Establecimiento de un protocolo experimental para determinar la

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. 1, 2005.
Establecimiento de un protocolo experimental
para determinar la adherencia in vitro
de lactobacilos a las células intestinales
Anaís Prats, Ramón Boucourt* y Luis Ducat.**
Centro de Investigaciones Clínicas, Calle 34 No. 4501, esquina a Calle 45, Reparto Kohly, Playa, Ciudad de La Habana. *Departamento de Biotecnología, Subdirección de Fisiología y Bioquímica, Instituto de Ciencia Animal. **Departamento de Compuestos Marcados, Centro de Isótopos, Cuba.
Recibido: 30 de enero de 2003.
Aceptado: 26 de septiembre de 2003.
Palabras clave: lactobacilos, adherencia, probióticos, células intestinales, microorganismos.
Key words: lactobacillus, adherence, probiotic, intestinal cells, microorganisms.
RESUMEN. El objetivo del presente trabajo fue establecer un protocolo experimental para la determinación de la adherencia in vitro a células intestinales, mediante el uso de aminoácidos marcados con tritio. Se conformaron
seis combinaciones a partir de dos medios de cultivo, 3H-alanina y 3H-leucina
para el marcaje de los lactobacilos, que sirvieron como punto de partida para
un diseño completamente aleatorizado con seis repeticiones para seleccionar la variante óptima. Se estudió la estabilidad del marcaje de los
lactobacilos, el efecto de la actividad sobre ellos, así como la influencia del
tiempo de incubación a 37 °C sobre su adherencia en una suspensión de
células intestinales de cerdos sanos. Se desarrollaron ensayos para determinar la dinámica de supervivencia de las células intestinales de cerdo, en los
cuales se alcanzó una satisfactoria supervivencia durante 4 h en estabilizador fosfato a pH = 7,2 y 4 °C . El medio semisintético con 50 µL de 3H-alanina,
fue el seleccionado como óptimo para el marcaje del lactobacilo con una adecuada incorporación del isótopo. La liberación de la actividad al medio fue
de menos del 2 % en 4 h, sin daños significativos para los lactobacilos con
los niveles de actividad utilizados. Se fijó un tiempo de incubación de 20 min
para el ensayo de adherencia y se utilizó un método indirecto para su determinación. Los resultados permitieron establecer un protocolo experimental
para la valoración de la adherencia de lactobacilos a las células intestinales
de cerdos utilizado el método de los indicadores radiactivos.
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ABSTRACT. The aim of the present work was to establish an experimental protocol for the determination of in vitro adherence by means of
tritium-labeled compounds. Six combinations of culture media, 3 H-alanine and 3 H-Leucine were studied for lactobacillus labeling, which were
employed as points of a completely randomized experimental design with
six repetitions to determine the optimal variant. Stability of the label,
the effect of activity levels on lactobacillus viability, as well as the influence of incubation time at 37 °C on labeled lactobacillus adherence to
healthy swine intestinal cells were studied. Assays to determine the survivor dynamics of intestinal swine cells were performed. Satisfactory
levels of survivor of intestinal cells were achieved for 4 h, in phosphate
buffer pH = 7.2 at 4 °C . Semisynthetic media with 50 µL of 3 H-alanine
was the optimal for lactobacillus labeling, attaining satisfactory levels
of isotope uptake. Less than 2 % of activity within 4 h was delivered to
the culture media, without any significant damage to lactobacillus for
used activity levels. Incubation time was fixed at 20 min for adherence
assay and indirect method was used for its determination. Conclusions:
An experimental protocol for the assessment of lactobacillus adherence
to intestinal cells using the method of radioactive indicators was established.
INTRODUCCION
En el mundo se está desarrollando en los últimos tiempos una tendencia a utilizar la terapia natural,
como alternativa al uso de los antibióticos. Dentro de este marco se
inserta el uso de los probióticos,
como una forma de combatir las enfermedades sin introducir ninguna
sustancia química que no forme
parte normal del intestino. 1 En
Cuba, como parte de los esfuerzos
por desarrollar esta línea, se está
trabajando por primera vez en la
obtención y uso de compuestos biológicos con características probióticas para cerdos y aves.
La capacidad de un microorganismo de adherirse a las células intestinales, es una característica determinante, para que pueda ser utilizado como probiótico. La determinación de la adherencia a las células intestinales in vitro, resulta una
vía adecuada en el proceso de selección de microorganismos potenciales probióticos, como paso previo a
las pruebas in vivo.2 Hasta el momento, en el país no estaba establecida ninguna variante segura para
lograr este propósito. Contar con
una forma segura para determinar
la adherencia in vitro, significa un
ahorro considerable, pues reduce el
número de cepas a probar en los
estudios in vivo, con el consiguiente gasto de recursos y tiempo.
Para la determinación de la adherencia in vitro, se han empleado
técnicas de microscopia, tanto de
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. 1, 2005.
contraste de fase3,4 como electrónica,5,6 técnicas de ELISA,7 marcaje de
los microorganismos con biotina y
compuestos quimioluminiscentes.8,9
Estos procedimientos presentan
como desventajas la elevada dependencia de la habilidad del técnico
que realice el ensayo; el ser sólo útiles en un reducido número de microorganismos y el efecto dañino
del marcaje sobre la célula bacteriana, respectivamente.10
En los últimos años, el marcaje
metabólico de las bacterias usando
radioisótopos, para determinar el
valor absoluto de la adhesión bacteriana a las células, se convirtió en
una variante muy útil y popular.10
Su limitación responde a cuestiones
de seguridad en el trabajo con radiaciones. Tiene la ventaja que el resultado es independiente del técnico que realice el ensayo. Ibrahim AS
y colaboradores11 plantean que para
elevadas concentraciones de microorganismos, es preferible emplear
esta variante, en lugar de otras que
dependan de la apreciación humana.
Entre los radionucleidos más
empleados para el marcaje de células bacterianas se encuentra el
tritio, como radioisótopo del hidrógeno. Su incorporación a una molécula orgánica no altera las propiedades químicas de ésta, por lo que
como trazador, su presencia física
no varía las características del sistema que se estudia. Los métodos
de marcaje radioisotópico de aminoácidos con este radionucleido son
ampliamente conocidos, y es posible obtener una elevad actividad específica sin grandes complicaciones
desde el punto de vista de la protección radiológica.12
Dentro de los aminoácidos
esenciales para los lactobacilos,
la leucina y la alanina están entre los de mayores requerimientos para este tipo de microorganismo. 13
El objetivo de este trabajo fue
establecer un protocolo experimental para la determinación de
la adherencia in vitro de lactobacilos a células intestinales utilizando aminoácidos marcados con
tritio.
MATERIALES Y METODOS
Cepa de lactobacilo utilizada en el
estudio
Cepa B/103-1-5: Lactobacillus
acidophilus (Universidad OLZTYM,
Polonia). Esta cepa presenta características de crecimiento, estabilidad adecuada frente a ácidos y bi-
lis, que condicionan su potencialidad como probióticos. La cepa fue
incubada a 37 °C, temperatura óptima para su crecimiento.
Se empleó como inóculo un cultivo con un contenido de lactobacilos de 108 UFC/mL . El volumen
utilizado, correspondió a la décima
parte del volumen total de medio de
cultivo empleado.
Marcaje de lactobacilos utilizando
aminoácidos tritiados
Se conformaron seis combinaciones de medio de cultivo y aminoácidos tritiados:
1. Medio semisintético14 + 25 µL 3Halanina + 25 µL 3H- leucina
2. Medio semisintético14 + 50 µL 3Hleucina
3. Medio semisintético14 + 50 µL 3Halanina
4. Medio Rogosa + 25 µL 3H- alanina
+ 25 µL 3H- leucina
5. Medio Rogosa + 50 µL 3H- leucina
6. Medio Rogosa + 50 µL 3H- alanina
Alanina: actividad específica de
4 662 MBq/mmol (98 % de pureza
radioquímica). Leucina: actividad
específica de 3 330 MBq/mmol (96 %
de pureza radioquímica).
Se inoculó un mililitro de cada
medio y se incubó durante 18 h a
37 °C . Se centrifugó a 3 700 r/min
durante 10 min . Se separó el sobrenadante y el precipitado se lavó con
disolución estabilizadora de fosfato
(pH = 7,2) y se resuspendió en esta
disolución.
Se midió la actividad de 5 µL de
muestra en 5 mL de líquido de centelleo Scintran (BDH) sobre base
dioxano. La determinación se realizó en contador de centelleo líquido
durante 60 s .
Se empleó un diseño completamente aleatorizado con seis repeticiones por tratamiento. Se realizó un análisis de varianza simple, según la
dócima de Duncan, p < 0,05 empleando el programa SPSS V. 5.02 para
Windows.
Determinación de la liberación de
la actividad al medio en el tiempo
El pellet del lactobacilo suspendido en estabilizador fosfato fue
centrifugado a 3 700 r/min y se midió la actividad del sobrenadante en
el tiempo con intervalos de media
hora durante 4 h .
Efecto de las radiaciones sobre el
crecimiento de los lactobacilos
Se determinó el valor de densidad óptica como criterio del crecimiento de los lactobacilos desarrollados en medio de cultivo con 0,93;
7,70 y 13,88 MBq de actividad total,
producida por los aminoácidos
tritiados. Se utilizó como control el
crecimiento de los lactobacilos en
medio sin radiactividad.
Toma de muestras y tratamiento
de las células intestinales del cerdo
Los animales utilizados fueron
cerdos sanos de 10 semanas de
edad, que se encontraban en ayuno
durante 24 h . El ayuno se llevó a
cabo para eliminar restos de alimentos que hacen más difícil la manipulación del tracto digestivo, pero
sobre todo, para eliminar los lactobacilos que estuvieran adheridos
a las células intestinales, como
parte de la flora normal del intestino.
El sacrificio se llevó a cabo por
conmoción e inmediatamente, se
les extrajo el aparato digestivo. El
intestino delgado fue abierto con
tijeras y lavado con disolución salina fisiológica (NaCl, 0,9 %) para evitar la muerte de las células. Se raspó superficialmente la mucosa intestinal con un portaobjetos en un ángulo de 45 ° y la muestra se suspendió en
50 mL de estabilizador fosfato (pH
= 7,2). Todo el trabajo y la transportación de las células se llevó a cabo
a 4 °C . La suspensión celular se obtuvo con agitación suave en homogenizador. La obtención de poco
material celular por el método utilizado, se compensó centrifugando
la suspensión obtenida en condiciones de refrigeración.
El número de células se determinó por la técnica para el conteo celular reportada por Bird y Forrester. 15 Se realizó cada dos horas el
conteo a la suspensión celular original, mantenida a 4 °C y se determinó la viabilidad (%) en el tiempo.
Ensayo de adherencia
Se incubaron 500 µL de la suspensión de microorganismos marcados con 3H-alanina en estabilizador fosfato con 500 µL de la suspensión de células a 37 °C . Se probaron tiempos de incubación entre 5
y 30 min, para obtener el óptimo de
incubación. Después de centrifugar
las muestras a 600 r/min durante
1 min, se midió la actividad del sobrenadante al inicio y al cabo de estos tiempos. Se determinó la disminución de la actividad en el sobrenadante. El porcentaje de microorganismos adheridos fue proporcional a esta disminución de la actividad.
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RESULTADOS Y DISCUSION
Marcaje de lactobacilos utilizando
aminoácidos tritiados
Los resultados obtenidos durante el marcaje de los lactobacilos con
aminoácidos tritiados permitieron
detectar la radioactividad sin una
lisis previa de estos (Tabla 1).
No se obtuvieron diferencias significativas entre la variante 1 y 3
(p < 0,05), debido a la menor actividad específica alcanzada durante el
proceso de marcaje de la leucina-3H
respecto a la alanina-3H.
Las diferencias entre la utilización de la alanina-3H o la leucina-3H
solas, se deben, en primer lugar, a
la actividad alcanzada para esta última durante el marcaje, pero además, encuentran explicación en las
concentraciones de estos aminoácidos presentes en la pared de estos
microorganismos. El contenido de
leucina presente en la pared de los
lactobacilos, es menor que el de
alanina13 y se corresponde con la actividad encontrada para cada uno.
Las características de las partículas
ß− del tritio permiten afirmar que la
radioactividad hallada en los microorganismos, sin previa ruptura de
su estructura, corresponde a la parte más externa de estos, pues la pared actúa como blindaje de la actividad contenida en su interior.
El comportamiento de las variantes 4, 5 y 6 viene dado, porque
en el medio Rogosa, al ser más completo nutricionalmente, se tiene una
mayor dilución del isótopo radiactivo, además, el crecimiento es mayor. Utilizar alguna de estas variantes, implicaría trabajar con menores actividades específicas en el resto del ensayo, lo que atentaría contra los niveles de detección en los
pasos siguientes del método.
El número de conteos obtenidos
al medir el pellet de lactobacilos sin
lisar, permite que la determinación
de la actividad, se lleve a cabo sin
ese paso. Si se tiene en cuenta que
en este caso, el isótopo está siendo
utilizado como señalización para de-
tectar la adherencia a las células intestinales, resulta una gran ventaja
para el desarrollo de la técnica, el
que no haya necesidad de lisar
para determinar actividad en el
sistema.
Los mejores resultados en el
marcaje de los lactobacilos, se obtuvieron con las variantes 1 y 3.
Desde el punto de vista económico,
resulta menos costoso utilizar un
solo aminoácido tritiado, por lo que
con estas condiciones de actividad
de los compuestos tritiados, resulta más factible emplear la variante
del medio semisintético con 50 µL
de alanina-3H para el marcaje de los
lactobacilos.
En estos estudios, donde el microorganismo va a hacer la función
de sonda, resulta de extraordinaria
importancia, garantizar que la marca radiactiva permanezca en él, al
menos durante el tiempo que demore el ensayo. Las variaciones de actividad durante los tiempos probados fueron de menos del 2 %, por lo
que es posible concluir, que no hay
una pérdida considerable de actividad en el pellet de lactobacilos.
Conway y col.16 obtuvieron resultados similares para bacterias ácido
lácticas marcadas con aminoácidos
tritiados en un intervalo de 3 h .
No se encontraron afectaciones
en la supervivencia de estos lactobacilos frente a los niveles de actividad probados en los experimentos. El resultado obtenido corrobora lo reportado para este género,
que los considera como microorganismos muy resistentes a las radiaciones. Se ha reportado que a partir
de 2 690 MBq empiezan a morir algunos lactobacilos a las 24 h .17 Este
nivel de actividad, se encuentra
muy por encima de los alcanzados
en este trabajo.
Establecimiento de las condiciones
para el mantenimiento celular
Resulta difícil que las cepas indígenas sean desplazadas de las células por las cepas administradas.
Tabla 1 Actividad específica detectada en el pellet de lactobacilo sin lisar.
No.
44
Tratamientos
Actividad específica
(cpm/UFC) · 10-5
1
Medio semisintético + 3H-Ala + 3H-Leu
81,1 ± 2,0
2
Medio semisintético + 3H-Leu
16,1 ± 0,3
3
Medio semisintético + H-Ala
82,6 ± 3,0
4
Medio Rogosa + 3H-Ala + 3H-Leu
9,31 ± 0,20
5
Medio Rogosa + 3H-Leu
1,44 ± 0,05
6
Medio Rogosa + 3H-Ala
9,89 ± 0,08
3
Jonson E y col.18 obtuvieron resultados negativos en las cepas de lactobacilos administradas a cerdos
sanos canulados en el intestino, los
que fueron atribuidos a la incapacidad de dichas cepas para desplazar
a la flora autóctona. Según estos autores en animales con disturbios en
la flora intestinal, la situación es diferente.18 El ayuno prolongado provoca estos disturbios y aumenta la
probabilidad de que las células colectadas, no tengan ocupados los sitios de adhesión.
A 4 °C se han obtenido buenos
resultados en el mantenimiento de
la viabilidad celular, sobre todo, para
trabajar en condiciones que no requieran un mantenimiento celular
prolongado.2
Se determinó la supervivencia
en el tiempo de las células intestinales a las condiciones de mantenimiento. Dentro de las cuatro primeras horas más del 88 % de ellas se
mantienen viables, lo que permite
utilizar esta suspensión durante
este tiempo sin mayores contratiempos.
Determinación de la adherencia
del lactobacilo a las células intestinales del cerdo
En los diferentes ensayos de determinación de adherencia in vitro,
se utilizaron tiempos de incubación
entre 5 y 30 min .10 A partir de los
resultados obtenidos para estos
tiempos, se estableció un tiempo de
incubación de 20 min como el más
adecuado.
En la separación de las bacterias
no adheridas de las que sí lo están a
las células, se emplea filtración o soporte sólido. En el caso de los ensayos en los que se utilizan suspensiones celulares, la filtración ha sido
la variante más utilizada.2
Para hacer efectiva esta separación, se recurrió a la centrifugación.
El proceso de centrifugación logra
la separación en función de la diferencia en los pesos específicos. La
diferencia entre el peso específico
de los lactobacilos y las células es
grande, lo que en principio haría
posible la separación por esta vía.
Esta alternativa le imprime mayor
dinamismo a la determinación
cuando el número de muestras es
grande y además, disminuye los
costos, pues los filtros adecuados
pueden ser utilizados una sola vez.
Se estableció que centrifugando a
600 r/min durante un minuto se logra esta separación.
Se utilizó un criterio indirecto en
la determinación de la adherencia,
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. 1, 2005.
a partir de la disminución de la actividad en el sobrenadante. Esta disminución es proporcional a la actividad adherida a las células. Este
procedimiento fue utilizado con éxito por Ibrahim y col.,11 al tener dificultades para determinar directamente el número de microorganismos adheridos.
Al analizar la cepa B/103-1-5,
cuando se determinó la adherencia
a las células intestinales del cerdo
con las condiciones seleccionadas:
tiempo de incubación de 20 min y separación por centrifugación a 600 r/
min durante 1 min, la disminución
de la actividad en el sobrenadante
fue de un 37 %, proporcional al número de lactobacilos adheridos. De
esa forma, puede decirse que esta
cepa presenta un 37 % de adherencia de los lactobacilos a las células
intestinales.
Holzapfel WH y col.19 consideran
que aquellas bacterias que presenten una adherencia positiva de, al
menos, el 10 %, son las deseadas
para los estudios posteriores como
probióticos. No es éste el único criterio que existe al respecto, pero sí
el más estricto. De acuerdo con este
criterio, la cepa de Lactobacillus
acidophilus B/103-1-5 se presenta
como promisoria para llevar a cabo
los estudios in vivo y comprobar así,
sus potencialidades como probiótico.
Como resultado del presente trabajo, se obtuvo un procedimiento
relativamente sencillo que puede
ser aplicado para determinar la adherencia in vitro de lactobacilos a
las células intestinales. Este método, que no existía con anterioridad
en el país, brindaría la posibilidad
de probar in vitro las cepas bacterianas, para determinar las de mejores condiciones para los ensayos
in vivo como probióticas, lo cual implica ahorro de tiempo y recursos.
CONCLUSIONES
Los resultados han permitido establecer un protocolo experimental
para la valoración de la adherencia
in vitro de lactobacilos a las células
intestinales de cerdos utilizado el
método de los indicadores radiactivos con gran ahorro de tiempo y
recursos, a la hora de determinar
cepas probióticas.
9.
10.
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