• • INSTRUCCIONES DE USO Anti-Transglutaminasa tisular IgG BINDAZYMETM Kit de Enzimoinmunoensayo MK019 Kit para diagnóstico in vitro únicamente The Binding Site sucursal en España, C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona Teléfono 902027750 Fax: 902027752 e-mail: [email protected] web: www.bindingsite.es 1 UTILIZACIÓN Este kit está preparado para la medición in vitro de anticuerpos antitransglutaminasa tisular (tTG) IgG específicos presentes en el suero humano, como ayuda en el diagnóstico de la enfermedad celíaca. Se suministra material suficiente para analizar un máximo de 41 muestras por duplicado o bien 89 en un único ensayo, con una curva de calibración y 2 controles. 2 INFORMACIÓN GENERAL La enfermedad celíaca se caracteriza por una intolerancia al gluten que conduce a un desorden crónico de malabsorción debido a la inflamación de la mucosa intestinal y a que el epitelio intestinal se vuelve plano1. Los criterios revisados para el diagnóstico de la enfermedad celíaca, según la ESPGAN (European Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition) 1990, requieren la identificación de una biopsia intestinal positiva junto con la presencia de al menos dos de los siguientes anticuerpos IgA: anticuerpos antiendomisio IgA3, anticuerpos anti-gliadina IgA e IgG4 y anticuerpos antireticulina. INHIBIDOR CONCENTRACIÓN Kathon Azida sódica ProClin™ 300 Bromonitrodioxano Metilisotiazona 0.02% 0.099% 0.045% 0.002% 0.002% ProClin™ es marca registrada de of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Spanish Producto fabricado por: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk cabo dichos procedimientos. La azida sódica puede provocar la formación de azidas explosivas en contacto con el cobre y plomo de los desagües. Al eliminar los reactivos dejar correr abundantes cantidades de agua para evitar la formación de dichos compuestos. Los tampones y suero suministrado con este kit contienen diversos inhibidores enzimáticos, como se indica a continuación. Deben manipularse con precaución. • Kathon es irritante y puede causar sensibilización por contacto con la piel. La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M, que es irritante. Evite el contacto con la piel y los ojos para evitar quemaduras. Derrames de reactivo deben limpiarse adecuadamente, según las normativas locales y medioambientales. 4.2 ADVERTENCIAS • Este producto debe ser utilizado únicamente por personas correctamente entrenadas. • Se recomienda seguir el protocolo de forma estricta. Cualquier desviación puede afectar a la funcionalidad de este ensayo y a los resultados obtenidos. Ponga especial atención a los avisos y “Notas” que encontrará en estas instrucciones de uso. • NO se pueden intercambiar calibradores, controles, conjugados y placas de distintos lotes. La sustitución de estos componentes con lotes que difieran de los incluidos en el kit puede conducir a resultados inconsistentes e imprecisos. Deben tomarse todas las tiras del mismo envoltorio.. • Utilice únicamente material plástico o de vidrio limpio para evitar la contaminación de los reactivos. Nunca devuelva reactivos no utilizados a los viales. • No deje viales de reactivo abiertos; cualquier posible contaminación o evaporación dará resultados inconsistentes. • El sustrato TMB no debe ser expuesto a la luz o al agua. • Muestras hemolizadas, lipémicas, con material particulado o contaminación microbiana no deben ser utilizadas. • No se puede comprobar una posible dilución de muestra incorrecta ya que los controles están listos para su uso. Se recomienda la utilización de pipetas calibradas y muestras CQ internas apropiadas. • La utilización de sistemas automáticos, dilutores de muestra u otro equipo automatizado puede llevar a diferencias en los resultados cuando se compara con el procedimiento manual. Cada laboratorio es responsable de validar el sistema completo y asegurar que los resultados entran dentro de los límites indicados en esta hoja de instrucciones y el certificado QC asociado. • Todo el equipamiento ha de ser calibrado y mantenido según las instrucciones del fabricante. 4.3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Diversos estudios demuestran que el ensayo anti-endomisio IgA tiene una especificidad superior al 99% para enfermedad celíaca y una sensibilidad superior a los ensayos de anticuerpos anti-gliadina y anti-reticulina5,6. Es importante incluir un ensayo para anticuerpos IgG ya que es común la deficiencia de IgA entre los pacientes celíacos, lo que puede provocar la aparición de resultados falsos negativos en individuos con biopsia intestinal confirmada7,8. La utilización de transglutaminasa tisular recombinante como fuente de antígeno se revisa en las referencias 9 y 10, y la evaluación de transglutaminasa tisular como antígeno de elección se revisa en las referencias 11 y 12. 3 PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos se encuentran sensibilizados con transglutaminasa tisular recombinante tTG. El antígeno ha sido expresado en células de Baculovirus a partir de un ADN complementario que codifica para una isoforma larga de la tTG humana. Los calibradores, controles y muestras diluidas de pacientes se añaden a los pocillos y los autoanticuerpos que reconocen el antígeno tTG se unen durante la primera incubación. Tras el lavado de los pocillos para eliminar las proteínas no unidas, se añade un conjugado de conejo purificado anti-IgG (específico de cadena γ) humana marcado con peroxidasa. El conjugado se une al anticuerpo humano capturado y el exceso de conjugado no unido se elimina mediante un lavado posterior. El conjugado unido se visualiza con el sustrato 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina (TMB) que da un producto de color azul cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en la muestra. Se añade ácido fosfórico a cada pocillo para parar la reacción, lo que produce un color amarillo final que se lee a 450 nm. 4 PRECAUCIONES 4.1 AVISOS • Todos los donantes de suero humano suministrado en este kit han sido analizados para la presencia de HBsAg, HIV1 y HIV2 y HCV, con resultados negativos. De todos modos dichos ensayos no pueden asegurar la ausencia de dichos agentes infecciosos, por tanto deben establecerse procedimientos adecuados para la manipulación y eliminación de material potencialmente infeccioso, y únicamente personal con entrenamiento adecuado debe llevar a • • • 5 • • • • 6 El kit debe conservarse a 2-8ºC y no debe congelarse. Temperaturas de conservación no adecuadas afectarán a los resultados. El tampón de lavado diluido puede conservarse a 2-8ºC durante un máximo de 4 semanas y puede utilizarse directamente de la nevera sin que las características del ensayo se vean afectadas. La fecha de caducidad de este kit se muestra en la etiqueta exterior. OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS Las muestras de sangre se han de obtener por venopunción, dejar que coagule de modo natural y separar el suero. El suero puede conservarse a 2-8ºC hasta 7 horas antes del ensayo13, o para periodos superiores, ha de alicuotarse y conservarse a -20ºC. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. Las muestras de suero no deben ser inactivadas por calor ya que esto puede ocasionar resultados falsos positivos. MATERIALES 6.1 MATERIAL SUMINISTRADO • Hoja de instrucciones: Indica todos los detalles del ensayo. • Certificado QC: Indica la funcionalidad esperada del lote. • Pocillos sensibilizados con Transglutaminasa humana: 12 tiras de 8 pocillos separables, sensibilizados con tTG recombinante. La placa se suministra en una bolsa que puede volver a cerrarse y que contiene dos bolsas de desecante. • Diluyente de muestra tipo lll: 2 botellas con 50mL de tampón para dilución de la muestra. Listo para uso. Coloreado en amarillo. • Tampón de lavado tipo lll: 1 botella con 50mL de tampón concentrado 20 x para el lavado de los pocillos. • Calibradores de Transglutaminasa IgG: 5 viales cada uno con 1mL de suero humano diluido, con las siguientes concentraciones de autoanticuerpo antitTG: 100, 33, 11.1, 3.7, 1.23 U/mL. Listo para uso. • Control positivo Transglutaminasa IgG: 1 vial con 1mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso. • Control negativo Transglutaminasa IgG: 1 vial con 1mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso. Insert Code: E019.E, Version: 5 December 2006, Page 1 of 4 • Conjugado Transglutaminasa IgG: 1 vial con 12 mL de anticuerpo humano purificado IgG marcado con peroxidasa. Color rojo. Listo para uso. 4. Lavado Repita el paso 2. • SustratoTMB: 1 botella con 14mL de sustrato TMB. Listo para uso. 5. • Solución de parada: 1 botella con 14 mL de ácido fosfórico 3M. Listo para uso. Adición del sustrato (TMB) Dispense 100µL de sustrato TMB en cada pocillo, seque la parte superior de los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: Nunca devuelva cantidades sobrantes de TMB a la botella de reactivo, para evitar su contaminación. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. 6. Parada Dispense 100µL de solución de parada en cada pocillo. De este modo se produce un cambio de color de azul a amarillo. 7. Medición de la densidad óptica Lea la densidad óptica (OD) de cada pocillo a 450nm en un lector de microplacas, dentro de los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. 6.2 MATERIAL ADICIONAL Y EQUIPO NO SUMINISTRADO • • • • • • 7 Lavador automático de microplacas: Su uso es recomendable, aunque las placas pueden lavarse manualmente. Lector de microplacas: Capaz de medir densidades ópticas a 450nm en referencia al aire. Agua destilada o desionizada: Ha de ser de la calidad más alta disponible. Micropipetas calibradas: Para dispensar 1000, 100 y 10µL. Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de 100µL de conjugado, solución sustrato y solución de parada. Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de la muestra. METODOLOGÍA DE ENSAYO 7.1 PASOS PRE-ENSAYO 1. • • Lleve el kit a temperatura ambiente Los kits están diseñados para su uso a temperatura ambiente (20-24°C). Retire el kit de la cámara frigorífica y déjelo a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. Los pocillos no deben sacarse de su envoltorio hasta que hayan alcanzado la temperatura ambiente. NOTA: los kits pueden mantenerse a temperatura ambiente hasta una semana. 2. Componentes del kit Mezcle cuidadosamente cada componente del kit antes de su uso. 3. Dilución del tampón de lavado Añada 50mL del tampón de lavado concentrado a 950mL de agua destilada (dilución 1 a 20) en un recipiente limpio y mezcle. NOTA: El tampón de lavado diluido puede conservarse hasta 4 semanas a 2-8ºC, por tanto diluya únicamente la cantidad necesaria. Si el tampón muestra signos de contaminación microbiana o se vuelve turbio, elimínelo y prepare solución fresca. 4. 5. Dilución de la muestra Diluya 10µL de cada muestra con 1000µL de diluyente de muestra (1:100) y mezcle bien. NOTA: La muestra diluida debe utilizarse dentro de las 8 horas siguientes a la dilución. Manipulación de tira y marco Coloque el número de pocillos necesarios en el soporte de las tiras. Posicione a partir del pocillo A1, rellenando las columnas de izquierda a derecha a través de la placa. Cuando manipule la placa, apriete los bordes largos del marco para evitar que los pocillos caigan fuera. NOTA: Vuelva a colocar inmediatamente los pocillos no utilizados en su envoltorio junto a las dos bolsitas de desecante, y séllelo fuertemente para minimizar su exposición a la humedad. Tenga cuidado de no perforar o rasgar el envoltorio, ver más abajo. ATENCIÓN: La exposición de los pocillos a la humedad o a contaminación por polvo u otro material particulado provocará la degradación del antígeno, dando como resultado una precisión pobre del método y potencialmente resultados falsos. 8 1. • • • Cálculo de densidades ópticas medias (Solo para ensayos que se lleven a cabo en duplicado) Calcule la media de DO de las lecturas duplicadas para cada calibrador, control y muestra. El %CV para cada duplicado de DO ha de ser inferior al 15%. 3. Trazado de la curva de calibración Se puede trazar la curva de calibración de modo manual o automático, con los valores de concentración de autoanticuerpo anti-tTG IgG en la escala log frente a la DO en la escala lineal, para cada calibrador: Automático – utilice un software adecuado y validado y el ajuste de curva que mejor se adapte a los datos. Manual – utilice papel gráfico log/lineal y dibuje una curva suave a través de los puntos (no una línea recta o punto a punto). • • 4. Tratamiento de puntos anómalos Si alguno de los puntos no entra en la curva, puede eliminarse. Si la ausencia de dicho punto implica que la forma de la curva es distinta a la curva de calibración de muestra, o más de un punto parece ser anómalo, el ensayo debe repetirse. 5. Cálculo de los valores de control Lea el nivel de autoanticuerpo anti-tTG IgG de la curva de calibración. El valor debe entrar dentro del rango indicado en el certificado QC. 6. Cálculo del nivel de autoanticuerpo en las muestras diluidas Lea el nivel de autoanticuerpo anti-tTG IgG en las muestras diluidas directamente de la curva de calibración. Nota: Los valores de calibrador han sido ajustados en un factor de 100 para tener en cuenta la dilución de la muestra 1:100. Por tanto, no hace falta ninguna corrección posterior. 7. Calibración del ensayo El ensayo se encuentra calibrado en U/mL frente a un calibrador de referencia arbitrario, ya que no existe en la actualidad una preparación de referencia reconocida internacionalmente. 8. • Limitaciones Este kit se utiliza únicamente como ayuda en el diagnóstico. Un resultado positivo sugiere la presencia de ciertas enfermedades, que deben confirmarse mediante otros resultados serológicos y la historia clínica del paciente. Los resultados de este ensayo no son una prueba diagnóstica de la presencia o ausencia de enfermedad. No se ha establecido el uso de este ensayo y el rango normal (interpretación de resultados) para muestras pediátricas. Un resultado negativo no descarta la enfermedad celíaca y las muestras deben ensayarse también para anti-tTG tipo IgA. Mantenga la misma secuencia de dispensación durante todo el proceso. 2. Adición de la muestra Dispense 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida (1:100) en los pocillos adecuados de la placa. Nota: Las muestras deben añadirse lo más rápidamente posible a la placa para minimizar la deriva del ensayo, y conectar el timer tras la adición de la última muestra. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavado El procedimiento de lavado es crítico y requiere una atención especial. Un lavado inadecuado de la placa dará resultados inexactos, con una precisión pobre y fondos elevados. Tras la incubación retire la placa y lave 3 veces con 250-350µL de tampón de lavado por pocillo. Puede lavar la placa con un lavador de placas automático o manualmente como se indica a continuación. Después del último lavado automático, invierta la placa y golpee los pocillos sobre papel secante. Las placas pueden lavarse de modo manual como sigue: a. Sacuda el contenido de la placa en un fregadero b. Golpee los pocillos sobre papel secante c. Pipetee 250-350µL de tampón de lavado en cada pocillo con una pipeta multicanal d. Agite la placa suavemente en una superficie plana e. Repita a-d dos veces. f. Repita a y b. 3. Control de calidad Para que un ensayo sea válido se han de cumplir los siguientes requisitos: Se han de incluir calibradores y controles positivo y negativo en cada ensayo. El valor obtenido para el control positivo y negativo ha de entrar en el rango especificado en el certificado QC. La forma de la curva ha de ser similar a la curva de calibración que se muestra en el certificado QC. Si estos requisitos no se cumplen el ensayo no es válido y debe repetirse. 2. 7.2 METODOLOGÍA DE ENSAYO 1. RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD • • • 9 VALORES ESPERADOS Se determinó el rango normal a partir de sueros de 200 donantes de sangre adultos normales. Estos rangos se indican únicamente como una guía. Los ensayos ELISA son muy sensibles y capaces de detectar pequeñas diferencias en muestras de poblaciones. Por tanto es recomendable que cada laboratorio determine sus propios rangos de normalidad, basado en la población, técnicas y equipo utilizado. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Negativo <6 U/mL Positivo débil 6 - 9 U/mL Positivo >9 U/mL Adición del conjugado Dispense 100µL de conjugado en cada pocillo, seque la parte superior de los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: No devuelva cantidades que sobren de conjugado al vial original del reactivo, con el fin de evitar su contaminación. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Insert Code: E019.E, Version: 5 December 2006, Page 2 of 4 10 CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO 10.1 10.6 PRECISIÓN Se añadió una serie de sustancias interferentes a muestras anti-tTG IgG negativas y positivas, y se analizaron posteriormente. El método utilizado para comprobar dichas sustancias se basó en el kit Interference Check A plus Kokusai Shiyaku, Japón. Se midió la precisión intra-ensayo utilizando 6 muestras en el rango de la curva de calibración. Se muestra a continuación el %CV para cada una: PRECISIÓN INTRA-ENSAYO Concentración (U/mL) 4,5 7,5 13,5 21,9 29,3 87,9 n=20 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 % CV 5,7 5,3 5,2 3,5 4,3 5,2 Se midió la precisión inter-ensayo utilizando 6 muestras ensayadas en duplicado seis veces durante tres días. El %CV para cada muestra se indica a continuación: PRECISIÓN INTER-ENSAYO Concentración (U/mL) 4,3 7,8 14,4 23,7 31,9 82,2 n=6 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 10.2 % CV 10,1 8,8 6,9 11,0 7,6 9,3 10.7 RANGO DE MEDIDA 10.4 10.8 2. tTG IgG normal sample distribution 3. 4. 5. 6. No. of samples 200 150 7. 100 8. 50 9. 0 <1.23 1.23 - 1.9 1.9 - 3.0 3.1 - 4.0 tTG IgG U/mL 10. 11. Además, se ensayaron 40 muestras de pacientes con enfermedad de Crohn (n=21) y colitis ulcerosa (n=19). Todos fueron negativos para autoanticuerpos anti-tTG IgG. 10.5 ESPECIFICIDAD, SENSIBILIDAD Y CORRELACIÓN RELATIVA La especificidad, sensibilidad y correlación relativa se determinaron frente al resultado de la biopsia, utilizando 35 sueros de pacientes de enfermedad celíaca. Biopsia + BINDAZYME + 26 2a b Anti-IgG tTG EIA 0 7 Sensibilidad relativa 78.8% Correlación relativa 74.3% a. b. 1 de 2 se clasificaron como positivo débil. 2/7 también negativos para IFA endomisio, 5/7 fueron negativos en un kit ELISA alternativo. La especificidad, sensibilidad y correlación relativa se determinaron frente a los ensayos anti-IgA y anti-IgG utilizando 56 muestras de biopsia de celíacos confirmados y de muestras de donantes de sangre normales. BINDAZYME Anti-IgG tTG EIA Sensibilidad relativa Especificidad relativa Correlación relativa + - BINDAZYME Anti-IgA tTG EIA + 31 2a b 14 9 77.5% 87.5% 80.4% a. Positivo IgG, negativo IgA, una muestra fue de un paciente con deficiencia de IgA conocida, el estatus IgA de la otra muestra era desconocido. La utilización del ensayo tTG IgG permite la detección de estas muestras. b. 8/9 muestras fueron positivos fuertes IgA tTG y 1/9 fue positiva débil, confirmando que una proporción de pacientes solo produce anticuerpos IgA. 19.3mg/dL Bilirrubina C (Conjugada) 19.9mg/dL Hemoglobina Hemolizada 485mg/dL Quilo 1550 Unidades Factor reumatoide 45 UI/mL LINEARIDAD DEL ENSAYO ESTUDIOS DE PROZONA Para estudiar un posible efecto prozona se diluyeron tres muestras positivas 1:6.25 (dilución normal 1:100) en diluyente de muestra. No se observaron resultados falsos negativos a las diluciones de muestra inferiores, por lo que no se observó efecto prozona. 11 RANGO NORMAL Se ensayaron autoanticuerpos anti-tTG IgG en suero de 200 donantes de sangre adultos normales. En base a la guía de interpretación de resultados, 0/200 fueron positivos para autoanticuerpos anti-tTG IgG. Concentración Se ensayo la linearidad con tres muestras distribuidas en el rango de calibración. El coeficiente de regresión R2 fue superior a 0.995 comparando el valor observado con el esperado en U/mL, con una recuperación media del 92%. 1. El rango de medida del ensayo es 1,23 - 100 U/mL. Sustancia Bilirrubina L (Libre) No se observaron interferencias en ninguna de las muestras ensayadas. SENSIBILIDAD ANALÍTICA La sensibilidad del ensayo es de 1,23 U/mL se confirmó ensayando dos muestras en múltiples replicados con valores 1.4 y 2.2 veces el punto inferior de calibración (1,23 U/mL). El análisis estadístico con la t de Student confirmó que dichas muestras eran significativamente diferentes una de otra (p<0.0001). 10.3 SUSTANCIAS INTERFERENTES 12. 13. REFERENCIAS Trier, JS. Celiac Sprue. The New England Journal of Medicine 1991; 24: 17091719. Walker Smith J A et al. Revised criteria for the diagnosis of celiac disease: Report of working group of European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood. 1990; 65: 909-911. Valdermarsson T et al. Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science. 1996; 41:83-87. Bürgin-Wolff et al. Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Archives of Disease in Childhood 1991; 66: 941-947 Volta U et al. IgA anti-endomysial antibody test: A step forward in celiac disease screening. Digestive Diseases and Science. 1991; 36:752-756. Grodzinsky E. Hed J, Skogh T. IgA anti-endomysial antibodies have a high predictive value for celiac disease in asymptomatic patients. Allergy. 1994; 49:593-597. Collin P et al. Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand J. Gastroenterol 1992; 27(5), 367-371. Cataldo F. et al. IgG1 antiendomysium and IgG anti-tissue Transglutaminase (anti-tTG) antibodies in coeliac patients with selective IgA deficiency. Gut. 2000; 47:366-369. Sulkane S et al. Tissue Transglutaminase Autoantibody Enzyme linked Immunosorbent Assay in detecting Celiac Disease. Gastroenterology. 1998; 115:1322-1328. Sollid LM and Scott H. New tool to predict Celiac Disease on its Way to the Clinics. Gastroenterology. 1998; 115:1584-1594. Dieterich W et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of Celiac Disease. Nature Medicine. 1997; 3:797-801. Dieterich W et al. Autoantibodies to Tissue Transglutaminase as Predictors of Celiac Disease. Gastroenterology. 1998; 115:1317-1321. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. 12 PLANTILLA DE PLACA Vea la parte posterior de la hoja de instrucciones. Resumen del procedimiento 1. Añada 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida 1:100 en los pocillos correspondientes. Incube durante 30 minutos. Lave. 2. Añada100µL de conjugado a cada pocillo. Incube durante 30 minutos. Lave. 3. Añada 100µL de sustrato a cada pocillo. Incube durante 30 minutos. 4. Añada 100µL de solución de parada a cada pocillo. Mida la absorbancia a 450 nm. BINDAZYME™ es marca registrada de The Binding Site Ltd. P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB. England Insert Code: E019.E, Version: 5 December 2006, Page 3 of 4 Plantilla de placa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Insert Code: E019.E, Version: 5 December 2006, Page 4 of 4