Pruebas bioquímicas

Introducción
Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales,
conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partir
de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.
Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a
las exigencias del microorganismo en estudio.
De la amplia variedad de pruebas bioquímicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10, aplicados a 5 especies
de microorganisos.
Además estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados experimentales entre los
distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.
Objetivos
• Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar −aplicando éste método− distintos
microorganismos.
• Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioquímcas es o son el (los) adecuado(s)
de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar.
• Entender los principios bioquimicos de las pruebas.
• Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioquímias
• Conocer el uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos
• Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconocer
en que partes del procedimiento se cometió el o los errores, para así, mediante el desarrollo
experimental conocer mas profundamente las pruebas bioquímicas.
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
FACULTAD TECNOLOGICA
TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
Microbiología
Pruebas Bioquímicas
Autor:
Lab N° 4
Cod. 06
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Bibliografía
• Microbiología / Thomas D. Brock, Michael T. Madigan
2a. ed. en español, 1993. México ; Englewood Cliffs : Ed. Prentice Hall Hispanoamericana.
• Microbiología / Michael J. Pelczar, Jr., Roger D. Reid
2a. ed. en español., 1982. México : Ed. McGraw−Hill.
• Tratado de microbiología : con inclusión de inmunología y
genética molecular / Bernard D. Davis
2a. ed., 1978. Barcelona : Ed. Salvat.
Internet:
• http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html
• http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html
• http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html
• http://edicion−micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html
• Prueba de la Oxidasa
El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa.
Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e−. Este se detecta utilizando el
tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la
citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura.
Procedimiento:
Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la
bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos,
observamos si ha ocurrido algún cambio.
Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo.
Se considera positva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra.
Resultados:
(+) Pseudomonas aeruginosa
( − ) Escherichia coli
• Prueba de la Catalasa
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El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa
El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un
compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 −>
H2O + ½ O2).
Prodecimiento:
Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo previamente
esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos
por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liíquida de peróxido de
hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.
La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.
Resultados:
(+) Staphylococcus aureus
( − ) Streptococcus spp.
• Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de
aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para
diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.
Procedimiento:
Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo
de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo
con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15
minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.
Resultados:
Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:
1: pequeños coágulos no oganizados
2: pequeños coágulos oganizados
3: gran coágulo organizado
4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.
Se consideran positivos los niveles 3 y 4.
(+) Staphylococcus aureus
3
( − ) Staphylococcus epidermis.
• Prueba MIO (Motility−Indole−Ornitine ó Motilidad−Indol−Ornitina)
Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la
descarboxilación de la ornitina.
Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .
Interpretación y Resultados:
Reacción
Enturbiamiento del
Interpretación
Hay movilidad
Agar.
Agar transparente de−
No hay movilidad
sarrollo solo en picada
Azul (alcalino)
Coloración Amarilla (ácido)
Rojo (anillos)
Amarillo (anillos)
Descarboxila ornitina
No descarboxila
Indol (+)
Indol ( − )
• Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a
partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de
SH2.
Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con
objetivo de diferenciar entre:
• bacterias fermentadoras de la glucosa
• bacterias fermentadoras de la lactosa
• bacterias fermentadoras de sacarosa
• bacterias aerogénicas
• bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.
Prodedimiento:
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del
tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35°
durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.
Resultados:
• Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no
fermentadoras como Pseudomonas sp.
• Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.
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• Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de
ácido sulfhídrico. Salmonela spp.
• Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no.
Escherichia coli.
A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.
• Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)
Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la
lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2.
Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.
Procedimiento:
Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .
Interpretación y Resultados:
Reacción
Azul (alcalino)
Rojo
Engrecimiento
Ruptura del Agar
Fondo Amarillo y
Interpretación
Hay movilidad
No hay movilidad
Descarboxila ornitina
No descarboxila
Descarboxilación de lisina
Tendido púrpura
Pruebas Bioquímicas IMViC:
• Agar Citrato
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de
enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con
citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de
pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Procedimiento:
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y
cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir
del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa
crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados:
(+)Klebsiella spp.
( − ) Escherichia Coli
• Indol
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El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que
poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido
pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas
especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el
indol reacciona con el grupo aldehído del p−dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los
reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
Procedimiento:
Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar
este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color
rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de
indol y una prueba positiva.
Resultados:
(+) Escherichia coli
( − ) Klebsiella pneumoniae
• Rojo Metilo
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias
lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la
glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido−mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En
la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y
CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales
productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para
visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.
Procedimiento:
Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio.
Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo
de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción
de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía
de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.
Resultados:
(+) Escherichia coli
( − ) Enterobacter aerogenes
• Vogues Proskauer
En la prueba de Voges−Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba
de rojo de metilo. El acetil−metil−carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de
butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en
presencia de alfa−naftol dando un color rojo−fucsia.
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Procedimiento:
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a
35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un
tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa−naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente
para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un
color rojo−fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y
por lo tanto una prueba VP positiva.
Resultados:
(+) Enterobacter aerogenes
(−)Escherichia coli
Microorganismos utilizados en las Pruebas Bioquímicas
MICROORGANISMO
FAMILIA
TINCION
PSEUDOMONA SPP.
ENTEROBACTER GRAM −
SALMONELLA
ENTEROBACTER GRAM −
SHIGUELLA SPP.
ENTEROBACTER GRAM −
ESCHERICHIA COLI
ENTEROBACTER GRAM −
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
MICROCACEAE
GRAM +
FORMA
MOVILIDAD
BACILOS
POSEE
CORTOS,
FLAGELOS
CURVADOS O
POLARES
RECTOS
BACILOS
FLAGELOS
CORTOS
PERÍTRICOS
BASTONCILLOS NO TIENE
BACILOS
FLAGELOS
CORTOS NO
PERÍTRICOS
ESPORULADOS
COCACEA
NO TIENE
Resultados Experimentales
Grupo 1: Sebastián Leyton − Carlos Vera
Grupo 2: Yuri Gálvez − David Fuica
Grupo 3: Graciela Quintero − Carolina
Grupo 4: Carolina Iribarra − Jessica Pizarro
Oxidasa
MICROORGANISMO
PSEUDOMONA SPP.
SALMONELLA
SHIGUELLA SPP.
ESCHERICHIA COLI
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
GRUPO 1
+
+
−
+
−
GRUPO 2
+
+
−
+
−
GRUPO 3
+
+
−
+
−
GRUPO 4
+
+
−
+
−
7
Catalasa
MICROORGANISMO
PSEUDOMONA SPP.
SALMONELLA
SHIGUELLA SPP.
ESCHERICHIA COLI
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
GRUPO 1
+
+
−
+
+
GRUPO 2
+
+
+
+
+
GRUPO 3
+
+
−
+
+
GRUPO 4
+
+
+
+
+
GRUPO 1
+
GRUPO 2
+
GRUPO 3
+
GRUPO 4
+
Coagulasa
MICROORGANISMO
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Indol
MICROORGANISMO
ESCHERICHIA COLI
GRUPO 1
+
GRUPO 2
+
GRUPO 3
+
GRUPO 4
+
GRUPO 1
−
GRUPO 2
−
GRUPO 3
−
GRUPO 4
−
GRUPO 1
−
GRUPO 2
−
GRUPO 3
−
GRUPO 4
−
GRUPO 1
+
GRUPO 2
+
GRUPO 3
+
GRUPO 4
+
Agar Citrato
MICROORGANISMO
ESCHERICHIA COLI
Vogues−Proskauer
MICROORGANISMO
ESCHERICHIA COLI
Rojo Metilo
MICROORGANISMO
ESCHERICHIA COLI
LIA
MICROORGANISMO(S)
GRUPO 1
GRUPO 2
GRUPO 3
GRUPO 4
DETECTADO(S)
SALMONELLA
SHIGUELLA SPP.
DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DESCARBO
DE ORNITINA
DE ORNITINA
DE ORNITINA
DE ORNITI
DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DESCARBO
DE LISINA
DE LISINA
DE LISINA
DE LISINA
MIO
MICROORGANISMO(S) GRUPO 1
GRUPO 2
GRUPO 3
GRUPO 4
8
DETECTADO(S)
PSEUDOMONA
SPP.
DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DESCARBOXILACION DESCARBO
DE ORNITINA
DE ORNITINA
DE ORNITINA
DE ORNITI
NO DESCARBOXILA
NO DESCARBOXILA
NO DESCARBOXILA
NO DESCA
ORNITINA
ORNITINA
ORNITINA
ORNITINA
ST. AUREUS
TSI
MICROORGANISMO(S)
GRUPO 1
GRUPO 2
GRUPO 3
GRUPO 4
GLUCOSA
GLUCOSA
GLUCOSA
GLUCOSA
DETECTADO(S)
FERMENTADA FERMENTADA FERMENTADA FERMENTADA
LACTOSA NI
LACTOSA NI
LACTOSA NI
LACTOSA NI
SACAROSA
SACAROSA
SACAROSA
SACAROSA
SALMONELLA
FERMENTADAS FERMENTADAS FERMENTADAS FERMENTADAS
PRODUCCION
PRODUCCION
PRODUCCION
PRODUCCION
DE ACIDO
DE ACIDO
DE ACIDO
DE ACIDO
SULFHIDRICO
GLUCOSA
SULFHIDRICO
GLUCOSA
SULFHIDRICO
GLUCOSA
SULFHIDRICO
GLUCOSA
FERMENTADA FERMENTADA FERMENTADA FERMENTADA
SHIGUELLA SPP.
LACTOSA NI
LACTOSA NI
LACTOSA NI
LACTOSA NI
SACAROSA
SACAROSA
SACAROSA
SACAROSA
FERMENTADAS FERMENTADAS FERMENTADAS FERMENTADAS
Diagrama de flujo realización de Pruebas Bioquímicas
RECOLECCIÓN DE MATERIALES A UTILIZAR EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS
PREPARACION DE MATERIAL DE LABORATORIO
REALIZACION DEL PROCEDIMINTO PARA PRUEBAS BIOQUIMICAS
INCUBACION DE MUESTRAS
ANOTAR RESULTADOS
ANALISIS DE RESULTADOS
9
COMPARACION DE RESULTADOS EXPERIMENTALES Y TEORICOS
EVALUACION Y RESULTADOS FINALES DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
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