EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE EXTRACTOS Y

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE EXTRACTOS Y
FRACCIONES DE Isertia laevis EMPLEANDO LÍNEAS CELULARES
DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS.
SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ.
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
BIÓLOGA.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
BOGOTÁ, D.C.
2006
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis.
Sólo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la
verdad y la justicia”.
Bogotá, 3 de octubre 2006.
Señores
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA.
Ciudad
Estimados Señores:
Yo (nosotros) Alba Nohemí Téllez Alfonso y Sandra Liliana Castro Diaz,
identificado(s) con C.C. No. 23. 556. 606 y 52. 776. 154, autor(es) del trabajo
de grado titulado Evaluación de la Actividad Citotóxica de Extractos y
Fracciones de Isertia laevis Empleando Líneas Celulares Derivadas de Tumores
Humanos, presentado como requisito para optar al título de Bióloga en el año de
2006; autorizo(amos) a la Universidad Javeriana a:
a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrónico con el fin de ofrecerlo
para la consulta en la Biblioteca General. Si.
b) Poner a disposición para la consulta con fines académicos, en la página
web de la Facultad, de la Biblioteca General y en las redes de información
con las cuales tenga convenio la Universidad Javeriana. Si.
c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea
seleccionado para participar en concursos de trabajos de grado. Si.
d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades
educativas con las que la facultad tenga convenio de intercambio de
información, para que este sea consultado en las bibliotecas y centros de
documentación de las respectivas entidades. No.
e) Todos los usos, que tengan finalidad académica. Si.
Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo
establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión
Andina 351 de 1993, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles,
inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la
obra, mediante cita bibliográfica se debe dar crédito al trabajo y a su(s) autor(es)
Este documento se firma, sin perjuicios de los acuerdos que el autor(es) pacte con
la Unidad Académica referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad
industrial que puedan surgir de la actividad académica.
Alba Nohemí Téllez Alfonso.
23. 556. 606
Sandra Liliana Castro Diaz.
52.776.154
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE EXTRACTOS Y
FRACCIONES DE Isertia laevis EMPLEANDO LÍNEAS CELULARES
DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS.
SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ.
APROBADO
--------------------------------------ALBA NOHEMÍ TÉLLEZ, Ph. D.
DIRECTORA
--------------------------------------CLEMENCIA DE CASTRO
JURADO
---------------------------------JULIO PEDROZO, Ph.D.
JURADO
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE EXTRACTOS Y
FRACCIONES DE Isertia laevis EMPLEANDO LÍNEAS CELULARES
DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS.
SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ.
APROBADO
--------------------------------------ÁNGELA UMAÑA, M. Phil.
DECANA ACADÉMICA
-------------------------------------ANDREA FORERO
DIRECTORA CARRERA
DE BIOLOGÍA
AUTOR O AUTORES
Apellidos
Nombres
Sandra Liliana
Alba Nohemí
Castro Diaz
Téllez Alfonso
DIRECTOR(ES)
Apellidos
Téllez Alfonso
Nombres
Alba Nohemí
TRABAJO PARA OPTAR EL TÍTULO DE: Bióloga.
TÍTULO COMPLETO DEL TRABAJO: Evaluación de la Actividad Citotóxica
de Extractos y Fracciones de Isertia laevis Empleando Líneas Celulares Derivadas
de Tumores Humanos.
FACULTAD: Ciencias Básicas.
PROGRAMA: Carrera: x
NOMBRE DEL PROGRAMA: Biología.
CIUDAD: BOGOTÁ. AÑO DE PRESENTACIÓN DEL TRABAJO: 2006.
NÚMERO DE PÁGINAS: 68
TIPO DE ILUSTRACIONES:
Mapas.
Tablas, gráficos y diagramas.
Fotografías.
DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES:
Actividad citotóxica, Isertia laevis, Extractos hojas.
RESUMEN DEL CONTENIDO:
Las fracciones y subfracciones de Isertia laevis del extracto Petrol y EtOH,
mostraron actividad citotóxica frente a líneas celulares tumorales humanas de
cáncer de seno (MCF-7 y CSC 1595) y de cólon (colo 205). Las fracciones
fueron probadas a una concentración de 100 µg/ml, la fracción MeOH del
extracto Petrol presentó un 7% de viabilidad sobre la línea celular 1595 y fue la
fracción más activa, del extracto EtOH la fracción 3 con 27% de viabilidad para
la línea MCF-7 y 23% de viabilidad en la línea 1595 fueron las fracciones que
mostraron mejores resultados. Para la línea celular colo 205 las fracciones más
activas fueron la 4 y 5 del extracto EtOH con un 41% de viabilidad. Las pruebas
fitoquímicas cualitativas mostraron que las fracciones de petrol y las de EtOH
contienen esteroles y/o triterpenos.
DEDICATORIA
A mis padres por la paciencia que han tenido durante estos años.
A mis hermanos por su apoyo en todo momento.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Alba Nohemí Téllez por ser una verdadera maestra y por el apoyo en la
dirección del trabajo.
A la Dra. Clemencia de Castro y Tulia de Murcia por proporcionarme las líneas
celulares y por su preciada colaboración en todo el desarrollo del trabajo.
A los profesores del Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Javeriana por
su cooperación.
Al Laboratorio de Virología e Inmunología de la Universidad Javeriana por
permitir usar sus instalaciones en el desarrollo del proyecto.
A Andrea y Ángela por su ayuda.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN
2
2. MARCO TEÓRICO
4
2.1 LAS PLANTAS, FUENTE DE NUEVAS SUSTANCIAS
4
2.2 FAMILIA RUBIACEAE
6
2.3 CONCEPTOS GENERALES DEL GÉNERO ISERTIA.
7
2.3.1 ISERTIA LAEVIS
8
2.3.2 FITOQUÍMICA DEL GÉNERO ISERTIA
10
2.4 PLANTAS MEDICINALES CON TRITERPENOS, SAPONINAS
TRITERPÉNICAS Y SU ACTIVIDAD CITOTÓXICA Y ANTITUMOR 13
2.4.1 ACCIÓN CITOTÓXICA DE ESPECIES DE LA FAMILIA
RUBIACEAE
16
2.5 CULTIVO CELULAR
18
2.5.1 LÍNEAS CELULARES
19
2.6 ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO
20
2.6.1 MÉTODO DEL MTT
22
2.7 EL CÁNCER, ENTRE LAS PRINCIPALES CAUSAS DE
MORTALIDAD
23
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
25
3.1 FORMULACIÓN DE PROBLEMA
25
3.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
25
3.3 JUSTIFICACIÓN
26
4. OBJETIVOS
27
4.1 OBJETIVO GENERAL.
27
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
27
5. MATERIALES Y MÉTODOS
28
6. RESULTADOS Y DISCUSION
34
6.1 RESULTADOS
34
6.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
45
7 CONCLUSIONES
48
8 RECOMENDACIONES
50
9 BIBLIOGRAFÍA
51
10 ANEXOS
57
INDICE DE TABLAS
TABLA No 1. METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE ESPECIES
DEL GÉNERO ISERTIA.
12
TABLA NO 2. PLANTAS MEDICINALES CON SAPONINAS
TRITERPÉNICAS, TRITERPENOS Y SU ACTIVIDAD CITOTÓXICA Y
ANTITUMOR.
15
TABLA 3. PRUEBAS FITOQUÍMICAS DE LAS FRACCIONES DEL
EXTRACTO PETROL.
34
TABLA 4. PRUEBAS FITOQUÍMICAS DE LAS FRACCIONES DEL
EXTRACTO ETOH.
35
TABLA 5. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS PARA LOS
EXTRACTOS ETOH Y PETROL FRENTE A LAS LÍNEAS CELULARES
PROBADAS. CONCENTRACIÓN 300 µg/ml.
37
TABLA 6. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS PARA LAS
FRACCIONES PETROL, CH2CL2, ACOET, MEOH DEL EXTRACTO
PETROL. CONCENTRACIONES APLICADAS A 100 µg/ml.
37
TABLA 7. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS PARA LAS
FRACCIONES 1 – 10 DEL EXTRACTO ETOH. CONCENTRACIONES
APLICADAS A 100 µg/ml.
39
TABLA 8. PRUEBAS FITOQUÍMICAS DE LAS SUBFRACCIONES DE LA
FRACCIÓN MEOH DEL EXTRACTO PETROL.
41
TABLA 9. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS PARA LAS
SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN MEOH DEL EXTRACTO PETROL.
CONCENTRACIONES 50 µg/ml, ALCALOIDE 25 µg/ml.
42
TABLA 10. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS PARA LAS
MEZCLAS DE LAS SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN MEOH DEL
EXTRACTO PETROL CONCENTRACION 50 µg/ml.
43
TABLA 11. PRUEBAS FITOQUÍMICAS DE LA FRACCIÓN 3 DEL
EXTRACTO ETOH.
43
TABLA 12. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS PARA LAS
SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO ETOH.
CONCENTRACIONES APLICADAS A 50 µ g/ml.
44
TABLA 13. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE
PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595.
57
TABLA 14. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3
DE ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595.
57
TABLA 15. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIONES 4-6 DE ETOH SOBRE
LA LÍNEA CELULAR CSC 1595.
58
TABLA 16. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIONES 7-10 DE ETOH
SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595.
58
TABLA 17. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE
PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO 205.
58
TABLA 18. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 DE
ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO 205.
59
TABLA 19. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIONES 4-6 DE ETOH
SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO 205.
59
TABLA 20. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIONES 7-10 DE ETOH
SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO 205.
59
TABLA 21. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES
PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7.
60
TABLA 22. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3
DE ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7.
60
TABLA 23. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIONES 4-6 DE ETOH
SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7.
60
TABLA 24. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIONES 7-10 DE ETOH
SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7.
61
TABLA 25. EFECTO CITOTÓXICO DEL ALCALOIDE SOBRE LA LÍNEA
CELULAR CSC 1595.
61
TABLA 26. EFECTO CITOTÓXICO DE FRACCIÓN MEOH DEL
EXTRACTO PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595.
61
TABLA 27. EFECTO CITOTÓXICO DE LAS SUBFRACCIONES MEOH DEL
EXTRACTO PETROL SOBRE 1595.
62
TABLA 28. EFECTO CITOTÓXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA
FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC
1595.
62
TABLA 29. EFECTO CITOTÓXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA
FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC
1595.
62
TABLA 30. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DEL
EXTRACTO Y FRACCIONES PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC
1595. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
63
TABLA 31. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DEL
EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC
1595. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
63
TABLA 32. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE
FRACCIONES ETOH SOBRE LA LÍNEA CSC 1595. (100 µg/ml).
63
TABLA 33. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE
FRACCIONES ETOH SOBRE LA LÍNEA CSC 1595. (100 µg/ml).
64
TABLA 34. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DEL
EXTRACTO Y FRACCIONES PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR COLO
205. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
64
TABLA 35. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DEL
EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR
COLO 205. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
64
TABLA 36. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE
FRACCIONES ETOH 4-6 SOBRE LA LÍNEA COLO 205. (100 µg/ml).
65
TABLA 37. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE
FRACCIONES ETOH 7-10 SOBRE LA LÍNEA COLO 205. (100 µg/ml).
65
TABLA 38. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DEL
EXTRACTO Y FRACCIONES PETROL SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF7. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
65
TABLA 39. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DEL
EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR
MCF-7. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
66
TABLA 40. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE
FRACCIONES ETOH 4-6 SOBRE LA LÍNEA MCF-7. (100 µg/ml).
66
TABLA 41. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE
FRACCIONES ETOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR MCF-7. (100 µg/ml). 66
TABLA 42. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE
SÓLIDO ALCALOIDE SOBRE LA LÍNEA CSC 1595. (25 µg/ml).
67
TABLA 43. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE LA
FRACCIÓN MEOH SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. (50 µg/ml). 67
TABLA 44. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE
SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN MEOH DEL EXTRACTO PETROL
SOBRE LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. (50 µg/ml).
67
TABLA 45. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE
SUBFRACCIONES DE LA FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO ETOH SOBRE
LA LÍNEA CELULAR CSC 1595. (50 µg/ml).
68
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. DISTRIBUCIÓN DE I .laevis.
9
FIGURA 2. INFLORESCENCIA DE I. laevis.
10
FIGURA 3. METABOLIZACIÓN DE MTT A SALES DE FORMAZÁN POR
CÉLULAS VIABLES
23
FIGURA 4. MARCHA FITOQUÍMICA I. laevis.
30
FIGURA 5. SIEMBRA DE CÉLULAS Y EXTRACTOS EN PLACAS DE 96
POZOS.
33
FIGURA 6. CROMATOGRAFÍA EXTRACTO PETROL Y FRACCIONES.
35
FIGURA 7. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL EXTRACTO ETOH
TOTAL Y FRACCIONES 1-8.
36
FIGURA 8. CROMATOGRAFÍA FRACCIONES 8-10 EXTRACTO ETOH
36
FIGURA 9 EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE
PETROL EN LÍNEA CELULAR MCF-7
38
FIGURA 10. EFECTO CITOTÓXICO DEL EXTRACTO Y FRACCIONES
PETROL EN LÍNEA CELULAR 1595.
38
FIGURA 11. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE
PETROL SOBRE LÍNEA CELULAR COLO 205.
38
FIGURA 12. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE
ETOH EN LÍNEA CELULAR MCF7.
39
FIGURA 13. EFECTO CITOTOXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE
ETOH EN LÍNEA CELULAR 1595.
40
FIGURA 14. EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE
ETOH EN LÍNEA CELULAR COLO 205.
40
FIGURA 15. CROMATOGRAFÍA SUBFRACCIONES MEOH DEL
EXTRACTO PETROL
41
FIGURA 16. EFECTO CITOTÓXICO DEL ALCALOIDE Y
SUBFRACCIONES DEL EXTRACTO PETROL SOBRE LÍNEA CELULAR
1595.
FIGURA 17. CROMATOGRAFÍA SUBFRACCIONES
42
DEL EXTRACTO
ETOH
43
FIGURA 18. EFECTO CITOTÓXICO DE SUBFRACCIONES DE ETOH EN
LÍNEA CELULAR 1595
44
ÍNDICE DE ANEXOS
EFECTO CITOTÓXICO DE EXTRACTOS Y FRACCIONES. (TABLAS).
57
ANÁLISIS ESTADÍSTICO (TABLAS).
63
INDICE DE ABREVIATURAS
AcOEt: acetato de etilo.
CCD: cromatografía en capa delgada.
CH2Cl2: diclorometano
CSC-1595: línea celular colombiana de cáncer de seno
Colo 205: línea celular de cólon.
DMSO: Dimetil Sulfoxido
EtOH: etanol
MCF-7: línea celular comercial de cáncer de seno
MeOH: metanol
MTT: (metil tiazol tetrazolio) ó (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil tetrazolio
bromuro)
Pf: punto de fusión
RESUMEN
Colombia presenta una gran diversidad de plantas vasculares, pero un número
reducido de éstas han sido estudiadas en su composición química y actividad
farmacológica. Más del 50 % de las drogas de uso clínico derivan de productos
naturales,
por lo tanto los bosques de Colombia tienen un gran potencial
medicinal.
El presente trabajo evaluó la actividad citotóxica de la especie Isertia laevis de la
familia Rubiaceae que es la cuarta familia de plantas vasculares con más especies.
Esta planta es reportada en etnobotánica por ser anticancerígena y para curar
infecciones de la piel; en Colombia presenta una buena distribución, va de los
300 a los 1700 m.s.n.m.
Entre los compuestos que han sido reportados para otras especies del género se
encuentran alcaloides indólicos,
triterpénicas.
glicósidos triterpénicos, esteres y saponinas
Todos estos metabolitos han sido evaluados en otras familias
botánicas y en diferentes especies de la familia rubiaceae y han presentado una
buena respuesta en ensayos de citotoxicidad sobre líneas celulares derivadas de
tumores.
En este trabajo se evaluó la actividad citotóxica de extractos y fracciones de la
especie I. laevis sobre las líneas celulares de cáncer de seno MCF-7, CSC-1595 y
de cólon Colo 205 mediante el método in vitro MTT (metil tiazol tetrazolio) ó (3(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil tetrazolio bromuro), un ensayo colorimétrico
rápido, cuantitativo, que se utiliza para medir la viabilidad celular
Los resultados indican que la fracción MeOH del extracto Petrol presentó un
efecto citotóxico moderado con 32 y 7 % de viabilidad en las líneas celulares de
cáncer de seno, las fracciones 2, 3, 4, 7, 8 y 9 del extracto EtOH también
presentaron porcentajes de viabilidad menores al 50% para estas dos líneas. La
línea celular Colo 205 tuvo un comportamiento diferente al de las otras dos líneas,
siendo las fracciones 4 y 5 las más activas con un porcentaje de viabilidad de 41%
para el resto de fracciones tuvo un efecto proliferativo con porcentajes entre 79 y
162% de viabilidad. La línea celular que presentó mayor sensibilidad frente a los
extractos y fracciones fue la línea 1595 seguida de la línea MCF-7.
La mezcla de las subfracciones de la fracción MeOH mostró cierto grado de
sinergismo al potenciar la acción citotóxica de SF-1 y SF-3.
1. INTRODUCCIÓN.
El estudio de las propiedades curativas de la gran diversidad de plantas vasculares
colombianas es hasta el momento incipiente, siendo el más bajo el de las especies
con posible actividad antineoplásica. Las plantas superiores han sido una fuente
útil de compuestos antitumorales de importancia clínica, en consecuencia, es
importante rastrear los productos de origen natural mediante modelos in vivo y/o
in vitro, entre los que se destacan los ensayos de citotoxicidad como uno de los
indicadores de actividad antitumoral inicial.
Si se tiene en cuenta que la tercera causa de muerte en Colombia es debida a las
neoplasias malignas y que por ejemplo el cáncer de mama en nuestro país tiene
una tasa de incidencia en las mujeres de 30 por cada 100 000, se deben enfocar
los estudios en la búsqueda de nuevas sustancias con efecto citotóxico sobre
diferentes líneas celulares tumorales.
De acuerdo a bancos de información
etnobotánica, Isertia laevis se utiliza como anticancerígena, hacen una decocción
de las hojas y se dice cura el cáncer de estómago. García Barriga (1992).
Isertia laevis pertenece a la familia Rubiaceae, esta familia es una de las más
numerosas, se encuentra representada en todos los ecosistemas, en la región
Andina se registra el mayor número de especies. El género Isertia presenta
catorce especies en América, sólo siete de ellas conocidas en Colombia, es un
grupo al que se le debe prestar atención ya que la actividad farmacológica de sus
metabolitos secundarios no ha sido estudiada.
Las especies del mismo género: Isertia pittieri, Isertia haenkeana e Isertia
hypoleuca, producen alcaloides indólicos, triterpenos y saponinas triterpénicas,
metabolitos secundarios que pueden contribuir al desarrollo y descubrimiento de
nuevos fármacos al igual que
productos de interés biológico en general.
Igualmente los estudios revelan que estos metabolitos obtenidos de otras familias
botánicas han mostrado tener un potencial importante de actividad citotóxica y
anticancerígena.
El trabajo que aquí se presenta evaluó la actividad citotóxica de extractos y
fracciones de la especie Isertia laevis sobre dos líneas celulares de cáncer de seno
MCF-7 y CSC-1595 y la línea celular de cólon Colo 205, mediante el método de
“fraccionamiento bioguiado por bioensayo MTT” un ensayo colorimétrico,
rápido, versátil y cuantitativo.
Es parte del programa de investigación “La
biodiversidad colombiana como fuente de nuevos fármacos en oncología” que
viene desarrollando el Grupo de Investigación Fitoquímica de la Pontificia
Universidad Javeriana.
2. MARCO TEÓRICO.
2.1 Las plantas, fuente de nuevas sustancias.
Según Samper (2000), cuando nos referimos a la flora, se habla de la diversidad
de las plantas a nivel global y se calcula que en la actualidad hay cerca de 270 000
especies de plantas vasculares.
Pero esta riqueza no está distribuida
uniformemente alrededor del globo y de hecho conocemos que hay ciertas
regiones, entre ellas Colombia, que se caracteriza por tener una alta concentración
de especies.
Se estima que en Colombia existen entre 35 000 y 50 000 especies de plantas
vasculares. La gran variabilidad de climas, paisajes, grandes regiones e historias
evolutivas, ha permitido que podamos hablar de Colombia como un país
megadiverso. Sin embargo, tenemos megadiversidad en la medida en que lo
reconozcamos y lo comprobemos y para eso se requiere de estudios básicos
como los inventarios biológicos. Gast, F en Mendoza et al (2004).
La forma alarmante en la que progresa el exterminio de especies vegetales en
ciertas áreas, incluso antes de que dichas plantas hayan sido registradas y mucho
menos, estudiadas químicamente, viene también a incrementar la necesidad de
realizar cada vez mayores esfuerzos, respecto a la conservación genética de las
plantas medicinales utilizadas en determinadas zonas. Pese a la rápida expansión
de la literatura fitoquímica, sólo un pequeño porcentaje de la totalidad de las
especies se ha estudiado y queda, por tanto, un amplio campo de investigación
futura. Los investigadores se enfrentan al problema de realizar una investigación
sistemática entre miles de especies aún no estudiadas y de muchas de las cuales no
se conoce ninguna indicación inmediata de su actividad farmacológica. Pedrozo
(2004).
El descubrimiento de nuevas sustancias a partir de plantas con actividad
terapéutica constituye una meta de la humanidad. El reino vegetal contiene un
enorme potencial de moléculas por descubrir; se estima que más del 90 % de las
especies no han sido estudiadas. La naturaleza ha demostrado ser una fuente
importante de compuestos anticancerígenos efectivos;
por ejemplo drogas
derivadas de microorganismos y de plantas. Los productos naturales representan
el 50 % de las drogas de uso clínico en países desarrollados, el 25 % de los cuales
derivan de plantas superiores. Téllez et al (2004), Mongelli et al (2002). En los
países en desarrollo el uso de las plantas medicinales representa el 80 % del
arsenal terapéutico. Sharapin (2000).
Un 57% de las fórmulas médicas vendidas en Estados Unidos están basadas en
productos naturales, esto es, son productos naturales en sí o son derivados
sintéticos o análogos de productos naturales. De 1983 a 1995, más del 60% de las
nuevas drogas aprobadas para el tratamiento del cáncer e infecciones estuvieron
basadas en productos naturales. Los bosques tropicales por lo tanto representan
una reserva con potencial medicinal. Setzer et al (2003).
Las plantas tienen una larga historia de uso en el tratamiento del cáncer, aunque
muchas de las demandas para la eficacia de tal tratamiento deben verse con algún
escepticismo porque el cáncer es definido pobremente en la medicina tradicional.
Los primeros agentes de uso clínico fueron los llamados alcaloides de vinca
vinblastina y vincristina aislados de Catharanthus roseus la cual es usada por
varias culturas para el tratamiento de diabetes. Esta droga fue descubierta durante
una investigación de la planta como un recurso potencial como agente
hipoglicemiante; por consiguiente, su descubrimiento puede ser atribuido
indirectamente a la observación de un uso medicinal de la planta. Cragg et al
(2003).
Dos agentes con actividad clínica epidoside y teniposide
semisintéticos del
originalmente
a
producto natural epipodophyllotoxin,
una
planta
usada
para
el
son derivados
que es relacionado
tratamiento
del
cáncer.
Epipodophyllotoxin es un isómero de podophyllotoxin el cual fue aislado como el
agente anti-tumor activo
de las raíces de varias especies del género
Podophyllum. Estas plantas poseen una larga historia de uso medicinal por parte
de las culturas americanas y asiáticas, incluso en el tratamiento de cáncer de piel y
verrugas. Cragg et al (2003).
Otros ejemplos son la homoharringtonine que ha mostrado eficacia contra las
varias leucemias,
aislado del árbol chino Cephalotaxus harringtonia var
drupacea y el elliptinium, un derivado de ellipticine, comercializado en Francia
para el tratamiento de cáncer de seno, aislado de especies de la familia de
Apocynaceae, incluida Bleekeria vitensis una planta medicinal de Fiji con
reputadas propiedades anticáncer; las hojas de Taxus baccata usadas en la
medicina tradicional de la India (ayurveda), con un uso reportado en el
tratamiento del cáncer. El flavopiridol es totalmente sintético, pero la base para su
estructura es un producto natural, el rohitukine, aislado de Dysoxylum
binectariferum. El combretastatins, derivado de Combrettum cajfrunn, actúa
causando el cierre vascular en el tumor y produciendo la necrosis. Cragg et al
(2003).
2.2 Familia Rubiaceae.
A lo largo de la historia taxonómica de Rubiaceae la definición de tribus ha
presentado variaciones y en la actualidad aún no se cuenta con una clasificación
ampliamente aceptada. Al nivel de géneros, la mayoría son estables y sólo en
pocos casos se presentan segregaciones o diferencias entre especialistas. Mendoza
et al (2004).
Rubiaceae es una de las familias de plantas vasculares más grandes, con 659
géneros y un número estimado de 10 700 especies alrededor del mundo, solo
Asteraceae, Orchidaceae y Poaceae tienen más especies. Aproximadamente 80 %
de los géneros son leñosas. Se han registrado 75 géneros y 729 especies de
Rubiaceae en los Andes por encima de los 1000 m de altitud, Palicourea el
género más grande con 164 especies. Andersson (1995).
Es una familia cosmopolita, pero con mayor presencia en las regiones tropicales
y subtropicales. En el neotrópico, Rubiaceae generalmente figura entre las
primeras familias con mayor número de especies cuando se realizan inventarios
locales y en Colombia no sólo es una de las más diversas sino con mayor número
de individuos en las regiones Andina, Amazónica y del Chocó biogeográfico, la
mayor diversidad se registra en la región Andina. Presenta una amplia cobertura
de ecosistemas, que van desde las zonas costeras y de los manglares hasta las
zonas de páramo Mendoza et al (2000), (2004).
De los géneros de Rubiaceae presentes en Colombia, cerca del 68% tienen
especies de hábito arbustivo o arbóreo. Se encuentran en bosques, rastrojos,
potreros o pantanos.
Para Colombia se registran 105 géneros nativos o
naturalizados distribuidos en 25 tribus. Adicionalmente se documentan cuatro
géneros introducidos y cultivados como ornamentales o alimenticios. Mendoza et
al (2004). En Cundinamarca está representada por 46 géneros y 115 especies.
García Kirkbride (1986).
El mayor oficio que cumplen es alimentar la fauna silvestre Mahecha (1997);
presenta especies con importancia económica ya sea en la producción de tintes,
sustancias médicas, productos comestibles, maderables y ornamentales. Mendoza
et al (2004). La familia tienen importancia económica principalmente por el café
que es uno de sus integrantes, también son conocidas la quina, que sirvió para
extracción de alcaloides y drogas para curar el paludismo y la ipecacuana que es
emitizante. García Kirkbride (1986).
2.3 Conceptos generales del género Isertia.
Isertia se distribuye desde Centroamérica hasta el norte de Suramérica, en el
caribe solo en el extremo occidente de Cuba y Guadalupe. Es característica de
bosques secundarios o sucesionales. Boom (1984). El género presenta catorce
especies en América, para Colombia se conocen siete especies distribuidas en
áreas bajas del Chocó biogeográfico, Caribe, Llanos orientales, Amazonas y
piedemonte de los Andes en donde asciende hasta los 1.700 m de altitud.
Mendoza et al (2004).
Entre los nombres comunes y usos de las especies del género, en el Amazonas se
conoce como “tefé-capacira” a Isertia coccinea var hypoleuca (Benth.) K. Schum,
que tiene propiedades medicinales. Isertia haenkeana DC. es conocida en Bolívar
como “pava”; los Karijonas la llaman “cuyarocrí”; las hojas se emplean contra el
reumatismo, el paludismo y las úlceras. En Nariño se conoce a Isertia pittieri
(Standl.) Standl. como “tabaquillo” y “flor de quinde”. García Barriga (1992),
Mendoza et al (2004). Los indígenas miraña utilizan la corteza de Isertia sp que al
secarla y pulverizarla aplican sobre la zona que presenta heridas y granos para
acelerar la cicatrización. La Rotta (1988).
A
Isertia laevis (Triana) B.M. Boom se le llama “asaquiro” y “asaquirú”
(Vaupés), “vara santa” (Tolima); las hojas se emplean como anticancerígenos y
para curar infecciones de la piel. García Barriga (1992), Mendoza et al (2004). En
Perú la madera de esta especie se utiliza en construcción y se conoce con el
nombre de “asaquiro”, “caaynum”, “tsagnum”, y “cagnum”. Boom (1984).
2.3.1 Isertia laevis (Triana) B.M. Boom
La clasificación taxonómica de Isertia laevis es:
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta.
Clase: Magnoliopsida.
Subclase: Asteridae.
Orden: Rubiales
Familia: Rubiaceae.
Subfamilia: Cinchonoideae
Tribu: Isertieae
Género: Isertia
Especie: Isertia laevis
En la base de datos W3 TROPICOS del Missouri Botanical Garden se encuentra
que la sinonimia de esta especie es: Cassupa laevis Triana; Cassupa panamensis
Standl; Creatantha peruviana Standl; Isertia alba Sprague; Isertia panamensis
(Standl.) Standl.; Isertia parvifolia Standl; e Isertia weberbaueri Standl.
En Colombia presenta una distribución entre los 300-1700 m de altitud. Se
encuentra en los departamentos del Amazonas,
Antioquia,
Boyacá, Chocó,
Caldas, Cauca, Caquetá, Casanare, Cundinamarca, Huila, Meta, Putumayo y
Tolima. Mendoza et al (2004); en los Andes se puede encontrar en elevaciones
que van desde los 100 hasta los 2000 m.s.n.m y se extiende desde el norte de
Costa Rica y de oriente a occidente de la Amazonía. Boom (1984). Figura 1.
Figura 1. Distribución de I. laevis. (Tomada de Boom (1984)).
Son arbustos o árboles pequeños de 12 metros de alto, ramas cuadrangulares.
Hojas membranáceas a subcoriáceas, elípticas, 29-43 cm de largo, 14-20 cm de
ancho, ápice agudo o cuspidado de 1-2 cm de largo, base aguda a redondeada,
haz glabro, envés blanco, pubescente. Pecíolo 40-120 mm de largo, 2-5 mm de
ancho. 4 estípulas, interpeciolares, triangulares, 5-13 mm de largo. Inflorescencia
en panícula. Cáliz en forma de copa, 5-6 mm de largo, 3-4 mm de ancho, dentro
glabro o ciliado, 5-6 lóbulos. Corola blanca, tubular, 32-53 mm de largo, con
pubescencia alrededor de la boca, lóbulos 5 a 6. Estambres 6 o 7, anteras
oblongas, 7-9 mm de largo. Ovario 2 a 3 locular. Estilo ciliolado, 32-47 mm de
largo, estigma con 2 lóbulos oblongos, 3-5 mm de largo. Fruto en baya, elipsoidal,
8-11 mm de diámetro. Semillas 0.7-1 mm de largo. Boom (1984). Figura 2.
Figura 2. Inflorescencia de I. laevis. (Tomado de www.mobot.mobot.org)
Las hojas se usan como anticancerígenas, hacen una decocción de dos hojas para
una taza, lo cual se toma dos veces al día.
Se dice que cura el cáncer de
estómago; otro uso es el de los indios Cholos del Chocó que toman la decocción
de las hojas para curarse las infecciones de la piel, especialmente las “úlceras
malignas”; García Barriga (1992).
2.3.2
Fitoquímica del género Isertia.
Algunos de las compuestos químicos que han sido reportados para otras especies
de Isertia según Bohlmann et al (1969); García Barriga (1992); Bruix et al
(1993) y Soto et al (2001) son alcaloides de tipo indólico y fueron encontrados
por Arriaga et al (1990) y
Rumbero et al (1990), triterpenos y saponinas
triterpénicas por Um et al (2001).
Dos especies de este género han sido estudiados previamente: Isertia hypoleuca
de la cual se aislaron alcaloides del tipo quinamina, esteroles y triterpenos; en
Isertia haenkeana, aislaron secoiridoides, glicósidos triterpénicos, esteres de
ácido quínico. Bruix et al (1993); Rumbero- Sánchez et al (1991).
Alcaloides 2,2´- Indolylquinuclidine son encontrados generalmente en tallos y
hojas de especies de Cinchona y Remijia. Sin embargo recientemente, bases
semejantes han sido aisladas de I. hypoleuca e I. haenkeana. Dihidroquinamina y
epidihidroquinamina de I. hypoleuca; de las hojas de I. haenkeana también se ha
aislado el segundo compuesto. En I. haenkeana fue encontrado un alcaloide
derivado del ácido nicotínico que había sido aislado previamente de la especie
Nauclea diderrichii. Bruix et al (1993).
Según Bruneton (2001), la distribución de este amplísimo grupo de alcaloides
indolmonoterpénicos está prácticamente limitado a tres familias: Apocynaceae,
Loganiaceae y Rubiaceae. La diversidad estructural de este grupo cuenta con más
de
2 000 compuestos diferentes. Menos de un 10% de los géneros que
componen la familia Rubiaceae elaboran alcaloides a partir de una unidad
monoterpénica, se trata de géneros pertenecientes a las tribus más primitivas de
la subfamilia de las Rubioideae (Psychotrieae: Cephaelis)
y de los
Cinchonoideae (Naucleae: Andina, Nauclea; Cinchoneae: Remijia, Mitragyna,
Uncaria, etc).
La relación entre Rubiaceae, Apocynaceae y Loganiaceae, en lo concerniente a
alcaloides,
ha sido reconocida extensamente. Entre las especies que
dieron
positivo para el test de alcaloides indólicos, estuvieron I. haenkeana e I. laevis.
Soto- Sobenis et al (2001).
Se aisló y determinó de Isertia pittieri la estructura de dos nuevos 27-nor
bidesmósidos glicosidos triterpenos
junto con dos glicosidos triterpénicos
conocidos, los 27-nor-triterpenos tienen un esqueleto C35 ese esqueleto deriva del
esqueleto normal C30 y su distribución está restringida a unas pocas familias
botánicas. Ácidos glicosidos pirocincólicos han sido aislados solo de la familia
Rubiaceae, cuatro de Adena rubella y uno de I. haenkaena Um et al (2001).
Además muchos glicosidos interesantes de ácido quinóvico y cincholic han sido
aislados de la familia Rubiaceae. Arriaga et al (1990). Tabla 1.
Tabla 1 Metabolitos secundarios aislados de especies del género Isertia.
Especie
Estructuras
Nombres
Parte
planta
I. hypoleuca
Alcaloides
* Dihydrocinchonamine
Hojas
* Isodihydroquinamine
I. haenkeana Alcaloides
* Epidihydroquinamine
Hojas
*Apodihydrocinchonami
y
ne
I. haenkeana Glicósidos triterpénicos
* Ácido quinóvico
corteza
Hojas
3β-O-6deoxy-Dglucopyranoside-28-O-βD-glucopyranoside.
* Cincholic acid 3β-O-β6-deoxy-Dglucopyranoside-28-O-βD-glucopyranoside.
I. haenkeana
* Pyrocincholic acid 3β- Hojas
O-6-deoxy-Dglucopyranoside-28-O-βD-glucopyranoside.
I. pittieri
Pyrocincholic acid 3β-O- Tallo
Glicósidos triterpénicos
β-D-quinovopyranosyl28-β-Dglucopyranosyl(1-6)-β-Dglucopyranosyl ester.
I. pittieri
4,5-di-O-caffeoylquinic
Esteres
acid butyl ester.
1,5-di-O-caffeoylquinic
acid.
3,4-di-O-caffeoylquinic
acid
4,5-di-O-caffeoylquinic
acid.
2.4 Plantas medicinales con triterpenos, saponinas triterpénicas y su actividad
citotóxica y antitumor.
Los triterpenos, 4 000 compuestos basados en más de 40 esqueletos diferentes,
son compuestos en C30 procedentes de la ciclación del
3S-2,3-epóxido-2,3-
dihidroescualeno más raramente del mismo escualeno. Casi siempre hidroxilados
en C3. Bruneton (2001).
Las saponinas
son producidas principalmente por plantas pero también por
animales marinos inferiores y algunas bacterias.
Constan de un azúcar,
usualmente contienen glucosa, galactosa, xilosa, rhamnosa o metil pentosa,
glicosidicamente enlazada a una aglicona hidrofóbica (sapogenina) la cual puede
ser terpenoide o esteroide. La aglicona puede contener uno o más enlaces C-C
insaturados. La cadena oligosacárida está unida normalmente a la posición C3
Tallo
(monodesmósido) pero muchas saponinas tienen un azúcar adicional en la
posición C26 o C28 (bidesmósido). Francis et al (2002).
Según Bilbao (1997), las saponinas triterpénicas se aíslan principalmente de
dicotiledóneas; son un grupo de glicósidos solubles en agua, que tienen las
propiedades de hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial del agua
formando espuma abundante.
Las saponinas son comunes en un gran número de plantas y productos de plantas
que son importantes en la nutrición humana y animal. Muchos efectos biológicos
han sido atribuidos a las saponinas.
Experimentos han demostrado las
propiedades fisiológicas, inmunológicas y farmacológicas de las saponinas lo que
ha provocado un considerable interés clínico en estas sustancias. Francis et al
(2002).
Según Sparg et al (2004), muchas saponinas son usados en fitoterapia y en la
industria cosmética. Ellas son los constituyentes de muchas drogas de plantas
populares y
farmacológicas.
son consideradas responsables de numerosas propiedades
Entre las propiedades biológicas y farmacológicas de las
saponinas se pueden enumerar: actividad antiparasitaria, citotóxica y antitumoral,
antiviral,
antiinflamatorio, antifúngico.
Numerosos reportes destacan las
propiedades citotóxicas de muchas saponinas. Sin embargo las saponinas con
gran citotoxicidad no siempre tienen propiedades antitumor.
Las saponinas aisladas de diferentes plantas y animales han demostrado inhibir el
crecimiento de células cáncer in vitro. La búsqueda de las sustancias naturales
capaces de controlar células malignas ha conducido a la investigación
considerable sobre esta característica de las saponinas. El efecto depresivo de las
saponinas contra las células de cáncer puede ocurrir a través de mecanismos
diversos y complejos. Más claridad en cuanto a la especificidad de las saponinas
sobre diferentes tipos de cánceres podría ser conveniente
preparaciones terapéuticas. Francis et al (2002).
en el diseño de
Tabla 2.
Plantas medicinales con saponinas triterpénicas, triterpenos y su
actividad citotóxica y antitumor.
Nombre planta.
Modelo
Compuesto
experimental.
utilizado.
Aralia dasyphylla Células KB,
Saponinas
Miq.
triterpénicas
HeLa-S3
Respuesta
Referencia
Actividad citotóxica
Xiao et al., 1999
Actividad antitumor
Lee et al., 1999
(Araliaceae)
ginseng Células carcinoma Saponinas
Panax
C.A.Meyer
de próstata LNCaP triterpénicas Inhibe el crecimiento Liu et al., 2000
(Araliaceae)
y
la
proliferación
celular.
Pulsatilla
Saponinas
chinensis (Bunge)
triterpénicas
Actividad citotóxica
Mimaki
et
al.,
1999
Regel
(Ranunculaceae)
Trevesia palmata Líneas
celulares Saponinas
Inhibe
la De Tommasi et al.,
(Roxb. Ex Lindl.) J774, HeK-293 y triterpénicas proliferación celular 2000
Vis. (Araliaceae)
WEHI-164
Acanthophyllum
Linfocitos
Saponinas
squarrosum Boiss.
Actividad citotóxica
Gaidi et al., 2000
Actividad antitumor
Kumara & Huat.,
triterpénicas
(Caryophyllaceae)
Nigella sativa L.
Saponinas
(Ranunculaceae)
triterpénicas
Silene
fortunei Células tumorales Saponinas
Vis.
de cólon
2001
Actividad citotóxica
Gaidi et al., 2002
Actividad citotóxica
Abdel-Kader et al.,
triterpénicas
(Caryophyllaceae)
Acacia
(L.)
tenuifolia Línea celular de Saponinas
Willd. cáncer de pulmón triterpénicas
(Leguminosae)
Acacia
M109
victoriae Células
Benth
(Leguminosae)
2001
humanas Saponinas
de leucemia T.
triterpénicas
Actividad citotóxica
Mujo et al., 2001
Acacia
concinna Células
de Saponinas
Wall.
fibrosarcoma
(Leguminosae)
humano HT-1080
Pittosporum
Líneas celulares de Saponinas
Actividad citotóxica
Tezuka et al., 2000
Actividad citotóxica
Seo et al., 2002
triterpénicas
viridiflorum Sims cáncer de ovario triterpénicas
(Pittosporaceae)
A2780
Chysanthemum
Células Raji
Triterpeno
Efecto
inhibitorio Ukiya et al., 2002
morifolium
pentacíclico sobre virus Epstein-
(Composite)
dioles
y Barr
trioles
Clinopodium
vulgara
(Lamiaceae)
Melanoma
L. metastático
Glucósidos, Inhibe el crecimiento Dzhambazo et al.,
triterpenos
de células tumorales. 2002
humano,carcinoma y saponinas
epidermoide
triterpénicas
humano
2.4.1 Acción citotóxica de especies de la familia Rubiaceae
Entre las especies de rubiaceae con estudios de actividad citotóxica, se puede
nombrar a Palicurea ovalis,
a esta planta
le evaluaron los alcaloides que
presentaba en extractos y fracciones frente a células VERU-YARU, se encontró
que la CL50 para el extracto EtOH fue de 112 ± 26.9 µg/ml, calicantina (alcaloide)
125.8 ± 25.6 µg/ml y uno de los alcaloides (no identificado todavía) 71 ± 37.6
µg/ml, concluyeron que la citotoxicidad del extracto fue debida en gran medida a
uno de los alcaloides presentes. Arteaga et al (1997).
El género Uncaria ha sido una de los más estudiados, se descubrieron dos esteres
triterpenos tetracíclicos y ácidos uncarínicos de la especie U. rhynchophylla. Estos
compuestos inhibieron la fosfolipasa Cγl (PLCγl) con CI50 de 35.66 y 44.55 µM
respectivamente. Los compuestos también inhibieron el crecimiento de las líneas
celulares de cáncer A-549, HCT-15, MCF-7 y HT-1197. Otros seis compuestos
encontrados en esta especie fueron reportados porque también inhibieron tanto la
PLCγl y el crecimiento de células de cáncer, con una CI50 de 9.5-4.6 µM y 0.5 –
6.5 µg/ml respectivamente. Estos compuestos incluían nuevos ácidos uncarínicos
y otros tres esteres triterpenos pentacíclicos. Heitzman et al (2005).
Los extractos acuosos de U. tomentosa inhibieron la proliferación de células
HL60 y Raji y afectó solo de forma moderada a las células K562.
Ácidos
ursólicos aislados de esta misma especie han sido citotóxicos en las líneas
celulares SK_MEL, KB, BT-549, SK-OV-3 y VERO con CI50 entre 30 y 40
µg/ml en todas las líneas celulares. Heitzman et al (2005).
De Mitragyna inermes se han reportado alcaloides indólicos y saponinas
triterpénicas que poseen una 27-nor-triterpenoide aglycona poco común la cual ha
sido solo reportada aislada de Adina rubella e Isertia haenkeana. El extracto
MeOH fue probado en las líneas celulares HL-60, Bel-7402, 293 y KB, presentó
la fracción I como la única citotóxica para línea celular Bell-7402 inhibiendo
>50% a una concentración de 102 µg/ml, esta fracción fue purificada y se aisló el
componente
citotóxico
3-O-(β-D-6-deoxy-glucopiranosil)-ácido
quinóvico,
inhibiendo 43,01% y 91,74% el crecimiento de las células Hela en un a una
concentración de 102 y 103 µg/ml . Cheng et al (2002).
Otras especies estudiadas han sido Chiococca alba, Hamelia patens, Posoqueria
latifolia, Psychotria parvifolia, P. elata y Randia matudae, se utilizaron células
Hep G2, RatH-4-II-E, MDA-MB-231, Hs 578T, 5637. Ch. alba actuó mejor en la
línea celular Hs 578T con un porcentaje de células muertas de 100%, en las líneas
celulares Hep G2 y MDA-MB-231 no presentó actividad citotóxica y en la línea
celular 5637 tuvo un porcentaje de 6.44%;
H. patens presentó un 10.56% de células muertas en la línea MDA-MB-231 y sin
citotoxicidad en Hep G2; Posoqueria latifolia tuvo un 27.69% de células muertas
en Hs 578T y un 0% en Hep G2 y MDA-MB-231 P. parvifolia tuvo un 70% de
células muertas en la línea 5637, 44% en Hs 578T , 20% en MDA-MB-231 y 10%
para Hep G2 P. elata presentó porcentajes entre el 88 y 98% en todas las líneas
celulares. Setzer et al (2003).
2.5 Cultivo celular.
El cultivo de células tiene su origen en el siglo XIX, cuando se comenzaron a
estudiar con cierto detalle los tejidos y órganos en vasos de vidrio. Tras la
incorporación de modificaciones que dieron lugar a medios más sofisticados, se
hizo posible el cultivo de células tumorales procedentes de muestras de tejidos
malignos tanto del hombre como animales. En un principio el objetivo principal
era el estudio de las propias células, cómo crecen, qué necesitan para su
crecimiento, cómo y cuándo dejan de crecer. Este tipo de estudios todavía tiene
hoy un gran interés científico, por ejemplo, en relación con investigaciones sobre
el ciclo celular y el control del crecimiento de células tumorales. Morgan &
Darling (1995).
El cultivo de células tiene el objetivo de mantener vivas, fuera de su organismo
de origen, células animales para estudiar su comportamiento sin el control normal
ejercido por el organismo vivo; para observarlas, bajo un ambiente experimental
controlable. Freshney (2000).
El cultivo de células, es la mejor manera de establecer nuevas líneas celulares en
cultivo para estudiar la morfología celular y para comparar el efecto de diferentes
agentes, o diferentes concentraciones de un agente sobre el crecimiento y
metabolismo.
2.5.1 Líneas celulares.
Las líneas celulares son células de origen animal o humano que se han adaptado a
vivir en cultivo, poseen capacidad de proliferación ilimitada, debido a que han
sufrido un proceso de transformación, que puede ocurrir espontáneamente, ser
inducido por compuestos químicos, radiaciones o virus; que implica la alteración
de las características de crecimiento. Freshney (2000).
Las líneas celulares establecidas se pueden
dividir en dos tipos principales:
adherentes (células en monocapa) que se fijan al material plástico de un frasco o
placa y por lo tanto tienen que desprenderse de esa superficie antes de utilizarlas y
no adherentes (células en suspensión) que normalmente no se fijan a la superficie
del recipiente de cultivo. Morgan & Darling (1995).
Las células que crecen en cultivo, ya sean adherentes o en suspensión, suelen
clasificarse en primarias, inmortales o transformadas. Las células primarias son
aquellas recientemente aisladas a partir de tejidos u órganos y suelen tener una
duración limitada de cultivo. Las células inmortales o transformadas presentan
ambas la propiedad de crecer en forma ilimitada en cultivo (es decir, no mueren).
Las células transformadas están integradas por células que derivan de tumores o
que han sido manipuladas de algún modo. Morgan & Darling (1995).
La demostración de que las células y los tumores sólidos humanos pueden dar
origen a líneas celulares continuas, fomentó su empleo en investigación sobre
cáncer e impulsó su implementación como método
complementario de
“screening” o tamizaje previo a los ensayos in vivo, en el Grupo de Desarrollo de
Fármacos del Instituto Nacional de Cáncer de los Estados Unidos. Cordero
(2002).
La propagación de líneas celulares requiere que el número de células aumente
continuamente, las condiciones de cultivo han sido seleccionadas para favorecer
al máximo la proliferación celular. Estas condiciones son: baja densidad celular,
baja concentración de Ca2+ y la presencia de factores de crecimiento. Dentro de
los requerimientos generales de un cultivo de líneas celulares se cuentan: el medio
de cultivo nutritivo, condiciones de pH, temperatura y ambiente controlado. El
medio nutritivo básicamente debe ser un medio líquido, que contenga una fuente
de carbono, aminoácidos esenciales, oligoelementos, un sistema regulador de pH,
iones y factores de crecimiento aportados por el suero fetal bovino (FBS) con el
que generalmente se suplementa el medio. Adicionalmente los medios de cultivo
celular contienen rojo de fenol como indicador de pH, para permitir un constante
monitoreo de esta variable. Freshney (2000).
Después de preparar el medio básico deben ser añadidos otros suplementos, de
modo que pueda utilizarse en el cultivo celular, como por ejemplo antibiótico para
disminuir el riesgo de contaminación por microorganismos y suero que
proporciona una serie de nutrientes importantes para las células. Alvarado et al
(2002).
Entre las ventajas de las línea celulares que citan Morgan & Darling (1995) se
encuentran que suelen ser más sencillas de manejar que las células primarias,
crecen continuamente y puede obtenerse un mayor número de células. Además
son más fáciles de obtener y existe una información relativamente abundante
sobre ellas.
2.6 Ensayos de citotoxicidad in vitro.
La definición de citotoxicidad tiende a variar dependiendo de la naturaleza del
estudio, si las células mueren o simplemente tienen su metabolismo alterado.
Estos ensayos son empleados porque son baratos, fácilmente cuantificables y
reproducibles. Muchos experimentos in vitro, tienen el propósito de determinar la
potencial citotoxicidad de los compuestos estudiados, porque ellos van a ser
usados como fármacos, cosméticos y deben demostrar que no son tóxicos o
porque van a ser usados como agentes anticáncer y la citotoxicidad es crucial
para su acción. Freshney (2000).
La configuración de los modelos experimentales empleados in vitro para valorar
la toxicidad de los compuestos químicos se fundamenta en dos pilares básicos,
que son el sustrato biológico y los indicadores de toxicidad. El sustrato es el
material generalmente orgánico, vivo o no, sobre el que se aplica in vitro el
xenobiótico. Estas alteraciones se valoran mediante indicadores de toxicidad, que
son los parámetros que se determinan para cuantificar las modificaciones
producidas en la estructura o fisiología
ensayo. Repetto (1995).
de los componentes del sustrato de
Según Cragg & Newman. (2003), en la década de los 90´s el descubrimiento de
agentes antitumor de origen natural estuvo basado en tests de actividad citotóxica
contra líneas celulares de cáncer usando modelos in vitro o in vivo. Muchos
agentes anti-cáncer descubiertos usando tales ensayos han mostrado ejercer su
acción citotóxica a través de la interacción con la tubulina o de la inhibición de la
topoisomerasa.
Con la identificación de un número creciente
de blancos
moleculares asociados con cánceres particulares, el descubrimiento de drogas
anti-cáncer está basado ahora en el alto rendimiento de tamizar compuestos
contra un rango de tales blancos.
En Monks et al (1991) se muestra como por ejemplo el Instituto Nacional de
Cáncer de los E.U. ha implementando nuevas investigaciones in vitro para el
descubrimiento de nuevas drogas contra la enfermedad. Con el propósito de
examinar esto se proporcionaría una evaluación inicial de más de 10 000 nuevas
sustancias por año para la actividad citotóxica y/o la inhibición del crecimiento
contra una gran diversidad de tipos de tumores y permitir la detección de la
sensibilidad que un tumor puede tener a determinada droga. El objetivo es testar
nuevas sustancias contra un amplio panel representativo de líneas celulares de
tumores humanos.
Según Fresney (2000), los ensayos de citotoxicidad se pueden clasificar en
ensayos de viabilidad y ensayos de supervivencia, los primeros se emplean para
determinar la proporción
de células que inmediatamente después de un
tratamiento potencialmente traumático, se mantienen intactas. Mediante estos
ensayos se puede evaluar la citotoxicidad de un tratamiento en términos de
concentraciones letales (LC).
La concentración letal 50 (LC50) es la concentración de la sustancia de tratamiento
que causa la muerte al 50% de las células presentes, evaluadas inmediatamente
después del tratamiento. Cordero (2002).
Para Freshney (1995), (2000), algunos ensayos de citotoxicidad como los de
viabilidad que se basan en la capacidad que tienen las células para excluir
sustancias a las que son impermeables, ofrecen una interpretación instantánea,
Estos tests de viabilidad son para medir la tasa de supervivencia directamente, las
células que al ser expuestas al colorante no se tiñen, se consideran viables y son
de particular importancia para agentes tóxicos los cuales ejercen sus efectos
primarios sobre la integridad de la membrana.
2.6.1
Método del MTT.
Muchos ensayos biológicos requieren medir la supervivencia y/o proliferación de
las células de mamífero, esto puede lograrse por varios métodos, para esto se
desarrollo un ensayo colorimétrico rápido, versátil y cuantitativo, basado en una
sal de tetrazolio MTT (metil tiazol tetrazolio) ó (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5
difenil tetrazolio bromuro),mide sólo células vivientes y puede medirse
espectofotométricamente leyendo la absorbancia entre 540–570 nm. Mosmann
(1983).
El MTT es una sal de tetrazolio color amarillo que se utiliza para medir la
actividad y viabilidad celular por el rompimiento causado por la reducción
(aceptación de un H+) del anillo de la sal de tetrazolio MTT por acción de las
enzimas
deshidrogenasas mitocondriales: succinato–deshidrogenasas, para
formar unos cristales azules de formazan insolubles en agua, pero solubles en
dimetil sulfóxido (DMSO). La viabilidad celular es proporcional a la absorbancia,
que presentan los cristales de formazán en solución. Angel (1999). Figura 3.
Figura 3. Metabolización de MTT a sales de formazan por células viables.
Este método está basado en la capacidad de las enzimas mitocondriales de las
células viables de transformar la sal de tetrazolio MTT en cristales de formazan.
El método ha sido usado exitosamente para monitorear la sensibilidad de células
de tumores humanos a agentes quimioterapéuticos. Ferrari et al (1990).
2.7
El Cáncer, entre las principales causas de mortalidad.
Para Pardo et al (2003) el país no tiene aún conocimiento certero acerca del
comportamiento de la enfermedad en nuestro medio, después de las enfermedades
cardiovasculares y las muertes violentas, las neoplasias malignas son la tercera
causa de mortalidad en Colombia, para el 2000, el cáncer de cuello uterino fue el
más común en las mujeres (23,4%), seguido por el de mama (19,7%) y el de piel
(11,8%).
Según los datos de la International Agency for Research in Cancer (IARC), en el
2002, en el mundo, el cáncer de mama representó 22,8% de todos los cánceres en
las mujeres, estimándose más de 1 millón de casos nuevos por año. En los países
desarrollados, el cáncer de mama es muy superior en incidencia a los otros tipos
de cáncer, mientras que, en los países menos
desarrollados, la magnitud es
variable. En Colombia, la tasa de incidencia estimada es de 30 por 100.000
mujeres, muy similar a la de cáncer de cuello uterino que es de 33 por 100.000
mujeres. Díaz et al (2005).
En Colombia, la mortalidad por cáncer de mama muestra una clara tendencia al
incremento en la última década. Para el año 2000, el cáncer de mama ocupó el
tercer lugar como causa de muerte por cáncer entre mujeres (con 1.542 muertes
registradas), después del cáncer de estómago y el de cuello uterino. Díaz et al
(2005).
Según Cordero (2002), dentro de la propuesta de programas de bioprospección
nacional se ha planteado como uno de los objetivos, el seleccionar e implementar
una serie de ensayos económicos, rápidos, reproducibles, sensibles e indicativos,
para someter a los extractos naturales y sus fracciones a esta batería de pruebas,
con el propósito de evaluar su potencialidad de aplicaciones en campos
terapéuticos con alto impacto sobre la economía y la calidad de vida.
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema.
En este trabajo de grado se planteó evaluar el posible efecto citotóxico frente a
líneas celulares tumorales
de extractos obtenidos de una
especie vegetal
perteneciente a la familia Rubiaceae.
En la parte de los Andes tropicales por encima de los 1000 m.s.n.m, el registro de
géneros de Rubiaceae que se tiene es de 75 y 729 especies, el género Isertia, tribu
Isertieae, aunque presenta una buena distribución es un género poco conocido.
Aunque Isertia es un género
pequeño,
se encontró entre sus metabolitos
secundarios nuevas saponinas triterpénicas, triterpenos y alcaloides indólicos,
dichas sustancias han sido estudiadas en otras familias botánicas y se sabe que
presentan actividad citotóxica y anticancerígena,
haciendo que esta planta
medicinal se convierta en una alternativa para estudiar
preliminarmente su
citotoxicidad.
El cáncer es un problema relevante dentro del perfil epidemiológico de Colombia.
Datos generales muestran que, después de las enfermedades cardiovasculares y las
muertes violentas, las neoplasias malignas son la tercera causa de mortalidad en
Colombia (Dane) y la incidencia estimada para el 2000 fue de 60.883 casos, con
33.178 muertes. Pardo et al (2003).
3.2 Pregunta de investigación
¿Tendrán algún efecto citotóxico frente a las líneas celulares de cáncer de seno
CSC-1595 y MCF-7 y la línea de cólon Colo 205 los extractos y fracciones
obtenidos de Isertia laevis?
3.3 Justificación.
Las plantas son una fuente de drogas medicinales que podrían ser aprovechadas en
un uso clínico para atacar muchas de las enfermedades que no tienen opciones de
tratamiento; en los bosques colombianos un gran número de especies vegetales
no han sido estudiados, esta clase de trabajos son convenientes si se tiene en
cuenta la rápida destrucción que están sufriendo estas zonas de vida.
Hacia finales de la década de los ochenta, resurge el interés de la industria
farmacéutica mundial, por las plantas medicinales y otros recursos naturales como
fuentes de principios con actividad biológica, como alternativa a las estrategias de
diseño de fármacos como la química combinatoria y la simulación por
computador, que resultaron de difícil
aplicación y atendiendo a las
recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud de promover el uso de
plantas medicinales
y sus derivados en el tratamiento de patologías de alto
impacto social. Asebey (1996).
A las especies de Isertia se les atribuyen propiedades
diferentes enfermedades como úlceras,
etnobotánicas para
reumatismo, paludismo y cáncer de
estómago. La valoración preliminar de la potencial actividad citotóxica de los
extractos y fracciones de Isertia laevis servirá para avanzar en la búsqueda de
principios que tengan actividad farmacológica y para la generación de beneficios
sociales y económicos para la comunidad a través del acercamiento a nuevas
alternativas terapéuticas del cáncer que pueden ser aplicadas en el país.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general.
Determinar la viabilidad de líneas celulares tumorales de cáncer de seno MCF-7,
CSC-1595 y cólon Colo 205, tratados con extractos y fracciones obtenidos de
Isertia laevis.
4.2 Objetivos específicos.
Identificar los extractos y fracciones de hojas de Isertia laevis citotóxicamente
activas.
Realizar la identificación y caracterización química cualitativa de la fracción o
principio activo citotóxico obtenido de Isertia laevis.
Demostrar la acción sinérgica o antagónica de los posibles componentes del
extracto y/o fracción citotóxica más activa de la especie Isertia laevis, frente a la
línea celular más sensible.
5. MATERIALES Y MÉTODOS.
Material vegetal:
Se colectó el material vegetal en el municipio de Medina
departamento de
Cundinamarca, a una altura de 550 m.s.n.m. La clasificación taxonómica de la
planta fue realizada por M. Gutiérrez del Instituto de Ciencias Naturales de la
Universidad Nacional de Colombia como Isertia laevis (Triana) B. M. Boom, de
la familia Rubiaceae.
Un ejemplar se encuentra depositado en el Herbario
Nacional Colombiano con el No. COL: 506495.
La planta se limpió, se separó en sus partes, (hojas, tallo, flores y frutos), el
material vegetal se secó a la sombra en un lugar con buena corriente de aire.
Después se pulverizó en un molino de cuchillas para que las partículas pequeñas
tuvieran una mayor superficie de contacto con el solvente, se pesó (2.6 Kg) y se
guardó en un recipiente limpio y seco para utilizarlo posteriormente.
Obtención de extractos:
En el Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Javeriana se obtuvieron los
extractos y fracciones de las hojas de Isertia laevis.
El material vegetal seco y molido se extrajo en Soxhlet con Petrol, durante 72
horas con el fin de desengrasar el material, el extracto en Petrol se concentró en
un rotaevaporador a presión reducida, posteriormente se floculó con MeOH-agua
por 24 horas, se filtró y se llevó a sequedad.
El marco desengrasado se extrajo por maceración en frío con EtOH, el extracto se
concentró a presión reducida en rotavapor.
Obtención de fracciones:
A (5g) del extracto en petrol floculado, se le hizo una cromatografía en columna
tipo flash con sílica gel G-60, eluída con Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH. A cada
fracción se le realizó cromatografías en placas de sílica gel corridas en Petrol:
AcOEt (7:3), reveladas con ácido perclórico.
(2g) del extracto etanólico, se percoló en una columna cromatografía tipo flash
con RP-18 y eluída con mezclas de MeOH:H2O (10:2), MeOH, MeOH:CH2Cl2
(8:2) y CH2Cl2, se obtuvieron 10 fracciones de 50 mL cada una. Las primeras
fracciones se monitorearon en CCD de RP-18 corridas en MeOH:H2O (10:2),
para el resto de fracciones CCD sílica gel corridas en Petrol:AcOEt (7:3),
reveladas con ácido perclórico.
La fracción MeOH del extracto petrol se pasó por cromatografía en columna de
Sephadex, se obtuvieron 3 subfracciones se realizó cromatografía en placas de
RP-18 corridas en MeOH:H2O (10:2), y revelada con ácido perclórico; a la
fracción 3 del extracto EtOH se le hizo cromatografía en columna de Sephadex, se
obtuvieron 2 fracciones, se realizó cromatografía en placas de RP-18 corridas en
MeOH:H2O (10:2), y revelada con ácido perclórico. Figura 4.
A los extractos totales de EtOH y Petrol, a las fracciones y subfracciones se les
realizaron pruebas fitoquímicas cualitativas de terpenos: liebermann burchard,
salkwoski; glicósidos:
molish,
antrona; saponinas: prueba
de espuma;
Flavonoides y fenoles: shinoda, cloruro férrico; alcaloides: dragendorff.
Material vegetal
Hojas
(1.5 Kg)
Extracción en Soxhlet con petrol
Marco I
Extracto Petrol
(41.34g)
Maceración en frío
con EtOH
Flocular
Extracto EtOH
(2g)
Extracto
(5g)
Cromatografía
columna flash
sílica gel
Cromatografía
en columna tipo flash
RP-18
F1............. F3…. ... F10
petrol CH2Cl2 AcOEt
MeOH
(580mg)(2980mg)(1112mg) (3708mg)
Cromatografía
columna
Sephadex
sephadex
Sf3.1
(352mg)
Sf3.2
(130mg)
Sf1
(223mg)
Sf2
(438mg)
Sf3
(162mg)
Figura 4. Marcha fitoquímica I. laevis.
Para aislar alcaloides se utilizaron 20g de material vegetal y fueron extraídos en
maceración en frío con MeOH, se concentró en el rotavapor. El extracto MeOH
se acidificó con HCl al 10%, después de filtrado se neutralizó con NH4OH a pH 9.
Se extrajo con AcOEt en embudo de separación, la fase orgánica se concentró
en el rotavapor. En el balón se formó un precipitado que se sacó con EtOH, este
precipitado formó un sólido con Pf: 221º C.
Fraccionamiento guiado por bioensayo:
La evaluación de la actividad biológica se realizó siguiendo el método:
"fraccionamiento guiado por bioensayo”. El cual consiste en la aplicación de
técnicas de separación y aislamiento sobre un determinado extracto, con el objeto
de hacer un seguimiento de la actividad biológica de las fracciones y compuestos
puros obtenidos, para finalizar con la identificación de los principios activos
responsables de la actividad citotóxica demostrada por el extracto original,
determinar el posible efecto sinérgico o antagónico entre las sustancias que están
presentes en la fracción que contiene el posible principio activo.
Bioensayos:
Los ensayos citotóxicos se realizaron en el laboratorio de Virología de la
Universidad Javeriana. La viabilidad celular fue determinada por la técnica del
MTT, ensayo que se encuentra ampliamente referenciado en la literatura
Studzinski (1999). Se tomó como control negativo del solvente empleado el
DMSO 0.2%.
Solubilización y preparación de muestras:
Los extractos se solubilizan en Dimetil Sulfoxido (Merck) al 0.2% concentración
inocua para las células, se realizaron
los ensayos de los extractos a la
concentración de 300 µg/ml, las fracciones a 100 µg/ml y subfracciones a 50
µg/ml.
Líneas celulares:
Se utilizaron las líneas celulares neoplásicas suministradas por el Instituto
Nacional de Cáncer de EEUU: MCF -7 (seno) y Colo 205 (cólon) y la línea de
cáncer de seno obtenida y caracterizada en el Instituto Nacional de Cáncer de
Colombia CSS-1595 con las siguientes características:
MCF-7. Tumor de una paciente de 69 años con adenocarcinoma de glándula
mamaria, hipotetraploide, células epiteliales.
CSC 1595.
Línea celular colombiana obtenida en el laboratorio de biología
experimental del INC del tumor de una paciente de 77 años con cáncer de seno
ductal infiltrante avanzado, características: aneuploide, 70 cromosomas,
hormonodependiente, sensible a antraciclinas y 5-fluoracilo. Téllez et al (2006).
Colo 205. Tumor de un paciente de 70 años, caucásico, con carcinoma de cólon
(adenocarcinoma), hipertriploide.
Cultivo celular:
Se utilizaron cajas de 96 pozos para el cultivo de las células con medio de cultivo
L-15 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 µl/10ml, penicilina
estreptomicina y neomicina (5000U, 5mg estreptomicina y 10 mg neomicina/ml).
Las líneas celulares fueron resuspendidas en medio de cultivo L-15 (±40 000
células por pozo) en 100 µl por pozo. Las cajas se incubaron a 37º C y 5% de CO2
por 24 horas, tiempo para la formación de la monocapa de células. Después de la
formación de la monocapa, se colocaron 20 µl de cada una de las soluciones de
extractos y fracciones a las concentraciones definidas (300 µg/ml de extractos y
100 µg/ml de fracciones), en los pozos de la caja, cada concentración de los
extractos y fracciones tenían seis réplicas, se incubaron por 24 horas, tiempo
para que las células puedan incorporar las sustancias. Pasado este periodo las
soluciones de extractos y sus respectivas fracciones son retiradas y a cada pozo se
le adicionaron 100 µl de medio L-15, por 24 horas para establecer si las células se
recuperan.
Posteriormente el medio es retirado y a cada pozo se le agregaron 100 µl de
medio Dulbecco modificado y 50 µl de MTT, las cajas se incubaron por 4 horas a
37º C. Pasadas las 4 horas se retiraron los 150 µl de medio Dulbecco y MTT y se
adicionaron en los pozos 100 µl de isopropanol para disolver los cristales de
formazan producidos, a continuación se leyó la absorbancia en espectrofotómetro
a una longitud de onda de 540 nm. Figura 5.
Cultivo de líneas celulares MCF-7, CSC-1595, colo 205
en placas de 96 pozos
100 µl x pozo
con medio L-15
suero fetal bovino
antibiótico
Incubar por 24h, a 37º C, con 5% de CO2
Adición de 20 µl de tratamiento por pozo
Incubar por 24h, a 37º C, con 5% de CO2
300 µg/ml extractos
100 µg/ml fracciones
50 µg/ml subfracciones
Retiro de tratamientos
Adición de 100 µl de L15 x pozo
Incubar por 24h, a 37º C, con 5% de CO2
Retiro de medio L-15
Adicionar 100 µl de medio Dulbecco modificado y 50 µl de MTT
Incubar 4h
Retirar medio Dulbecco modificado y MTT
Adicionar 100 µl de isopropanol
Lectura de placas en espectofotómetro a 540nm
Figura 5. Siembra de células y extractos en placas de 96 pozos.
El análisis estadístico entre los valores de controles y
ensayos fueron
interpretados mediante la prueba t (Student), con un nivel de significancia de
(p<0.05). Tablas 30-45.
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 RESULTADOS.
Para las fracciones Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH del extracto en Petrol, las
pruebas fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos en
las fracciones CH2Cl2, AcOEt, MeOH, tabla 3.
Tabla 3. Pruebas fitoquímicas de las fracciones del extracto Petrol.
Fracción
Cloruro
Shinoda
Férrico
1 Petrol
Liebermann Salkwoski Antrona
Molisch
Burchard
-
-
-
-
-
-
2 CH2Cl2 -
-
+
+
-
+
3 AcOEt
-
-
+
+
-
+
4 MeOH
-
-
+
+
+
-
Estas fracciones se monitorearon mediante una CCD en sílica gel G-60 corrida en
Petrol: AcOEt (7:3) y revelada en ácido perclórico como se observa en la figura
6. Los Rf para el extracto Petrol fueron 0.25; 0.38; 0.52, los Rf para la fracción
Petrol fueron: 0.48; 0.55; 0.63 y 0.76. Rf fracción CH2Cl2: 0.14; 0.36; 0.51 y
0.66 Rf fracción AcOEt: 0.14; 0.39. Rf fracción MeOH: 0.69 y 0.80.
Figura 6. Cromatografía Extracto Petrol y fracciones 1-4.
Las fracciones obtenidas del extracto EtOH
mostraron en las pruebas
fitoquímicas cualitativas la presencia de flavonoides, esteroides y/o triterpenos y
saponinas ver
tabla 4.
Tabla 4. Pruebas fitoquímicas de las fracciones del extracto EtOH.
Fracción
Cloruro Shinoda Liebermann Salkwoski
Férrico
Antrona
Molisch
Burchard
1
+
+
+
+
+
+
2
+
-
+
+
+
+
3
-
-
+
+
+
+
4
-
-
+
-
-
-
5
-
-
+
-
-
-
6
-
-
+
-
-
-
7
-
-
+
-
-
-
8
-
-
+
-
-
-
9
-
-
+
-
-
-
10
-
-
+
-
-
-
En la figura 7 se muestra la CCD de RP-18 del extracto EtOH total y fracciones 1
a 8, corrida en MeOH:H2O (10:2), revelada con ácido perclórico. Rf extracto
EtOH total: 0.21 y 0.95. Rf fracción 1: 0.92. Rf fracción 2: 0.62; 0.675; 0.76;
0.9; 0.9625.
Rf fracción 3: 0.37; 0.4. Rf para la fracción 4 fueron: 0.21. Rf
fracción 5: 0.08 y 0.21. Rf fracción 6: 0.075.
Figura 7. Cromatografía en capa fina del extracto EtOH total y fracciones 1-8.
En la figura 8 se muestra la cromatografía de las fracciones 8-10 del extracto
EtOH en placa de sílica gel, corrida con Petrol: AcOEt (7:3) y revelada con ácido
perclórico. Rf subfracción 9: 0.23. Rf subfracción 10: 0.23; 0.36; 0.5.
Figura 8. Cromatografía fracciones 8-10 extracto EtOH.
Los resultados obtenidos en la evaluación citotóxica siguiendo el método:
"fraccionamiento guiado por bioensayo (MTT)”,
extractos y
se consideraron activos los
las fracciones que presentaron porcentajes de viabilidad igual ó
inferiores a un 50 %. Los extractos totales petrol y etanólico frente a las líneas
celulares CSC 1595, MCF-7 y Colo 205, demostraron la mayor actividad los dos
extractos frente a línea celular colombiana CSC-1595
con porcentajes de
viabilidad del 50% (50% de citotoxicidad) a la concentración de 300 µg/mL como
se muestra en la tabla 5.
Tabla 5. Porcentaje de viabilidad de las células para los extractos EtOH y Petrol
frente a las líneas celulares probadas. Concentración 300 µg/ml.
% Viabilidad
Extracto Petrol total
Extracto EtOH total
MCF-7
82
76
Colo 205
104
101
CSC 1595
50
50
Las fracciones Petrol, CH2Cl2, AcOEt y MeOH se obtuvieron a partir del
extracto total en petrol y se probaron a la concentración de 100 µg/mL, La
fracción MeOH presentó la mayor actividad como se muestra en la Tabla 6 y
figuras 9, 10 y 11; con porcentajes de viabilidad 32% y 7%
para las líneas
celulares de cáncer de seno MCF-7 y CSC 1595 respectivamente y no activo para
la línea Colo 205 de colón.
Tabla 6. Porcentaje de viabilidad de las células para las fracciones Petrol, CH2Cl2,
AcOEt, MeOH del extracto petrol. Concentraciones aplicadas a 100 µg/ml.
F. Petrol
F. CH2Cl2
F. AcOEt
F. MeOH
MCF-7
66
81
97
32
CSC 1595
64
43
38
7
Colo 205
77
82
97
69
%
VIABILIDAD
EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO PETROL EN LA
LÍNEA CELULAR MCF-7
100
80
60
40
20
0
Petrol 300ug/mL
F. Petrol 100ug/ml
F. CH2Cl2
F. AcOEt
F. MeOH
EXTRACTO Y FRACCIONES
Figura 9. Efecto citotóxico de extracto y fracciones Petrol en línea celular MCF-7
%
VIABILIDAD
EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO PETROL EN LÍNEA
CELULAR 1595
80
60
40
20
0
P et r ol
F. P et r ol
300ug/ mL
100ug/ ml
F. CH2Cl 2
F. A c OE t
F. M eOH
EXTRACTO Y FRACCIONES
Figura 10. Efecto citotóxico del extracto y fracciones petrol en línea celular 1595.
% VIABILIDAD
EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO PETROL EN LA
LÍNEA CELULAR COLO 205
120
100
80
60
40
20
0
Petrol 300ug/mL
F. Petrol
100ug/ml
F. CH2Cl2
F. AcOEt
F. MeOH
EXTRACTO Y FRACCIONES
Figura 11. Efecto citotóxico de extracto y fracciones de Petrol sobre línea celular
Colo 205.
Las fracciones F.1 ....F.10 obtenidas a partir del extracto total etanólico se
probaron a la concentración de 100 µg/mL, La fracción F.9 presentó la mayor
actividad frente a la línea celular MCF-7 con un porcentaje de viabilidad del 20%
; La fracción F.3 presentó actividad con porcentajes de viabilidad 27% y 23%
para las líneas celulares de cáncer de seno MCF-7 y CSC 1595 respectivamente y
no activa para la línea de colón Colo 205 con un 162% de viabilidad , sin
embargo sí mostraron actividad para esta línea las fracciones F. 4 y F. 5 con un
41% de viabilidad, como se muestra en la Tabla 7 y figuras 12,13 y 14.
Tabla 7. Porcentaje de viabilidad de las células para las fracciones 1 – 10 del
extracto EtOH. Concentraciones aplicadas a 100 µg/ml.
F.1
F.2
F.3
MCF-7
93
43
27
CSC 1595
130
39
Colo 205
108
103
F.4
F.5
F.6
F.7
F.8
F.9
F.10
44
72
44
29
50
20
55
23
48
58
57
35
38
42
104
162
41
41
115
127
157
152
148
%
VIABILIDAD
EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO EtOH EN LA
LÍNEA CELULAR MCF-7
100
80
60
40
20
0
ETOH F.2
total
F.4
F.6
F.8
F-10
EXTRACTO Y FRACCIONES
Figura 12. Efecto citotóxico de extracto y fracciones obtenidas del extracto en
EtOH frente a la línea celular MCF7, a una concentración de 100 µg/ml.
%
VIABILIDAD
EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO EtOH EN LA
LÍNEA CELULAR 1595
140
120
100
80
60
40
20
0
ETOH F.2
total
F.4
F.6
F.8
F-10
EXTRACTO Y FRACCIONES
Figura 13. Efecto citotóxico de extracto y fracciones de EtOH en línea celular
CSC1595.
%
VIABILIDAD
EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO EtOH EN LA
LÍNEA CELULAR COLO 205
200
150
100
50
0
ETOH
total
F.2
F.4
F.6
F.8
F-10
EXTRACTO Y FRACCIONES
Figura 14. Efecto citotóxico de extracto y fracciones de EtOH en línea celular
colo 205.
La fracción activa en MeOH se fraccionó percolando en cromatografía en
columna con Sephadex como fase estacionaria y fase móvil MeOH, se obtuvieron
tres subfracciones,
se realizó cromatografía en placas de RP-18 corridas en
MeOH:H2O (10:2), y revelada con ácido perclórico. Los Rf para la subfracción 1
fueron: 0.4 y 0.425. Rf subfracción 2 0.25 y 0.4. Figura 15.
Sf1 Sf2 Sf3
Figura 15.Cromatografía subfracciones obtenidas de la fracción MeOH del
extracto en Petrol
Para las subfracciones de la fracción MeOH del extracto en Petrol, las pruebas
fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos, tabla 8.
Tabla 8. Pruebas fitoquímicas de las subfracciones de la fracción MeOH del
extracto Petrol.
Fracción
Cloruro
Shinoda
Liebermann Salkwoski Antrona
Férrico
Molisch
Burchard
Sf1
-
-
+
+
-
+
Sf2
-
-
+
+
-
+
Sf3
-
-
+
+
-
+
Las subfracciones Sf1, Sf2 y Sf3 obtenidas a partir de la fracción MeOH del
extracto Petrol se probaron a la concentración de 50 µg/ml. La subfracción Sf1
mostró un porcentaje de viabilidad del 100%; La subfracción Sf2 presentó un
porcentaje de viabilidad de 72% y Sf3 83% de viabilidad para la línea celular de
cáncer de seno CSC 1595 como se muestra en la Tabla 9 y figura 16.
Tabla 9. Porcentaje de viabilidad de las células para las subfracciones de la
fracción MeOH del extracto Petrol concentraciones aplicadas a 50 µg/ml,
alcaloide a 25 µg/ml.
% viabilidad
CSC 1595
Sf1
Sf2
Sf3
Alcaloide
100
72
83
83
% VIABILIDAD
EFECTO CITOTOXICO DE ALCALOIDE Y SUBFRACCIONES
DE LA FRACCIÓN MeOH DEL EXTRACTO PETROL EN LA
LÍNEA CELULAR 1595
100
80
60
40
20
0
Alcaloide
subfr.1
subfr. 2
Subfr.3
ALCALOIDE, SUBFRACCIONES
Figura 16. Efecto citotóxico del alcaloide y subfracciones de la fracción MeOH
del extracto petrol sobre línea celular 1595.
Para probar si las subfracciones actuaban de forma sinérgica o antagónica se
hicieron mezclas de las subfracciones, se probaron a una concentración de 50
µg/ml, las subfracción 1 y 2 fueron las que presentaron un porcentaje de
viabilidad más bajo 68% (32% citotoxicidad) como se muestra en la tabla 10
Tabla 10. Porcentaje de viabilidad de las células para la mezcla de las
subfracciones de la fracción MeOH del extracto Petrol, concentraciones
50
µg/ml.
% viabilidad
Sf1+ Sf2+Sf3
Sf1+ Sf2
Sf2+Sf3
Sf1+Sf3
Concentración
Concentración
Concentración
Concentración
16.6 µg/ml
16.6 µg/ml
25 µg/ml
25 µg/ml
71
68
92
84
CSC 1595
La fracción activa F.3 se paso por una columna con Sephadex, eluída con MeOH,
obteniéndose dos subfracciones, se realizó cromatografía en placas de RP-18
corridas en MeOH:H2O (10:2), revelada con ácido perclórico. Los Rf para la
fracción F.3 y sus subfracciones 1 y 2 presentaron manchas con Rf 0.30; 0.37 y
0.45, figura 17.
F3 S3.1 S3.2
Figura 17. Cromatografía subfracciones de la fracción 3 del extracto EtOH
Las pruebas fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos
en las subfracciones de la fracción 3 del extracto EtOH. Tabla 11.
Tabla 11. Pruebas fitoquímicas de la fracción 3 del extracto EtOH.
Fracción
Cloruro
Shinoda
Férrico
Liebermann
Salkwoski
Antrona
Molisch
Burchard
S3.1
-
-
+
+
-
+
S3.2
-
-
+
+
-
+
Las subfracciones S3.1 y S3.2 de la fracción 3 del extracto EtOH se probaron a
la concentración
de 50 µg/ml.
La subfracción S3.1 tuvo un porcentaje de
viabilidad del 60% y la subfracción S3.2 mostró un porcentaje de viabilidad de
61% en la línea celular CSC 1595 como se muestra en la Tabla 12 y figura 18.
Tabla 12. Porcentaje de viabilidad de las células para las subfracciones de la
fracción 3 del extracto EtOH. Concentraciones aplicadas a 50 µg/ml
subfracciones.
% viabilidad
CSC 1595
Sf1
Sf2
60
61
%
VIABILIDAD
EFECTO CITOTOXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA
FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO EtOH DEL EXTRACTO EN LA
LÍNEA CELULAR 1595
61,5
61
60,5
60
subf r .1
Subf r . 2
SUBFRACCIONES
Figura 18. Efecto citotóxico de subfracciones de EtOH en línea celular 1595
Los resultados de la prueba estadística t de Student (ver anexos) muestran que el
efecto citotóxico de los extractos y fracciones fue producto de las concentraciones
que fueron probadas y no causado por otros agentes.
6.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Los extractos y fracciones obtenidos de Isertia laevis se probaron frente a un
panel de células provenientes de tejido tumoral, una colombiana obtenida del
Laboratorio de Biología Experimental del Instituto Nacional de Cancerología, la
línea CSC-1595 y las líneas comerciales de seno MCF-7 y cólon Colo 205, con el
fin de evaluar su actividad citotóxica.
Los extractos se probaron a una concentración de 300 µg/ml mostrando los
siguientes efectos citotóxicos, la línea tumoral CSC 1595 fue la más sensible a los
extractos totales petrol y etanólico, con un efecto citotóxico del 50% (% de
viabilidad 50%).
En la evaluación de las fracciones petrol, CH2Cl2, AcOEt y MeOH valoradas a
100 µg/mL, se demostró que la más activa fue la fracción MeOH con porcentajes
de viabilidad de 32% y 7% en las líneas tumorales de seno MCF-7 y CSC 1595
respectivamente.
La línea celular obtenida de tumor de paciente colombiano CSC 1595 fue la más
sensible al efecto de las fracciones CH2Cl2, AcOEt y MeOH con porcentajes de
viabilidad del 43%, 38% y 7% respectivamente, este resultado es interesante si
se tiene en cuenta que esta línea se considera joven, conservando un buen grado
de similitud entre el tejido tumoral y la línea celular, opuesto a lo que sucede con
la líneas celulares comerciales como lo menciona
Téllez et al (2004). Las
fracciones no fueron activas para la línea celular de colón Colo 205. Estos
resultados demuestran cierta selectividad de acción frente a las líneas tumorales de
diversa procedencia y origen.
El comportamiento de las fracciones del extracto de EtOH también fue similar
para las líneas 1595 y MCF-7. Las fracciones 2, 3, 4, 7, 8 y 9 del extracto EtOH
presentaron porcentajes de viabilidad entre 23 y 50% para las líneas celulares
CSC 1595 y MCF-7, la fracción 6 tuvo una viabilidad 44% solo para la línea
celular MCF-7, la línea celular Colo 205 tuvo un comportamiento diferente al de
las otras dos líneas, siendo las fracciones 4 y 5 las más activas con un porcentaje
de viabilidad de 41% como se presenta en la tabla 7, opuesto a lo que mostró la
viabilidad para el resto de fracciones y extractos de petrol y EtOH que tuvieron
un efecto proliferativo con porcentajes de viabilidad entre 79 y 162% en esta línea
celular. Figuras 13.
Las pruebas fitoquímicas cualitativas muestran que las fracciones del extracto
EtOH y del extracto petrol contienen esteroides y/o triterpenos y saponinas
triterpénicas Tablas 3 y 4, concuerda con la química reportada en la literatura
para las especies de Isertia, Arriaga et al (1990), Rumbero et al (1990), Bruix et
al (1993); Um et al (2001).
Los resultados del porcentaje de citotoxicidad para la fracción MeOH a unas
concentraciones de 100 y 50 µg/ml fue de (93% y 35% de efecto citotóxico)
respectivamente lo que indica que la CC50 se debe encontrar entre los 50 y 100
µg/ml; al subfraccionar la fracción MeOH que fue la que presentó el porcentaje
de viabilidad inferior al 7% se quiso determinar el posible efecto sinérgico o
antagónico entre las sustancias que presentaba esta fracción,
se obtuvieron tres
fracciones y la fracción que presentó un mayor porcentaje de citotoxicidad fue la
Sf2 (28%), las subfracciones no actuaron de manera similar como la fracción
MeOH, por eso se hicieron mezclas de las subfracciones para observar cual
presentaba un efecto citotóxico moderado, se observó que las mezclas donde se
encontraba la subfracción 2 presentaron una mejor actividad citotóxica explicando
así que las subfracciones 2 y 1 se relacionan de forma sinérgica y la subfracción 3
presenta un efecto antagónico con respecto a las otras subfracciones.
Según las cromatografías y las pruebas fitoquímicas cualitativas, los metabolitos
secundarios esteroides y/o triterpenos posiblemente sean los que están actuando
favorablemente en la actividad citotóxica de las fracciones que presentaron un
porcentaje de viabilidad menor o igual al 50%. A los triterpenos y saponinas
triterpénicas se les ha comprobado propiedades farmacológicas importantes, entre
ellas una buena actividad citotóxica en varias líneas celulares derivadas de
tumores humanos, como lo referencia Sparg et al (2004) para varias familias
botánicas y Cheng et al (2002) y Setter et al (2003) para especies de la familia
rubiaceae.
Uno de los géneros más estudiado ha sido el género Uncaria, en la especie U.
rhynchophylla se encontraron varios esteres triterpenos tetracíclicos y ácidos
uncarínicos, los cuales inhibieron el crecimiento de las líneas celulares de cáncer
A-549, HCT-15, MCF-7 y HT-1197. Heitzman et al (2005).
En el trabajo de Cheng et al (2002) sobre Mitragyna inermes se reportó una 27nor-triterpenoide aglycona que había sido aislada solo de Isertia haenkeana y
Adina rubella. El extracto MeOH fue el que mostró ser citotóxico contra un
panel de líneas celulares de cáncer humanos, utilizaron como eluyentes de la
columna de sílica gel CH2Cl2, AcOEt y MeOH, obteniendo tres fracciones. La
fracción I presentó la inhibición del crecimiento de más del 50% en la línea
celular Bel-7402, esta fracción fue sometida a purificación sobre columna de
Sephadex LH-20 y se aisló el componente citotóxico (un ácido quinóvico).
Tanto el género Uncaria como el género Isertia pertenecen a la subfamilia
Cinchonoideae compartiendo caracteres morfológicos, pero sería preciso acudir a
caracteres
quimiotaxonómicos
que
fortalecieran
aún
más
los
aspectos
filogenéticos dentro de la subfamilia.
Con la prueba t se comparó el control con cada uno de los extractos y fracciones
evaluadas, los valores de t calculados mostraron ser inferiores a los valores de t
de la tabla. Se rechazó la Ho, es decir sí hay diferencias significativas entre los
tratamientos y el control.
7. CONCLUSIONES
Las líneas celulares de cáncer de seno CSC 1595 y MCF-7 fueron las líneas más
sensibles al exponerlas a los diferentes extractos y fracciones de petrol y EtOH.
La fracción MeOH del extracto en Petrol a la concentración de 100 µg/mL fue la
que presentó mayor actividad citotóxica entre los extractos y fracciones evaluadas
con un 7% de viabilidad (efecto citotóxico de 93%) frente a la línea celular de
cáncer de seno CSC 1595 y con un 32% de viabilidad (68% de efecto citotóxico)
en la línea celular comercial de seno MCF-7.
La subfracción obtenida a partir de la fracción MeOH, (SF-1, SF-2 y SF-3) que
presentó la mayor actividad citotóxica a la concentración de 50 µg/mL fue SF-2.
La fracción SF-1 Presentó un 100% de viabilidad.
La mezcla de las subfracciones de la fracción MeOH demostró cierto grado de
sinergismo al potenciar la acción citotóxica de SF-1 y SF-3.
La fracción más activa de Isertia laevis mediante las
cualitativas demostró
pruebas químicas
la presencia glicósidos de triterpenos (Glicósidos
esteroidales y/o saponinas). Posiblemente los causantes de la acción citotóxica.
Las fracciones del extracto EtOH presentaron moderada actividad citotóxica para
las líneas celulares CSC 1595 y MCF-7.
Las fracciones y extractos que presentaron un porcentaje de viabilidad menor al
50% pueden ser evaluadas en otras líneas celulares derivadas de cáncer de seno,
para estimar si existe especificidad citotóxica frente a esta clase de líneas
celulares.
Las fracciones y extractos que no presentaron efecto citotóxico pueden ser
probadas en líneas celulares derivadas de tumores de otros órganos para evaluar
que tan inocuas son.
8. RECOMENDACIONES
Se recomienda que todas las fracciones y extractos se prueben en un panel amplio
de líneas celulares tumorales humanas.
Se sugiere hacer pruebas con otras líneas celulares de cáncer de seno.
Es importante seguir evaluando la fracción MeOH del extracto Petrol que
presentó una viabilidad del 7%.
Es recomendable hacer ensayos sobre células normales para poder evaluar el
efecto tóxico que presentan los extractos y fracciones.
Se aconseja utilizar otras partes de la planta para comparar cual presenta mayor
concentración de metabolitos secundarios.
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10. ANEXOS.
Tabla 13. Efecto citotóxico de extracto y fracciones de petrol sobre la línea
celular CSC 1595.
CSC-1595
Petrol
F. Petrol
300ug/mL
100ug/ml
F. CH2Cl2
F. AcOEt
F. MeOH
CONTROL
0,108
0,12
0,077
0,065
0,06
0,147
0,117
0,101
0,076
0,069
0,006
0,193
0,108
0,094
0,064
0,058
0,005
0,191
0,111
0,091
0,081
0,073
0,004
0,194
0,094
0,113
0,085
0,062
0,005
0,188
0,011
0,176
0,086
0,092
0,005
0,172
Promedio
0,0915 0,115833333 0,078166667 0,069833333 0,014166667 0,180833333
Desv Est
0,040153456 0,031492327 0,008035339 0,01205681 0,022462561 0,018432761
Comp Control
5,7623E-04 0,00141388 1,97853E-07 2,23796E-07 6,5468E-08
Viabilidad
50,59907834 64,05529954 43,22580645 38,61751152 7,834101382
Tabla 14. Efecto citotóxico de extracto y fracciones 1-3 de EtOH sobre la línea
celular CSC 1595.
Promedio
Desv Est
Comp Control
Viabilidad
ETOH total
0,042
0,087
0,084
0,097
0,118
0,123
0,091833333
0,029157618
8,6832E-05
50,78341014
F.1
0,234
0,195
0,187
0,173
0,235
0,387
0,235166667
0,078552955
0,130069354
130,0460829
F.2
0,049
0,051
0,043
0,051
0,068
0,165
0,071166667
0,046717948
0,000324199
39,35483871
F.3
0,036
0,038
0,033
0,057
0,033
0,056
0,042166667
0,011267949
2,22335E-08
23,31797235
CONTROL
0,147
0,193
0,191
0,194
0,188
0,172
0,180833333
0,018432761
Tabla 15. Efecto citotóxico de fracciones 4-6de EtOH sobre la línea celular CSC
1595.
F.4
F.5
F.6
CONTROL
0,08
0,086
0,086
0,175
0,072
0,094
0,102
0,19
0,08
0,092
0,101
0,146
0,09
0,093
0,097
0,188
0,076
0,104
0,099
0,159
0,081
0,106
0,088
0,133
Promedio
0,079833333 0,095833333
0,0955 0,165166667
Desv Est
0,006013873 0,007652886 0,00683374 0,023129346
Comp Control 5,34706E-06 3,84804E-05 3,39292E-05
Viabilidad
48,33501514 58,0221998 57,82038345
Tabla 16. Efecto citotóxico de fracciones 7-10 de EtOH sobre la línea celular
CSC 1595.
F.7
Promedio
Desv Est
Comp Control
Viabilidad
F.8
0,061
0,062
0,056
0,055
0,051
0,066
0,0585
0,005468089
6,6293E-07
35,41876892
F.9
0,066
0,075
0,058
0,072
0,068
0,044
0,063833333
0,011321072
2,22443E-06
38,64783047
0,067
0,074
0,068
0,081
0,072
0,061
0,0705
0,00683374
2,27595E-06
42,68415742
F.10
0,15
0,167
0,168
0,185
0,183
0,178
0,171833333
0,013044795
0,552315225
104,0363269
CONTROL
0,175
0,19
0,146
0,188
0,159
0,133
0,165166667
0,023129346
Tabla 17. Efecto citotóxico de extracto y fracciones petrol sobre la línea Colo
205.
Colo 205
Petrol
300ug/mL
0,252
0,389
0,33
0,234
0,242
0,234
Promedio
0,280166667
Desv Est
0,06456134
Comp Control
7,0826E-01
Viabilidad
104,2157471
F. Petrol
100ug/ml
F. CH2Cl2
F. AcOEt
F. MeOH
CONTROL
0,19
0,227
0,246
0,224
0,246
0,26
0,243
0,302
0,266
0,281
0,195
0,223
0,267
0,152
0,318
0,175
0,256
0,242
0,134
0,284
0,175
0,163
0,272
0,149
0,228
0,255
0,216
0,25
0,19
0,256
0,208333333 0,221333333 0,263166667 0,185833333 0,268833333
0,038944405 0,032054121 0,022435834 0,051164115 0,032089978
0,014868353 0,02811947 0,730327646 0,007165794
77,49535028 82,33106014 97,89212647 69,12585245
Tabla 18. Efecto citotóxico de extracto y fracciones 1-3 de EtOH sobre la línea
celular colo 205.
Promedio
Desv Est
Comp Control
Viabilidad
ETOH total
0,325
0,255
0,202
0,208
0,345
0,299
0,272333333
0,060251694
9,0255E-01
101,3019219
F.1
0,203
0,262
0,289
0,374
0,383
0,235
0,291
0,07359076
0,51417516
108,2455053
F.2
0,221
0,197
0,321
0,33
0,37
0,223
0,277
0,071897149
0,804586015
103,0378177
F.3
0,462
0,39
0,353
0,55
0,602
0,267
0,437333333
0,125525562
0,009725912
162,6782393
CONTROL
0,246
0,281
0,318
0,284
0,228
0,256
0,268833333
0,032089978
Tabla 19. Efecto citotóxico de fracciones 4-6 de EtOH sobre la línea celular Colo
205.
F.4
F.5
F.6
CONTROL
0,258
0,241
0,553
0,401
0,197
0,208
0,548
0,455
0,212
0,198
0,535
0,406
0,179
0,147
0,46
0,429
0,155
0,172
0,481
0,579
0,142
0,186
0,599
0,482
Promedio
0,1905
0,192 0,529333333 0,458666667
Desv Est
0,041965462 0,032106074 0,050867147 0,066358622
Comp Control 7,93916E-06 4,75947E-06 0,065256485
Viabilidad
41,53343023 41,86046512 115,4069767
Tabla 20. Efecto citotóxico de fracciones 7-10 de EtOH sobre la línea celular
Colo 205.
F.7
Promedio
Desv Est
Comp Control
Viabilidad
0,575
0,655
0,564
0,55
0,466
0,701
0,585166667
0,082804388
1,5298E-02
127,5799419
F.8
0,665
0,718
0,799
0,704
0,621
0,835
0,723666667
0,080587013
9,90923E-05
157,7761628
F.9
0,667
0,784
0,886
0,491
0,776
0,606
0,701666667
0,142138899
0,003517424
152,9796512
F.10
0,74
0,685
0,395
0,698
0,711
0,863
0,682
0,154660919
0,008712474
148,6918605
CONTROL
0,401
0,455
0,406
0,429
0,579
0,482
0,458666667
0,066358622
Tabla 21. Efecto citotóxico de extracto y fracciones Petrol sobre la línea celular
MCF-7.
MCF-7
Petrol
300ug/mL
0,388
0,348
0,49
F. Petrol
100ug/ml
0,255
0,379
0,352
F. CH2Cl2
0,421
0,421
0,372
F. AcOEt
0,42
0,492
0,535
Promedio
0,408666667 0,328666667 0,404666667 0,482333333
Desv Est
0,073221126 0,065209917 0,028290163 0,058106225
Comp Control
2,0887E-01 0,030365027 0,157508506 0,828605817
Viabilidad
82,39247312 66,26344086 81,58602151 97,24462366
F. MeOH
0,152
0,155
0,182
CONTROL
0,458
0,403
0,502
0,654
0,548
0,411
0,163
0,496
0,016522712 0,094891517
0,000639086
32,86290323
Tabla 22. Efecto citotóxico de extracto y fracciones 1-3 de EtOH sobre la línea
celular MCF-7.
ETOH total
0,04
0,407
0,692
Promedio
Desv Est
Comp Control
Viabilidad
0,379666667
0,326858277
4,2043E-01
76,54569892
F.1
F.2
F.3
0,537
0,408
0,442
0,197
0,221
0,222
0,14
0,12
0,142
0,462333333
0,066860551
0,604456533
93,21236559
0,213333333
0,014153916
0,001632932
43,01075269
0,134
0,012165525
0,000380601
27,01612903
CONTROL
0,458
0,403
0,502
0,654
0,548
0,411
0,496
0,094891517
Tabla 23. Efecto citotóxico de fracciones 4-6 de EtOH sobre la línea celular
MCF-7.
F.4
0,224
0,192
0,251
Promedio
0,222333333
Desv Est
0,02953529
Comp Control 0,002120235
Viabilidad
44,82526882
F.5
0,462
0,326
0,292
F.6
0,182
0,211
0,265
CONTROL
0,458
0,403
0,502
0,654
0,548
0,411
0,36 0,219333333
0,496
0,089955545 0,042122836 0,094891517
0,078728504 0,002215909
72,58064516 44,22043011
Tabla 24. Efecto citotóxico de fracciones 7-10 de EtOH sobre la línea MCF-7.
F.7
Promedio
Desv Est
Comp Control
Viabilidad
F.8
F.9
F.10
0,14
0,143
0,162
0,214
0,297
0,237
0,108
0,1
0,102
0,281
0,356
0,182
0,148333333
0,011930353
4,8556E-04
29,90591398
0,249333333
0,04285246
0,004124494
50,2688172
0,103333333
0,004163332
0,000226881
20,83333333
0,273
0,087275426
0,011455932
55,04032258
CONTROL
0,458
0,403
0,502
0,654
0,548
0,411
0,496
0,094891517
Tabla 25. Efecto citotóxico del sólido alcaloide sobre la línea celular CSC 1595.
Alcaloide
CONTROL
0,3390
0,4150
0,3930
0,4460
0,3280
0,4840
0,4650
0,3910
0,3710
0,4110
0,3010
0,4950
Promedio
0,3662
0,4403
Desv Est
Comp
Control
0,0582
0,0421
Viabilidad
83,1567
0,0300
Tabla 26. Efecto citotóxico de fracción MeOH en la línea CSC 1595.
CSC-1595
Promedio
Desv Est
Comp Control
Viabilidad
fr. MeOH(50) CONTROL
0,166
0,244
0,183
0,249
0,156
0,237
0,152
0,272
0,16425
0,2505
0,01381726
0,01515476
0,0001539
65,5688623
Tabla 27. Efecto citotóxico de las subfracciones MeOH del extracto petrol sobre
1595.
CSC-1595
Promedio
Desv Est
Comp
Control
Viabilidad
A+B+C
A+B(50)
B+C(50)
A+C
CONTROL
0,215
0,229
0,289
0,165
0,282
0,15
0,171
0,177
0,164
0,249
0,163
0,148
0,174
0,187
0,237
0,166
0,161
0,162
0,181
0,272
0,178
0,169
0,25
0,223
0,244
0,1744
0,1756
0,2104
0,184
0,2568
0,02478508 0,03118974 0,05596695 0,02397916 0,01925357
0,00037389
67,9127726
0,00111581
68,3800623
0,11769359
81,9314642
0,00073416
71,6510903
Tabla 28. Efecto citotóxico de las subfracciones de la fracción 3 del extracto
EtOH sobre la línea celular CSC 1595.
Subfr.1
0,238
0,261
0,261
0,294
0,284
0,261
0,2665
Promedio
Desv Est
Comp Control
Viabilidad
Subfr. 2
CONTROL
0,196
0,415
0,244
0,446
0,292
0,484
0,327
0,391
0,286
0,411
0,274
0,495
0,269833333 0,440333333
0,01982675
3,5671E-06
0,045070685
4,91071E-05
60,52233157
61,27933384
0,042103048
Tabla 29. Efecto citotóxico de las subfracciones de la fracción 3 del extracto
EtOH sobre la línea celular CSC 1595.
CSC-1595
F-3 1+2
Promedio
Desv Est
Comp Control
Viabilidad
0,381
0,243
0,225
0,224
0,335
0,2816
0,0720125
0,47819333
109,657321
CONTROL
0,282
0,249
0,237
0,272
0,244
0,2568
0,01925357
Tabla 30. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones Petrol
sobre la línea celular CSC 1595. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
VAR. 1
VARIABLE 1 VARIABLE 1 VARIABLE 1 VARIABLE1 VARIABLE2
Ext. Petrol
F. Petrol
F. CH2Cl2
F. AcOEt
F. MeOH
0,043597704 0,110308296
0,07741116
0,0683247
0,00580645
0,17906486
0,0016123 0,000991767
6,4567E-05
0,00014537
0,00050457
0,00033977
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética
de las medias
6
6
6
6
6
0
0
0
0
0
Grados de libertad
10
10
10
10
10
P(T< =t) una cola
P(T< =t) dos colas
0,000288113
0,000576226
0,00070694
0,00141388
9,8927E-08
1,9785E-07
1,119E-07
2,238E-07
3,2734E-08
6,5468E-08
Tabla 31. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones 1-3
EtOH sobre la línea celular CSC 1595. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética de
las medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T< =t) dos colas
VARIABLE 1 VARIABLE1 VARIABLE1
Ext. EtOH
F.1
F.2
0,080947109
0,21922655
0,05788927
0,000850167
0,00617057
0,00218257
6
6
6
0
10
4,3416E-05
8,68319E-05
0
10
0,06503468
0,13006935
0
10
0,0001621
0,0003242
VARIABLE1
F.3
0,039973183
0,000126967
6
VARIABLE 2
0,179064859
0,000339767
6
0
10
1,11168E-08
2,22335E-08
Tabla 32. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH sobre la
línea celular CSC 1595. (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética
de las medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T <=t) dos colas
VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2
F.4
F.5
F.6
0,079466437 0,095332209 0,095077002 0,162363964
3,61667E-05 5,85667E-05 4,67E-05
0,000534967
6
6
6
6
0
10
2,67353E-06
5,34706E-06
0
10
1,92402E-05
3,84804E-05
0
10
1,69646E-05
3,39292E-05
0
10
0
0
6
Tabla 33. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH sobre la
línea celular CSC 1595. (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética de las
medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T< =t) dos colas
VARIABLE1
F.7
0,058071563
2,99E-05
6
VARIABLE1
F.8
0,061824903
0,000128167
6
0
10
3,31465E-07
6,6293E-07
0
10
1,11222E-06
2,22443E-06
VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2
F.9
F.10
0,069952263
0,17096484 0,162363964
4,67E-05 0,000170167 0,000534967
6
6
6
0
10
1,13797E-06
2,27595E-06
0
10
0
0
0
10
0,276157613
0,552315225
Tabla 34. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones
Petrol sobre la línea celular colo 205. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética
de las medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T <=t) dos colas
VAR. 1
Ext. Petrol
0,26968121
0,00416817
6
VAR. 1
F. Petrol
0,20278726
0,00151667
6
VAR. 1
F. CH2Cl2
0,216796946
0,001027467
6
VAR. 1
F. AcOEt
0,2616623
0,00050337
6
VAR. 1
F. MeOH
0,175234231
0,002617767
6
0
10
0,35413138
0,70826276
0
10
0,00743418
0,01486835
0
10
0,014059735
0,02811947
0
10
0,36516382
0,73032765
0
10
0,003582897
0,007165794
VAR. 2
0,26570122
0,00102977
6
0
10
Tabla 35. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones 1-3
EtOH sobre la línea celular colo 205. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética de las
medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T <=t) dos colas
VAR. 1
Ext. EtOH
0,26087284
0,00363027
6
0
10
0,45127341
0,90254683
VAR.2
0,26570122
0,00102977
6
0
10
VAR. 1
F.1
0,27594845
0,0054156
6
VAR. 1
F.2
0,261624814
0,0051692
6
VAR. 1
F.3
0,40578663
0,01575667
6
0
10
0,25708758
0,51417516
0
10
0,402293007
0,804586015
0
10
0,00486296
0,00972591
Tabla 36. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones 4-6 EtOH sobre
la línea celular colo 205. (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética
de las medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T< =t) dos colas
VAR.1
F.4
0,183208619
0,0017611
6
VAR.1
F.5
0,187496522
0,0010308
6
VAR.1
F.6
0,52517979
0,00258747
6
VAR. 2
0
10
3,96958E-06
7,93916E-06
0
10
2,37973E-06
4,75947E-06
0
10
0,03262824
0,06525649
0
10
0,45155463
0,00440347
6
Tabla 37. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH 7-10
sobre la línea celular colo 205. (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética de las
medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T< =t) dos colas
VARIABLE1
F.7
0,575289271
0,006856567
6
VARIABLE1
F.8
0,716294168
0,006494267
6
VARIABLE1
F.9
0,67575836
0,02020347
6
0
10
0,007649051
0,015298102
0
10
4,95462E-05
9,90923E-05
0
10
0,00175871
0,00351742
VARIABLE1 VARIABLE 2
F.10
0,64234781
0,45155463
0,02392
0,00440347
6
6
0
10
0,00435624
0,00871247
0
10
Tabla 38. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones Petrol
sobre la línea celular MCF-7. (300 µg/ml), (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética
de las medias
Grados de libertad
P(T<=t) una cola
P(T< =t) dos colas
VAR.1
Ext. Petrol
0,4004432
0,00536133
6
VAR. 1
F. Petrol
0,31911498
0,00425233
6
VAR. 1
F. CH2Cl2
0,4032927
0,00080033
6
VAR. 1
F. AcOEt
0,477506911
0,003376333
6
VAR.1
F. MeOH
0,16194274
0,000273
6
VARIABLE2
0
10
0,10443536
0,20887071
0
10
0,01518251
0,03036503
0
10
0,07875425
0,15750851
0
10
0,414302908
0,828605817
0
10
0,00031954
0,00063909
0
10
0,482168327
0,0090044
6
Tabla 39. Análisis estadístico del efecto citotóxico del extracto y fracciones 1-3
EtOH sobre la línea celular MCF-7. . (300 µg/ml), (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética de las
medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T <=t) dos colas
VARIABLE 1
Ext. EtOH
0,10379872
0,10683633
6
0
10
0,21021593
0,42043187
VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1
F.1
F.2
F.3
0,45623066
0,21268249 0,133224125
0,00447033
0,00020033
0,000148
6
6
6
0
10
0,30222827
0,60445653
0
10
0,00081647
0,00163293
0
10
0,000190301
0,000380601
VARIABLE 2
0,48216833
0,0090044
6
0
10
Tabla 40. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH 4-6 sobre
la línea celular MCF-7. (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia
hipotética de las
medias
Grados de
libertad
P(T <=t) una cola
P(T <=t) dos
colas
VAR.1
F.4
0,219672672
0,000872333
3
VAR.1
F.5
0,346554609
0,008092
3
VAR.1
F.6
0,214172098
0,001774333
3
VAR. 2
0
0
0
0
7
0,001060117
7
0,039364252
7
0,001107954
7
0,002120235
0,078728504
0,002215909
0,4821683
0,0090044
3
Tabla 41. Análisis estadístico del efecto citotóxico de fracciones EtOH 7-10
sobre la línea celular MCF-7. (100 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia
hipotética de las
medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T <=t) dos colas
VARIABLE1
F.7
0,14771992
0,00014233
3
VARIABLE1
F.8
0,244711981
0,001836333
3
VARIABLE1
F.9
0,103223388
1,73333E-05
3
VARIABLE1
F.10
0,252903903
0,007617
3
0
7
0,00024278
0,00048556
0
7
0,002062247
0,004124494
0
7
0,000113441
0,000226881
0
7
0,005727966
0,011455932
VARIABLE 2
0,48216833
0,0090044
3
0
7
Tabla 42. Análisis estadístico del efecto citotóxico de sólido alcaloide sobre la
línea celular CSC 1595. (25 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética
de las medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T< =t) dos colas
VAR.1
VAR 2
Alcaloide
0,35903684 0,437039267
0,00339057 0,001772667
6
6
0
10
0,0149798
0,0299596
0
10
Tabla 43. Análisis estadístico del efecto citotóxico de la fracción MeOH sobre la
línea celular CSC 1595. (50 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética de las medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T <=t) dos colas
0,163413505
0,000190917
4
0
6
7,69487E-05
0,000153897
0,24983909
0,00022967
4
0
6
Tabla 44. Análisis estadístico del efecto citotóxico de subfracciones de la fracción
MeOH del extracto petrol sobre la línea celular CSC 1595. (50 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética de las medias
Grados de libertad
P(T <=t) una cola
P(T< =t) dos colas
0,17185159
0,0009728
5
0
8
0,0005579
0,00111581
0,17182212
0,0031323
5
0
8
0,0588468
0,11769359
0,18171954
0,000575
5
0
8
0,00036708
0,00073416
0,25567072
0,0003707
5
0
8
Tabla 45. Análisis estadístico del efecto citotóxico de subfracciones de la fracción
3 del extracto EtOH sobre la línea celular CSC 1595. (50 µg/ml).
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética de las medias
Grados de libertad
P(T< =t) una cola
P(T< =t) dos colas
0,268330991
0,0051858
5
0
8
0,239096666
0,478193332
0,25567072
0,0003707
5
0
8
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICO DE EXTRACTOS Y
FRACCIONES DE Isertia laevis EMPLEANDO
LÍNEAS CELULARES
DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS
SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ., ALBA .N. TÉLLEZ ALFONSO.
[email protected], [email protected]
RESUMEN
Las fracciones y subfracciones de Isertia laevis del extracto Petrol y EtOH,
mostraron actividad citotóxica frente a líneas celulares tumorales humana de
cáncer de seno (MCF-7 y CSC 1595) y de cólon (colo 205). Las fracciones
fueron probadas a una concentración de 100 µg/ml,
la fracción MeOH del
extracto Petrol presentó un porcentaje de viabilidad de 7% sobre la línea celular
1595 y fue la fracción más activa, del extracto EtOH la fracción 3 con 27%
para la línea MCF-7 y 23 % de viabilidad en la línea 1595 fue la fracción que
mostró mejor resultado. Para la línea celular colo 205 las fracciones más activas
fueron la 4 y 5 del extracto EtOH con un porcentaje de viabilidad de 41%. Las
pruebas fitoquímicas cualitativas mostraron que las fracciones de petrol y las de
EtOH contienen esteroles y/o triterpenos
Palabras claves: Actividad Citotóxica, Isertia laevis, Extractos hojas.
ABSTRACT
The fractions of Isertia laevis showed citotoxic activity in front of human tumor
cell lines of breast cancer (MCF-7 and CSC 1595) and of colon (colo 205). The
fractions were proven to a concentration of 100 µg/ml, the fraction MeOH of the
extract Petrol presented a percentage of viability of 7% on the cell line 1595 and it
was the most active fraction, of the extract EtOH the fraction 3 with 27% for the
line MCF-7 and 23% of viability in the line 1595 the fraction that showed better
result were. For the cell line colo 205 the most active fractions it was the 4 and 5
of the extract EtOH with a percentage of viability of 41%. The tests qualitative
showed that the fractions contain esterols and/or triterpenes.
Key words: cytotoxic activity, Isertia laevis, leaves extracts.
INTRODUCCIÓN.
Colombia presenta una gran diversidad de plantas vasculares, la mayoría de ellas
no han sido estudiadas o son poco conocidas.
No se conocen trabajos fitoquímicos de Isertia laevis, se tienen reportes de los
metabolitos secundarios de I.pittieri, I.haenkeana e I.hypoleuca, en las que se han
encontrado alcaloides indólicos Bohrmann et al (1969); García Barriga (1992);
Bruix et al (1993) y Soto et al (2001), triterpenos Arriaga et al (1990) y Rumbero
et al (1990) y saponinas triterpénicas Um et al (2001); estas últimas según
varios estudios en otras familias botánicas tienen propiedades citotóxicas y
anticancerígenas y han presentado buenos resultados en ensayos con líneas
celulares tumorales. Sparg et al (2004). En etnobotánica I. laevis se utiliza como
anticancerígena García Barriga (1992).
En este trabajo se evaluó la actividad citotóxica de extractos y fracciones de hojas
de la especie I. laevis sobre las líneas celulares de cáncer de seno MCF-7, CSC1595
y de cólon Colo 205 mediante el método in vitro MTT, un
ensayo
colorimétrico rápido, versátil y cuantitativo. Mosmann (1983).
MATERIALES Y MÉTODOS.
Material vegetal: Se colectó en el municipio de Medina
departamento de
Cundinamarca. Un ejemplar se depositó en el Herbario Nacional Colombiano con
No. COL: 506495.
Obtención de extractos: Se realizó extracción en Soxhlet con Petrol para el
desengrase del material durante 72 horas, se concentró en rotavapor a presión
reducida. Al extracto floculado se le hizo una cromatografía en columna flash en
sílica gel eluída con Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH de la cual se obtuvieron 4
fracciones. A cada fracción se le realizó cromatografías en placas de sílica gel
corridas en Petrol:AcOEt (7:3), reveladas con ácido perclórico.
El material desengrasado fue extraído por maceración en frío con EtOH, el
extracto se concentró a presión reducida en rotavapor. Se realizó cromatografía en
columna flash con RP-18 eluída con mezclas de MeOH:H2O (10:2), MeOH,
MeOH:CH2Cl2 (8:2) y CH2Cl2, se obtuvieron 10 fracciones.
A la fracción MeOH se le hizo cromatografía en columna con Sephadex eluída
con MeOH, se obtuvieron tres subfracciones, se les hizo cromatografía en placas
de RP-18 corridas en MeOH:H2O (10:2), revelada en ácido perclórico. A la
fracción 3 del extracto EtOH también se le hizo subfraccionamiento y se
obtuvieron dos subfracciones, se realizó cromatografía
en placas de RP-18
corridas en MeOH:H2O (10:2), revelada con ácido perclórico.
A los extractos totales de EtOH y Petrol y a las fracciones se les realizaron
pruebas fitoquímicas cualitativas de terpenos: liebermann burchard, salkwoski;
saponinas: molish, antrona, prueba de espuma; flavonoides: shinoda, cloruro
férrico; alcaloides: dragendorff.
Fraccionamiento guiado por bioensayo: consiste en la aplicación de técnicas de
separación y aislamiento sobre un determinado extracto, con el objeto de hacer un
seguimiento de la actividad biológica de las fracciones obtenidas, para finalizar
con la identificación de
los principios activos responsables de la actividad
citotóxica demostrada por el extracto original, determinar el posible efecto
sinérgico o antagónico entre las sustancias que están presentes en la fracción que
contiene el posible principio activo.
Bioensayos: La viabilidad celular fue determinada por la técnica del MTT, ensayo
que se encuentra ampliamente referenciado en la literatura Studzinski (|1999). Se
tomó como control negativo del solvente empleado DMSO 0.2%.
Solubilización y preparación
de muestras: Los extractos
se solubilizan en
Dimetil Sulfoxido (Merck) al 0.2% concentración inocua para las células.
Líneas celulares: Se utilizaron las líneas celulares neoplásicas suministradas por
el Instituto Nacional de Cáncer de EEUU: MCF -7 (seno) y Colo 205 (cólon) y
la línea de cáncer de seno obtenida y caracterizada en el Instituto Nacional de
Cáncer de Colombia CSS-1595 con las siguientes características:
MCF-7. Tumor de una paciente de 69 años con adenocarcinoma de glándula
mamaria, hipotetraploide, células epiteliales.
CSC 1595.
Tumor de una paciente de 77 años con cáncer de seno ductal
infiltrante
avanzado,
características:
aneuploide,
70
cromosomas,
hormonodependiente, sensible a antraciclinas y 5-fluoracilo. Téllez et al (2006).
Colo 205. Tumor de un paciente de 70 años, caucásico, con carcinoma de cólon
(adenocarcinoma), hipertriploide.
Cultivo celular: Se utilizaron cajas de 96 pozos para el cultivo de las células con
medio L-15 suplementado con 10%
de suero fetal bovino y
100 µl/10ml,
penicilina estreptomicina y neomicina (5000U, 5mg estreptomicina y 10 mg
neomicina/ml). Las líneas celulares fueron resuspendidas en medio de cultivo L15 (±40 000 células por pozo) en 100 µl por pozo. Las cajas se incubaron a 37º C
y 5% de CO2 por 24 horas, tiempo para la formación de la monocapa de células.
Después de la formación de la monocapa, se colocaron 20 µl de cada una de las
soluciones de extractos y fracciones a las concentraciones definidas (300 µg/ml de
extractos y 100 µg/ml de fracciones), en los pozos de la caja, se incubaron por 24
horas, tiempo para que las células puedan incorporar las sustancias. Pasado este
periodo las soluciones de extractos y sus respectivas fracciones son retiradas y a
cada pozo se le adicionaron 100 µl de medio L-15, por 24 horas para establecer si
las células se recuperan.
Posteriormente el medio es retirado y a cada pozo se le agregaron 100 µl de
medio Dulbecco modificado y 50 µl de MTT, las cajas se incubaron por 4 horas a
37º C. Pasadas las 4 horas se retiraron los 150 µl de medio Dulbecco y MTT y se
adicionaron en los pozos 100 µl de isopropanol para disolver los cristales de
formazan producidos, a continuación se leyó la absorbancia en espectrofotómetro
a una longitud de onda de 540 nm.
RESULTADOS.
Para las fracciones Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH del extracto en Petrol, las
pruebas fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos.
Tabla 1. Pruebas fitoquímicas de las fracciones del extracto Petrol.
Fracción
Cloruro
Shinoda
Liebermann
Férrico
Salkwoski
Antrona
Molisch
Burchard
Petrol
-
-
-
-
-
-
CH2Cl2
-
-
+
+
-
+
AcOEt
-
-
+
+
-
+
MeOH
-
-
+
+
+
-
Las fracciones obtenidas del extracto EtOH
mostraron en las pruebas
fitoquímicas cualitativas la presencia de flavonoides, esteroides y/o triterpenos y
saponinas ver
tabla 2.
Tabla 2. Pruebas fitoquímicas de las fracciones del extracto EtOH.
Fracción
Cloruro
Shinoda
Férrico
Liebermann
Salkwoski
Antrona
Molisch
Burchard
1
+
+
+
+
+
+
2
+
-
+
+
+
+
3
-
-
+
+
+
+
4-10
-
-
+
-
-
-
A los extractos de Petrol y EtOH se hojas de I.laevis se les evaluó el efecto
citotóxico a una concentración de 300 µg/ml y a las fracciones a una
concentración de 100 µg/ml, frente a las líneas celulares. Las fracciones que se
consideraron activas fueron las que presentaron un porcentaje de viabilidad menor
a un 50%. La fracción MeOH del extracto Petrol presentó la mayor actividad
como se muestra en la Tabla 3 con un porcentaje de viabilidad de 7% en la línea
celular 1595.
Tabla 3. Porcentaje de viabilidad de las células para las fracciones Petrol, CH2Cl2,
AcOEt, MeOH del extracto petrol. Concentración a 100 µg/ml.
F. Petrol
F. CH2Cl2
F. AcOEt
F. MeOH
MCF-7
66
81
97
32
Colo 206
77
82
97
69
CSC 1595
64
43
38
7
En el estudio se encontró que las fracciones actuaron mejor sobre las líneas
celulares de cáncer de seno 1595 y MCF-7 en las que se encontraron porcentajes
de viabilidad de 20 a 48%. Según tabla 4.
Tabla 4. Porcentaje de viabilidad de las células para las fracciones 1 – 10 del
extracto EtOH. Concentraciones a 100 µg/ml.
F.1
F.2
F.3
F.4
F.5
F.6
F.7
F.8
F.9
F.10
MCF-7
93
43
27
44
72
44
29
50
20
55
Colo 205
108
103
162
41
41
115
127
157
152
148
CSC 1595
130
39
23
48
58
57
35
38
42
104
Figuras 1, 2 y muestran las fracciones tanto del extracto petrol como del EtOH
que tuvieron un porcentaje de viabilidad menor al 50%. Las dos líneas celulares
de cáncer de seno presentaron un mayor número de fracciones con viabilidad
inferior al 50%. En la línea celular colo 205 las fracciones 4 y 5 presentaron
viabilidad de 41%.
%
VIABILIDAD
FRACCIONES CON EFECTO CITOTOXICO < A 50% EN LA
LÍNEA CELULAR 1595
50
40
30
20
10
0
F. MeOH
F.2
F.3
F.4
F,7
F.8
F.9
FRACCIONES
Figura 1. Fracciones petrol y EtOH con porcentaje de viabilidad menor al 50% en
la línea celular 1595
%
VIABILIDA
D
FRACCIONES CON EFECTO CITOTOXICO < AL 50% EN LA
LÍNEA CELULAR MCF-7
60
40
20
0
F. MeOH
F.2
F.3
F.4
F.6
F,7
F.9
FRACCIONES
Figura 2. Fracciones petrol y EtOH con porcentaje de viabilidad menor al 50%
sobre la línea celular MCF-7.
Para las subfracciones de la fracción MeOH del extracto en Petrol, las pruebas
fitoquímicas determinaron
la presencia de esteroides y/o triterpenos. Las
subfracciones Sf1, Sf2 y Sf3 obtenidas a partir de la fracción MeOH del extracto
Petrol se probaron a la concentración de 50 µg/ml. La subfracción Sf1 mostró
un porcentaje de viabilidad del 100%; La subfracción Sf2 presentó un porcentaje
de viabilidad de 72% y Sf3 83% de viabilidad para la línea celular de cáncer de
seno CSC 1595 como se muestra en la Tabla 5 y figura 3.
Tabla 5. Porcentaje de viabilidad de las células para las subfracciones de la
fracción MeOH del extracto Petrol concentraciones 50 µg/ml
% viabilidad
CSC 1595
Sf1
Sf2
Sf3
100
72
83
%
VIABILIDAD
EFECTO CITOTOXICO DE SUBFRACCIONES DE LA
FRACCIÓN MeOH DEL EXTRACTO PETROL EN LA LÍNEA
CELULAR 1595
100
50
0
Alcaloide
subfr.1
subfr. 2
Subfr.3
SUBFRACCIONES
Figura 3. Efecto citotóxico de subfracciones de la fracción MeOH del extracto
petrol sobre línea celular 1595.
Para probar si las subfracciones actuaban de forma sinérgica o antagónica se
hicieron mezclas de las subfracciones, se probaron a una concentración de 50
µg/ml, las subfracciones 1 y 2 fueron las que presentaron un porcentaje de
viabilidad más bajo 68% como se muestra en la tabla 6.
Tabla 6. Porcentaje de viabilidad de la mezcla de las subfracciones de la fracción
MeOH del extracto Petrol concentraciones 50 µg/ml.
% viabilidad
Sf1+ Sf2+Sf3
Sf1+ Sf2
Sf2+Sf3
Sf1+Sf3
Concentración 16.6
Concentración
Concentración 25
Concentración 25
µg/ml
16.6 µg/ml
µg/ml
µg/ml
71
68
92
84
CSC 1595
Las pruebas fitoquímicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos
en las subfracciones de la fracción 3 del extracto EtOH. Las subfracciones S3.1
y S3.2 de la fracción 3 del extracto EtOH se probaron a la concentración de 50
µg/ml. La subfracción S3.1 tuvo un porcentaje de viabilidad del 60% y la
subfracción S3.2 mostró un porcentaje de viabilidad de 61% en la línea celular
CSC 1595
Tabla 7. Porcentaje de viabilidad de las células para las subfracciones de la
fracción 3 del extracto EtOH. Concentraciones 50 µg/ml.
CSC 1595
Sf1
Sf2
60
61
%
VIAB
ILID
AD
EFECTO CITOTOXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE
LA FRACCIÓN 3 DEL EXTRACTO EtOH DEL
EXTRACTO EN LA LÍNEA CELULAR 1595
62
60
s ubf r . 1
Subf r . 2
SUBFRACCIONES
Figura 4. Efecto citotóxico de subfracciones de EtOH en línea celular 1595
DISCUSIÓN
Los extractos se probaron a una concentración de 300 µg/ml mostrando los
siguientes efectos citotóxicos, la línea tumoral CSC 1595 fue la más sensible a los
extractos totales petrol y etanólico, con un efecto citotóxico del 50% (% de
viabilidad 50%).
En la evaluación de las fracciones petrol, CH2Cl2, AcOEt y MeOH valoradas a
100 µg/mL, se demostró que la más activa fue la fracción MeOH con porcentajes
de viabilidad de 32% y 7% en las líneas tumorales de seno MCF-7 y CSC 1595
respectivamente.
La línea celular obtenida de tumor de paciente colombiano CSC 1595 fue la más
sensible al efecto de las fracciones CH2Cl2, AcOEt y MeOH con porcentajes de
viabilidad del 43%, 38% y 7% respectivamente, este resultado es interesante si
se tiene en cuenta que esta línea se considera joven, conservando un buen grado
de similitud entre el tejido tumoral y la línea celular, opuesto a lo que sucede con
la líneas celulares comerciales como lo menciona
Téllez et al (2004). Las
fracciones no fueron activas para la línea celular de colón Colo 205. Estos
resultados demuestran cierta selectividad de acción frente a las líneas tumorales de
diversa procedencia y origen.
El comportamiento de las fracciones del extracto de EtOH también fue similar
para las líneas 1595 y MCF-7. Las fracciones 2, 3, 4, 7, 8 y 9 del extracto EtOH
presentaron porcentajes de viabilidad entre 23 y 50% para las líneas celulares
CSC 1595 y MCF-7, la fracción 6 tuvo una viabilidad 44% solo para la línea
celular MCF-7, la línea celular Colo 205 tuvo un comportamiento diferente al de
las otras dos líneas, siendo las fracciones 4 y 5 las más activas con un porcentaje
de viabilidad de 41%, opuesto a lo que mostró la viabilidad para el resto de
fracciones y extractos de petrol y EtOH que tuvieron un efecto proliferativo con
porcentajes de viabilidad entre 79 y 162% en esta línea celular.
Las pruebas fitoquímicas cualitativas muestran que las fracciones del extracto
EtOH y del extracto petrol contienen esteroides y/o triterpenos y saponinas
triterpénicas Tablas 1 y 2, concuerda con la química reportada en la literatura
para las especies de Isertia, Arriaga et al (1990), Rumbero et al (1990), Bruix et
al (1993); Um et al (2001).
Los resultados del porcentaje de citotoxicidad para la fracción MeOH a unas
concentraciones de 100 y 50 µg/ml fue de (93% y 35% de efecto citotóxico)
respectivamente lo que indica que la CC50 se debe encontrar entre los 50 y 100
µg/ml; al subfraccionar la fracción MeOH que fue la que presentó el porcentaje
de viabilidad inferior al 7% se quiso determinar el posible efecto sinérgico o
antagónico entre las sustancias que presentaba esta fracción,
se obtuvieron tres
fracciones y la fracción que presentó un mayor porcentaje de citotoxicidad fue la
Sf2 (28%), las subfracciones no actuaron de manera similar como la fracción
MeOH, por eso se hicieron mezclas de las subfracciones para observar cual
presentaba un efecto citotóxico moderado, se observó que las mezclas donde se
encontraba la subfracción 2 presentaron una mejor actividad citotóxica explicando
así que las subfracciones 2 y 1 se relacionan de forma sinérgica y la subfracción 3
presenta un efecto antagónico con respecto a las otras subfracciones.
Según las cromatografías y las pruebas fitoquímicas cualitativas, los metabolitos
secundarios esteroides y/o triterpenos posiblemente sean los que están actuando
favorablemente en la actividad citotóxica de las fracciones que presentaron un
porcentaje de viabilidad menor o igual al 50%. A los triterpenos y saponinas
triterpénicas se les ha comprobado propiedades farmacológicas importantes, entre
ellas una buena actividad citotóxica en varias líneas celulares derivadas de
tumores humanos, como lo referencia Sparg et al (2004) para varias familias
botánicas y Cheng et al (2002) y Setter et al (2003) para especies de la familia
rubiaceae.
Uno de los géneros más estudiado ha sido el género Uncaria, en la especie U.
rhynchophylla se encontraron varios esteres triterpenos tetracíclicos y ácidos
uncarínicos, los cuales inhibieron el crecimiento de las líneas celulares de cáncer
A-549, HCT-15, MCF-7 y HT-1197. Heitzman et al (2005).
En el trabajo de Cheng et al (2002) sobre Mitragyna inermes se reportó una 27nor-triterpenoide aglycona que había sido aislada solo de Isertia haenkeana y
Adina rubella. El extracto MeOH fue el que mostró ser citotóxico contra un
panel de líneas celulares de cáncer humanos, utilizaron como eluyentes de la
columna de sílica gel CH2Cl2, AcOEt y MeOH, obteniendo tres fracciones. La
fracción I presentó la inhibición del crecimiento de más del 50% en la línea
celular Bel-7402, esta fracción fue sometida a purificación sobre columna de
Sephadex LH-20 y se aisló el componente citotóxico (un ácido quinóvico).
Tanto el género Uncaria como el género Isertia pertenecen a la subfamilia
Cinchonoideae compartiendo caracteres morfológicos, pero sería preciso acudir a
caracteres
quimiotaxonómicos
que
fortalecieran
aún
más
los
aspectos
filogenéticos dentro de la subfamilia.
El análisis estadístico entre los valores de controles y
ensayos fueron
interpretados mediante la prueba t (Student), con un nivel de significancia de
(p<0.05). Los valores de t calculados mostraron ser inferiores a los valores de t
de la tabla, sí hay diferencias significativas entre los tratamientos y el control, el
efecto citotóxico de los extractos y fracciones fue producto de las concentraciones
que fueron probadas y no causado por otros agentes.
LITERATURA CITADA.
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