creía imposible. Este avance científico abrirá nuevos horizontes especialmente en
el campo de la biotecnología (Serrano, 2004).
Lección 37. Métodos de clonación
De acuerdo a lo expresado por Chuaire, Sánchez y Franco (2004), existen
básicamente dos métodos de clonación: la partición y la transferencia de células
somáticas.
Partición. En esta técnica se utilizan embriones octocelulares, en estado de
preimplantación. Estos embriones son sometidos a una microcirugía que los
divide, luego se toman las mitades o secciones y se introducen dentro de zonas
pelúcidas naturales o artificiales. A continuación, se efectúa la implantación del
producto en el endometrio. El número máximo de células del embrión, no puede
ser superior a 8, porque a partir de este momento, se inicia la expresión del
genoma embrionario. Los individuos obtenidos son prácticamente idénticos entre
sí, aunque diferentes a los progenitores, por lo cual se considera que son el
equivalente de los gemelos monocigóticos.
Clonación por transferencia nuclear de células somáticas (SCNT: Somatic
Cell Nuclear Transfer). En este tipo de clonación se utilizan dos tipos de células:
somáticas o no sexuales, y sexuales femeninas, u ovocitos. Los núcleos de
células somáticas de individuos postnatales son transferidos dentro de ovocitos o
de cigotos enucleados. Esta técnica tiene la ventaja que permite conservar el
genoma durante la diferenciación celular y la capacidad del citoplasma celular
para reprogramar la actividad génica y aumentar la redireccionalidad de la
diferenciación celular. Para clonar a un ser vivo mediante SCNT, se extrae el
material genético de ambos tipos de células y, a continuación, se inyecta el núcleo
de la célula somática que se desea clonar (donante), dentro del oocito
previamente enucleado (receptor). El transplante de núcleos somáticos dentro de
ovocitos enucleados tiene como fin reproducir los procesos bioquímicos y
fisiológicos que, de manera natural, se desencadenan durante la fertilización.
Fuente: www.produccionbovina.com/genetica...en.../11-clonacion.pdf
Fuente: http://www.unav.es/cryf/clonacion3.png
Fig. 35. Proceso de clonación.
Lección 38. Técnica de clonación.
Para poder lograr la clonación es necesario tener los siguientes elementos:
 Un núcleo que contenga la información hereditaria completa,
 El citoplasma de un óvulo que debe corresponder, en principio, a la misma
especie que el núcleo trasplantado y
 Una madre receptora que anidará en su útero al embrión. Respecto al valor
de la especie que anida el embrión, se debe notar que hay casos en que el
útero de una especie puede anidar a un ejemplar de otra especie diferente,
como el caso de una yegua que sirvió de madre huésped para una cebra, o
el caso de osos pandas que pueden desarrollarse en úteros de hembras de
otras especies de osos (Rojas, et al, 2004).
Fuente: http://www.drogomedia.com/hemeroteka/archivos/200807254.pdf
Fig. 36. Clonación por transferencia nuclear.
La técnica de clonación por transferencia nuclear se llama así porque involucra
transferir el núcleo (y, por lo tanto, la mayor parte del material genético) de una
célula de un ser existente a un óvulo, con el fin de reemplazar el núcleo del óvulo.
Este huevo, ahora un embrión, se divide por la aplicación de energía eléctrica, y
es guiado por su nuevo material genético a desarrollarse como un ser que es
genéticamente casi idéntico al cual se extrajo el núcleo. A continuación se explica
este proceso paso a paso.
Enucleación.
Se toma una célula somática, mediante un proceso de microcirugía se extrae el
núcleo que contiene todos los cromosomas (la información genética)
Fuente: www.forodegeneticabovina.com/pdfs/03_rigali_florencia.pdf
Fig. 37. Enucleación.
Transferencia nuclear.
Se toma un óvulo no fertilizado y se le extrae el núcleo.
Fuente: www.forodegeneticabovina.com/pdfs/03_rigali_florencia.pdf
Fig. 38. Transferencia nuclear.
Ovocito con núcleo transferido.
Mediante una microcirugía se transfiere el núcleo (la información genética). El
citoplasma provee los nutrientes para el desarrollo del futuro embrión.
Fuente: www.forodegeneticabovina.com/pdfs/03_rigali_florencia.pdf
Fig. 39. Ovocito con núcleo.
Fusión.
Posteriormente se aplica una mínima corriente eléctrica para que la célula se
empiece a dividir como si hubiese sido fertilizada (Electroestimulación). El ovocito
se pega a las células somáticas mediante fusión eléctrica. Se espera un lapso de
tres horas y después se provoca, mediante un procedimiento químico que genera
la entrada de grandes cantidades de calcio, un engaño de fertilización en el óvulo.
El núcleo que estaba contraído durante la fusión se dilata nuevamente y empieza
a dividirse la célula, primero en dos, después en cuatro, hasta llegar a ocho
(Fauba, 2007).
Fuente: www.forodegeneticabovina.com/pdfs/03_rigali_florencia.pdf
Fig. 40. Electrofusión.
Cultivo embrionario.
Las células se multiplican en un tubo de ensayo y son cultivadas durante un
periodo de 7 días.
Fuente: www.forodegeneticabovina.com/pdfs/03_rigali_florencia.pdf
Fig. 41. Cultivo.
Transferencia embrionaria.
Al séptimo día es transferido el embrión en vacas receptoras sincronizadas para
tal fin.
Fuente: www.forodegeneticabovina.com/pdfs/03_rigali_florencia.pdf
Fig. 42. Transferencia embrionaria.
Avances de la clonación animal
La clonación ha tenido un gran desarrollo durante los últimos años, desde que se
realizó por primera vez con éxito en una oveja en el año 2007, son muchos los
experimentos que se han realizado con diversos resultados en varias especies. A
continuación se señalan los avances cronológicos que se han obtenido en las
especies animales (Vivanco, 2009).
Avance de la clonación en las diferentes especies
1997
Ovinos: La oveja “Dolly”, Escocia
1998 Vacunos: “Elsie” clon de “Lady”, NZ
1998
Ratones
1999
Caprinos
2000 Cerdos
2002 Conejo y gato
2003 Mula, Rata y Yegua (Prometea)
2004 Venado Rojo y Gato montés
2005 Perro
2006 Mink
2007 Lobo y Búfalo
2009
Camello
Fuente: http://www.drogomedia.com/hemeroteka/archivos/200807254.pdf
Fig. 43. Clonación en las diferentes especies.
La clonación de Dolly
En el año de 1997 en Escocia, se dio al mundo la noticia de la primera clonación
con éxito, el científico responsable de este logro fue Ian Wilmut, quien logro la
clonación de una oveja, a quien llamaron “Dolly”. Sin embargo el proceso de
clonación de Dolly no fue fácil, este fue un proceso largo y complejo, resultado de
decenas de experimentos en diversos laboratorios con un sinnúmero de fracasos.
El primer paso fue obtener por medio de biopsia células mamarias de una oveja
blanca en el tercer trimestre de preñez. Estas células fueron cultivadas in vitro y
luego mantenidas durante cinco días en un medio pobre en suero para llevar el
ciclo celular al borde de la apoptosis. Cada una de estas células en estado de casi
hibernación fueron introducidas en un ovocito enucleado de una oveja de cabeza
negra. Estos ovocitos habían sido obtenidos quirúrgicamente por perfusión de los
oviductos después de una estimulación ovárica, durante la metafase II, en el
momento de la ovulación. Después de aspirar el núcleo (incluso el cuerpo polar y
algo de citoplasma) los ovocitos fueron puestos en cultivo a 37 °C y activados con
un primer pulso eléctrico y luego fusionados con las células mamarias continuando
con una serie de pulsos eléctricos, lo que permitía la formación de una nueva
célula, un nuevo embrión. Mediante este proceso de obtuvieron 277 embriones,
los cuales
fueron introducidos en el oviducto previamente ligado de diversas
hembras. Después de 6 días, 247 fueron recuperados, y de ellos únicamente 29
habían llegado a la etapa de blastocito. Estos 29 embriones fueron introducidos en
el útero de 13 ovejas. En julio, un solo embrión había llegado a término, naciendo
una oveja de cabeza blanca que recibía el nombre de Dolly (Dosne, 2001). Si bien
el desarrollo de Dolly fue normal durante los primeros años, luego se manifestó
una artritis severa a una edad precoz para su especie, y se observó, al igual que
en los demás animales clonados por esta técnica, una disminución en la longitud
de los telómeros. Este punto es de gran interés, ya que la longitud de los extremos
de los cromosomas (los telómeros) podría funcionar como un reloj genético, lo que
ha llevado a especular
acerca de cual sería la edad real de Dolly.
Finalmente, Dolly murió a los 6 años de edad (la vida media de una oveja es de
alrededor de 12 años) debido a una afección pulmonar, sin que se haya podido
establecer hasta el momento si esta enfermedad está relacionada a su origen
clonal.
Fuente: http://www.queciencia.com/wp-content/uploads/2007/12/01-ciencia-oveja-dolly.jpg
Fig. 44. Oveja Dolly y su creador.
Clonación en bovinos
En el año de 1998 se dio el nacimiento del primer vacuno clonado en el mundo, el
clon de la vaca Lady, en Nueva Zelanda en Agresearch/arTech Ruakura Research
Station, la ternera fue llamada “Lady”.
Fuente: http://www.rarebreeds.co.nz/enderby1.jpg
Fig. 45. Lady, la primera ternera clonada.
Posteriormente en el año 2002, se produjo el primer clon en el mundo de un toro
probado, producido en Italia por el Dr. Cesare Galli en el Instituto Lázaro
Spallanzani, el toro fue bautizado con el nombre de “Galileo”
En el año 2002, se produjo el primer clon de un ternero en Argentina, se trató de
un vacuno raza jersey, Pampa fue creada a partir de una célula somática (célula
adulta) de un animal, que permitió obtener otro con idéntica información genética.,
A partir de este método de clonación nació luego Pampa Mansa, una vaca
también de raza Jersey que porta el gen de la hormona de crecimiento humana
(hGH: somatotropina) en sus células de la glándula mamaria.
Fuente: http://www.pregonagropecuario.com.ar/assets/images/upload/ternera_PAMPA.jpg
Fig. 46. Pampa mansa.
En el año de 2008, Científicos de la Universidad de San Martín, Buenos Aires,
clonaron por primera vez a un toro de raza Brangus, al que llamaron “Manuel”,
producto de unas células de un toro llamado “ciruelo”. Sin embargo, este toro fué
resultado de una gran cantidad de experimentos, ya que para lograr este resultado
se tuvieron que implantar 20 embriones, de los cuales se lograron cinco preñeces,
sin embargo, se presentaron 2 pérdidas embrionarias tempranas antes del día 60,
posteriormente al día 120, solo habían dos preñeces y al octavo mes, sólo una,
luego al día 280 de gestación se realizó la cesárea y se obtuvo el nacimiento del
primer clon argentino. En la actualidad en Argentina, la empresa de biotecnología
animal y vegetal Goyaike ya tiene 16 toros clonados de pedigrí con fines
productivo en su propio rodeo y día a día se especializa más en brindar servicios
de clonación a terceros, abriendo así el mercado de a compra y venta de ADN.
Fuente: http://d.yimg.com/i/ng/ne/afp/20090708/09/3810366514-argentina-clona-mundo-toro-raza-brangus.jpg
Fig. 47. Manuel
En Chile en al año 2008, fue producido el primer bovino chileno a través de
técnicas de clonación, una hembra de nombre "Victoria", enmarcado dentro de un
proyecto impulsado y cofinanciado por la estatal Fundación para la Innovación
Agraria (FIA) y por investigadores de la Facultad de Medicina Veterinaria de la
Universidad de Concepción .
Fuente: http://www.perulactea.com/panel/noticias/gallery/040808145terneroclon%20chil e.jpg
Fig. 48. Victoria
Clonación en equinos.
En el año 2003, científicos italianos, lograron la primera clonación en equinos, una
yegua a la que llamaron "Prometea", la yegua fue creada en el Laboratorio
Especial de Técnicas Reproductivas de Cremona, en el sur de Italia. La madre
nodriza de Prometea es a la vez la vez donante de las células para la producción
de Prometea, es decir es su madre nodriza y su “original” de Prometea.
Fuente: http://www.diariodenavarra.es/actualidad/20030806/culturaysociedad/culturaysociedad50_300.jpg
Fig. 49. Prometea y su progenitora.
Clonación en caninos.
En Agosto del año 2005, el investigador Woo Suk Hwang, doctor en Medicina
Veterinaria y Filosofía, exdirector del Departamento de Teriogenología y
Biotecnología del Colegio de Medicina Veterinaria en la Universidad Nacional de
Seaul, Corea del Sur, fue el primer científico en lograr la clonación de un perro de
raza Afgano, llamado
Snuppy. Aunque dos estudios de Hwang sobre células
embrionarias humanas posteriormente resultaron ser falsos, Snuppy sí era un clon
auténtico. El perrito clon se llama Snuppy, por su abreviatura de Seúl National
University Puppy, es decir: cachorro de la Universidad Nacional de Seúl, la
"maternidad" donde nació. Sin embargo, es importante señalar que más de mil
embriones transferidos a 123 recipientes, sólo Snuppy sobrevivió. Uno terminó en
aborto, y otro murió de neumonía a los 22 días de vida. Los investigadores no
relacionaron esa dolencia con el hecho de que haya nacido por clonación.
Fuente: http://greatdane.lt/var/greatdane/storage/images/media/images/snuppy/36113-1-lit-LT/Snuppy.jpg
Fig. 50. Snuppy
Posteriormente, en el año 2008 un cachorro labrador de 10 meses fue clonado por
una empresa californiana en Corea del Sur, para una pareja estadounidense,
constituyéndose en la primera clonación comercial del mundo. La empresa
responsable de este proceso fue
BioArts International en San Francisco, y el
responsable del servicio de clonación, fue Lou Hawthorne. En este mismo año,
Hawthorne clonó a su propia perra: Missy, una mezcla de border collie y husky,
que había muerto en 2002 a los 15 años, con su material genético congelado se
crearon tres hermanos, los tres cachorros se parecían a Missy y heredaron sus
características, de acuerdo con Hawthorne.
Hawthorne en 1997, luego del éxito en la clonación de la oveja Dolly, compró al
equipo de Dolly la licencia mundial para clonar perros y gatos., en este sentido, en
el año 2004 la firma de biotecnología de Hawthorne, llamada entonces Genetic
Savings and Clone, inicio la clonación de gatos a pedido, por un valor cercano a
los 50.000 dólares. Sin embargo, dos años después la empresa tuvo que cerrar
porque el procedimiento no era rentable económicamente.
Fuente: http://misionlandia.com.ar/blog/mascotas/files/perro-clonado.jpg
Fig. 51. El primer cachorro clonado comercial.
Fuente: http://www.elmundo.es/elmundo/2009/04/29/ciencia/1241005919.html
Fig. 52. Caninos clonados.
En Corea del sur, el año 2009 en un grupo de científicos consiguieron clonar
cuatro perros transgénicos (de la raza beagle) cuya piel brilla con un color rojo
fluorescente. El objetivo del experimento es demostrar la utilidad de esta técnica
en la investigación biomédica. Los cuatro cachorros de beagle tienen la misma
apariencia que cualquier otro beagle a la luz del día. Sin embargo, bajo rayos
ultravioleta, brillan en la oscuridad con un tono rojizo, y tanto sus uñas como su
vientre tienen este color incluso bajo una luz normal. Según el profesor Lee
Byeong-chun, de la Universidad Nacional de Seúl, que ha dirigido al equipo
científico responsable del experimento, asegura que se trata de los primeros
perros transgénicos del mundo a los que se les ha implantado genes fluorescentes
(El mundo, 2009).
Clonación en ratones.
En el año de 1998, los científicos japoneses Teruhiko Wakajama y Ryouzo
Yanagimachi, de la Universidad de Hawai, presentaron al mundo unos ratones
clónicos, y lo han logrado mediante un técnica distinta a la que utilizaron los
investigadores
del
Instituto
Roslin
para
crear
a
"Dolly".
El primer ratón (que nació en octubre de 1997) fue bautizado como "Cumulina",
se trasnfirieron mas de 800 embriones, sin embargo solo fue posible la obtención
de un pequeño grupo de hembras de ratón sanas (10 ratones).
Lección 39. Transgénesis
Normalmente, en los organismos superiores animales o vegetales la información
genética se transmite por mecanismos de reproducción sexual; es lo que se
conoce como transmisión genética vertical. Sin embargo, hace aproximadamente
treinta
años se logró obtener los primeros ratones transgénicos mediante
transferencia génica por inyección directa de ADN extraño en un cigoto obtenido
por fecundación in vitro; es decir, se trataba de una transmisión genética
horizontal, también llamada transgénesis. La transgénesis se puede definir como
la introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable
de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares.
Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgen, se introduce en
zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN extraño en su genoma,
previamente a la primera división, producirán un organismo transgénico; de modo
que el transgen pasará a las siguientes generaciones a través de la línea germinal
(gametos) (Lacadena, 2002)
Los estudios experimentales fueron iniciados por
Gordon y Ruddle en 1980
(Lacadena, 2002) en los mismos inyectaron ADN de ratón en uno de los
pronúcleos de un cigoto de la misma especie. En 1981, Gordon y Ruddle
demostraron la integración y transmisión estable a través de la línea germinal de
genes inyectados en pronúcleos de cigotos de ratón obtenidos por fecundación in
vitro, desarrollando así los primeros ratones transgénicos. El paso siguiente
consistió en probar que también se podían obtener ratones transgénicos que
incorporaran en su genoma un gen (transgén) de otra especie. Así, Palmiter en el
año de 1982 obtuvieron ratones transgénicos gigantes al inyectar en el pronúcleo
de un cigoto el gen de la rata que codifica para la hormona del crecimiernto.
Incluso, se obtuvieron también ratones transgénicos gigantes cuando el transgén
introducido era el gen humano que codifica para la hormona de crecimiento
(Lacadena, 2002).
La transgénesis comprende la introducción de ADN exógeno en el genotipo de un
animal, esta es una herramienta importante tanto para la agricultura, como para la
farmacología, la biomedicina y la biotecnología. Una gran variedad de métodos
han sido desarrollados para introducir ADN, entre ellos la inyección de ADN en
embriones y la transfección de células somáticas seguidas del transplante nuclear
o clonación (Salamone, 2005).
Lección 40. Técnicas de obtención de animales transgénicos
Las técnicas de obtención de animales transgénicos son:
 Microinyección de ADN en núcleo de ovocito
 Vectores virales o retrovirus
 Manipulación de células embrionarias
Técnicas:
Transgénesis por microinyección de ADN en núcleo de ovocito: Es una
técnica fácilmente aplicable a una variedad de especies, el inconveniente radica
en que el gen se inserta al azar en el genoma y que solo el 5% de los ovocitos dan
lugar a un animal transgénico vivo. Par realizar la téncia en primer lugar se induce
la superovulación en la hembra, a nivel del laboratorio se hace la fertilización in
vitro. Se inyecta el nuevo gen en el
núcleo del ovocito,
posteriormente los
ovocitos son reintroducidos en hembras receptoras, sin embargo, el porcentaje de
embriones que sobreviven es muy bajo. Por último, tras el destete de los recién
nacidos, éstos se chequean, para ver si ha ocurrido la incorporación del transgén.
Transgénesis por Retrovirus: Mediante esta técnica se consigue que el trasgen
esté presente en todas las células de individuo transgénico, sin embargo el gen
también se inserta al azar. Cabe la posibilidad de que el retrovirus usado como
transporte se reproduzca en el organismo transgénico dando lugar
a la
presentación de enfermedades. El proceso consiste en elegir un virus benigno y
atenuarlo hasta eliminar su carga viral, se inserta en el virus el transgen que se
desea introducir. El virus actúa como medio de
transporte, cuando el virus
comienza a replicarse al interior de las células se libera el transgen.
Transgénesis por manipulación de células madre embrionarias: Este método
es el menos aleatorio y se utiliza cuando es importante dirigir las secuencias
genéticas a lugares específicos del genoma. Cuando las células están en cultivo
es posible llevar a cabo modificaciones genéticas especificas como la eliminación
o sustitución de un gen, por lo tanto se tiene la célula madre transgénica, y se
realiza la respectiva modificación. Las células modificadas son inyectadas en
embriones en fase de blastocisto, los individuos resultantes portan el gen
transferido solo en un porcentaje de sus células.
Avances en transgénesis
Los fines que pretende la transgénesis, es la creación de animales genéticamente
superiores, con diversos fines: animales para producción comercial, animales
resistentes a enfermedades, animales gigantes, animales con fines terapéuticos
(animales productores de medicamentos o donantes de órganos, animales
pharming).
El uso principal de la transgénesis en los animales ha sido su utilización como
“laboratorios vivientes” para la producción de medicamentos, en tal sentido, los
animales son utilizados como biorreactores para producir proteínas y sustancias
biológicas de interés para la salud humana, las cuales son segregadas en la leche
por el ganado. Por tal razón, en Estados Unidos, a las granjas de experimentación
con animales transgénicos se les ha empezado a llamar "pharms", haciendo un
juego de palabras que intercambia el significado original de la palabra granja
(granja en inglés se dice "farm") por el de "pharmacy" (que quiere decir farmacia).
Y es que una de las aplicaciones de la transgénesis. En el año 1990 en el Instituto
Roslin de Escocia se creó la primera oveja transgénica, a cual segregaba alfa-1antitripsina en su leche. Esta enzima es empleada en el tratamiento del enfisema
pulmonar, una enfermedad que suele tener carácter hereditario y que afecta a las
fibras elásticas de los pulmones. La leche de estas ovejas contiene hasta un 30%
de alfa-1-antitripsina, una sustancia que también se encuentra en experimentación
en los Laboratorios PPL para el tratamiento de la fibrosis quística, luego esta
enzima es aislada a nivel del laboratorio. La elaboración de productos
farmacéuticos es uno de los resultados más visibles de las investigaciones con
animales transgénicos, pero la mayor parte de este tipo de animales se destina a
la investigación básica. Los ratones transgénicos, por ejemplo, han aportado una
nueva visión a los científicos sobre cómo funciona el sistema inmune, el cerebro,
la memoria, la formación de órganos y han sido especialmente valiosos en
oncología (Lacadena, 2002).
En el año 2002, en Argentina se logró la clonación de Pampa Mansa, una vaca
Jersey a la cual se le agregó un gen para la producción de hGH (Somatotropina
humana), por lo cual produce grandes cantidades de la hGH en su leche.
Por otro lado, durante los últimos años los estudios en transgénicos se han
enfocado hacia la producción de animales para consumo,
el objetivo es
introducirles genes que induzcan el crecimiento mayor, con menos cantidad de
grasa y resistencia a las enfermedades, entre otros aspectos.
Dentro de este marco, en el año 2006 se logró el nacimiento de algunos lechones
con producción de ácidos omega 3, benéficos para la salud humana. Para obtener
estos animales transgénicos, los investigadores transfirieron al núcleo de las
células madre un gen llamado fat-1, responsable de la producción de una enzima
que transforma en omega-3 los ácidos grasos omega-6, menos beneficiosos pero
más comunes. Luego se usó el método de clonación empleado en 1996 con la
oveja Dolly. De 1.633 embriones implantados en 14 cerdos, nacieron vivos 10
lechones, de los cuales seis tenían el gen fat-1 (Carletti, 2006).
El 28 de mayo de 2009, en la revista Nature, científicos japoneses informaron la
creación de micos tití transgénicos. Estos primates se incorporó un transgen de
proteína verde fluorescente en la línea germinal y se logro la trasmisión en la
descendencia, constituyéndose un gran avance para estudiar las enfermedades
humanas y las posibles terapias (Margawati, 2009).
Tabla 16. Avances de la transgénesis.
MAMÍFEROS TRANSGÉNICOS: ANTECEDENTES Y CRONOLOGÍA
1938:
Spemann propone experimento de transferencia nuclear
1949:
Hammond mantiene embriones de ratón en cultivo in vitro
1961:
Tarkowski obtiene ratones quiméricos agregando embriones
1966:
Lin describe la técnica de microinyección de embriones de ratón
1980:
Gordon, Ruddle y col. obtienen los primeros ratones transgénicos por
microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981
Gordon y Ruddle obtienen ratones transgénicos por microinyección de ADN en
el pronúcleo de cigotos de ratón
1981:
Evans y Kaufman obtienen células embrionarias totipotentes de ratón
1982:
Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de
la hormona del crecimiento de la rata
1983
Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de
la hormona de crecimiento humana
1983:
McGrath y Solter desarrollan una nueva técnica para experimentos de
transferencia nuclear en ratón
1985:
Hammer y col. obtienen animales de granja transgénicos (conejos, ovejas,
cerdos) con el transgén de la hormona del crecimiento humano
1987:
Thomas y Capecchi obtienen los primeros ratones knockout por recombinación
homóloga
1989
Clark y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano del factor IX de
coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN en el pronúcleo del
cigoto
1991
Wright y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano de la a -1antitripsina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos
1991
Ebert y col. obtienen cabras transgénicas con el gen AtPH humano (activador
tisular de plasminógeno) mediante microinyección de ADN en pronúcleo de
cigoto
1991
Krimpenfort y col. obtienen vacas transgénicas con el gen humano de la
lactoferrina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos
1993:
Nagy y Rossant obtienen ratones quiméricos por co-cultivo de embriones
1993:
Schedl y col. obtienen ratones transgénicos con cromosomas artificiales de
levaduras
1994:
Brinster y col. obtienen ratones transgénicos por transplante de
espermatogonias
1996:
Campbell y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células
embrionarias en cultivo
1997:
Wilmut y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células
diferenciadas fetales y adultas en cultivo
1997:
Schnieke y col. obtienen ovejas clónicas transgénicas por transferencia nuclear
a partir de células fetales diferenciadas
1998:
Cibelli y col. obtienen vacas clónicas transgénicas por transferencia nuclear a
partir de células fetales diferenciadas
1999
Baguisi y col. obtienen cabras transgénicas por transferencia nuclear
1999
Yanagimachi y col. obtienen ratones transgénicos mediante la co-inyección de
cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
2000
Marcación genética en ovejas
2002
Adición artificial de un cromosoma en una vaca (vaca trans-cromosómica)
2002
Se creó en Argentina, la vaca Pampa Mansa, la cual tiene un gen para la
producción de Somatotropina.
2003
Obtención de cerdos transgénicos vía inyección lentiviral (Transferencia del
trasngen dentro del zigoto)
2009
Científicos clonaron por primera vez perros transgénicos de color rojo
fluorescente
2009
Científicos japoneses informaron la creación de micos tití transgénicos
Fuente: Lacadena, 2002
CAPITULO 3. SEXAJE DE SEMEN, QUIMERAS, ICSI, CELULAS
MADRE
Lección 41. Aspectos generales.
La biotecnología ha desarrollado herramientas muy útiles que permiten mejorar la
eficiencia reproductiva de las explotaciones. Hoy, es fácil decidir que sexo va a
tener la próxima cría de nuestro hato, utilizar reproductores de alta genética que
presentan problemas de infertilidad y próximamente producir células madre con
destino a la regeneración de tejidos específicos o producir animales con destino a
la donación de órganos todo esto gracias a la biotecnología reproductiva.
El mundo científico no se detiene, y mientras leemos esto un nuevo
descubrimiento tiene la ciencia para nosotros. Así que aprovechemos de manera
racional las herramientas que la biotecnología trae para mejorar la eficacia de las
explotaciones pecuarias.
Lección 42. Sexaje de semen.
La producción de semen sexado es una realidad que ya se encuentra disponible
comercialmente. Hoy en día es posible decidir el sexo que va a tener el nuevo ser
antes de producirse la fecundación, algo que hasta hace menos de 20 años
parecía un imposible. Así se podrá decidir el semen a utilizar de acuerdo con la
finalidad de la explotación, en el caso de ganadería lechera, se querrá obtener
hembras para reemplazo, al contrario en las explotaciones de ganadería de carne,
se preferirá la obtención de machos para engorde.
Pero, como se puede realizar esta técnica? es un procedimiento algo complejo:
las
células
reproductivas
femeninas
aportan
un
cromosoma
“X”
y
el
espermatozoide puede aportar un cromosoma “X” o un cromosoma “Y”, por ende
el espermatozoide es el que determina el sexo de las crías en los mamíferos. En
este sentido, para que se produzca una hembra (XX) deberá un espermatozoide
“X” fertilizar el óvulo. Por el contrario, si fuera el espermatozoide con cromosoma
“Y” el que lo fertilizara, se produciría un macho (XY) (Velasco, 2004).
Se estima que aproximadamente la mitad de los espermatozoides portan
cromosoma “X” y la mitad “Y”, por lo tanto se obtiene aproximadamente un 50% de
nacimientos por cada sexo El objetivo de esta biotecnología, es modificar esa
proporción, y obtener animales de un determinado sexo, de acuerdo con los
objetivos de la explotación.
La técnica utilizada en la obtención del semen sexado es denominada: “citometría
de flujo”, esta técnica fue desarrollada por Dr Johnson, y se fundamenta en las
diferencias de ADN expuestas para hacer dicho sexaje (el espermatozoide de toro
que contiene el cromosoma “X” tiene 3.8% más ADN que el que contiene el
cromosoma “Y”).
.
La técnica consiste en primer lugar en una tinción que se hace a los
espermatozoides con una solución fluorescente (con Hoechst 33342), por 45
minutos, lo cual hace que este tinte se una al ADN cuantitativamente.
El
espermatozoide “X” produce 3.8% más fluorescencia azul cuando es expuesto a
un láser de cierta longitud de onda. El semen se separa razón de 90,000
gotas/segundo con un espermatozoide c/u, pasando a través de una boquilla muy
fina a 100 Km./h. Los “X” se cargan positivamente y los “Y” negativamente. Los
espermatozoides muertos y aquellos que no han podido ser sexados no son
cargados. Los espermatozoides corren a través de placas cargadas, los “Y” son
atraídos a la placa positiva, los “X” a la negativa, y las gotas sin carga son
descartadas.
Fuente: http://www.chemometec.com/global/files/file_12.jpg
Fig. 53. Citómetro de flujo. Fue desarrollado en al año de 1970.
Algunos de los avances que se han dado gracias esta técnica son: En el año de
1992, en Cambridge nace la primera ternera producida por fertilización in vitro y
semen sexado, posteriormente hacia el año 1995, en la Colorado State University,
nace la primera ternera producida por Inseminación artificial y semen sexado. En
el año 2001, nace la primera ternera lechera con la utilización de semen sexado
en Suiza. En el año 2001, en Sydney (Australia) nacen las primeras corderas,
mediante la utilización de semen sexado (Velasco, 2004).
Del computador al
cargador de gotas
Al computador
Fuente: http://edis.ifas.ufl.edu/LyraEDISServlet?command=getScreenImage&oid=1746729
Fig. 54. Citometría de flujo en la producción de semen sexado.
Una de las desventajas que presenta esta técnica es su elevado valor comercial,
lo cual dificulta su aplicación en todas las explotaciones animales. Sin embargo,
durante los últimos años se ha difundido mucho esta técnica, logrando la
disminución de su valor y facilitando la consecución de semen sexado a precios
accequibles.
Lección 43. Producción de quimeras.
Una quimera es un animal que tiene características de dos o más especies. La
quimera se origina por la mezcla de células provenientes de especies diferentes y
posee las características de los dos individuos que genéticamente lo originan. Las
quimeras son aquellas logradas por métodos experimentales de manipulación
embrionaria y pueden ser de diferentes especies o de una misma especie (Rojas,
et al, 2004).
De acuerdo con algunos autores se pueden diferenciar dos clases de quimeras:
 Primarias: aquellas naturales o artificiales que desde los estadios
embrionarios presentan dos poblaciones celulares genéticamente diferentes
 Secundarias: aquellas en las que los tejidos u órganos de dos fetos o
adultos diferentes se combinan.
Un ejemplo de las quimeras secundarias es el caos de los trasplantes de órganos,
en los que un órgano de la misma o de otra especie es introducido y se incorpora
en el cuerpo de un animal.
Tal como lo plantea Rojas y col. (2004) las primeras quimeras fueron
desarrolladas en 1920, en el laboratorio de Hans Spemann por fusión de
embriones
tempranos
de
anfibios,
pero
los
primeros experimentos
que
desarrollaron quimeras en mamíferos, se realizaron en la década de los años 60 y
fueron logrados por Beatrice Mintz, empleando métodos de micromanipulación de
embriones. Beatrice Mintz utilizó mórulas provenientes de cruzamientos de parejas
de conejos albinos y también mórulas de parejas de conejos negros. Las mórulas
fueron separadas de la zona pelúcida mediante tripsina, y luego fueron
fusionadas. El blastocisto gigante resultante se colocó en el útero de una madre
receptora, que había sido hormonalmente tratada para simular una gestación. El
resultado fueron crías con cuatro padres (tetraparentales), que presentan una
cubierta de pelos formada por manchones de pelo blanco y manchones de pelo
negro. Más tarde, se produjeron de la misma forma quimeras en conejos y ovejas.
Este método se emplea habitualmente cuando se fabrican los animales knock-out,
los cuales pueden ser considerados también como quimeras. Pero no cabe duda
de que dentro de las quimeras de mamíferos, el caso mas interesante ha sido el
de la oveja-cabra creada en Cambridge (Inglaterra) por Fehilly y Willadsen. Estos
investigadores utilizaron blastocistos de cabra y oveja. El embrioblasto de cabra
fue introducido dentro del blastocisto de una oveja. El embrión así formado
formado fue transferido a una oveja receptora. El animal que nació mostró una
mezcla de ambas especies: lo más destacado fue su pelaje que presentaba las
características de ambas especies: y sus cuernos que tenían la forma de los de la
cabra, pero que aparecían enroscados como los de oveja. Asimismo, su sangre
contenía células de ambas especies. Existían en este animal otras características
interesantes, como que se parecía físicamente más a una cabra, aunque prefería
la compañía de las ovejas. También el análisis de sus proteínas mostró que
poseía características de ambas especies, pero que predominaban las de oveja.
Respecto a su comportamiento reproductivo, demostró ser fértil aunque era capaz
sólo de copular con ovejas.
Los estudios realizados con quimeras son de gran interés para analizar el proceso
embriológico, ya que se pueden fabricar quimeras utilizando embriones de
diferentes edades. Por ejemplo, cuando se mezcla un embrión de cuatro células
con uno de ocho, esta última forma el embrión, mientras el de cuatro células forma
el trofoblasto. Al respecto, se debe notar que el trofoblasto es el que interactúa con
el útero materno, por lo tanto, esta técnica podría ser usada potencialmente para
producir transferencias embrionarias entre especies diferentes (Rojas, et al, 2004).
Lección 44. Inyección intracitoplasmática de semen.
La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) es una técnica que fue
desarrollada en el año 1992, consiste en seleccionar un espermatozoide e
inyectarlo directamente dentro del óvulo. Esta técnica se ha empleado a nivel de
la medicina humana para problemas de infertilidad, en aquellos casos, en donde
los espermatozoides no tienen la capacidad de penetrar al interior del ovocitos, o
en caso de azoospermia. Sin embargo, en los últimos años se han realizado
estudios experimentales para su implementación a nivel de la producción animal.
Fuente: http://www.brusselsivf.be/user_docs/hi storiek/28)ICSI.jpg
Fig. 55. Inyección del espermatozoide.
Los pasos que involucra la ICSI son:
1. Estimulación de la ovulación
2. Aspiración folicular
3. Obtención de espermatozoides
4. Fecundación o fertilización
5. Transferencia embrionaria
La ICSI es una herramienta con gran potencial aplicativo en diversos campos de la
producción animal, entre los que destacan la producción de animales transgénicos
de interés en ganadería o biomedicina, y la recuperación de razas en peligro de
extinción. En la actualidad existen referencias de obtención de descendencia viva
mediante esta tecnología en diversas especies, sin embargo, el rendimiento aún
es muy bajo, posiblemente debido al desconocimiento de las condiciones idóneas
para el desarrollo de la misma, y la dificultad de los cigotos para alcanzar el
estadio de blastocisto in vitro (García, 2005).
Ovocito sujetado
Fuente: http://www.pacificfertilitycenter.com/images/lab_icsi_process_fig3.gif
Fig. 56. ICSI
De acuerdo a lo reportado por Lossino y Aguilar (2002), en el año de 1997 se
reporto el nacimiento del primer potrillo obtenido por ICSI, con oocitos maduros
recuperados de ovarios de una yegua post-mortem. Posteriomente, en marzo de
1998, McKinnon y col. (Citado por
Lossino y Aguilar, 2002) en Australia,
comunicaron el nacimiento de un potrillo también obtenido por ICSI, pero con
oocitos maduros aspirados de una yegua, transportados refrigerados 200 km al
laboratorio de la Universidad,
fertilizados y mantenidos "in vitro", luego
transportados nuevamente a una clínica y transferidos al oviducto de una
receptora. En ese mismo año, investigadores de la Universidad de Louisiana
reportaron el nacimiento de 2 potrancas producto de oocitos inmaduros colectados
por aspiración transvaginal de yeguas preñadas, madurados "in vitro", fertilizados
por ICSI y transferidos quirúrgicamente a una receptora.
Lección 45. Producción de células
embrionarias primarias pluripotenciales)
madre
embrionarias
(Células
Las células embrionarias primordiales pluripotenciales son células indiferenciadas
derivadas del embrión en estadio temprano capaces de proliferar in vitro en forma
indiferenciada e ilimitada, estas mantienen la habilidad de diferenciarse en todos
los tipos celulares (Prelle y Wolf, 2001).
De acuerdo lo expresado por Flores y Paniagua (2006), existen cuatro niveles de
células madre:
1) las células madre embrionarias totipotenciales,
2) las células madre pluripotenciales,
3) las células madre multipotenciales y
4) las células madre progenitoras unipotenciales.
El primer nivel, corresponde a las células más primitivas, producto inmediato de la
fecundación con capacidad de diferenciarse hacia todos los tejidos que forman los
órganos de un organismo. Las células del segundo nivel se desarrollan
aproximadamente en el cuarto día de la fertilización y pueden diferenciarse a
cualquier tipo celular, excepto a células totipotenciales y de la placenta. El tercer
nivel celular se encuentra en la circulación periférica de un recién nacido y pueden
ser recuperadas de sangre de placenta colectada del cordón umbilical. El cuarto
nivel celular puede originar solamente un tipo celular, por ejemplo, una célula
progenitora eritroide de diferencia solamente a eritrocito, generando células
terminales. Las células madre embrionarias totipotenciales, solamente se pueden
obtener durante los primeros cuatro días después de la fertilización, justo en el
momento en el que el cigoto se ha constituido como mórula para comenzar el
proceso de segmentación de 2 hasta 32 blastómeros (68 h), organizándose en
una capa periférica denominada trofoblasto (Flores y Paniagua, 2006).
Fuente: http://juanv.files.wordpress.com/2008/01/ stemcells2-gif.gif
Fig. 57. Producción de células madre
Actualmente, son muchos los laboratorios en todo el mundo que trabajan para
obtener células totipotenciales embrionarias. Estas células son llamadas así
porque tienen la potencialidad de originar todos los tipos celulares que existen en
el cuerpo y se han convertido en una esperanza terapéutica para muchas
enfermedades tanto del hombre como de los animales.
Las células madres
embrionarias son las únicas capaces de autorrenovarse y diferenciarse en muchas
líneas celulares. Algunos tejidos adultos de mamíferos conservan también células
madres, pero éstas son capaces de generar sólo un número limitado de tipos
celulares. Las células madres obtenidas de embriones en la etapa de blastocisto
tienen la capacidad de formar todas las células del cuerpo, porque mantienen el
cariotipo normal, y una alta actividad telomerasa, además, logran en cultivo, un
notable potencial de proliferación durante un largo período de tiempo, dando la
posibilidad de una expansión ilimitada.
Las células madres se obtienen del
embrioblasto de un blastocisto y deben cultivarse “in vitro” para obtener líneas de
células pluripotenciales. Estas células madre pueden seguir los siguientes dos
caminos, dependiendo del medio de cultivo que se utilice:
a) Mantenerse en un estado indiferenciado y
b) Diferenciarse en líneas celulares más específicas, por ejemplo cardíacas,
neurales, sanguíneas, etc.
Es importante señalar que la investigación relacionada con células madres
embrionarias se ha desarrollado ratones de laboratorio y algunos otros animales
como conejos, ovejas y vacas.
BIBLIOGRAFIA
Albeiro, Ricardo (2001). Manejo de donantes y receptoras. Biotecnología de la
Reproducción, INTA, Argentina, 2001.
Alvarado, Javier (2008). Historia de la Inseminación artificial. Disponible en:
http://javieralvaradomoreno.googlepages.com/articulosinteresantes.
Ángeles, Marín, Álvaro (1999). Por qué y cómo sincronizar el celo en cerdas
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias.
Barañao, Lino (2007). Biotecnología en Reproducción animal. Departamento de
Fisiología, Biología Molecular y Celular. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires.
Becaluba, Facundo (2007). Métodos de sincronización de celo en bovinos.
Bedoya, Cedeño Carlos; Hinojosa, Gustavo; Bedoya, Eduardo; González Eduardo;
Arroyo, Edith; Chaves, Arturo y González Ezequiel (2005). Inseminación artificial
en ovinos. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Michoacana
de San Nicolás de Hidalgo. Morelia, Michoacán, México.
Billanova, Lourdes y Ballalares, Pedro pablo (2008). La evaluación andrológica:
justificación
y
métodos.
Disponible
en:
http://avpa.ula.ve/docuPDFs/libros_online/manual-ganaderia/seccion6/articulo18s6.pdf
Bó, Gabriel Almicar (2006). La Función Ovárica en las Terneras Prepúberes y
Peripúberes.
Disponible
en:
http://www.sinervia.com/library_files/1857887697_Dinamica%20folicular.pdf.
Bó, Gabriel; Moreno, Dolores; Cutaia, Lucas; Caccia Mariana; Tribulo, Humberto y
Tribulo, Ricardo (2002). Transferencia de embriones a tiempo fijo: tratamientos y
factores
que
afectan
los
índices
de
preñez.
Disponible
en:
produccionbovina.com.ar/.../92-metodos_sincronizacion.htm
Bolívar P.A y Maldonado Estrada J.G. (2008). Análisis de costos de esquemas de
transferencia de embriones bovinos utilizados en Colombia. Revista Colombiana
de Ciencias Pecuarias 2008; 21:351-364
Ben G.A.; Goitia O.E; Mujica I.F (2006). Inseminación artificial a tiempo fijo:
Manuel
de
procedimientos.
Disponible
en:
http://www.imperiorural.com.ar/imperio/estructura/miriam%20archivos/Bovinos/ma
nual_inseminacionartificialatfijo.htm
Cáceres Cercamo, Walkiria Gissela (2008). Evaluación de la inseminación artificial
intracervical y poscervical con semen congelado en cerdas multíparas. Disponible
en: http://zamo-oti-02.zamorano.edu/tesis_infolib/2008/T2555.pdf
Calier (2008). Pluset: Superovulación. Laboratorios Calier, S.A. – Registro
Mercantil de Barcelona, Hoja nº 14.156, Folio 82, Tomo 1650, Libro 1.076, Sección
2ª, Inscripción 2ª. – C.I.F. a-08-226128.
Calle, Jonathan; Corrales Juan David; Yepes Sergio Alejandro; Cañas Jhon
Jacobo, Ramírez, Julián y Mesa Carolina (2006). Inseminación intrauterina
profunda en cerdos. Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquía.
Disponible en: kogi.udea.edu.co/.../inseminacion%20intrauterina%20profunda.doc.
Campos, Fernando (2007). Trasplante de embriones en equinos. Disponible en:
http://www.engormix.com/_que_es_transplante_s_articulos_519_CAB.htm
Carletti, Eduardo (2006). Crearon cerdos transgénicos clonados, sanos como el
pescado. Disponible en: http://axxon.com.ar/not/160/c-1600275.htm
Celestinos, M y Gatica, R (2002). Vitrificación como técnica de crioconservación
de embriones bovinos. Arch. Med. Vet. XXXIV, Nº 2, 2002
CENIAP (1999). Técnica de inseminación artificial en bovinos. Disponible en:
http://www.ceniap.gov.ve/pbd/Monografias/cdinsebovinos/bovinos/contenido/tecnic
adeinseminacioni.htm
Chenowet, P.J (2003). Impulso sexual del toro y comportamiento reproductivo.
Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Kansas State
University, Manhattan, Kansas, USA. Traducido por C. Jiménez Escobar, Fac. de
Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Univ. Nacional de Colombia, Bogotá.
Disponible
en:
http://www.ivis.org/advances/Repro_Chenoweth/chenoweth_es/IVIS.pdf
Cutaia, Lucas (2006). Inseminación artificial a tiempo fijo (IATF): una herramienta
para el mejoramiento genético. Instituto de Reproducción Animal Córdoba;
Universidad Católica de Córdoba, Argentina.
Cutaia, Lucas (2006). Inseminación Artificial a Tiempo Fijo en Rodeos Lecheros:
Diferentes
Estrategias
de
Implementación.
Disponible
en:
http://www.repromax.com.mx/informesTecnicos/Manejo-Reproductivo-en-RodeosLecheros.pdf
Chuaire, Lilian; Sánchez, Magda Carolina y Franco, María Liliana (2004).
Clonación animal: avances y perspectivas. En: Revista Colombia médica, ISSN
1657-9534.
Cyagra (2008). Fertilización in vitro. Disponible en: http://www.cyagra.cl/invitro.html
De Luca, Leonardo (2007).
http://www.produccionbovina.com/
Método
de
transplante.
Disponible
en:
Del campo, Marcelo (2000). Transferencia de embriones. Disponible en:
http://monografiasveterinaria.uchile.cl/CDA/mon_vet_completa/0,1421,SCID%253
D7958%2526ISID%253D419,00.html
De los Reyes, Mónica (1994). Fecundación in vitro en bovinos: Avances en el
manejo de gametos. Avances de Medicina Veterinaria, Vol.9, N°1, Enero-Junio,
1994
Dosne, Cristiane (2001). Clonación. Medicina - Volumen 61 - Nº 1, 2001.
Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Disponible en:
http://www.medicinabuenosaires.com/revistas/vol61-01/1/clonacion.htm
Embrios (2008). Definición y tipos de células madre. Disponible
http://www.embrios.org/celulasmadre/definicion_celula_madre.htm
en:
El mundo (2009). Científicos surcoreanos clonan perros transgénicos de color rojo
fluorescente.
Disponible
en:
http://www.elmundo.es/elmundo/2009/04/29/ciencia/1241005919.html
Espinoza Villavicencio, José Luis ; Pérez, Ricardo Ortega ; Espinosa, Alejandro
Palacios ; Méndez, Javier Valencia ; Flores, Carlos Fernando Arechiga (2007).
Ovarian follicular growth in domestic animals: a review. COPYRIGHT 2007
Interciencia Association.
Evangelista, S; Cordero, A; Santiani, A; Vásquez, M; Huanca T; Cárdenas, O Y
Huanca, W (2007). Efecto del tratamiento con progesterona-eCG sobre la calidad
embrionaria en llamas. APPA - ALPA - Cusco, Perú, 2007.
Fauba (2007). Clonación animal. Fauba - www.agro.uba.ar.
Fernández Tubino, Álvaro (2003).
Dinámica folicular: Funcionamiento y
regulación. Departamento de Reproducción Animal, Facultad de Veterinaria,
Montevideo,
Uruguay.
Disponible
en:
http://www.produccionbovina.com/informacion_tecnica/inseminacion_artificial/23ondas_foliculares.htm.
Fernández, Adriana; Bastidas, Pedro y Trocóniz, Juan (1997). Fertilización in vitro
de ovocitos recolectados de vacas cebú postmortem. Universidad Central de
Venezuela, Facultad de Ciencias Veterinarias, Instituto de Reproducción Animal e
Inseminación Artificial. Apartado Postal 4563, Maracay, Estado Aragua,
Venezuela. Arch. Latinoam. Prod. Anim. 5(Supl. 1): 324-325 (1997)
Flores, Fernando y Paniagua, Jorge (2006). Las células madre embrionarias
totipotenciales. Disponible en: http://www.medigraphic.com/espanol/e-htms/efacmed/e-un2006/e-un06-6/em-un066d.htm
García Roselló, Empar (2005). Análisis de diferentes factores que afectan al
rendimiento de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) en la
especie
porcina.
Disponible
en:
www.tesisenxarxa.net/TDX/TDR_UM/TESIS/...//egr02de10.pdf
Gigli, I, Russo, A. y Aguero, A (2006). Consideraciones sobre la dinámica ovárica
en equino, bovino y camélidos sudamericanos. InVet (B. Aires), ene./dic. 2006,
vol.8, no.1, p.183-204. ISSN 1668-3498.
Guzmán, Alba Cielo; Barrera, Carlos; Gómez, Adriana; Patiño, Marina; Preciado,
Johana y Gómez, Joaquín (2008). Transferencia de embriones: conceptos básicos
y aplicaciones actuales, presentación curso Reproducción Animal Avanzada,
UNAD, Colombia.
Henao R, Guillermo y Trujillo A, Luis Emilio (2000). Establecimiento y desarrollo de
la dominancia folicular bovina. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias Vol. 13
No.2 (2000); p. 108-120.
Herradon, P.G; Quintela, L.A; Becerra,J.J; Ruibal, S y Fernández; M (2007).
Fecundación in vitro: alternativa para la mejora genética en bovinos. Arch.
Latinoam. Prod. Anim. Vol. 15 (Supl. 1) 2007
Hernández, Hugo (2004). Fecundación in vitro. Facultad de Ciencias Veterinarias.
Universidad del Zulia. Venezuela.
Hernández Leal, Cecilia (2003). Inyección intracitoplasmática del espermatozoide
(ICSI). Una técnica de reproducción asistida con indicaciones. Revista colombiana
de obstetricia y ginecología VolL. 54 No. 3. 2003
Hidalgo, Carlos Olegario; Tamargo, Carolina y Diez, Carmen (2006). Análisis del
semen bovino. Boletín informativo del Serida N° 2.
Huanca, Wilfredo (2001). Inseminación artificial a tiempo fijo en vacas lecheras.
Rev Inv Vet Perú 2001; 12(2): 161-163.
IMV
(2000).
Inseminación
artificial
porcina.
http://mto.humeco.net/fotos/649029683rad7BE52.pdf
Disponible
en:
Infocarne (2005). Detección de celo, servicio natural e inseminación artificial.
Disponible en: http://www.infocarne.com/bovino/inseminacion_artificial2.asp
Intervet
(2009).
REGUMATE.
Disponible
en:
http://www.intervet.com.mx/productos/regumate_/020_informaci_n_del_producto.a
sp
Lacadena, Juan Ramón (2002). Animales
http://www.prodiversitas.bioetica.org/des18.htm
transgénicos.
Disponible
en:
Larson, Bob (2007). Toros: examen sanitario y de aptitud reproductiva. American
Angus journal.
López, Hernando (2007). Consideraciones fundamentales para la implementación
de
programas
de
IATF.
ABS
México.
Disponible
en:
http://www.absmexico.com.mx/articulos/consider.pdf
Losinno Luis (2007). Transferencia embrionaria en equinos. Disponible en:
http://www.congresoreproequina.com.ar/docs/transferencia_embrionaria_equinos.
pdf
Losinno Luis y Aguilar, Javier (2002). Reproducción y biotecnologías en la
producción equina. Cátedra de Producción Equina, Depto. Producción Animal,
Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto.
Mangarwati, Engard (2009). Transgenic Animals: Their Benefits To Human
Welfare. Disponible en: http://www.actionbioscience.org/biotech/margawati.html
Mazzarri, Giorgio (1984). Control de la Reproducción e Inseminación Artificial en
Cerdos.
FONAIAP
DIVULGA,
N°
15.
ABRIL,
1984.
http://www.ceniap.gov.ve/pbd/RevistasTecnicas/FonaiapDivulga/fd15/texto/control.
htm
Munar, Carlos (2006). Colecta de ovocitos bovinos a campo con laboratorio móvil
para fertilización in vitro y sexado de embriones. Disponible en:
http://www.agroinnova.gov.ar/agroinnova/pdfs/Panel%204%220Biotecnolog%EDa/
4.5.pdf
Peña J, Miguel, Góngora O, Agustín and Estrada L, José. Growth factors in the
follicular development, embryonic early and implantation. implications in the
production of bovine embryos.Rev.mvz cordoba, Jan./June 2007, vol.12, no.1,
p.942-954. ISSN 0122-0268.
Prelle, Katja y Wolf, Eckhard (2001) Células embrionarias
Biotecnología de la Reproducción, INTA, Argentina, 2001.
tempranas.
Ramírez O y Jiménez, C (1999). Recolección de oocitos para maduración in vitro
en
bovinos.
Disponible
en:
http://www.encolombia.com/acovez24_recoleccion4.htm
Raso, Miguel; Buratovich, Osvaldo y Villa, Martin. Comparación de 4 tratamientos
de sincronización de celo en ovinos. Carpeta Técnica, Ganadería Nº 9, Abril 2004.
EEA INTA Esquel
Rigali, Florencia (2006). Animales clonados ventajas y problemas conocidos.
Halitus
biotecnología.
Disponible
en:
www.forodegeneticabovina.com/pdfs/03_rigali_florencia.pdf
Roa, Noris; Tamasaukas, Rita; Silva, Alba y Sánchez, Josefina (2005).
Criopreservación
de
semen
suino
en
Venezuela.
Disponible
en:
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n050505/050504.pdf.
Rodríguez, Inmaculada (2009). Inseminación artificial o monta dirigida en la yegua.
Universidad Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Hospital Clínico
Veterinario
de
la
Universidad
de
Córdoba.
Disponible
en:
http://albeitar.portalveterinaria.com/noticia.asp?ref=728
Rodríguez, Luis Alfonso (2006). Aspiración folicular guiada por ultrasonido.
Disponible en: http://www.asoangusbrangus.org.co/tecnico7.htm
Rojas, Mariana; Venegas, Felipe; Servey, Jean Luc y Guillomot, Michell (2004).
Clonación, producción de quimeras y células pluripotenciales. Disponible en:
http://www.scielo.cl/pdf/ijmorphol/v22n4/art18.pdf
Salamone, Daniel (2005). Transgenesi y clonación en animales de granja.
Laboratorio Biotecnología Animal. FA-Universidad de Buenos Aires, Argentina.
Disponible
en:
http://www.inta.gov.ar/mercedes/info/JornadasEEA/Reprod05/Salamone.pdf
Salgado, Roger, González, Marco y Simanca, Juan. Artificial insemination at fixed
time in lactating cows brahman. Rev.MVZ Cordoba, July/Dec. 2007, vol.12, no.2,
p.1050-1053. ISSN 0122-0268.
Serizier Sosa, Andrés (2005). Fecundación in vitro, una Técnica de Reproducción
Animal al Servicio del Mejoramiento Genético. Vitrogen, Venzuela.
Serrano Díaz, Norma (2004). Aspectos específicos e implicaciones
de
la
clonación.
Disponible
en:
www.geosalud.com/Clonacion/clonacion_aspectos_cient%EDficos.htm
Urrego, Rodrigo; Tarazona, Ariel; Olivera, Martha y Camargo, Omar (2008).
Simplificación de la fertilización de ovocitos durante la producción in vitro de
embriones bovinos. Rev Colom Cienc Pecua vol.21 no.3 Medellín July/Sept. 2008
Velazco Molina, Joel (2004). El sexaje de semen de toro: ¿un sueño o realidad?
Disponible
en:
http://www.engormix.com/el_sexaje_semen_toro_s_articulos_220_GDL.htm
Velázquez Domínguez, José Antonio y Mendieta Márquez, Enrique (1999).
Factores que regulan el desarrollo folicular I: folículos preantrales. Departamento
de Ciencias de la Salud, Laboratorio de Biología Molecular y Fisiología Gonadal,
División de Ciencias Biológicas y de la Salud, UAM-Iztapalapa. Disponible en:
http://www.encuentros.uma.es/encuentros99/foliculos.htm
Vivanco, William (2009). Clonación en la reproducción y mejoramiento animal.
Primera conferencia nacional de biotecnología animal, Mayo de 2009. Lima, Perú.
Wilde, Oscar R; De la Vega, Adolfo C. y Cruz, María L. (2002). Uso de un
dispositivo intravaginal para el control del estro en yeguas. Zootecnia Trop.,
20(4):483-492. Univ. Nacional de Tucumán, Fac. de Agronomía y Zootecnia,
Depto. de Producción Animal.