RESUMEN Toxoplasma gondii es un protozoo parásito intracelular

UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
RESUMEN
Toxoplasma gondii es un protozoo parásito intracelular
obligado,
como
Apicomplexa.
todos
Es
de
los
miembros
distribución
del
phylum
universal
y,
probablemente, el agente más frecuente de infección
protozoaria en el hombre. Este
microorganismo se
encuentra comúnmente en los gatos, los pájaros y la carne
poco cocida, especialmente la de cerdo, cordero o venado.
El gato actúa como hospedador definitivo, y los animales
vertebrados
intermediarios.
y
el
hombre
como
hospedadores
T. gondii puede producir una infección
aguda en las personas sanas, toxoplasmosis congénita e
infecciones graves en el paciente inmunodeprimido.
La infección contraída durante el embarazo puede ser
transmitida al feto durante la fase de parasitemia mediante
el paso transplacentario directo del parásito. El tipo de
manifestación varía en relación con el momento de la
infección fetal. En el primer trimestre el paso de
Toxoplasma gondii provoca regularmente aborto y daños
graves al feto. En el segundo trimestre predominan lesiones
compatibles con la vida pero funcionalmente graves: triada
de Bamatter (hidrocefalia, calcificaciones endocraniales,
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CECILIA MUÑOZ P.
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coriorretinitis). De la semana 25 hasta el término del
embarazo las consecuencias de la infección toxoplásmica
son menores, dada a una mejor capacidad del feto de
defenderse, pero puede persistir el riesgo de secuelas
neuro-psíquicas.
En este trabajo consideraremos de especial interés
determinar la concentración de anticuerpos IgG específicos
a T. gondii, empleando la Técnica de Micro ELISA en las
alumnas de la Escuela de Bioquímica y Farmacia de la
Universidad de Cuenca.
PALABRAS CLAVES:
Toxoplasma gondii, Toxoplasmosis, ELISA, igG.
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INDICE
CONTENIDO
PAGINAS
CAPITULO I
1. INTRODUCCION……………………………………….….………. 9
CAPITULO II
2. OBJETIVOS……………….…………………………..….………. 12
CAPITULO III
3. TOXOPLASMOSIS………….……………………….……..…….. 13
3.1. Reseña Histórica……………………………….….………...…. 13
3.2. Ubicación en la escala zoológica……………….……....….. 14
3.3. Definición…………………………………………......….…….. 16
3.3.1. Clasificación de los protozoarios……..…….……... 17
3.4. Agente etiológico…………………………………..….………… 19
3.4.1. Estructura…………………………………..….……….. 19
3.4.2. Estructura antigénica……………………..…..……… 24
3.4.3. Ciclo de vida………………………………..….……….. 25
3.4.3.1. Reproducción……………………..……...… 29
3.5. Patología………………………………………….…..…………. 30
3.5.1. Lesiones placentarias…………………..…….……… 33
3.5.2. Lesiones fetales…………………………..…….……… 35
3.6. Manifestaciones clínicas……………………………...……... 37
3.6.1. Toxoplasmosis aguda………………………….…..… 38
3.6.2. Toxoplasmosis ganglionar………………….……….. 39
3.6.3. Toxoplasmosis ocular………………………….…….. 40
3.6.4. Toxoplasmosis congénita…………………….……… 41
3.6.4.1. Infección generalizada………….……….. 43
3.6.4.2. Encefalitis aguda…………………….…….. 43
3.6.4.3. Secuelas irreversibles……………….……. 44
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CECILIA MUÑOZ P.
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3.6.5. Otras localizaciones de la toxoplasmosis………. 45
3.6.6. Toxoplasmosis en el paciente inmunosuprimido. 47
3.7. Inmunidad…………………………………………….…………. 48
3.7.1. Inmunidad humoral frente a la infección……….. 50
3.8. Diagnóstico……………………………………………………… 53
3.8.1. Demostración directa del parásito……….……….. 55
3.8.2. Inoculaciones………………………………………….. 56
3.8.3. Métodos inmunológicos……………………………... 57
3.8.3.1. Inmunofluoresencia Indirecta…….…… 58
3.8.3.2. Prueba de ELISA….……………………….. 62
3.8.3.3. Hemaglutinación Indirecta (HIA)……… 63
3.8.3.4. Sabin y Feldman………………………….. 64
3.8.3.5. Fijación del Complemento………………. 66
3.8.3.6. Otras pruebas…………….……………….. 66
3.8.3.7. Toxoplasmina………………………………. 67
3.8.3.8. Detección de Antígenos………………….. 68
3.8.4. Hemograma……………………………………………. 68
3.8.5. Primoinfección materna…………………………….. 69
3.9. Epidemiología…………………………………………………. 70
3.9.1. Infección por ooquistes…………………………….. 71
3.9.2. Infección por quistes……………………………….. 72
3.9.3. Infección transplacentaria………………………… 72
3.9.4. Prevalencia de la infección………………………… 73
3.9.5. Prevalencia de la enfermedad congénita……….. 74
3.10. Prevención…………………………………………………….. 75
3.11. Tratamiento…………………………………………………… 76
3.11.1. Adulto inmunocompetente……………………………… 76
3.11.2. Embarazada………………………………………………… 76
3.11.3. Toxoplasmosis congénita……………………………….. 78
3.11.4. Tratamiento pleno………………………………………… 79
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CAPITULO IV
4. ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA)….………………………. 82
4.1. Reactivos………………………………………………………… 85
4.2. Ensayo de enlace competitivo………………………………. 87
4.3. Ensayo de enlace no competitivo………………………….. 90
4.4. Aplicación en el laboratorio…………………………….…… 91
4.5. Muestra………………………………………………………….. 93
4.6. Ensayo…………………………………………………………… 95
4.6.1. Principio…………………………………………………. 95
4.6.2. Interpretación de los resultados…………………… 96
4.6.3. Reactivos y contenidos………………………………. 97
4.6.4. Preparación de reactivos…………………………….. 98
4.6.5. Procedimiento………………………………………….. 98
4.6.5.1. Etapa 1……………………………………….. 98
4.6.5.2. Etapa 2……………………………………….. 99
4.6.5.3. Etapa 3……………………………………….. 100
4.6.6. Cálculo de valores de control y punto de corte… 100
4.6.7. Validación de la prueba…………………………….. 101
4.6.8. Interpretación de los resultados………………….. 101
4.6.8.1. Cualitativa………………………………….. 101
4.6.8.2. Cuantitativa………………………………… 102
4.6.9. Valores de referencia………………………………… 103
CAPITULO V
5. RESULTADOS….………………………………………………… 104
CAPITULO VI
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES…………….…. 126
6.1. Conclusiones…………………………………………………… 126
6.2. Recomendaciones……………………………………….…….. 128
ANEXOS………………………………………………………………. 131
BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………… 145
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“Incidencia de Toxoplasma gondii en las alumnas
de la Escuela de Bioquímica y Farmacia de la
Universidad de Cuenca”.
TESIS PREVIA LA OBTENCIÓN
DEL TITULO DE DOCTORA EN
BIOQUÍMICA Y FARMACIA.
AUTORAS:
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
DIRECTORA:
Dra. SUSANA CALVO J.
CUENCA – ECUADOR
2006
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CECILIA MUÑOZ P.
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AGRADECIMIENTO
A Dios
por darnos sabiduría y
perseverancia para conseguir nuestras
metas.
A nuestros padres por su sacrificio y
entrega y por ser los pilares fundamentales
en
nuestra
vida
y
por
hacernos
comprender
que
con
paciencia
y
dedicación se pueden realizar nuestros
sueños.
A nuestros hermanos por su apoyo
incondicional en todos estos años de
estudio.
A la Dra. Susana Calvo J., por su
dedicación
y
por
transmitirnos
sus
conocimientos para el desarrollo de este
trabajo de investigación.
A la Dra. Norma Cedillo A., por ser una
gran amiga y un apoyo durante la
realización de nuestro estudio.
Mariuxi y Cecilia.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
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DEDICATORIA
A nuestros padres y hermanos ya que sin
su apoyo este trabajo no se hubiera podido
realizar.
A nuestros amigos por todos estos años de
haber compartido maravillosos momentos
en las aulas universitarias.
Mariuxi y Cecilia.
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CECILIA MUÑOZ P.
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CAPITULO I
1.1. INTRODUCCIÓN:
Toxoplasma
gondii
es
un
protozoo
parásito
intracelular obligado, como todos los miembros del
phylum Apicomplexa. Es de distribución universal y,
probablemente, el agente más frecuente de infección
protozoaria en el hombre. Este microorganismo se
encuentra comúnmente en los gatos, los pájaros y la
carne poco cocida, especialmente la de cerdo, cordero
o venado. El gato actúa como hospedador definitivo, y
los
animales
vertebrados
y
el
hombre
como
hospedadores intermediarios. T. gondii puede producir
una
infección
aguda
en
las
personas
sanas,
toxoplasmosis congénita e infecciones graves en el
paciente inmunodeprimido. La toxoplasmosis afecta el
cerebro y causa una enfermedad llamada encefalitis por
toxoplasma.
El
microorganismo
puede
infectar
y
enfermar a otros órganos, entre ellos, los ojos y los
pulmones.
Si bien los gatos y los pájaros domésticos que tienen
resultados negativos en los análisis de toxoplasmosis,
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no representan un peligro; los que salen de la casa
pueden traer el toxoplasma de afuera. La manipulación
de los excrementos de pájaros, o de la arena de las
cajas donde los gatos orinan y defecan, es una de las
principales causas de infección.
La infección contraída durante el embarazo puede ser
transmitida al feto durante la fase de parasitemia
mediante el paso transplacentario directo del parásito.
El riesgo de la infección fetal varía con la edad
gestacional y con las condiciones inmunológicas de la
embarazada. El riesgo periconcepcional (hasta la 6ª
semana) del pase del parásito al producto es de
aproximadamente 1-2 %, aumentando a un 15-20 % en
el período comprendido entre la 7ª y la semana 24,
incrementándose gradualmente de la semana 25 hasta
el termino del embarazo, hasta ser de un 75%. El riesgo
global es del 60%.
El tipo de manifestación varía en relación con el
momento de la infección fetal. En el primer trimestre el
paso de Toxoplasma gondii
provoca regularmente
aborto y daños graves al feto. En el segundo trimestre
predominan lesiones compatibles con la vida pero
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funcionalmente graves: triada de Bamatter (hidrocefalia,
calcificaciones endocraniales, coriorretinitis, lesiones
oculares y neurológicas. De la semana 25 hasta el
término del embarazo las consecuencias de la infección
toxoplásmica
capacidad
son
del
menores,
feto
de
dada
a
defenderse
una
mejor
(incremento
significativo del pase transplacentario de la
IgG
específica materna, mejor estructuración fetal), pero
puede persistir el riesgo de secuelas neuro-psíquicas.
En este trabajo consideraremos de especial interés
determinar
la
concentración
de
anticuerpos
IgG
específicos a T. gondii, empleando la Técnica de Micro
ELISA en las alumnas de la Escuela de Bioquímica y
Farmacia de la Universidad de Cuenca.
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CAPITULO II
OBJETIVOS:
2.1. Objetivo general:
Determinación de Toxoplasma gondii en las alumnas
de la
Escuela de Bioquímica y Farmacia de la
Universidad de Cuenca.
2.2. Objetivos específicos:
• Evaluar los resultados obtenidos con las muestras.
• Determinar el índice de toxoplasmosis en las alumnas
de la escuela de Bioquímica y Farmacia en un
periodo de cinco meses.
• Dar
a
conocer
los
resultados
obtenidos
para
concientizar al alumnado sobre el peligro de la
enfermedad.
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CAPITULO III
TOXOPLASMOSIS
3.1. RESEÑA HISTÓRICA:
La Toxoplasmosis es una infección producida por
Toxoplasma gondii, protozoo intracelular de la subclase
Coccidia. Fue descubierto en 1.908
Manceaux,
en
Túnez,
en
el
por Nicolle y
roedor
africano
Ctenodactylus gundi; simultáneamente Splendore en
Brasil
lo
encontró
en
conejos.
Durante
aproximadamente 30 años, el parásito fue poco
conocido y no se le dio la importancia desde el punto de
vista humano.
Janku en 1.923, en Praga, descubrió la corioretinitis
toxoplasmósica y se informó el primer caso en una niña
recién nacida.
Hasta 1937, se los había aislado, de diversas especies
animales, considerándose cada una como especie
diferente, y en ese año Sabin y Olitsky comprobaron
que era una sola especie al realizar la transmisión
cruzada.
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Posteriormente
Wolf
demostraron
que
y
colaboradores
el
parásito
en
1.939
causaba
meningoencefalitis congénita.
En 1940, se reporta el primer caso de toxoplasmosis
adquirida del adulto en una manifestación generalizada
grave. Un paso muy importante para el diagnóstico de
la infección se dio 1.948, cuando Sabin y Feldman
establecieron una reacción serológica. Un año después
Frenkel descubrió una prueba de Hipersensibilidad, útil
tanto para el diagnóstico de las formas crónicas como
para los estudios epidemiológicos.
En 1.970, Frenkel en Estados Unidos y Hutchison en
Inglaterra, lograron establecer su verdadera forma de
transmisión en la naturaleza, al encontrar que T. gondii
era un parásito del intestino de los gatos y las formas
infectantes salían en las materias fecales de estos
animales. 9
3.2. UBICACIÓN EN LA ESCALA ZOOLÓGICA
Después
del
descubrimiento
del
parásito
se
encontraron Toxoplasmas en diferentes animales; y
partiendo del conocimiento intuitivo de que ese parásito
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se reproducía por esquizogonia, pareció lo más natural
considerarlo
como
un
Esporozoario
y
dada
la
especificidad parasitaria de ese grupo de Protozoarios
se eligieron diferentes especies de Toxoplasma
de
acuerdo a su hospedero, pero desde 1939 y gracias a
los trabajos de Albert Sabin se sabe hoy que sólo hay
una especie válida, el T. gondii. También se consideró
al Toxoplasma como un flagelado, aunque no se ha
encontrado evidencia de flagelos en su organismo. Por
último Wenyon sugirió la posibilidad de que pueda
relacionárselo con el Histoplasma, con el que puede
establecerse alguna confusión no solo por el nombre
sino por las apariencias histopatológicas. Ahora se sabe
de modo definitivo que es un esporozoario y pertenece
a la clase Toxoplasmea.
Pero sería arriesgado considerar como Toxoplasma a
organismos de morfología parecida a la descrita,
especialmente si estos organismos se aíslan de pájaros
en los que muchas veces se han encontrado elementos
considerados como tales sin mayor examen.
Existen cuatro características principales que permiten
afirmar con certeza que determinado organismo es
realmente T. gondii, ellos son:
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1. Morfología y propiedades tintoriales propias del
Toxoplasma.
2. Que sea un parásito que se multiplica en el
interior de células.
3. Que sea patógeno para mamíferos y aves.
4. Que se relacione inmunológicamente con cepas
reconocidas.8
3.3. DEFINICIÓN:
La toxoplasmosis es una enfermedad infecciosa
ocasionada por un parásito, el Toxoplasma gondii,
protozoario intracelular obligado. La toxoplasmosis
puede ser aguda o crónica, sintomática o asintomática.
La infección aguda recientemente adquirida suele ser
asintomática en niños mayores y adultos; y en caso de
presentar síntomas y signos (enfermedad aguda) estos
suelen ser de corta duración y autolimitados. En la
mayoría de los casos persiste como quistes en los
tejidos pero la persona no suele tener manifestaciones
clínicas (infección crónica), pero en otros casos se
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presenta con formas clínicas persistentes o recurrentes
(enfermedad crónica).
El parásito se presenta bajo tres formas diferentes:
trofozoíto (antes taquizoíto), quistes tisulares y
ooquistes. Estos últimos sólo se producen en los
intestinos de los huéspedes definitivos.
3.3.1. CLASIFICACIÓN DE LOS PROTOZOARIOS
Protozoarios de importancia clínica
Phylum:
Protozoario
Subphylum:
flagelos)
Sarcomastigophora (seudópodos y
Ciliosphora (cilias)
Apicomplexa (complejo apical)
Subphylum
Sarcomastigophora
Entamoeba
Superclase
Clase
Sarcodinos
Género
Rizópodos
(Seudópodos para
Endolimax
Locomoción)
Iodomeba
Dientamoeba
Acantamoeba
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Noagleria
Mastigóforos
Zooflagelados
Giardia
(Flagelos para
Chilomastix
locomoción)
Tichomonas
Leishmania
Tripanosomas
Opalinidios
(Sin importancia clínica)
Ciliophora
Balantidium
Ciliados
Apicomplexa
Plasmodia
Esporozoarios
Toxoplasma
Sarcocystis
Isospora
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3.4. AGENTE ETIOLÓGICO
3.4.1. ESTRUCTURA:
Toxoplasma
gondii
pertenece
al
filum
Apicomplexa, clase Sporozoa y familia Sarcocystidae,
la cual incluye los géneros Sarcocystis y Toxoplasma.
El parásito adopta diferentes estados según la fase de
su desarrollo. Su nombre deriva de la palabra griega
“toxon” que significa arco, por su morfología curva o de
media luna. En la infección aguda se encuentra la forma
proliferativa o taquizoito, término que se refiere a los
parásitos
extraepiteliales,
que
se
multiplican
rápidamente. Su tamaño es de 4 a 6 micras de longitud
por 2 a 3 micras de ancho. Cuando se hacen
coloraciones con Wright o Giemsa, además de observar
su forma arqueada con un extremo más delgado, se
encuentra que su citoplasma se tiñe de azul pálido y su
núcleo para central, de color rojizo.
En las infecciones crónicas los quistes son las formas
predominantes, estos aparecen en el ciclo de vida del
parásito incluidos por el estado inmunitario del huésped.
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Los quistes poseen una membrana propia y miden entre
20 y 200 micras, forma generalmente redondeada
algunas veces alargada. En su interior se encuentran
cientos de parásitos conocidos como bradizoítos.
Estos parásitos intraquísticos miden aproximadamente
7 micras de longitud por 2 de ancho.
Endozoítos. — Etapas que se encuentran en los
macrófagos y otras células huésped. Como se multiplican
muy rápidamente se los conoce también por taquizoítos.
Antiguamente se les denominaba trofozoítos o formas
proliferativas. Estas etapas miden entre 4 a 7 por 2 a 4
micrómetros y tienen, en general, forma de media luna.
Seudoquistes. — Están formados por un gran número de
endozoítos incluidos en un macrófago u otra célula
huésped. Los parásitos se hallan unidos por tejido de la
célula huésped.
Cistozoítos. — Etapas que se encuentran en los quistes.
Como se multiplican lentamente reciben también el
nombre de bradizoítos. Morfológicamente son similares a
los endozoítos, pero contienen gran cantidad de una
sustancia
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polisacárida
y,
por
lo
tanto,
reaccionan
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intensamente a la coloración con el método del ácido
periódico-Schiff (PAS).
Quiste. — Está constituido por una gran cantidad de
parásitos incluidos dentro de una pared quística bien
definida, compuesta por tejido parasitario. Puede estar
localizado en cualquier órgano del cuerpo, y en general
tiene forma esférica. La pared del quiste es argirófila.
Esquízonte. — Etapa que da origen a los merozoítos.
Este proceso de división se conoce con el nombre de
esquizogonia.
Merozoítos. — Etapas formadas como consecuencia del
desarrollo asexual por división múltiple en las células
epiteliales del intestino. La estructura básica de esta etapa
es semejante a la de los endozoítos.
Microgametocito. — Etapa masculina del parásito que se
encuentra en las células epiteliales del intestino. El núcleo
sufre muchas divisiones que conducen a la formación de
microgametos.
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Macrogametocito. — Etapa femenina del parásito que se
encuentra en las células epiteliales del intestino. El núcleo
no se divide y sólo da origen a un macrogameto.
Ooquiste. — Etapa resistente del parásito que se forma
como consecuencia de la gametogonia. Los ooquistes de
Toxoplasma miden 9 x 13 micrómetros aproximadamente.
Conoide. — Estructura hueca en forma de cono que se
encuentra en el extremo anterior de los cistozoítos,
endozoítos y merozoítos. Está cubierta por estructuras
fibrilares dispuestas en espiral. Se cree en general que
este órgano es utilizado por el parásito para penetrar en
las células huésped.
Rhoptrias.
—
Conocidas
también
como
organelas
apareadas. Son estructuras en forma de palo, electrodensas, localizadas en el extremo anterior de los
endozoítos, cistozoítos y merozoítos. Se considera que
estas estructuras producen enzimas necesarias para la
penetración del parásito en el huésped.
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Micronemas. — Conocidas también con el nombre de
taxonemas.
Son
estructuras
cordiformes,
pequeñas,
electro-densas, localizadas cerca del conoide. En un corte
trasversal aparecen como cuerpos ovalados o esféricos.
Su función es desconocida.
(1)
(2)
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(3)
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Figura 1. Microfotografía electrónica de un Taquizoíto
intracelular. C: conoide; pv: vacuola parasitófora; r:
rhoptrias; n: núcleo; m: micronema; dg: gránulos densos.
Figura 2. Quiste tisular de T. Gondii (Tomado de la Revista
Microbiología Médica, 1997; 469-71.)
Figura 3. Ooquiste no esporulado de T. gondii en heces de
gato (Tomado de la Revista
Parasitología Médica
1997:26579)
3.4.2. ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
La superficie del taquizoíto de T. gondii está
dominada por 5 proteínas mayoritarias, que han sido
implicadas como ligandos mediante los cuales se
realiza el reconocimiento celular y la adhesión del
parásito a la célula hospedera. De estas la
P30
(SAG1) y la P22 (SAG2) son las más abundantes. La
proteína de membrana SAG2 es la segunda en
abundancia en la superficie del taquizoíto de T. gondii
y, al igual que la SAG1 solo está presente en este
estadio.
Se ha sugerido que la SAG2 puede ser un ligando del
parásito para acoplarse con los receptores de la célula
hospedera y que está involucrada en los procesos de
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invasión celular, específicamente en la reorientación
apical del parásito. Estudios anteriores han obtenido
resultados contradictorios en cuanto al papel de los
anticuerpos monoclonales (AcM) dirigidos contra esta
proteína en la invasión y multiplicación en las células
del hospedero.
Grimwood reportó que la utilización de 2 AcM contra la
SAG2 favorece la invasión, y sugiere que los
anticuerpos que reconocen la proteína causaron una
acumulación de los taquizoítos sobre la membrana de
la célula hospedera; mientras que Channon demostró
que cuando se bloquea esta proteína con otro AcM,
disminuye claramente la invasión.
3.4.3. CICLO DE VIDA
El ciclo de T. gondii
corresponde al de las
Coccidias, las cuales presentan un ciclo entero-epitelial,
en donde aparecen formas sexuadas y asexuadas. El
gato y algunos felinos son los huéspedes definitivos de
T. gondii. En estos animales ocurre el ciclo epitelial en
el intestino delgado, principalmente en el íleon. En las
células epiteliales se multiplican los taquizoítos por
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esquizogonias
sucesivas,
con
formación
de
esquizontes, merozoítos y posteriormente con la
aparición de macro y microgametocitos que pasan
finalmente a gametos. El taquizoíto mide 6 micras de
longitud por 2 de ancho. Su forma es alargada y un
poco arqueada, con una membrana externa y una
interna, ambas interrumpidas en uno de sus lados por el
microporo. El núcleo se tiñe con facilidad con colorantes
comunes. Al microscopio electrónico en el citoplasma
se visualiza el citoesqueleto con los microtúbulos y en la
parte anterior se localizan las rhoptrias
y los anillos
polares. Tienen además, los micronemas, mitocondrias,
aparato de Golgi y varios gránulos.
En el intestino tiene reproducción sexuada y luego se
desarrollan los ooquistes que salen con las materias
fecales. Estos miden de 10 a 12 micras y son casi
esféricos. En el medio ambiente los ooquistes maduran
de 1 a 2 días y en su interior se forman 2 esporoquistes,
cada uno de los cuales contiene 4 esporozoítos.
En
el
gato
y
otros
felinos,
además
del
ciclo
enteroepitelial, también pueden coexistir invasiones
extraintestinales, pues los taquizoítos por vía linfática o
hemática se diseminan a todos los órganos donde
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forman quistes. El hombre y los animales se infectan
mediante la ingestión de los ooquistes procedentes de
las materias fecales de gato o de las formas quísticas
presentes en tejidos de otros animales, en los cuales
ocurren invasiones extra intestinales haciendo un ciclo
incompleto, como huéspedes intermediarios. En estos
casos existe inicialmente una infección aguda con
reproducción intracelular de los taquizoítos. Cuando el
huésped desarrolla inmunidad la infección se hace
crónica y se forman los quistes con los bradizoítos.
Los felinos se infectan al ingerir ooquistes y después de
20 a 24 días aparecen nuevas formas infectantes del
parásito que salen en materias fecales. Si el animal
ingiere tejidos con bradizoítos enquistados, como ocurre
al comer un ratón infectado, el periodo patente se
reduce 3 ó 4 días.
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Figura 4. Ciclo de vida del T gondií. 1. Huésped
definitivo (gato); 2. Ooquiste no esporulado en heces de
gato; 3. Quiste ingerido por el gato; 4. Quiste en
huésped intermedio; 5. Quiste ingerido por el hombre; 6.
Taquizoíto transmitido a través de la placenta; 7. Feto
infectado; 8. Alimento y agua contaminada; 9. Huésped
intermediario; 10. Ooquiste esporulado; 11. Ooquiste en
agua y tierra; 12. Ingesta por huésped intermediario 3.
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3.4.3.1. Reproducción
Los trofozoitos se multiplican por un proceso asexual
denominado de endodiogenia, en la que dos células
hijas se forman en el interior de una célula madre. La
reproducción es rápida y por eso se los denomina
taquizoitos.
En el interior de los quistes la multiplicación es binaria,
mucho más lenta y por eso se los denomina bradizoitos.
Cuando los quistes son ingeridos por otro huésped o si
se rompen dentro del mismo huésped por falla
inmunitaria,
los
bradizoitos
se
comportan
inmediatamente como taquizoitos o elementos de
multiplicación rápida.
Los ooquistes son el producto de la reproducción
sexual, por gametocitos femenino y masculino que se
forman en el intestino del gato, se unen y forman estos
elementos que salen al medio ambiente. 9
Gametogonia. — Forma sexual de división que
comprende
la
formación
de
microgametocitos
y
macrogametocitos.
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Esporogonia. — Proceso de desarrollo de los
esporozoitos, que son las etapas infecciosas del
parásito. Esta forma de desarrollo tiene lugar fuera del
huésped.
Endodiogenia. — Forma asexual de división que
origina dos células hijas dentro de una célula madre.
Tanto
los
endozoítos
como
los
cistozoitos
se
multiplican por este método.
Endopoligenia.
—
Forma
asexual
de
división
observable en el intestino del gato. Este proceso se
asemeja a la endodiogenia, pero difiere de ella por la
formación de más de dos descendientes con múltiples
divisiones nucleares que ocurren simultáneamente.1
3.5. PATOLOGÍA
La severidad del síndrome clínico es determinada
por el grado de necrosis celular y la reacción
inflamatoria. El daño producido por el parásito en la fase
aguda depende del número
de
taquizoítos
que
proliferan en las células. En la fase crónica ocurre una
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reacción de hipersensibilidad al romperse los quistes
con la salida de antígenos que reaccionan localmente.
El parásito penetra la pared intestinal y siguiendo la vía
linfática o hemática se disemina a una gran variedad de
tejidos. Los taquizoítos se reproducen intracelularmente
y pasan de célula a célula causando la muerte; esta
proliferación
constituye
la
forma
activa
de
toxoplasmosis.
La diseminación a los diferentes órganos se hace a
partir del sitio de la infección, pasando a la circulación
directamente o llevados por macrófagos, linfocitos o
granulocitos.
Después de 1 a 2 semanas cuando se desarrolla la
inmunidad, la proliferación del parásito disminuye y
comienzan a aparecer bradizoítos enquistados en los
tejidos. Los parásitos intracelulares forman su propia
pared, dando origen a los quistes, que cuando están
íntegros, no tienen reacción inflamatoria alrededor. En
cualquier tejido pueden aparecer los quistes, pero con
mayor frecuencia se localizan en el cerebro, retina,
miocardio y músculo esquelético.
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Los ganglios están aumentados de tamaño, hay
hiperplasia de las células reticulares, en el corazón y en
el músculo esquelético puede haber invasión de células
intersticiales y fibras musculares, con destrucción de las
células en la fase aguda o formación de quistes en la
crónica. Cuando hay diseminación a los pulmones, los
macrófagos alveolares y otras células pueden estar
parasitadas.
En el sistema nervioso central T. gondii produce
encefalitis,
más
frecuente
en
pacientes
inmunosuprimidos. Hay invasión de Taquizoítos a las
células nerviosas, muerte de la célula produciendo
zonas de infarto, calcificaciones, etc.
Los ojos constituyen una localización frecuente e
importante del parásito se produce retinocoroiditis, la
retina y la coroides muestran varios grados de necrosis
y dentro de las células retinianas se observan los
parásitos, en su mayoría en forma quística.
En
el
embarazo
cuando
existe
diseminación
hematógena se puede infectar la placenta, en donde se
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forman acúmulos de taquizoítos y quistes, algunos
casos pueden ocurrir abortos o mortinatos. En el feto
existe invasión de taquizoítos a las vísceras, incluyendo
el Sistema nervioso central. La necrosis tisular puede
ocurrir por infarto al existir un daño vascular. Aumento
de la presión intracraneana e hidrocefalia.
3.5.1. LESIONES PLACENTARIAS:
Los cambios patológicos producidos por T. gondii en
la placenta suelen ser más frecuentes y de mayor
importancia
que
las
alteraciones
del
feto
y,
probablemente, son la causa primaria de la muerte del
mismo.
3.5.1.1. Alteraciones macroscópicas:
La lesión puede apreciarse macroscópicamente ya
desde el primer mes de infección, como múltiples
puntos o flecos blanquecinos de alrededor de 2 cm. de
diámetro, más o menos dispersos en los cotiledones y
bien delimitados respecto del tejido sano. Excepto en
los cotiledones, no se detecta alteración en el resto del
tejido placentario salvo, en ocasiones un ligero edema.
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Con frecuencia, los cotiledones de una misma placenta
difieren entre sí, presentándose algunos visiblemente
alterados
frente
probablemente
a
otros
afectados
aparentemente
con
sanos,
posterioridad.
En
infecciones recientes, el aspecto de los cotiledones
suele ser totalmente normal y la lesión sólo puede
detectarse por histología.
3.5.1.2. Alteraciones histológicas:
La
infección
sólo
afecta
a
los
cotiledones
placentarios. Comienza provocando múltiples focos
microscópicos de necrosis en los septos carunculares,
lo que permite el avance del parásito a los tejidos
adyacentes. La infección de las vellosidades fetales
estimula la hipertrofia e hiperplasia del trofoblasto
afectado, con descamación de algunas porciones y
necrosis coagulativa. Esto origina la liberación de los
taquizoítos a las vellosidades contiguas, aunque
algunos parásitos pueden quedar atrapados en el foco
necrótico.
En infecciones producidas a partir del segundo mes de
gestación, como respuesta celular, se produce edema
con
acúmulo
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de
células
mononucleares
en
el
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mesénquima
de
las
vellosidades.
En
procesos
avanzados hay regeneración conjuntiva con fibrosis e,
incluso, calcificación de los focos necróticos cuya
confluencia origina la fusión de vellosidades contiguas.
3.5.2. LESIONES FETALES:
El órgano más afectado es el encéfalo, en el que
pueden distinguirse dos tipos de lesiones, primarias y
secundarias.
• Las lesiones primarias: Son consecuencia directa
de la multiplicación del parásito en los tejidos, que
origina necrosis y hemorragias focales, localizadas
fundamentalmente en la sustancia cerebral gris y,
ocasionalmente, en las meninges.
• Las lesiones secundarias: Son fundamentalmente
cambios degenerativos de la sustancia blanca
encefálica, detectables por la presencia de focos de
leucoencefalomalacia. Estas lesiones se atribuyen a
la
anorexia
tisular
provocada
por
la
lesión
placentaria, y se consideran más directamente
implicadas en la muerte del feto.
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3.5.2.1. Alteraciones macroscópicas:
A diferencia de las lesiones placentarias, las
producidas por Toxoplasma en los tejidos fetales no son
macroscópicamente identificables.
Además de una autolisis más o menos avanzada, con
frecuencia
se
detecta
edema
subcutáneo,
ocasionalmente serohemorrágico, y la presencia de
líquido y grumos de fibrina en cavidades corporales. La
hipertrofia ganglionar generalizada y la esplenomegalia
son también hallazgos relativamente frecuentes.
3.5.2.2. Alteraciones histológicas:
En la sustancia cerebral gris suelen apreciarse
infiltrados de células de glia alrededor de los focos
necróticos, así como acúmulos perivasculares de estas
células y numerosos focos hemorrágicos.
En
la
sustancia
degenerativos
se
encefálica
blanca,
identifican
como
los
focos
zonas
más
interesantes eosinófilas, donde los núcleos de glia son
más escasos que en el tejido sano circundante.
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Estas lesiones degenerativas encefálicas suelen ir
acompañadas
de
focos
extramedulares
de
hematopoyesis en el hígado y el bazo y una
disminución de la fracción mieloide/eritroide en la
médula ósea, probablemente también atribuibles a la
insuficiencia placentaria. Es frecuente también la
detección de focos inflamatorios con infiltración de
células linfoides en hígado, pulmón, miocardio y, con
menor frecuencia, riñón y musculatura esquelética.
3.6. MANIFESTACIONES CLÍNICAS
La mayoría de las infecciones ocurren de manera
asintomática o con ligera sintomatología no específica.
Son frecuentes los hallazgos ocasionales de anticuerpos
circulantes, sin que previamente hubieran existido
síntomas de infección inicial.
Las infecciones crónicas son más frecuentes que las
agudas. Las principales formas clínicas de la enfermedad
son:
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3.6.1.
TOXOPLASMOSIS AGUDA
La forma aguda generalizada o febril exantemática
es rara y con frecuencia no se diagnostica. Después
de un periodo de incubación de unos 5 a 18 días,
aparece bruscamente un síndrome febril del tipo
séptico, con fiebre alta, escalofríos, sudoración,
cefalea, astenia y anorexia, rara vez el exantema. Es
frecuente,
además,
el
dolor
faríngeo,
tos
y
expectoración. En los casos severos se presentan
trastornos gastrointestinales, como dolor abdominal,
náuseas, vómito, diarrea o constipación. Existe
compromiso de los ganglios mesentéricos, los cuales
aumentan de tamaño. Si la vía de entrada por
inoculación
accidental
es
la
mano,
aparece
linfoadenitis epitroclear y axilar y al tercer día erupción
cutánea maculopapular generalizada, no pruriginosa,
sin compromiso de palmas y plantas. Con frecuencia
se presentan mialgias y artralgias. En los casos
severos
la
enfermedad
se
puede
manifestar
clínicamente como una encefalitis, hepatitis
o
miocarditis.
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3.6.2.
TOXOPLASMOSIS
GANGLIONAR
O
LINFÁTICA
Es la forma clínica más común de la toxoplasmosis
adquirida y se presenta principalmente en los niños y
adultos jóvenes. Puede transcurrir inicialmente en
forma asintomática o con ligeros síntomas. El periodo
de incubación varía entre dos semanas y dos meses.
El cuadro clínica más frecuente es un síndrome febril
con las características descritas en la forma aguda, en
la cual predominan las poliadenopatías.
Los ganglios linfáticos más fácilmente reconocibles
son los cervicales, suboccipitales, de la cadena espinal
y con menor frecuencia en otros sitios. Los ganglios
están aumentados de tamaño, de consistencia dura y
dolorosa. A veces está asociada a faringitis de tipo
granulomatoso. En general, la evolución es benigna,
pero
después
de
varias
semanas
o
meses,
desaparece el cuadro característico pero persiste por
mucho
tiempo
la
astenia
y
las
adenopatías.
Excepcionalmente existen complicaciones graves.
Durante la enfermedad se presenta anemia moderada
y leucopenia con linfomonocitosis, que tarda varios
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meses en desaparecer. La toxoplasmosis ganglionar
puede confundirse con mononucleosis infecciosa. Las
pruebas serológicas hacen el diagnóstico diferencial
entre las dos entidades.
3.6.3. TOXOPLASMOSIS OCULAR
Esta localización es muy común y muchas veces
única manifestación de la toxoplasmosis. Se considera
la causa de aproximadamente la tercera parte de
coriorretinitis. La toxoplasmosis ocular aparece a
cualquier edad y se considera que puede ser debida a
una infección prenatal, con recidivas posteriores. La
complicación a nivel popular puede ser debida tanto a
manifestaciones agudas como crónicas.
La lesión ocular se caracteriza por inflamación
granulomatosa del tracto uveal, la cual comienza por la
retina y luego compromete las coroides. Cuando existe
la ruptura de un quiste la retinocoroiditis presenta
reacción
inflamatoria
intensa
que
tiende
a
la
cicatrización esta ruptura es súbita y desaparece en 4
a 6 semanas.
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La lesión es casi siempre redondeada con bordes
pigmentados y la parte central blanquecina, se
manifiesta en la mayoría de los casos de forma aguda,
con disminución brusca de la visión y fenómenos
inflamatorios. En casos severos se puede presentar
desprendimiento de la retina y vítreo hemorrágico.
En las lesiones crónicas existe inflamación difusa, la
cual tiende a persistir por mucho tiempo, produciendo
pérdida progresiva de la visión que en algunos
pacientes puede llegar hasta la ceguera.
3.6.4. TOXOPLASMOSIS CONGÉNITA
Cuando la madre se infecta por primera vez en el
embarazo, los parásitos invaden las células y se
presenta parasitemia por donde se hace invasión a
todos los órganos, incluyendo la placenta y por
lo
tanto existe el riesgo de transmisión congénita en el
65% de los fetos cuyas madres tuvieron la infección en
el último trimestre. Esta cifra baja a 25 y 17%, cuando
la infección fue adquirida en el segundo y primer
trimestre.
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La infección en la madre es generalmente benigna y
transcurre asintomática. Si la infección fue adquirida
antes de la gestación, el niño no desarrolla infección
congénita. También se acepta que una madre que dio
a luz un niño con toxoplasmosis, no vuelva a tener otro
con la enfermedad. Se han descrito casos de abortos o
mortinatos en infecciones recientes, pero no hay
evidencia definitiva de abortos a repetición, asociados
a la toxoplasmosis. La infección congénita ocurre casi
exclusivamente cuando la mujer embarazada adquiere
la infección siendo seronegativa.
De
los
recién
asintomáticos,
nacidos
20%
infectados.
tienen
una
70%
forma
son
aguda
generalizada o secuelas neurológicas y el 10%
presentan compromiso ocular solamente.
Los síntomas que aparecen en el recién nacido
dependen del momento de la infección del feto.
Existen tres etapas:
• Infección generalizada.
• Encefalitis aguda.
• Secuelas irreversibles.
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3.6.4.1. Infección generalizada
Si la infección ocurre al final del embarazo, se
produce
una
forma
generalizada
aguda.
Aproximadamente la mitad de los recién nacidos son
prematuros o de bajo peso, con un cuadro clínico de
tipo séptico caracterizado por fiebre, hepato y
esplenomegalia,
ictericia
y
en
algunos
casos
miocarditis o neumonía intersticial. Alrededor del 80%
de ellos tienen LCR normal. No se presenta exantema
y raras veces existe compromiso neurológico y ocular.
La mortalidad en estos niños es muy elevada y llega al
12% si no se hace tratamiento.
En otras ocasiones la infección es poco manifiesta y
aún pasa desapercibida, sólo se encuentra un niño
prematuro sin ninguna otra sintomatología en el
momento del nacimiento.
3.6.4.2. Encefalitis aguda
Cuando la infección fetal ocurre alrededor de la
mitad del embarazo, la etapa de generalización sucede
dentro de la vida intrauterina y en el momento del
nacimiento
se
encuentra
sintomatología
de
la
encefalitis. En los casos benignos el niño puede tener
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peso normal y presentar pocas manifestaciones de la
enfermedad, pero después de varias semanas vuelve
apático, con dificultad para comer y ocasionalmente
desarrolla convulsiones.
En la toxoplasmosis subclínica la secuela más
importante es la retinocoroiditis. Se encuentran el 75%
de los casos con lesiones oculares a los 11 años
después del nacimiento. Cuando hay hipertensión
intracraneana se desarrolla hidrocefalia.
En los casos graves es común encontrar al recién
nacido con hidrocefalia y los signos y síntomas de
encefalitis aguda, retinocoroiditis y anormalidades en
el LCR.
Las manifestaciones viscerales pueden existir, pero no
son predominantes. Mas tarde se encuentran las
manifestaciones intracraneanas y se observa retardo
psicomotor.
3.6.4.3. Secuelas irreversibles
En los casos en que la infección se hace al inicio
del embarazo, cuando se está formando la placenta, el
parásito pasa al feto y se desarrolla la enfermedad en
la vida intrauterina. Toda la infección generalizada y
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los daños ocurren en el feto y en momento del
nacimiento
el
niño
tiene
las
secuelas.
Las
manifestaciones de la enfermedad, encontradas al
nacer, dependen del momento y de la intensidad de la
invasión. En las formas leves las manifestaciones
aparecen un tiempo después del nacimiento, en la
edad escolar y aún más tarde. Si existe infección
crónica, el paciente presenta pérdida progresiva de la
visión, como consecuencia de la retinocoroiditis.
En otros casos se encuentran lesiones más graves
pero con manifestaciones tardías, como epilepsia,
retardo en el desarrollo neurosíquico, retinocoroiditis y
calcificaciones cerebrales. En los casos severos puede
nacer el niño con macrocefalia y microcefalia, retraso
en su desarrollo, microftalmía, estrabismo y placas de
retinocoroiditis.
3.6.5.
OTRAS
LOCALIZACIONES
DE
LA
TOXOPLASMOSIS
En algunos casos la toxoplasmosis se manifiesta
clínicamente como una enfermedad que afecta un solo
órgano, distinta a las formas ocular o ganglionar,
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descritas anteriormente. Esto puede ocurrir a pesar de
que haya existido previamente una diseminación que
transcurrió en forma subclínica o clínicamente no
reconocida. Entre cuadros clínicos predominantes en
un órgano se pueden mencionar:
• Toxoplasmosis pulmonar, en la cual se presenta
un cuadro de neumonía intersticial, especialmente
en
la
infección
congénita
y
en
pacientes
inmunocomprometidos.
• Miocarditis
enfermedad
o
pericarditis.
está
asociada
Esta
forma
de
principalmente
con
infección congénita, pacientes inmunosuprimidos
ocasionalmente en infección aguda severa.
• Toxoplasmosis
especialmente
cerebral,
en
pacientes
que
aparece
inmunosuprimidos.
Existe en estos casos una encefalitis clínica con o
sin la enfermedad generalizada. En pacientes con
SIDA casi siempre se presenta la encefalitis.
• Hepatitis. Se ha sugerido esta localización como
una entidad clínica independiente, que puede
presentar focos de necrosis. Lo mismo puede
ocurrir en otros órganos.
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3.6.6.
TOXOPLASMOSIS
EN
EL
PACIENTE
INMUNOSUPRIMIDO
Cuando existe una inmunosupresión, se pueden
desarrollar dos tipos de enfermedad:
•
La infección primaria severa y
•
La infección crónica que se recrudece.
En el primer caso el paciente que no estaba infectado,
adquiere el parásito del suelo o la carne, o lo recibe
por un trasplante; la infección se desarrolla sin que la
inmunidad la controle y es generalmente fatal.
En los casos de recrudecimiento, la infección es
endógena. En estos últimos pacientes se desarrolla
principalmente una encefalitis con lesiones múltiples y
algunas veces focales, simulando un absceso o tumor.
En
otros
miocarditis,
pacientes
puede
retinocoroiditis
ocurrir
progresiva
neumonía,
u
otras
manifestaciones orgánicas. En pacientes con el
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la
complicación más común ocurre también en el sistema
nervioso central (SNC) y constituye una de las
infecciones oportunistas más importantes en estos
pacientes.
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Se estima que la toxoplasmosis del SNC está
alrededor del 40% de los enfermos de SIDA, según lo
informan los distintos autores. El cuadro clínico de la
encefalitis es de tipo focal en la mayoría de los casos.
Las anormalidades neurológicas incluyen hemiparesia,
hemiplejia, pérdida de sensibilidad, parálisis de nervios
craneanos, convulsiones, afasia, ataxia, confusión y
letargia. Los síntomas neurológicos pueden estar
asociados a fiebre. En algunos casos existen síntomas
meníngeos. En el LCR no se encuentran leucocitos o
son escasos y la glucosa es normal. Ocasionalmente
están aumentadas las proteínas. En los casos severos
la toxoplasmosis es fatal. También pueden tener un
recrudecimiento de la enfermedad los pacientes que
reciben
grandes
dosis
de
corticoesteroides,
inmunosupresión para un trasplante, terapia con
antimetabolitos, agentes alquilantes para leucemia,
linfoma o para tumores malignos.
3.7. INMUNIDAD
Algunos animales presentan resistencia natural a la
infección y todos los huéspedes, incluyendo al hombre,
aumentan la resistencia con la edad; tal sucede con
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las madres, que generalmente son asintomáticas, a
diferencia de los niños, que con mayor frecuencia
desarrollan la enfermedad.
Los huéspedes que albergan el parásito, desarrollan
gran actividad inmunitaria. Esto se logra en la infección
inicial, por la activa reproducción intracelular y
destrucción de las células con salida de los parásitos.
A medida que se estimula la respuesta inmune, ésta
induce al parásito a formar quistes en los tejidos; en
este momento los taquizoítos extracelulares son
lisados por la acción de los anticuerpos y el
complemento.
Aunque la inmunidad mediada por anticuerpos es
efectiva
contra
el
parásito,
se
considera
más
importante la inmunidad celular. Hay evidencia de que
los linfocitos T secretan sustancias específicas que
inhiben o matan los parásitos. Se ha demostrado que
se produce gamma interferón que también actúa
contra ellos y estimulan los macrófagos para inhibirlos
o matarlos. Algunos autores dudan sobre el papel de
los macrófagos en la inmunidad contra Toxoplasma.
La hipersensibilidad de tipo retardado, que se
comprueba
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con
la
toxoplasmina,
tiene
gran
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importancia en algunos momentos de la infección,
pues por este mecanismo las sustancias antigénicas,
al interaccionar con los linfocitos sensibilizados, inician
un proceso inflamatorio de tipo celular, que puede
causar lesiones y aun necrosis. La inmunidad mediada
por
células
es
deprimida
por
la
acción
de
corticoesteroides y otros inmunosupresores. Alrededor
de los quistes intactos no existe reacción inflamatoria,
pero cuando el equilibrio inmunológico se altera,
especialmente por un estado de inmunodeficiencia, los
quistes se rompen con liberación de bradizoítos y
algunas
sustancias
presentes
en
el
quiste
desencadenan una intensa reacción inflamatoria. Los
corticoesteroides, las drogas inmunosupresoras y
ciertas enfermedades debilitantes, alteran la inmunidad
del huésped y reactivan la toxoplasmosis.
3.7.1.
INMUNIDAD
HUMORAL
respuesta
inmunológica
FRENTE
A
LA
INFECCIÓN
La
del
hospedero
inmunocompetente a T gondii se desarrolla de manera
secuencial a partir de las diferentes inmunoglobulinas
así.
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3.7.1.1.
IgM:
Es
la
primera
en
aparecer
ontogénicamente. Puede ser detectada dentro de las
dos primeras semanas de haberse producido la
infección; su vida media oscila entre cinco días y
cuatro semanas y en un 5% de los pacientes puede
persistir positiva hasta por tres años, motivo por el cual
el diagnóstico de infección activa en la paciente
embarazada es en ocasiones difícil. Por lo tanto los
títulos de IgM elevados nos indican en la gran mayoría
de las veces, aunque no siempre, que estamos frente
a una toxoplasmosis en fase aguda.
3.7.1.2. IgG: Aparece una o dos semanas después de
la primoinfección, y alcanza su pico máximo entre la
sexta y octava semana. Los niveles de IgG luego
decrecen gradualmente a títulos relativamente bajos,
los cuales persisten durante toda la vida, lo que nos
indica que si detectamos títulos de IgG estables,
estamos frente a una toxoplasmosis latente, antigua o
que ya hubo una infección superada.
La IgG en niños menores de un año, no puede ser
distinguida de anticuerpos maternos, los cuales
pueden persistir en el niño por varios meses.
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3.7.1.3. IgA: La aparición de la IgA se presenta en
fases tempranas de la infección (alrededor de las dos
primeras semanas de haberse infectado), y su vida
media es parecida a la
IgM, e incluso puede
desaparecer entre el tercer y noveno mes.
3.7.1.4. IgE: El tiempo de aparición de la IgE es igual
al de la IgA pero al parecer la vida media es más
corta, siendo positiva hasta las cuatro semanas
posteriores a la infección, por lo cual puede ser útil en
el diagnóstico de infección aguda.
Así, para una apropiada interpretación de los títulos de
anticuerpos circulantes, ésta debe hacerse en asocio
de varias determinaciones. Por ejemplo, si se detecta
IgM e IgA simultáneamente lo más probable es que la
persona se encuentra en una fase aguda de la
infección (aproximadamente siete días postinfección),
lo que permitiría hacer una mejor evaluación del riesgo
en la mujer gestante.
La respuesta inmune específica del recién nacido es
caracterizada por la presencia específica de IgM e IgA,
ya que no atraviesan la placenta como lo hace la IgG.
En la ausencia de estimulación antigénica, el nivel de
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IgA en el primer año en los niños es solo el 20% del
observado en adultos. Si se encuentran en mayor
porcentaje, podría considerarse como indicio de
toxoplasmosis congénita.4
3.8. DIAGNÓSTICO
La toxoplasmosis es una enfermedad de difícil
diagnóstico parasitológico, pues no es fácil demostrar
el agente etiológico y establecer la relación entre
infección
y
enfermedad.
Clínicamente
se
debe
diferenciar de varias entidades, de acuerdo a la
localización de las lesiones predominantes.
En la toxoplasmosis aguda se requiere hacer un
diagnóstico diferencial con cualquier síndrome febril
con o sin exantema, especialmente con aquellos que
presentan
infecciosa,
adenopatías,
por
tener
como
cuadros
mononucleosis
clínicos
que
se
confunden. También se pueden comportar como una
fiebre tifoidea o una brucelosis.
La forma ganglionar semeja con frecuencia linfomas
incipientes. En los casos severos que presentan
encefalitis, hepatitis, neumonitis o miocarditis, se
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deben descartar otras etiologías que tengan estos
mismos cuadros clínicos. Cuando existe compromiso
ocular, es necesario considerar todas las causas de
uveítis
endógena,
en
especial
tuberculosis,
histoplasmosis, sífilis y citomegalovirus.
La toxoplasmosis congénita presenta una amplia gama
de manifestaciones clínicas, según la intensidad de la
infección, el momento de su aparición y las secuelas.
En el recién nacido se deben descartar enfermedades
como sífilis, sepsis, eritroblastosis fetal, infecciones por
virus de inclusión citomegálica y otras entidades. En
todo niño con encefalitis es necesario pensar en
toxoplasmosis.
El laboratorio es básico para definir la etiología de la
enfermedad. El diagnóstico de infección se puede
establecer mediante las pruebas serológicas; para
comprobar la enfermedad se requiere, además, el
criterio clínico.
Muchas veces es difícil separar lo que es infección por
Toxoplasma y presencia de enfermedad. Existen
varios procedimientos para demostrar el parásito en
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forma directa y otros de tipo indirecto para la búsqueda
de anticuerpos.
3.8.1. DEMOSTRACIÓN DIRECTA DEL PARÁSITO
Aunque la observación del parásito es lo ideal, sólo
es posible hacerlo en un reducido número de casos.
Este puede encontrarse en LCR, ganglios linfáticos,
médula ósea y ocasionalmente en otros tejidos.
Cuando se obtiene material por punción, sé busca el
parásito en fresco o coloreado. En los tejidos, las
características morfológicas son difíciles de precisar,
pues
el
estudio
histopatológico
muestra
formas
redondeadas o partes del parásito, según sea su
posición y se requiere mucho tiempo, experiencia y
cortes seriados para poder identificarlo; por este
motivo ocurren errores de diagnóstico en favor o en
contra del parásito. Se confunden sus estructuras con
otros protozoos, hongos, pólenes, etc. En los ganglios
se parecen a las células reticulares con inclusiones.
Los quistes son de reconocimiento más difícil, se
requiere diferenciarlos de pseudoquistes de T. cruzi,
nidos de Leishmania, quistes de Sarcocystis, formas
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de Encephalitozoon, acumules de hongos del género
Candida e Histoplasma, etc. La coloración con Giemsa
o hematoxilina-eosina ayuda a la diferenciación en
cortes histológicos, así como la inmunofluorescencia
directa y la inmunoperoxidasa.
3.8.2. INOCULACIONES
El parásito se puede aislar de sangre, LCR, esputo
y de los tejidos infectados, tales como ganglios
linfáticos, músculos, placenta, ojos enucleados y
vísceras. El procedimiento indicado para el aislamiento
es la inoculación al ratón. Los tejidos se pueden
homogeneizar o digerir mediante tripsina al 1%. Este
material se lava con solución salina isotónica antes de
ser inyectado al animal. Los líquidos, especialmente
LCR, se inoculan directamente. La cantidad de
material es de 0.5 ml para introducir por vía
intraperitoneal. Después de la primera semana se
estudia el exudado peritoneal para buscar el parásito,
generalmente intracelular. Algunas veces se requieren
pases ciegos con el exudado, para posteriormente
encontrar
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Toxoplasma.
Se recomienda
tratar el
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material para inocular, con penicilina y estreptomicina,
para evitar peritonitis bacteriana y muerte del animal,
antes de cumplir el tiempo de reproducción de los
parásitos.
Previamente
importante
asegurarse
a
las
inoculaciones,
serológicamente
que
es
los
animales de laboratorio estén libres de esta infección.
Los taquizoítos pueden aparecer después de 4 a 8
días. Si los animales sobreviven, se examinan
después de 4 a 6 semanas para buscar los quistes en
cerebro. Se ha utilizado también la vía intracerebral en
el ratón, los cultivos de tejidos y embrión de pollo; sin
embargo, estos métodos son más difíciles de realizar.
3.8.3. MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
La demostración indirecta de T. gondii se hace por
la búsqueda de anticuerpos. Su presencia indica que
hay infección, pero no necesariamente enfermedad.
Los anticuerpos detectados son principalmente IgM e
IgG, los primeros indican infección reciente. La
interpretación de los títulos de anticuerpos se debe
hacer frente al cuadro clínico y la historia del paciente.
El solo hecho de tener un resultado positivo de su
serología, no indica que el paciente tenga la
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enfermedad y el hecho de tener anticuerpos, no es
criterio suficiente para hacer un tratamiento. Muchas
veces los títulos de las reacciones no guardan relación
con la gravedad de la enfermedad y el estudio
serológico indica únicamente que la persona ha tenido
o tiene el parásito.
Las pruebas serológicas más utilizadas son las
siguientes:
3.8.3.1. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Esta prueba se comporta en forma similar a la de
Sabin y Feldman, con alta concordancia en cuanto a
su sensibilidad y especificidad. En la práctica se
prefiere por su fácil ejecución, porque no requiere
trabajar con parásitos vivos, ni con factor accesorio
que
es
difícil
de
conseguir.
Para
la
inmunofluorescencia se utilizan taquizoítos muertos
por formol o liofilizados. Los anticuerpos de la clase
IgG presentes en el suero del paciente se adhieren a
la pared del parásito, donde se detectan por medio de
gammaglobulina
antihumana
conjugada
con
isotiocianato de fluoresceína. La reacción se lee al
microscopio de luz ultravioleta y se determina el título
en la última dilución del suero, en la cual se encuentra
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fluorescencia de la pared del parásito. Los títulos
pueden ser tan altos como en la reacción de Sabin y
Feldman. Si se necesita buscar anticuerpos en algún
animal, es necesario cambiar de gamma globulina de
acuerdo a la especie.
Esta reacción se emplea para el seguimiento de los
pacientes y detecta anticuerpos después de 8 a 10
días de haberse iniciado la infección, se elevan
rápidamente y decrecen después de 8 a 12 meses,
pero
queda
positiva
permanentemente
y
es frecuente encontrar títulos estables por mucho
tiempo, además existen infecciones que evolucionan
con títulos bajos.
•
Un título de 1:64 se interpreta como infección
pasada o muy reciente.
•
Reacciones alrededor de 1:256 se consideran
como
títulos
intermedios
y
pueden
indicar
infecciones estabilizadas o recientes.
•
Los títulos de 1:1.024 o mayores, sugieren
infección activa.
Esta prueba serológica confirma la actividad de la
infección cuando aumentan en 2 a 4 semanas de
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intervalo. Se consideran modificaciones significativas
cuando el título se eleva 4 veces o más por encima del
anterior. Un mismo suero en distintas determinaciones,
con la misma prueba, puede presentar oscilaciones en
su título, pero éstas no deben exceder en más de una
dilución. Después del tratamiento de un paciente los
títulos bajan muy lentamente; en algunos casos pueden
subir después del tratamiento, pero luego descienden.
La eficacia del tratamiento no se puede medir
serológicamente sino por la clínica.
Para demostrar la producción local de anticuerpos (Ac)
en el ojo o en el sistema nervioso central, se aplica la
siguiente ecuación para definir un coeficiente (C).
Título Ac
C = en líquido
Concentración
X
gammaglobulina en suero
Título Ac
Concentración
en suero
gammaglobulina en
líquido
Si el coeficiente es 8 o más, indica que hay producción
local de anticuerpos en el ojo o en el sistema nervioso
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central, por lo tanto hay infección activa en estos
tejidos.10
3.8.3.1.1. Anticuerpos IgG.
Dosados por inmunofluoresencia indirecta (IgGIFA, “Indirect Fluorescent Antibody”). El título aumenta
en el mes o en los dos meses que siguen a la
infección, permanece alto durante los 6 – 12 meses,
después disminuye de manera progresiva y se
estabiliza en un título residual bajo.12
Un título alto de entrada (>300 UI/ml) o que se duplica
en 3 semanas sugiere una infección reciente. El “dye
test” (prueba de lisis de los parásitos) de Sabin –
Feldman da resultados comparables.
3.8.3.1.2. Anticuerpos IgM.
Dosados
por
prueba
de
Remington
o
de
inmunofluoresencia indirecta (IgM – IFA). El título ya
aumenta después de algunos días, alcanza un máximo
en 2 a 4 semanas y se normaliza en 1 a 2 meses. La
ausencia
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de
IgM
específicas
permite
descartar
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infección evolutiva, pero su presencia no autoriza a
afirmar que se trata de una infección reciente. En
efecto, se requiere el análisis de dos sueros extraídos
con 3 semanas de intervalo para demostrar la
seroelevación.12
3.8.3.2. Prueba de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent-assay). Es una
prueba
muy
sensible
y
requiere
una
buena
estandarización. En algunos casos los anticuerpos IgG
se correlacionan con los detectados por IFI, Sabin y
Feldman y la hemaglutinación indirecta, pero en otros
no se tiene buena correlación.
Se considera que una prueba de ELISA con menos de
10 unidades internacionales (UI) por ml es negativa; de
10 a 300 UI/ml indica infección pasada o en evolución,
y más de 300 UI/ml se refiere a enfermedad activa o
reciente.
La prueba de ELISA-IgM es positiva en los casos de
infección reciente. El método de captura de IgM o del
doble anticuerpo es más sensible y específico. Este
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procedimiento es un anticuerpo anti-IgM humano que
recubre los pozos del microplato, para capturar la IgM
del suero del paciente. La cantidad de antígeno
toxoplásmico se mide inmunoquímicamente, lo cual
constituye el método IgM-ELISA de doble capa o IgMELISA reversa. Si se usa aglutinación de los parásitos
se llama ISAGA. La prueba IgM-ISAGA es más
sensible y detecta anticuerpos IgM específicos más
precozmente que IgM-ELISA. Estas pruebas de
captura tienen menos reacciones falsas positivas o
negativas. La captura de IgM da positiva por más
tiempo que los otros métodos y detecta este tipo de
anticuerpos hasta por 2 ó 5 años.
Utilizando la prueba de ELISA se hace la detección de
IgA específica. La
DS- IgA-ELISA es más sensible
que la IgM-ELISA para detectar infección congénita en
el feto, en el recién nacido y en la mujer en embarazo.
3.8.3.3. Prueba de hemaglutinación indirecta (HAI)
Mediante un antígeno soluble ligado a eritrocitos de
carnero tamizados, se detectan anticuerpos circulantes
evidenciados por la aglutinación de los eritrocitos
preparados. La prueba es muy sensible y da títulos
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elevados; se considera también específica aunque
puede
dar
algunas
especialmente
cuando
reacciones
se
estudian
cruzadas,
sueros
de
animales. La prueba es deficiente para detectar
anticuerpos en la fase aguda de la infección. Se ha
encontrado concordancia con la reacción de Sabin y
Feldman y paralelismo con ella; sin embargo, se
encuentran casos de reacciones positivas de esta
última, con pruebas negativas a la hemaglutinación y
viceversa. Esta prueba es deficiente para detectar
anticuerpos en el recién nacido.
3.8.3.4. Prueba de Sabin y Feldman (S-F)
Se llama también prueba del colorante. Es un
método clásico y específico, pero tiene dificultades
técnicas, por lo cual se ha limitado su uso. Como
antígeno se utilizan parásitos vivos obtenidos de
exudado peritoneal de ratones, con 2 a 3 días de
inoculación.
El
suero
del
paciente
se
diluye
progresivamente para poder determinar el título de
anticuerpos.
La reacción antígeno-anticuerpo se lleva acabo en
unión del complemento sérico humano, lo que se ha
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llamado factor accesorio, que se obtiene de personas
sin anticuerpos para Toxoplasma. Al hacer las pruebas
y cuando no hay anticuerpos, los parásitos se tiñen
con azul de metileno, los cuales se observan al
microscopio corriente o con contraste de fase.
Los Toxoplasmas alterados por la acción de los
anticuerpos no toman el colorante; si el 50% o más
parásitos se encuentran sin teñir, la reacción se
considera positiva. Se informa como título, la última
dilución del suero en la cual se encuentra la reacción
positiva.
En infecciones activas los títulos están por encima de
1:1.024 y pueden llegar hasta 1:64.000 o mayores.
La prueba aparece positiva desde los primeros días de
iniciada la infección, mide principalmente anticuerpos
IgG y permanece así durante toda la vida del paciente,
con oscilaciones en su título que decrece lentamente
después del tratamiento. No se encuentran reacciones
cruzadas con otros protozoos o agentes infecciosos,
por lo cual se considera de alta especificidad.
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3.8.3.5. Reacción de fijación del complemento
Esta prueba es específica pero poco sensible. Se
utiliza un antígeno soluble, los títulos de anticuerpos
son generalmente bajos y pocas veces se elevan por
encima de 1:256. La reacción tiene un valor limitado y
se hace positiva más tardíamente que las pruebas
anteriores, generalmente aparece de 3 a 4 semanas
después de iniciada la infección. Se vuelve negativa
precozmente, entre 6 y 9 meses. Se pueden encontrar
reacciones falsas positivas en algunos casos.
3.8.3.6. Otras pruebas
Diferentes reacciones se han desarrollado, pero no
se utilizan de rutina, como son la prueba de látex,
inmunodifusión en agar, aglutinación directa, etc.
También se ha utilizado la prueba de Wester-blot para
comparar los anticuerpos de la madre y del hijo, frente
a diferentes antígenos de Toxoplasma, con el fin de
esclarecer el diagnóstico de infección congénita.
Recientemente se ha desarrollado la prueba conocida
como ELIFA (Enzyme-linked immuno-filtration assay)
en la cual se utiliza una membrana de microporo que
permite
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estudiar
anticuerpos
específicos
por
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inmunoprecipitación
e
inmunofiltración,
mediante
anticuerpos marcados con una enzima.
3.8.3.7. Toxoplasmina.
Esta
prueba
semejante
es
a
de
hipersensibilidad
la
tardía,
tuberculina.
Aparece positiva generalmente después de la quinta o
sexta semana y permanece así indefinidamente. El
antígeno que se inyecta es obtenido por lisis de
parásitos procedentes de exudado peritoneal de ratón.
Este antígeno se inyecta intradérmicamente en un
antebrazo; como control se utiliza extracto de bazo de
ratón, que se aplica en la misma forma en el otro
antebrazo. La lectura se hace midiendo la induración
que se presenta a las 48 horas. La prueba tiene poco
valor para el diagnóstico de la enfermedad, aunque en
casos de uveítis se encuentra una mejor correlación.
En las formas crónicas, las lesiones se deben a
reacciones de hipersensibilidad contra productos
antigénicos del parásito. Cuando la prueba es negativa
en un proceso de larga duración, puede ayudar a
descartar la entidad, a menos que se trate de energía,
como ocurre con pacientes en muy mal estado general
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o que están recibiendo corticoesteroides. La utilidad
principal
de
la
prueba
reside
en
el
estudio
epidemiológico de poblaciones para buscar contacto
previo con el parásito.
3.8.3.8. Detección de antígenos
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se
usa para amplificar ADN de T. gondii indicando la
presencia del parásito en los líquidos o tejidos,
inclusive
en
el
líquido
amniótico.
Tiene
mejor
sensibilidad que el cultivo y es más rápida (demora de
2 a 3 días). En particular, se la utiliza para el
diagnostico prenatal y en caso de inmusupresión.10
3.8.4. HEMOGRAMA
• Forma
adquirida:
neutropenia,
eosinofília,
presencia de células mononucleares con citoplasma
basófilo.
• Forma congénita: anemia, eritroblastosis y, a
veces, trombocitopenia.
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3.8.5. PRIMOINFECCIÓN MATERNA
• Seropositividad antes del embarazo: no exige
control, salvo en caso de inmunosupresión.
• Seropositividad o serología desconocida al
comienzo
del
embarazo:
practicar
examen
serológico.
- Resultado negativo: control mensual.
- IgG estables e IgM – en dos exámenes
sucesivos: inmunidad antigua.
- IgM - y aparición de IgM en el segundo examen:
seroconversión.
- IgG + e IgM +: infección reciente o evolutiva.
3.8.5.1.
Diagnóstico
diferencial:
mononucleosis
infecciosa, enfermedad de Hodgkin, encefalitis virales,
coriorretinitis, miocarditis, meningitis bacterianas. En la
forma
congénita:
neonatal,
congénitas
traumatismo
eritroblastosis
del
sistema
fetal,
obstétrico,
mal
nervioso.
tetania
formaciones
El
examen
radiológico plantea el diagnóstico diferencial de
esclerosis tuberosa, angiomatosis cerebral y tumores
cerebrales calcificados.
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3.8.5.2. Pronóstico: en la forma congénita, la
mortalidad es del 10% y las secuelas pueden ser
graves:
retardo
mental,
trastornos
psicomotores,
coriorretinitis.
3.9. EPIDEMIOLOGÍA
La toxoplasmosis es una zoonosis y es el
protozoario más difundido en el mundo. T. gondii es un
parásito eurixeno, pues capaz de multiplicarse y
desarrollarse en alrededor de 300 especies de
mamíferos y 30 especies de aves. Sin embargo, en su
ciclo sexual demuestra una gran especificidad pues
solo lo cumple en el gato y en especies muy afines.
Esta amplia diseminación se ve facilitada, por la
resistencia de los ooquistes a las condiciones
ambientales, pues permanecen viables e infectantes,
durante casi un año, en suelos húmedos y con
temperatura adecuada.
También la persistencia de los ooquistes tisulares, por
largos periodos de tiempo, en animales que sirven
como alimento, contribuye de manera importante a la
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diseminación. El ser humano se infecta naturalmente,
por ooquistes, quistes, y por vía transplacentaria.
3.9.1. INFECCIÓN POR OOQUISTES
El gato doméstico, y algunos felinos salvajes muy
cercanos son los únicos huéspedes definitivos de T.
gondii y excretan varios millones de ooquistes por día.
Esta excreción es por lo general una sola vez en la
vida del animal, aunque es posible que haya otros
periodos
mucho más cortos de eliminación
por
proceso de reinfección y falla inmunitaria del animal.
Es necesario que el felino no sea inmune y por eso la
producción de ooquistes es posible en animales de
corta edad, menores de 6 meses, cuando el animal no
se aleja del domicilio humano.
Los ooquiste en el ambiente maduran, bajo condición
de humedad, oxigenación y temperatura adecuadas.
Son sensibles a la desecación, putrefacción dentro de
la materia fecal, presencia de bacterias, acción directa
de la luz solar, y temperaturas de extremo frío o calor.
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Las lluvias son fundamentales para la diseminación de
los ooquistes, los liberan de la materia fecal y los
distribuyen en amplias áreas húmedas.
3.9.2. INFECCIÓN POR QUISTES
Los quistes, en las carnes de consumo habitual
humano, resisten el paso por el estómago y liberan
trofozoitos que desencadenan la infección.
Estas
formas evolutivas se destruyen a 60ºC. Las carnes de
cerdo y de oveja son las que mayor porcentaje de
quistes tisulares han demostrado, la carne de vacuno
también está infectada, así como las aves domésticas.
Los quistes permanecen viables hasta 1 mes en
carnes guardadas a 4ºC.
3.9.3. INFECCIÓN TRANSPLACENTARIA
Los trofozoitos son capaces de atravesar la barrera
placentaria llegando a la placenta por vía hematógena.
En primer lugar parasitan las células de la placenta
para luego infectar al feto.
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Esta transmisión puede ocurrir solo si la madre durante
el embarazo adquiere la primo infección. La inmunidad
proporcionada por infecciones pasadas no permite
nuevas parasitemias y en caso de alguna reactivación
de un quiste tisular materno esta parasitemia es
escasa y muy poco probable que pueda causar daño.
La primo infección materna en la mayor parte de los
casos no produce un niño infectado. En otros da lugar
a
aborto,
parto
aparentemente
prematura,
mortinatos
asintomáticos
que
o
niños
desarrollan
problemas neurológicos o visuales más adelante.
3.9.4. PREVALENCIA DE LA INFECCIÓN
No hay prevalecias diferentes en lo que respecta a
sexo o características raciales, en diversas áreas
geográficas varían de manera muy significativa, siendo
la más alta en regiones tropicales donde más del 80%
de los adultos ya han sido infectados. En las regiones
más frías y de montaña el porcentaje oscila entre 20 a
40%. Las tasas se incrementan con la edad y los
cuadros con sintomatología son muy escasos.
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Los estudios de prevalencia son hechos en base a la
titulación
de
anticuerpos
por
diversas
técnicas
serológicas, por la dificultad de aislar el parásito y la
facilidad actual de la ejecución de la serología y el alto
grado de sensibilidad y especificidad alcanzados.
3.9.5.
PREVALENCIA
DE
LA
ENFERMEDAD
CONGÉNITA
El riesgo de la infección congénita es exclusivo
para mujeres nunca infectadas o sero-negativas y
depende de la incidencia anual de la toxoplasmosis en
esa población.
En otros términos se refiere a cuantas nuevas
personas son infectadas cada año en la comunidad y,
por consiguiente, cual es la posibilidad de reunir las
dos condiciones fundamentales de: mujer seronegativa embarazada y la infección en ese momento.
En realidad el riesgo es pequeño y oscila entre 2.4 por
mil a 4 por mil. En términos generales puede admitirse
que a mayor número de mujeres infectadas antes del
embrazo (adolescencia, niñez), menor es el riego de
toxoplasmosis congénita.
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3.10. PREVENCIÓN
La
prevención
de
la
toxoplasmosis
está
encaminada a evitar la infección de la mujer
embarazada y sería aconsejable que los niños y
núbiles se infecten antes de la edad gestacional como
método de prevención.
A las mujeres embarazadas o en edad de quedar
embarazadas debe repetirse: “Evite contraer la
toxoplasmosis, cocine bien la carne y lávese las
manos frecuentemente, evite contacto con gatos y
con tierra”.
La práctica sistemática de serología durante el
transcurso del embarazo es una buena pero muy cara
medida y servirá para detectar las mujeres seronegativas que estarían en peligro de contraer la
infección y aconsejarles en enunciado anterior.
Otras medidas de control a nivel de transmisión por
heces de gato y carnes de animales teóricamente son
posibles, pero en realidad son impracticables. La
búsqueda de una vacuna se hace con la finalidad de
proteger grupos especiales de riesgo como pacientes
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que se someten a trasplantes de órganos y otros con
algún compromiso inmune.
Figura 5. Toxoplasmosis congénita: hidrocefalia, ceguera,
retrazo mental.
3.11. TRATAMIENTO
La toxoplasmosis es sensible a los antifólicos.
3.11.1. Adulto inmunocompetente. Por lo general, el
adulto
inmunocompetente
no
requiere
ningún
tratamiento.
3.11.2. Embarazada. Desde que se diagnostica
toxoplasmosis
(seroconversión),
se
prescribe
tratamiento con espiramicina (3g por día), que se sigue
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sin interrupciones hasta el final del embarazo y se
acompaña de ecografía mensual. En caso de signos
directos y/o indirectos de toxoplasmosis congénita, se
propone a la madre un tratamiento de un mes con la
asociación sulfadoxina + pirimetamina en el curso del
tercer trimestre. Se deben valorar los riesgos para el
feto de este tratamiento respecto del beneficio
potencial de menor riesgo de infección.
La pirimetamina se absorbe por vía oral, penetra bien
en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y bloquea el paso
del ácido fólico o folínico. Es depresor de la médula
ósea y puede ocasionar trombocitopenia y a veces
anemia y leucopenia, por lo que en el transcurso del
tratamiento deben realizarse controles de sangre
periférica 2 veces por semana. Para evitar su efecto
tóxico, puede asociarse ácido fólico por vía oral o
intramuscular.
Es
eficaz
una
combinación
de
pirimetamina y sulfadiacina para inhibir la replicación
de trofozoitos y la posible diseminación durante los
períodos en que se administran corticosteroides. Los
corticoides no están recomendados, pues pueden
favorecer la diseminación de taquizoides o reactivar
focos latentes. Sin embargo, en los casos de
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retinocoroiditis,
en
los
que
los
fenómenos
de
hipersensibilidad son importantes en el desarrollo de
las lesiones, está justificado su empleo Las sulfamidas
impiden la síntesis de ácido fólico. Las más activas
son: la sulfadiacina (existe la mejor experiencia por
parte de los médicos debido a sus buenos resultados y
es la más fácil de encontrar en el mercado); y las
sulfonamidas triples (sulfadiacina, sulfameracina y
sulfametacina). Se comporta de forma sinérgica con la
pirimetamina.
El
sulfixosazol
es
ineficaz.
La
sulfadiacina puede sustituirse por sulfonamidas triples
(triple sulfa).7
La espiramicina es menos tóxica, aunque menos
activa que la pirimetamina. Puede emplearse asociada
con ésta o con las sulfamidas y es el fármaco de
elección para el tratamiento de la toxoplasmosis en el
embarazo.
Desafortunadamente,
no
atraviesa
la
placenta y por lo tanto, no trata al niño. Se puede usar
en el niño recién nacido cuando tiene toxoplasmosis
congénita.
3.11.3. Toxoplasmosis congénita. Sulfadiazina +
pirimetamina durante 20 a 30 días. Los lactantes son
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tratados durante un año con Sulfadiazina todos los
días y pirimitamina cada 2 a 3 días.
3.11.4. TRATAMIENTO PLENO
Para la infección fetal comprobada.
ESQUEMA # 1: Ideal si se dispone de c/u de los
medicamentos:
SULFADIAZINA
+
PIRIMETAMINA
+
ÁCIDO
FOLÍNICO
SULFADIAZINA:
50-
100
mg/K
peso/día
(3
a
4mg/día), fraccionada en 4 dosis /día.
PIRIMETAMINA: 1mg/K/día (máximo 75mg/día).
ACIDO FOLINICO: 5 a 20 mg/día ó
LEVADURA DE CERVEZA: 10 mg/día.
Control semanal del cuadro hemático.
ESQUEMA # 2: Sugerido en caso de intolerancia a
las sulfas:
ESPIRAMICINA O CLINDAMICINA + PIRIMETAMINA
+ ÁCIDO FOLÍNICO
ESPIRAMICINA: 30 M UI VO c/8 horas ó
CLINDAMICINA: 300mg VO c/8 horas
+ PIRIMETAMINA: 25 mg VO c/8 horas
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+ ÁCIDO FOLÍNICO: 10 a 20mg VO c/día.
3
En caso de inmunosupresión. Dosis de ataque de
200mg de pirimetamina, seguida de Sulfadiazina 4 –
6g/día + pirimetamina 50 a 75mg/día durante 4 a 6
semanas (hasta 3 a 6 meses en caso de SIDA). La
administración concomitante de folato de calcio
(15mg/día)
previene
la
anemia
megaloblástica
causada por la pirimetamina.
En caso de alergia a la sulfadiazina, se puede indicar
clindamicina en dosis de 1.200 a 2.400mg/día. Los
corticoides pueden ser útiles para tratar infecciones
inflamatorias y el edema cerebral.
Se deben efectuar hemogramas periódicos para
controlar
la
toxicidad
hematológica
de
la
pirimetamina.13
NOTA: La seudotoxoplasmosis o síndrome de Sabin –
Feldman,
o
toxoplasmosis
seronegativa
es
un
síndrome clínico análogo a la toxoplasmosis con
serología negativa y ausencia de parásitos. Es
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atribuida al virus de la rubéola o a los efectos de
radiaciones ionizantes.
Sólo deben tratarse las infecciones agudas. Tampoco
necesitan tratamiento las formas de linfadenopatía en
personas con capacidad inmunológica.
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CAPITULO IV
Enzimoinmunoensayo (ELISA)
El estudio de los principios aplicados en los
sistemas ELISA fue iniciado durante la década del’ 60
por investigadores que buscaban sustituir las técnicas
de
radioinmunoanálisis,
marcados
con
que
radioisótopos
requieren
y
un
sustratos
instrumento
complicado para contar la emisión radioactiva.
Los sistemas básicos de detección por ELISA
consisten en anticuerpos que están unidos a enzimas
que mantienen la capacidad de catalizar una reacción
cuyo producto final se visualizaba. Por otra parte los
sitios de unión de los anticuerpos permanecen libres
para combinarse con sus respectivos antígenos. El
empleo de enzimas como marcadores tiene varias
ventajas. La enzima que no modifica durante el
proceso puede catalizar la reacción de gran número de
moléculas del sustrato, amplificando la reacción y
aumentando
conjugados
la
posibilidad
de
detección.
con enzimas son muy
Los
estables, a
diferencia de los reactivos, y pueden conservarse
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durante periodos relativamente prolongados. Además,
la formación de un producto final coloreado permite la
observación directa de la reacción o su medición con
un instrumento sencillo.
La mayoría de los sistemas ELISA desarrollados para
la detección de agentes infecciosos consisten en un
anticuerpo contra el agente en cuestión
fijado
firmemente a una matriz sólida, ya sea en la pared
interior de las cavidades de una poli cubeta sobre la
superficie de una esfera plástica o de metal o cualquier
otra matriz sólida. Estos sistemas se denominan
pruebas por inmunoadsorción en fase sólida (SPIA).
Cuando se agrega a la matriz un líquido que contiene
los antígenos correspondientes se forman complejos
estables antígeno-anticuerpo. En estas pruebas son
muy importantes las etapas de lavado para eliminar las
moléculas adsorbidas en forma no específica. Luego
se agrega un segundo anticuerpo contra el antígeno
buscado. Este anticuerpo ha sido fijado a una enzima,
como fosfatasa alcalina o peroxidasa que cataliza una
reacción cuyo producto final es coloreado. Si el
antígeno se ha unido a la matriz sólida, se unirá al
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segundo anticuerpo, formándose un “sandwich” con
el antígeno en el medio. Luego de un lavado para
eliminar el anticuerpo marcado que no ha sido fijado,
se agrega el sustrato correspondiente a la enzima con
lo cual se completa la reacción. El producto final
coloreado aparecerá en todos los puntos donde se
encuentra
la
amplificación
enzima.
de
la
Dada
reacción
la
capacidad
pueden
de
detectarse
cantidades muy pequeñas de antígeno (< 1 ng de
antígeno/ml).
El sistema descrito requiere un anticuerpo específico
marcado con la enzima para cada antígeno que se
desea investigar. Es más simple usar un ensayo
indirecto que emplea un segundo anticuerpo no
marcado que se une al complejo antígeno-anticuerpo
fijado a la matriz. Un tercer anticuerpo, marcado con la
enzima y dirigido contra la porción no variable Fc del
segundo anticuerpo, se emplea entonces como
marcador para la detección de numerosos complejos
antígeno-anticuerpo diferentes.
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La prueba ELISA se basa en varias suposiciones:
•
Que el antígeno o anticuerpo puede enlazarse a una
superficie
portadora
insoluble
y
retener
su
reactividad inmunológica.
•
Que las enzimas tienen actividad específica alta y
convierten una cantidad relativamente grande del
sustrato en producto detectable (relacionado con la
amplificación de señal), lo que permite detectar
concentraciones muy bajas del ligando.
•
Que
la
actividad
enzimática
o
reactividad
inmunológica de los conjugados se preserva y
permanece
estable
durante
el
análisis
y
el
almacenamiento y
•
Que las enzimas no están presentes en el líquido
biológico que se va a analizar.
4.1. REACTIVOS
Los anticuerpos que se emplean en el método
ELISA son de origen monoclonal o son anticuerpos
policlonales que se suministran como antisuero no
fraccionado
o
fracciones
de
inmunoglobulina
purificada. Los anticuerpos pueden ser solubles o estar
inmóviles sobre un soporte sólido. Se emplean como
conjugados no marcados o enzimáticos y por último
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reaccionan con determinante antigénico específico de
un antígeno o con un anticuerpo ligando-específico
(anticuerpo primario), según el protocolo de análisis.
Los estándares y controles son material liofilizado de
origen humano, azida de sodio y determinada
concentración de antígeno.
Los conjugados enzimáticos son antígenos o
anticuerpos unidos en forma covalente a la enzima de
elección. El reactivo que se forma por enlace covalente
de dos moléculas se denomina conjugado. También
es posible marcar en forma no covalente anticuerpos o
enzimas con biotina y agregar avidina. La avidina
posee cuatro sitios de enlace para la biotina y no todos
ellos participan en la interacción con el anticuerpo
marcado con biotina. Los sitios de enlace libres
restantes funcionan como aceptores para la enzima
marcada con biotina. Este procedimiento se acorta
utilizando anticuerpo marcado con biotina y avidina
marcada con enzima.
Se
utilizan
soluciones
amortiguadoras
para
mantener el pH de la reacción y la concentración
iónica, para diluir las muestras o como diluyente para
reconstruir los reactivos liofilizados para el análisis.
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Las combinaciones de enzima y sustrato que se
emplean en los diversos métodos ELISA incluyen:
•
Peroxidasa de rábano y su sustrato, peróxido de
hidrógeno, que en presencia de cromógeno ofenilendiamina producen un producto color amarillonaranja medible.
•
Galactosidasa beta y su sustrato o-nitrofenil-beta-D
galactopiranósido que se transforma en un producto
nitrofenolado amarillento medible o,
•
Fosfatasa alcalina y su sustrato p-nitrofenilfósfato
que también se transforma en nitrofenolato.
•
El reactivo ácido sulfúrico 1-N, se utiliza para inhibir
la actividad enzimática y estabilizar el producto final
de reacción que tiene color.
4.2. ENSAYOS DE ENLACE COMPETITIVO
Para detectar antígenos o haptenos con frecuencia
se utiliza una reacción ELISA de enlace competitivo en
fase sólida. En este tipo de análisis, el ligando no
marcado compite con un ligando conjugado con
enzimas por un número limitado de sitios de enlace
con el anticuerpo inmovilizado. Tras una incubación
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breve, se procede a separar el ligando enzimático
conjugado enlazado y libre mediante la técnica de
separación en fase sólida. Se agrega sustrato y la
enzima presente en la fracción enlazada transforma el
sustrato en un producto coloreado. La cantidad de
producto que se forma se relaciona de manera inversa
con la concentración del ligando no marcado en la
muestra
problema.
estándares,
controles
Las
y
absorbancias
muestras
de
problema
los
se
determinan con un espectrofotómetro calibrado a la
longitud de onda adecuada, en el lapso de dos horas
que sigue a la adición del reactivo para detener la
reacción. Las celdas de referencia que contienen
únicamente ligando conjugado con enzima muestran
mayor grado de color. La reducción de color en las
celdas es proporcional a la cantidad de antígeno
presente en los estándares, controles y muestras
problema.
La curva estándar se obtiene graficando en papel
milimétrico el valor de la absorbancia promedio de
cada conjunto de estándares por duplicado en el eje y,
contra la concentración de antígeno que contiene cada
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estándar en el eje x. El resultado es una línea recta. La
concentración de antígeno en los controles y las
muestras problema que se corrieron simultáneamente
con los estándares se determina a partir de la curva
estándar
utilizando
los
valores
promedio
de
absorbancia de las muestras por duplicado. Para
determinar la concentración del control y de la muestra
problema, se localiza la absorbancia promedio en el
eje y de la curva estándar y se lee la concentración
correspondiente en el eje x.
Para detectar anticuerpos se utiliza el método ELISA
de inhibición competitiva. En este tipo de análisis, el
anticuerpo no marcado en la muestra problema
compite con una concentración fija de anticuerpo
conjugado-enzima para enlazarse a una cantidad
limitada de antígeno inmovilizado sobre un soporte
sólido. Después de la incubación, el material que no se
enlaza se retira mediante lavado. Se añade el sustrato
enzimático y tras incubar para que ocurra el cambio de
color, se detiene la reacción enzimática añadiendo un
reactivo. La actividad enzimática se reduce en
presencia del anticuerpo de la muestra problema de
manera que dentro del rango de detección del análisis
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mientras mayor sea la concentración de anticuerpo,
menor será la absorbancia de la muestra.
4.3. ENSAYOS NO COMPETITIVOS
Los
ensayos
inmunoenzimétricos
(IEMA),
que
también se denominan técnica del emparedado, son
los métodos ELISA más empleados para detectar
antígenos que tienen por lo menos dos determinantes
antigénicos. Se adsorbe un exceso de anticuerpo
específico
para
anticuerpos
el
antígeno
monoclonales)
(con
sobre
frecuencia
perlas
de
poliestireno. Estos anticuerpos son específicos para un
solo determinante antigénico en el antígeno de interés.
Se incuban soluciones de la muestra problema con las
perlas recubiertas de anticuerpo, de manera que todo
el antígeno presente en la muestra problema se enlace
con el anticuerpo inmóvil. Tras retirar el material que
no se enlaza, la cantidad de antígeno que se enlazó
con
el
anticuerpo
anticuerpo
segundo
se
cuantifica
conjugado-enzima,
determinante
que
antigénico
añadiendo
un
reconoce
un
en
el
mismo
antígeno. Después de la segunda incubación y el paso
de separación, la actividad restante asociada con el
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emparedado se determina añadiendo sustrato. La
formación de producto se relaciona directamente con
la cantidad de antígeno en los estándares, controles y
muestras problema. Si el segundo anticuerpo es
monoclonal pueden añadirse anticuerpos reactivos
simultáneamente y sólo se requiere un paso de lavado.
El cambio de color es proporcional a la cantidad de
antígeno en la solución de prueba. La curva estándar
se obtiene graficando en papel milimétrico el valor de
absorbancia
por
medio
de
cada
conjunto
de
estándares por duplicado, contra la concentración de
antígeno que contiene cada estándar. El resultado es
una línea recta. Las concentraciones de antígeno en el
control y la muestra problema corridas por duplicado
en forma simultánea con los estándares se definen a
partir de la curva utilizando los valores de absorbancia
promedio. La fosfatasa alcalina es la enzima de
elección, ya que cataliza un solo paso de hidrólisis y se
obtiene una curva de respuesta enzimática lineal.
4.4. APLICACIONES DE LABORATORIO
Existen
métodos
ELISA
disponibles
para
medir
antígeno relacionado con el factor VIII, marcadores de
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tumores, antígeno carcinoembriónico, fetoproteínas
alfa, gonadotropina coriónica humana y anticuerpos
(IgG e IgM) que produce el huésped como respuesta a
diversas infecciones virales. Durante la última década,
los análisis ELISA en fase sólida han constituido el
método estándar para detectar anticuerpos al virus de
inmunodeficiencia humana (HIV) (Electronucleonics
Inc., o Biotech Laboratories, Rockville MD) y las
muestras que presentan reactividad repetida se
confirman
mediante
Recientemente
se
la
prueba
desarrolló
un
Westem
método
blot.
ELISA
(Dupont Corporation, Wilmington DE) para detectar
antígenos
al
HIV
en
suero,
plasma
y
líquido
cefalorraquídeo, pero no es tan sensible como los
demás métodos ELISA. Además de antígenos al HIV,
se determinan otros antígenos virales con la prueba
ELISA. La tendencia actual en detección de antígenos
es utilizar anticuerpos monoclonales para identificar
antígenos virales específicos, ya que estos anticuerpos
se generan con más facilidad ante las proteínas virales
de bajo peso molecular. Con frecuencia los métodos
IEMA emplean anticuerpos monoclonales y permiten la
detección de antígeno carcinoembriónico, fétoproteína
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alfa,
creatincinasa
isoenzima
(CK-MB),
ferritina,
hormona foliculoestimulante, gonadotropina coriónica
humana,
IgE,
hormona
luteinizante,
prolactina,
fosfatasa del ácido prostático, antígeno específico para
próstata y hormona estimulante de la tiroides.
4.5. MUESTRA:
La población estudiada corresponde a un número de
100 alumnas de la Escuela de Bioquímica y Farmacia
de la Universidad de Cuenca, con un rango de edad
comprendido entre los 17 a 26 años de los ciclos
comprendidos entre primero y décimo; en estas se
realizó un proceso de selección mediante una
encuesta
(ANEXOS),
luego
de
revisar
dichas
encuestas se prefirieron las alumnas con las siguientes
características:
Características de inclusión:
• Tener mascotas dentro de la casa especialmente
gatos y pájaros.
• Convivencia cercana con estos animales.
• En las alumnas en estado de gestación.
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• La presencia de algún caso de toxoplasmosis en
la familia.
Luego de tomar en cuenta estos criterios se acudió a
las alumnas seleccionadas y se les informo de la
posibilidad de presentar toxoplasmosis y de la
importancia del examen, dando a conocer a las
mismas que el examen no era obligatorio.
A las alumnas que decidieron realizarse el examen, la
toma de la muestra fue de la siguiente manera:
• Para realizar la toma de muestra se inició por
primer ciclo, tomando en el día muestras a dos
ciclos consecutivos, para evitar errores.
• La toma se realizó en las primeras horas de la
mañana
en
el
Análisis
Clínico,
previo
consentimiento de la doctora a cargo del
laboratorio.
• Paciente en ayunas, se toma 5ml de sangre
cantidad suficiente para extraer la cantidad
requerida de suero, dado que para cada
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determinación necesitamos 10µl como la prueba
se realizó por duplicado se necesito 20µl.
• Luego se procedió a congelar los sueros
previamente etiquetados.
• Se informó a las pacientes el tiempo de
realización de la prueba y que posteriormente se
les entregaría el resultado.
4.6. ENSAYO:
ELISA SÁNDWICH PARA LA DETECCIÓN DE
ANTICUERPOS IgG ANTI-TOXOPLASMA GONDII
EN SUERO HUMANO
4.6.1. PRINCIPIO: La prueba HUMAN ELISA TOXO IgG
está
basada
en
la
clásica
técnica
ELISA.
Los
micropocillos ELISA son recubiertos con antígenos de
Toxoplasma
preparados
con
parásitos
sonicados
Toxoplasma gondii (taquizoítos). En la primera etapa de
incubación, los anticuerpos anti-TOXO contenidos en la
prueba o el control se fijan específicamente a los
antígenos inmovilizados. Al final de la incubación, los
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componentes excesivos son eliminados por lavado. En la
segunda etapa de incubación, se añade un conjugado
anti-IgG (anticuerpos anti-IgG-humana, marcados con
peroxidasa) que se fija específicamente a los anticuerpos
IgG. Se forman inmunocomplejos típicos.
Después de eliminar el conjugado excesivo por lavado
(segunda etapa de lavado) y añadir TMB/Sustrato (etapa
tres), se forma un color azul que se transforma a amarillo
después de parar la reacción. La intensidad de este color
es
directamente
proporcional
a
la
cantidad
de
anticuerpos anti-TOXO IgG en la muestra.
4.6.2. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
La extinción de los colores y muestras se determina
haciendo uso de un lector de micropocillos ELISA. Los
resultados de los pacientes se obtienen por comparación
con un valor de punto de corte (cut-off value) o por
estimación cuantitativa en Unidades Internacionales por
mililitro (UI/ml) basándose en una curva de calibración
construida con el valor de control de punto de corte y tres
controles positivos.
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4.6.3. REACTIVOS Y CONTENIDOS:
• Micropocillos en porta tiras.
• Tiras de ocho micropocillos cada uno, recubiertas
con antígenos sonicados de T. gondii
• Control TOXO IgG negativo.
• Control TOXO IgG cut-off: 5UI/ml.
• Control TOXO IgG positivo bajo: 30 UI/ml.
• Control TOXO IgG positivo medio: 100 UI/ml.
• Control TOXO IgG positivo alto: 200 UI/ml.
• Buffer de dilución IgG:
pH 6.5 +/- 0.2
Buffer Fosfato…………………………….. 10 mmol/l.
Cloruro de sodio…………………………….... 8 g/l.
Albúmina…………………………………….. 10 g/l.
• Conjugado anti IgG
Anti-IgG-Humano,
marcado
con
peroxidasa
(conejo).
• Solución de lavado.
Buffer TRIS pH 7.2 +/-* 0.2
• Reactivo substrato pH 3.7 +/- 0.2
3,3’, 5,5’-Tetrametilbenzidina (TMB)…. 1.2 mmol/l
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Peróxido de Hidrógeno………………….
3 mmol/l.
• Solución de parada
Ácido Sulfúrico…………………………... 0.5 mmol/l.
• Cintas adhesivas.
4.6.4. PREPARACIÓN DE REACTIVOS:
• Solución de lavado de trabajo: diluir 1 porción de
solución de lavado con 20 porciones de agua
desyonizada fresca. Ejm., 50ml de solución de
lavado más 1.000ml de agua igual 1.050ml.
• Muestra: diluir el suero del paciente 1 + 100 con
buffer de dilución IgG. Por ejemplo 10µl de suero +
1ml de buffer de dilución y mezclar vigorosamente.
4.6.5. PROCEDIMIENTO:
4.6.5.1. ETAPA 1:
• Dejar el pocillo A1 para el blanco.
• Pipetear 100µl de control cut-off 5UI/ml en B1/C1.
• Pipetear 100µl de control positivo bajo 30UI/ml en
D1/E1.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
98
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
• Pipetear 100µl de control positivo medio 100UI/ml
en F1/G1.
• Pipetear 100µl de control positivo alto 200UI/ml
en H1/A2.
• Pipetear 100µl de control negativo en B2/C2.
• Pipetear las muestras diluidas desde D2 en
adelante por duplicado.
• Cubrir con cintas adhesivas.
• Incubar por 30’ a temperatura ambiente.
• Lavar 4 veces como se describe a continuación:
- Remover las cintas adhesivas. Aspirar el
contenido (en un envase con una Solución de
Hipoclorito de Sodio al 5%).
- Agregar 350ml de la solución de lavado de
trabajo, aspirar después de aproximadamente 30
segundos y repetir el lavado 4 veces.
4.6.5.2. ETAPA 2:
• Adicionar 100µl de conjugado Anti-IgG a todos
los pocillo excepto al blanco A1.
• Cubrir con cintas adhesivas.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
99
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
• Incubar por 30’ a temperatura ambiente.
• Lavar 5 veces como se describe en la etapa 1.
4.6.5.3. ETAPA 3:
• Adicionar 100µl de substrato a todos los posillos
incluyendo el blanco.
• Incubar por 15’ a temperatura ambiente, en la
oscuridad.
• Detener la reacción enzimática adicionando 100µl
de la solución de parada a todos los pocillos.
• Mezclar cuidadosamente.
• Leer la absorbancia a 450nm, llevando a cero de
absorbancia el instrumento lector de ELISA con el
blanco de sustrato del pocillo A1.
4.6.6. CÁLCULO DE VALORES DE CONTROL Y
PUNTO DE CORTE:
Valores promedio de absorbancia tanto de los
controles como del punto de corte.
MCC = A450 (B1) + A450 (C1)
2
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
100
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ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
MCC: Media del punto de corto.
A450: Absorbancia a 450nm
4.6.7. VALIDACIÓN DELA PRUEBA:
La serie analítica puede considerarse válida si
cumple con los siguientes criterios:
• Blanco sustrato en pocillo A1 < 0.150.
• La media del control negativo < a la media del
cut-off.
• La media del control positivo medio > 0.750.
• La media del control positivo medio / la media del
punto de corte > 5.
4.6.8 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
4.6.8.1. CUALITATIVA:
• Muestras con valores de absorbancia mayores o
igual al cut-off son consideradas positivas.
• Muestras con valores de absorbancia menores al
cut-off son consideradas negativas.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
101
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ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
4.6.8.2. CUANTITATIVA:
Para una estimación cuantitativa de los niveles de
anticuerpos Anti-Toxoplasma IgG en muestras
positivas UI/ml, el valor de el punto de corte y los
controles se grafica en las ordenadas, este se
grafica
contra
sus
correspondientes
concentraciones de Anti-T. gondii IgG de 5, 30, 100
y 200UI/ml en las absisas.
La estimación de los niveles de anticuerpos de los
pacientes se lee en el gráfico utilizando los valores
individuales de absorbancia de las muestras.
- Pacientes con valor mayor a 200 UI/ml deben
ser reanalizadas con una dilución mayor antes de
proceder definitivamente al cálculo del nivel de
anticuerpos.
1
2
3
A
Blanco200
M3
B
5UI
Neg.
M4
C
5UI
Neg.
M4
D
30
M1
etc.…
E
30
M1
F
100
M2
G
100
M2
H
2OO
M3
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
4
5
6
7
8
9
10
11
12
102
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ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
NOTA: M1…: muestra 1
M2…: muestra 2...
4.6.9. VALORES DE REFERENCIA:
Se considera que una prueba de ELISA con un valor
menor del punto de corte es negativa; con un valor mayor
al punto de corte es positiva.
Un valor de hasta 300UI/ml indica infección pasada o en
evolución, y más de 300 UI/ml se refiere a enfermedad
activa o reciente.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
103
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
CAPITULO V
RESULTADOS
Curva Nº 1/set Nº 1
Blanco= 0.071
Greyzone= 0.150
Cutt-off=
STD 1 (1) + DTD 1 (2) = 0.213 + 0.207
= 0.210
2
2
Estandares
Absorbancia
450 nm
Promedio
absorbancia
Desviación
estándar
1. CC: Cuttoff
2. PCL
0.213
0.207
0.473
0.487
1.127
1.115
2.183
2.175
0.210
3. PCM
4. PCH
Concentración
UI/ml
0.004
Coeficiente
de variación
%
1.905
0.480
0.010
2.083
30
1.121
0.008
0.713
100
2.179
0.007
0.321
200
Coeficiente
de variación
%
0.054
Concentración
UI/ml
Control
Absorbancia
450 nm
Promedio
absorbancia
Desviación
estándar
Control
negativo
0.201
0.201
0.201
0.000
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
5
________
104
UNIVERSIDAD DE CUENCA
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ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
Paciente
Edad
Ciclo
20
1
20
1
19
1
20
1
19
1
20
1
17
1
19
1
18
1
23
9
19
2
18
2
18
2
19
2
19
2
18
2
19
2
19
2
20
2
21
4
20
4
20
4
19
4
21
4
1. Doris Saquisilí
2. María Cristina Torres
3. Maritza Tacuri
4. Janneth Campusano
5. Anita Bueno
6. Martha Amaya
7. Teresa Apuparo
8. Stephanie Cárdenas
9. Paulina Sánchez
10. Johann Guevara
11. Adriana Jara
12. Marcia Ávila
13. Veronica Maldonado
14. Sienna Peralta
15. Diana Juca
16. Adriana Perez
17. Johana Enriquez
18. Cristina Perez
19. Esthela Mora
20. Mayra García
21. Karla Ruiz
22. Tatina Becerra
23. Lucrecia Brito
24. Gabriela Zambrano
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
Abs.
450 nm
Media
Abs.
D. S.
C. V. %
Concent.
(UI/ml)
1.346
1.447
0.418
0.392
Fuera de
curva
0.200
0.186
0.660
0.684
0.873
0.791
0.572
0.498
0.435
0.416
1.396
0.072
5.142
123
0.405
0.018
4.444
25.5
______
______
_______
___________
0.193
0.009
5.181
5
0.672
0.017
2.529
52
0.832
0.058
6.973
67.5
0.535
0.053
9.906
38.5
0.427
0.015
3.513
28
0.302
0.025
8.568
15.5
0.281
0.015
5.265
13.5
0.336
0.011
3.274
19
0.122
0.009
7.226
0
0.277
0.008
2.889
14
0.206
0.009
4.133
6
0.400
0.001
0.141
25
0.181
0.011
6.077
3.5
0.295
0.012
4.067
9.5
0.198
0.007
3.535
5.5
0.159
0.007
4.133
0
0.204
0.020
9.804
5
______
______
_______
___________
0.409
0.012
2.934
26.5
0.494
0.047
5.515
34
0.901
0.015
1.665
74.5
0.320
0.283
0.270
0.291
0.344
0.328
0.114
0.126
0.383
0.271
0.212
0.200
0.401
0.400
0.189
0.173
0.304
0.286
0.203
0.193
0.155
0.164
0.218
0.190
Fuera de
curva
0.418
0.400
0.527
0.461
0.911
0.890
105
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
25. Cecilia Durán
26. Diana Carpio
27. Johanna Inga
28. María Montaleza
29. Andrea Cabrera
30. Digna Sarmiento
31. Mónica Narváez
32. Soledad Yanque
33. Wilma Taxi
34. Sandra Chávez
35. Verónica Zapata
36. Diana Tapia
20
4
19
4
21
4
19
4
20
4
20
4
20
4
20
4
19
4
21
4
20
4
19
4
Fuera de
curva
0.564
0.584
Fuera de
curva
Fuera de
curva
0.252
0.264
1.290
1.387
0.292
0.299
0.349
0.335
0.423
0.439
1.170
1.090
0.360
0.331
0.398
0.342
______
______
_______
___________
0.574
0.014
2.939
42
______
______
_______
___________
______
______
_______
___________
0.258
0.008
3.101
11.5
1.339
0.069
5.141
117
0.296
0.005
1.689
14.5
0.342
0.009
2.631
19
0.431
0.011
2.552
28.5
1.130
0.057
5.022
97
0.345
0.021
5.958
20
0.370
0.040
10.811
22.5
ABSORBANCIA
Media
Error típico
Mediana
Moda
Desviación estándar
Varianza de la muestra
Curtosis
Coeficiente de asimetría
Rango
Mínimo
Máximo
Suma
Cuenta
Nivel de confianza (95.0%)
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
0,4616129
0,05952332
0,345
#N/A
0,3314118
0,10983378
2,29927864
1,69897746
1,274
0,122
1,396
14,31
31
0,1215627
UI
31,0645161
5,8572968
20
5
32,6120484
1063,5457
2,26716494
1,69359729
123
0
123
963
31
11,9621836
106
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
HISTOGRAMA DE ABSORBANCIAS
Clase
Frecuencia
Clase
Frecuencia
0,122
0,3768
0,6316
0,8864
1,1412
Y mayor...
1
16
8
2
2
2
0,3768
0,6316
0,8864
1,1412
Y mayor...
0,122
16
8
2
2
2
1
Frecuencia
Lectura de absorbancia
20
15
10
5
0
Frecuencia
0,3768
0,6316
0,8864
1,1412
y
mayor...
0,122
Absorbancia
Se observa mayor incidencia de las lecturas de
absorbancia en la clase 0.3768 seguido de la clase
0.6316 lo que indica que en estas clases esta la mayor
concentración de muestras.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
107
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
HISTOGRAMA DE UNIDADES INTERNACIONALES
Clase
Frecuencia
Clase
Frecuencia
0
24,6
49,2
73,8
98,4
y mayor...
2
15
8
2
2
2
24,6
49,2
0
73,8
98,4
Y mayor...
15
8
2
2
2
2
20
15
10
5
0
y
mayor...
98,4
73,8
49,2
0
Frecuencia
24,6
Frecuencia
Título de Anticuerpos
UI/ml
Este Histograma es equivalente al primero, este
representa
el
observándose
título
al
de
igual
Anticuerpos
que
el
en
anterior
UI/ml
mayor
concentración de las muestras en las dos primeras
clases.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
108
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
Curva Nº 2/set Nº 2
Blanco: 0.067
Grey zone=
0.150
Cutt-off= STD 1 (1) + DTD 1 (2) = 0.323 + 0.339 = 0.331
2
2
Estándares Absorbancia
Promedio
Desviación
450 nm
absorbancia
estándar
1. CC:
Cutt-off
2. PCL
3. PCM
4. PCH
0.323
0.339
0.490
0.510
1.199
1.237
2.153
2.073
0.331
0.011
Coeficiente
de variación
%
3.323
0.500
0.014
2.8
30
1.218
0.027
2.216
100
2.113
0.056
2.628
200
Coeficiente
de variación
%
18.412
Concentración
UI/ml
Control
Absorbancia
450 nm
Promedio
absorbancia
Desviación
estandár
Control
negativo
0.066
0.086
0.076
0.014
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
Concentración
UI/ml
5
_________
109
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
Paciente
3. Maritza Tacuri
Edad
Ciclo
19
1
20
4
20
4
20
4
20
4
20
4
19
4
19
4
19
4
19
4
19
4
22
4
21
4
26
6
23
6
25
6
22
6
21
6
22
6
21
6
21
6
22
6
21
6
20
6
22
22
6
6
21. Karla Ruíz
25. Cecilia Durán
27. Johana Inga
28. María Montaleza
37. Gabriela Valarezo
38. Karina Ulloa
39. Priscila Sánchez
39. Priscila Sánchez
40. Gabriela Astudillo
41. Diana Ávila
42. Noemí Cabrera
43. Julia González
44. Jessica Vega
45. Gabriela Ortega
46. Ruth Muñoz
47.Yenny Zhiña
48. María Guamán
49. Mayra Pesántez
50. Maritza Lamuelle
50. Maritza Lamuelle
51. Jenny Morocho
52. Mónica León
53. Yessica León
54. Gabriela Rodas
55. Cecibel Idrovo
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
Abs
450 nm
1.325
1.194
0.723
0.637
0.654
0.610
Media
Abs.
1.260
D.S.
C.V%
0.093
7.348
0.680
0.061
8.971
0.632
0.031
4.906
1.485
1.443
0.551
0.577
0.261
0.244
1.520
1.699
Fuera de
curva
1.368
1.314
0.416
0.418
0.167
0.157
0.699
0.683
0.551
0.575
0.505
0.475
0.480
0.468
0.217
0.201
0.351
0.305
0.626
0.648
0.614
0.531
Fuera de
curva
1.376
1.444
1.913
2.001
1.299
1.383
1.232
1.186
1.813
1.797
0.386
0.490
0.029
1.981
0.564
0.018
3.191
0.253
0.012
4.743
32X4=128
(dilución ¼)
39X3=117
(dilución 1/3)
7
1.609
0.126
7.831
148
______
______
___________
1.341
0.038
______
_
3.580
0.417
0.001
0.291
121X2=242
(dilución ½)
25
0.163
0.008
4.908
0
1.690
0.012
0.725
156.5
0.563
0.016
2.841
39
0.490
0.021
4.294
32
0.477
0.012
2.515
31
0.209
0.011
5.263
3
0.328
0.033
15.5
0.637
0.015
10.06
1
2.354
0.573
0.059
40.5
______
______
1.410
0.048
10.30
0
______
_
3.404
1.957
0.062
3.168
128X2=256
(dilución ½)
185
1.341
0.059
4.400
120
1.209
0.033
2.729
107
1.805
0.011
0.609
168.5
0.367
0.027
7.357
20
Concent.
UI/ml
112X2=224
(dilución ½)
52X3=156
(dilución ½)
47X3=141
(dilución 1/3)
47
___________
110
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
56. Nube Tenezaca
57. Cecilia Tapia
10.60
6
2.333
55
31.5
0.101
11.33
1
10.94
5
6.352
146.5
0.262
0.013
4.961
8.5
0.289
0.039
11.5
0.256
0.011
13.61
4
4.296
1.313
0.034
2.589
117
0.208
0.008
3.486
3
0.710
0.075
0.687
0.016
0.485
0.055
3
0.698
0.676
0.446
0.523
0.994
0.109
20
3
1.071
0.917
3
20
3
1.667
1.523
0.271
0.253
0.261
0.317
1.595
20
0.248
0.264
1.289
1.337
0.202
0.214
21
6
24
6
58. María Luzuriaga
20
59. Mónica Matute
60. María Guachi
61. Patricia Coronel
0.348
0.763
0.657
62. Magali Chunchi
20
3
20
3
20
3
63. Sandra Fajardo
64. Eliana Baculima
65. Ana Carrión
22
5
ABSORBANCIA
Media
Error típico
Mediana
Moda
Desviación estándar
Varianza de la muestra
Curtosis
Coeficiente de asimetría
Rango
Mínimo
Máximo
Suma
Cuenta
Nivel de confianza (95.0%)
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
0,80188235
0,09212148
0,6025
0,49
0,53715591
0,28853647
-0,8526803
0,70513921
1,794
0,163
1,957
27,264
34
0,18742271
53
84
8
UI
86,0882353
12,9938192
54
117
75,7663344
5740,53743
-0,63277653
0,66779681
256
0
256
2927
34
26,4361448
111
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
HISTOGRAMA DE ABSORBANCIAS
Clase
Frecuencia
Clase
Frecuencia
0,163
0,5218
0,8806
1,2394
1,5982
y mayor...
1
13
8
2
6
4
0,5218
0,8806
1,5982
Y mayor...
1,2394
0,163
13
8
6
4
2
1
15
10
5
0
0,163
1,2394
y
mayor...
1,5982
0,8806
Frecuencia
0,5218
Frecuencia
Lectura de absorbancia
Absorbancia
Se observa mayor incidencia de las lecturas de
absorbancia en la clase 0.5218 seguido de la clase
0.8806 lo que indica que en estas clases esta la mayor
concentración de muestras.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
112
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
HISTOGRAMA DE UNIDADES INTERNACIONALES
Clase
Frecuencia
Clase
Frecuencia
0
51,2
102,4
153,6
204,8
Y mayor...
1
15
3
8
4
3
51,2
153,6
204,8
102,4
Y mayor...
0
15
8
4
3
3
1
20
15
10
5
0
0
y
mayor...
102,4
204,8
153,6
Frecuencia
51,2
Frecuencia
Título de anticuerpos
UI/ml
Este Histograma es equivalente al primero, representa
el título de Anticuerpos en UI/ml observándose de igual
que el anterior mayor concentración de las muestras
en las dos primeras clases.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
113
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
Curva Nº 3/set Nº 3
Blanco=
0.070
Greyzone=
Cutt-off=
0.150
STD 1 (1) + DTD 1 (2) = 0.217 + 0.205 = 0.211
2
2
Estandares
Absorbancia
450 nm
Promedio
absorbancia
Desviació
n estandár
1. CC: Cuttoff
2. PCL
0.217
0.205
0.436
0.404
1.082
1.158
2.159
2.073
0.211
3. PCM
4. PCH
Concentración
UI/ml
0.008
Coeficiente
de variación
%
3.791
0.420
0.023
5.467
30
1.120
0.054
4.821
100
2.116
0.056
2.628
200
Coeficiente
de variación
%
0.005
Concentración
UI/ml
Control
Absorbancia
450 nm
Promedio
absorbancia
Desviación
estandár
Control
negativo
0.206
0.205
0.205
0.001
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
5
________
114
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
Paciente
Edad
Ciclo
21
5
20
5
20
5
21
5
23
5
21
5
21
21
5
5
21
5
21
8
22
8
22
8
23
8
22
8
22
8
21
8
22
8
22
7
23
7
22
7
22
7
24
9
23
9
23
9
66. Cinthya Bravo
67. Carmen Ortega
68. Mayra Castro
69. Viviana Arévalo
70. Diana Deleg
71. Lourdes Ramón
72. Silvia Torres
73. Silvana Álvarez
74. Yessica Portillo
75. Margarita Esquivel
76. Fanny Gonzales
77.Yomaira Gutiérrez
78. Lourdes Pacheco
79. Veronica Trelles
80. Sandra Banegas
81. Yessica Nieto
82. Ines Baculima
83. Elizabeth C
84. Monica Pardo
85. Tania Zavala
86. Magali Obano
87. Fanny Zaruma
88. Verónica Espinoza
89. Eulalia Tenezaca
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
Abs
450 nm
Media
Abs.
D.S.
C.V. %
Concent.
UI/ml
0.176
0.252
0.301
0.379
0.198
0.197
0.281
0.199
1.391
1.491
0.441
0.479
0.146
0.135
0.428
0.323
0.089
0.121
0.251
0.211
1.490
1.650
0.214
0.054
18.126
4.5
0.340
0.055
16.167
18
0.197
0.001
0.508
3
0.240
0.058
24.167
7.5
1.441
0.071
4.927
131
0.460
0.026
5.740
30
0.141
0.008
5.607
0
0.376
0.074
19.730
21
0.105
0.023
21.905
0
0.231
0.028
12.121
6.5
1.570
0.113
7.197
145X2=290
(dilución ½)
0.269
0.209
0.381
0.507
0.224
0.141
1.519
1.405
0.227
0.182
0.306
0.308
1.381
1.426
0.091
0.142
0.123
0.111
1.141
1.070
0.237
0.211
0.085
0.083
0.114
0.098
0.239
0.042
17.792
7
0.444
0.090
20.270
28
0.183
0.059
32.384
1
1.462
0.081
5.515
133.5
0.229
0.067
29.200
6.5
0.307
0.001
0.406
15
1.402
0.030
2.140
0.116
0.036
31.129
127X2=254
(dilución ½)
0
0.117
0.008
6.981
0
1.105
0.050
4.482
96.5
0.224
0.018
8.036
5.5
0.084
0.001
1.430
0
0.106
0.011
10.406
0
115
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
90. Karina Ormaza
91. Lady Gavilanez
92. María Cherrez
93. Janeth Campoverde
94. Fanny Gonzales
95. Monica Valarezo
96. Malena Iñiguez
97. Adriana Bermeo
98. Lorena Bravo
99. Diana Criollo
100. Malena Matamoros
23
9
22
9
22
7
24
7
20
3
23
7
20
3
25
9
23
10
22
7
26
10
0.140
0.112
0.175
0.151
0.128
0.137
0.102
0.080
0.267
0.257
0.104
0.073
0.072
0.078
0.238
0.195
1.746
1.848
0.141
0.092
0.206
0.180
0.126
0.020
15.874
0
0.163
0.017
10.429
0
0.132
0.006
4.676
0
0.091
0.016
17.582
0
0.262
0.008
2.876
10
0.088
0.022
24.609
0
0.075
0.004
5.610
0
0.216
0.030
13.994
5
1.797
0.072
4.007
168
0.117
0.035
29.613
0
0.193
0.018
9.326
2
ABSORBANCIA
Media
Error típico
Mediana
Moda
Desviación estándar
Varianza de la muestra
Curtosis
Coeficiente de asimetría
Rango
Mínimo
Máximo
Suma
Cuenta
Nivel de confianza (95.0%)
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
0,41694286
0,08443122
0,216
0,117
0,49950181
0,24950206
1,7821728
1,80125785
1,722
0,075
1,797
14,593
35
0,17158476
UI
35,5285714
12,2991074
5
0
72,7625007
5294,38151
5,47850043
2,45823172
290
0
290
1243,5
35
24,9947771
116
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
HISTOGRAMA DE ABSORBANCIAS
Clase
Frecuencia
Clase
Frecuencia
0,075
0,4194
0,7638
1,1082
1,4526
Y mayor...
1
26
2
1
2
3
0,4194
Y mayor...
0,7638
1,4526
0,075
1,1082
26
3
2
2
1
1
Frecuencia
Lectura de absorbancia
30
20
10
0
Frecuencia
0,4194
y
0,7638
mayor...
1,4526
0,075
1,1082
Absorbancia
Se observa mayor incidencia de las lecturas de
absorbancia en la clase 0.4194 lo que indica que esta
clase es la de mayor concentración de muestras.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
117
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
HISTOGRAMA DE UNIDADES INTERNACIONALES
Clase
Frecuencia
Clase
Frecuencia
0
58
116
174
232
Y mayor...
13
16
1
3
0
2
58
0
174
Y mayor...
116
232
16
13
3
2
1
0
Frecuencia
Título de anticuerpos
20
15
10
5
0
Frecuencia
58
0
174
y
mayor...
116
232
UI/ml
Este Histograma es equivalente al primero, representa
el título de Anticuerpos en UI/ml observándose de igual
que el anterior mayor concentración de la muestra en
la primera clase.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
118
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
PRUEBA F PARA VARIANZAS DE DOS MUESTRAS
CURVAS DE CALIBRACION: 1-2 (ABSORBANCIAS)
Prueba F para varianzas de dos muestras
Media
Varianza
Observaciones
Grados de libertad
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F
(una cola)
CURVA 1
0,8382
0,7016717
5
4
1,03130096
0,48844393
CURVA 2
0,8476
0,6803753
5
4
6,38823394
CURVAS DE CALIBRACION: 2-3 (ABSORBANCIAS)
Prueba F para varianzas de dos muestras
Media
Varianza
Observaciones
Grados de libertad
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F
(una cola)
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
CURVA 2
0,8476
0,6803753
5
4
1,01602948
0,49403687
CURVA 3
0,8144
0,6696413
5
4
6,38823394
119
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
CURVAS DE CALIBRACION: 1-3 (ABSORBANCIAS)
Prueba F para varianzas de dos muestras
Media
Varianza
Observaciones
Grados de libertad
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F
(una cola)
CURVA 1
0,8382
0,7016717
5
4
1,04783218
0,48248508
CURVA 3
0,8144
0,6696413
5
4
6,38823394
NOTA: No se realiza la prueba F para varianzas de
dos datos para la concentración de los patrones ya son
las mismas.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
120
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
PRUEBA F PARA VARIANZAS DE DOS MUESTRAS
MUESTRAS: SETS 1-2 (ABSORBANCIAS)
Prueba F para varianzas de dos muestras
Media
Varianza
Observaciones
Grados de libertad
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F
(una cola)
SET 1
0,4616129
0,10983378
31
30
0,38065822
0,00449915
SET 2
0,80188235
0,28853647
34
33
0,54844129
MUESTRAS: SETS 2-3 (ABSORBANCIAS)
Prueba F para varianzas de dos muestras
Media
Varianza
Observaciones
Grados de libertad
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F
(una cola)
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
SET 2
0,80188235
0,28853647
34
33
1,15644927
0,33754572
SET 3
0,41694286
0,24950206
35
34
1,77740844
121
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
MUESTRAS: SETS 1-3 (ABSORBANCIAS)
Prueba F para varianzas de dos muestras
Media
Varianza
Observaciones
Grados de libertad
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F
(una cola)
SET 1
0,4616129
0,10983378
31
30
0,44021192
0,01249478
SET 3
0,41694286
0,24950206
35
34
0,55001692
MUESTRAS: SETS 1-2 (UNIDADES INTERNACIONALES)
Prueba F para varianzas de dos muestras
Media
Varianza
Observaciones
Grados de libertad
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F
(una cola)
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
SET 1
31,0645161
1063,5457
31
30
0,18526936
5,5688E-06
SET 2
86,0882353
5740,53743
34
33
0,54844129
122
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
MUESTRAS: SETS 2-3 (UNIDADES INTERNACIONALES)
Prueba F para varianzas de dos muestras
Media
Varianza
Observaciones
Grados de libertad
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F
(una cola)
SET 2
86,0882353
5740,53743
34
33
1,0842697
0,4074475
SET 3
35,5285714
5294,38151
35
34
1,77740844
MUESTRAS: SETS 1-3 (UNIDADES INTERNACIONALES)
Prueba F para varianzas de dos muestras
Media
Varianza
Observaciones
Grados de libertad
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F
(una cola)
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
SET 1
31,0645161
1063,5457
31
30
0,20088195
1,2367E-05
SET 3
35,5285714
5294,38151
35
34
0,55001692
123
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
ANÁLISIS DE LAS PRUEBAS F PARA VARIANZAS
DE DOS MUESTRAS
Partimos de la hipótesis: S1 = S2 (varianza 1 =
varianza 2) para que
esta hipótesis se cumpla F
de la prueba debe ser menor o igual (<) a F crítico.
Para las curvas de calibración: F
prueba
<
F
crítico
Curvas 1-2:
1,03130096 < 6,38823394
Curvas 2-3:
1,01602948 < 6,38823394
Curvas 1-3:
1,04783218 < 6,38823394
Para las muestras:
F prueba < F crítico
Absorbancias
Muestras 1-2:
0,38065822 < 0,54844129
Muestras 2-3:
1,15644927 < 1,77740844
Muestras 1-3:
0,44021192 < 0,55001692
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
124
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
Unidades Internacionales
Muestras 1-2:
0,18526936 < 0,54844129
Muestras 2-3:
1,0842697
Muestras 1-3:
0,20088195 < 0,55001692
< 1,77740844
Como la condición se cumple los tres sets de reactivos
son iguales.
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
125
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
CAPITULO VI
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
6.1. CONCLUSIONES:
De acuerdo a los objetivos planteados, que son:
• Evaluar los resultados obtenidos con las muestras.
• Determinar el índice de toxoplasmosis en las alumnas
de la escuela de Bioquímica y Farmacia.
• Dar
a
conocer
los
resultados
obtenidos
para
concientizar al alumnado sobre el peligro de la
enfermedad.
Para el estudio de 100 personas pertenecientes a la
Escuela de Bioquímica y Farmacia de la Universidad
de Cuenca que corresponde a la población estudiada,
se llegó a las siguientes conclusiones:
• Se hizo una preselección de las alumnas para el
respectivo análisis, mediante la realización de una
encuesta escrita (Anexos).
• La selección se hizo tomando en cuenta la
convivencia
de
las
alumnas
con
animales
domésticos principalmente el gato, que es el
huésped definitivo de Toxoplasma gondii.
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• Se efectuaron los análisis obteniéndose un título de
anticuerpos Anti-Toxoplasma gondii menor a 300
UI/ml en todas muestras, lo que indica que ninguna
de las alumnas sometidas al análisis es portadora
de T. gondii, ya que la teoría nos indica que un
título menor a este corresponde a una infección
pasada y por lo tanto no se requiere de un
tratamiento.
• Según este resultado la hipótesis planteada no se
cumple, habiendo un 0% de portadoras de T.
gondii, pero se debe tener en cuenta que los títulos
obtenidos de anticuerpos IgG-Anti T. gondii en la
práctica nos muestran que se presenta una
infección pasada o en proceso de evolución en un
gran número de alumnas.
• Sobre la técnica podemos decir, que es de fácil
realización, y una de las más empleadas para el
diagnóstico de la Toxoplasmosis, además mediante
la determinación de la prueba F para varianzas de
dos muestras se comprobó que los tres sets de
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reactivos se trabajaron de igual manera, dando
mayor seguridad a la prueba.
6.2. RECOMENDACIONES:
Como se sabe la incidencia de Toxoplasmosis a
nivel mundial es elevada, la infección por ooquistes
predomina en países tropicales, en donde hay más
contaminación fecal del suelo por heces del gato, con
predominio mayor en la ciudades, por la más estrecha
convivencia con estos animales.
Lo contrario sucede en países no tropicales, en donde
predomina la transmisión por carnes. Los factores
económicos y sociales no tienen relación especial con
este parásito, pero los culturales influyen, pues la
costumbre de comer carne cruda o mal cocida y la de
tener gatos en las casas favorecen la infección.
Para prevenir la infección en el hombre se hacen las
siguientes recomendaciones:
a) Higiene personal y familiar para evitar la
ingestión de ooquistes presentes en la tierra.
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b) Saneamiento ambiental y control de cucarachas,
moscas, etc., por la posibilidad de actuar como
vectores mecánicos.
c) Buen cocimiento de las carnes y lavado de las
manos después de manipularlas.
d) Cuidados en relación con los gatos: evitar su
alimentación
con
carne
cruda,
cuidados
especiales con sus materias fecales, control de
ratones y ratas que son fuente de infección para
los
gatos,
evitar
el
contacto
con
ellos,
especialmente los niños y las embarazadas.
Basándonos en nuestro estudio recomendamos lo
siguiente:
• Que mediante extensión universitaria se llegue
hacia los sectores en riesgo, con la finalidad de
instruir
sobre
esta
enfermedad,
sus
peligros,
consecuencias y la manera de prevenirla.
• Todas las mujeres en edad fértil deben realizarse un
examen antes de la concepción para evitar daños
al feto.
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• Fácil acceso y publicidad de prueba de laboratorio,
en el Laboratorio de Atención al público de la
Facultad para todas las estudiantes universitarias.
• Mejorar nuestros hábitos alimenticios, comer en
lugares con buena higiene.
• Tener las mascotas fuera de la casa, con una buena
higiene y manejar de manera adecuada sus
excretas; y desparasitar permanentemente a las
mismas.
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ANEXOS
1. FOTOGRAFÍAS DE LAS DIFERENTES FORMAS
DEL PARÁSITO
Figura 6. Detalle de la estructura quística ocupada totalmente por bradizoitos
de Toxoplasma gondii.
Figura 7. Taquizoitos de toxoplasma Toxoplasma gondii Note las
características en forma curva. Aunque este es un estado intracelular,
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las células contienen taquizoitos (macrogametos). Cada taquizoíto mide
aproximadamente 10 µm de longitud.
Figura 8.Otro ejemplo de Taquizoítos de Toxoplasma gondii. (Imagen Original
de Oklahoma State University, College of Veterinary Medicine.)
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Figura 9. Taquizoíto Intracelular de Toxoplasma gondii. (Imagen
Original de "Parasites in Human Tissues," Department of Parasitology,
Kyungpook National University School of Medicine, Korea.)
Figura 10. Toxoplasma gondii bradizoítos (*) en una sección de
tejido de cerebro de ratón infectado experimentalmente.
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Figura 11. Toxoplasma gondii bradizoitos (*) en una sección de tejido
de cerebro de un ratón infectado experimentalmente. Esta fase de ciclo
de vida se encuentra durante la fase crónica de la infección, y puede
encontrarse en casi cualquier órgano del cuerpo.
Figura 12. Un zoitocisto de Toxoplasma gondii junto con bradizoítos;
este zoitocisto es en el músculo cardíaco.
Figura 13. Un ooquiste esporulado de Toxoplasma gondii. El
ooquiste contiene dos esporozoitos, cada uno contiene cuatro
esporozoitos. Así, ellos se parecen el ooquistes de Isospora sp. Sólo
gatos producirán y paso el oocquistes de Toxoplasma; el diámetro
aproximado = 10µm.
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Figura 14. Un ooquiste esporulado de Toxoplasma gondii.4
4 INTERNET
http://editorial.unab.edu.co/revistas/medunab/pdfs/r24rt_c3.html
2. FOTOGRAFÍAS TOMADAS EN LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
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Figura 15. SET de Reactivos IgG Anti -Toxoplasma gondii (HUMAN).
Figura 16. Dilución de los suero 1 + 100 con Buffer de dilución.
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Figura 17. Sueros diluidos.
Figura 18. Micropocillos con antígenos de Toxoplasma gondii.
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Figura 19. Primera Etapa: cargado de estándares y sueros
diluidos en los micropocillos.
Figura 20. Primera Etapa: micropocillos cargados, incubación por 30
minutos a temperatura ambiente.
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Figura 21. Lavador automático para el equipo de ELISA.
Figura 22. Proceso de lavado: cinco ciclos.
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Figura 23. Segunda etapa: adición del conjugado Anti- IgG a todos
los pocillos acepto el Blanco, incubación por 30 minutos a
temperatura ambiente.
Figura 24. Segundo lavado: cinco ciclos.
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Figura 25. Tercera Etapa: Adición de sustrato a todos los
micropocillos con incubación en la oscuridad por 15 minutos.
Figura 26. Adición de solución de parada a todos los micropocillos,
mezclar cuidadosamente para proceder a la lectura.
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Figura 27. Lector de micro-ELISA.
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Encuesta:
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ENCUESTA PREVIA LA REALIZACION DE LA TESIS:
“Determinación de IgG Anti-Toxoplasma gondii en las alumnas de la
Escuela de Bioquímica y Farmacia de la Universidad de Cuenca”.
DATOS PERSONALES:
NOMBRES Y APELLISOS: _________________________________________
EDAD: _____________________
CICLO: _____________________
ESTADO CIVIL: _____________
CUESTIONARIO:
1. TIENE UD. MASCOTAS EN SU CASA, CUALES SON?
2. SU MACOTA PERMANECE DENTRO O FUERA DE LA CASA?
___________________________________________________________________
3. CUANTO TIEMPO TIENE SU MASCOTA?
4. PASA GRAN PARTE DE SU TIEMPO CON SU MASCOTA?
5. HAY ALGUN CASO DE TOXOPLASMOSIS EN SU FAMILIA?
GRACIAS
MARIUXI MEDINA Q.
CECILIA MUÑOZ P.
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Esquema de pipeteo:
Los reactivos y las muestras deberán estar a temperatura ambiente antes del uso.
Diluir el suero del paciente 1+ 100 con Buffer de dilución IgG, por ejemplo 10µl de
suero + 1ml de Buffer de dilución IgG y mezclar vigorosamente. Las muestras
diluidas se pueden almacenar hasta 48 horas entre 2 a 8°C. Los controles son listos
para su uso.
ETAPA 1
Pocillo (µl)
A1
B1/C1
D1/C2
Blanco
CN
CP
Muestra
Control negativo en duplicado
---
100
---
---
Cut-off (5UI/ml) en duplicado, D1/E1
---
---
100
---
CP bajo (30UI/ml) en duplicado, F1/G1
---
---
100
---
CP medio (100UI/ml) en duplicado, H1/A2
---
---
100
---
CP alto (200UI/ml) en duplicado, B2/C2
---
---
100
---
---
---
100
---
Muestra diluida
D2…
Cubrir los micropocillos en porta tiras con cintas adhesivas.
Incubar por 30 minutos a 17 o 25°C.
Lavar 5 veces: remover las cintas adhesivas. Aspirar el contenido en un envase con
solución de Hipoclorito de Sodio al 5%, agregar solución de lavado aspirar después
de aproximadamente 30’’ y repetir el lavado, remover el líquido remanente
invirtiendo los micropocillos sobre papel absorbente.
Solución de lavado de trabajo
350
350
350
350
ETAPA 2
Conjugado Anti-IgG
---
100
100
100
Cubrir los micropocillos en porta tiras con cintas adhesivas.
Incubar por 30 minutos a 17 o 25°C.
Lavar 5 veces: como se describió anteriormente.
Solución de lavado de trabajo
350
350
350
350
100
100
100
100
100
100
ETAPA 3
Reactivo substrato
100
Incubar por 15’ a 17 o 25°C 5n la oscuridad.
Solución de parada
100
Mezclar cuidadosamente Llevar a cero de absorbancia el instrumento lector de ELISA
Con el blanco de substrato en el pocillo A1.
Medir la absorbancia a 450nm lo
más pronto posible o dentro de 30 minutos, después de terminar la reacción
usando una longitud de onda de referencia de 630-690nm (si está disponible).
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BIBLIOGRAFÍA:
1. ATLAS COLOR DE PARASITOLOGÍA CLÍNICA, Viqar ZAMAN,
Editorial Panamericana, Segunda Edición, Buenos Aires, Mayo
1998.
2. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO, Bailey/Scout; Finegold/Baron.
Editorial Panamericana, Séptima edición Buenos Aires-Argentina
1.991.
3. FARMACOLOGÍA, H.P. Rang, M.M. Dale, Editorial CLAMEDES,
S.L., Segunda Edición, España. 2001.
4. INTERNET
http://editorial.unab.edu.co/revistas/medunab/pdfs/r24rt_c3.html
5. INTERNET
http://www.bvs.sld.cu/revistas/mtr/vol53_3_01/mtr04301.htm
6. INTERNET
http://www.infectio.org/upload/eve23.pdf
7. INTERNET
http://www.bvs.sld.cu/revistas/mgi/vol12_4_96/mgi07496.htm
8. LECCIONES DE PARASITOLOGÍA HUMANA, Dr., José D.
Rodríguez M., Departamento de publicaciones de la Universidad
de Guayaquil, Cuarta Edición, 1969.
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9. MEDICINA TROPICAL, Dr. Telmo Fernández Ronquillo, Imprenta
Mariscal, Quito-Ecuador, 2004.
10. PARASITOSIS HUMANAS, David Botero, Marcos Restrepo,
Tercera Edición, Medellín-Colombia, 1998.
11. QUIMICA CLINICA, Shauna C. Anderson, Ph.D., Susan
Cockayne, Ph.D., Editorial Interamericana Mcgraw-Hill, 1993.
12. VADEMÉCUM CLÍNICO DEL DIAGNÓSTICO AL TRATAMIENTO,
V. FATTORUSSO; O. RITTER, Editorial El Ateneo, Novena Edición,
España, 2004.
13.
Williams
Obstetricia,
Varios
Autores,
Editorial
Médica
Panamericana, 21° Edición; Estados Unidos, 2004.
14. Prueba ELISA para la detección de anticuerpos IgG AntiToxoplasma gondii en suero Humano (técnica proporcionada por la
casa
comercial)
referencias:
www.human.de/data/gb/vr/el-
toxog.pdf.
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