ANÁLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS

ANÁLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS
ANTIGUOS
Andrea SMERLING Eduvigis SOLÓRZANO, Nancy DÍAZ, Rafael MONTIEL,
Eduard CHIMENOS y Assumpció MALCOSA
Introducción
Ya sea como jefe de tribu, curandero, chamán, mago o médico, a lo largo de la historia el hombre
ha adoptado diferentes formas y métodos para enfrentarse, conocer y combatir la enfermedad. Ha sido
la curiosidad, el interés o el instinto de supervivencia lo que aún hoy moviliza a mirar tanto hacia
delante como hacia atrás en busca de respuestas. Conocer las enfermedades en el pasado, la morbilidad,
el impacto en el ecosistema y los cambios evolutivos hasta llegar a la patología actual son argumentos de
suficiente peso para sustentar su interés en investigarlos (Campillo, 1993: 21-37)
La importancia del estudio de las diferentes lesiones asociadas a los dientes radica no solo en el
conocimiento de la salud buco-dental de una determinada población, sino en la información que aporta
al conocimiento de la dieta y hábitos existentes tanto de las poblaciones actuales como antiguas y
prehistóricas (Perea e. al. 2000)
La caries es la más común de las enfermedades dentales y es referida con relación a las
poblaciones arqueológicas con llLás frecuencia que otras lesiones buco-dentales (Roberts y Manchester,
2000). Otras alteraciones dentales comúnmente descritas son los depósitos de sales cálcicas en el cuello y
en algunas porciones de la corona de los dientes, producto de la mineralización de la placa bacteriana,
constituyendo auténticos cálculos. Su presencia se constata en todas las épocas (Campillo, 1993;
Linossier et al. 1996: 1005-1014) e indudablemente influye en el desarrollo de la enfermedad periodontal.
Estudiar el desarrollo de las enfermedades infecciosas orales a través del tiempo mediante la
observación de la caries, el cálculo dental y su relación con los agentes microbianos qLle las producen
puede proporcionar una valiosa información respecto al origen y subsistencia de estos procesos
(Chilenos y Martínez, 1998: 25-33).
Los estudios paleodontológicos, al igual que la mayoría de estudios paleoantropológicos son
principalmente morfológicos. Sin embargo, en las últimas dos décadas, el análisis de ADN se ha
convertido en una herramienta efectiva, versátil y accesible para Lm numeroso grupo de científicos.
Actualmente, el reciente desarrollo biotecnológico permite recoger diferentes datos genéticos de
poblaci<mes antiguas utilizando restos arqueológicos. Este nuevo campo de investigación presenta todas
las potencialidades para poder contribuir sustancialmente a la comprensión de nuestra historia evolutiva
(Capella et al. 2003: 59-64). La capacidad de las biomoléculas en el hueso yen los dientes de sobrevivir
largos períodos de enterramiento ha brindado esta oporttmidad.
ADN antiguo
El estudio de secuencias de ADN obtenido de organismos extintos, ADN antiguo (aDNA), abre
nuevas posibilidades en la recuperación de información genética proveniente del pasado, dando la
oportunidad de analizar la evolución molecular a través de largos períodos de tiempo. Actualmente el
grado de desarrollo de esta disciplina ha generado un campo autónomo dentro de la moderna biología
molecular, definiéndose corno "arqueología molecular" (Cooper y Wayne 1998: 49-53; Taylor, 1996: 283285).
En general, se trata de un material genético muy degradado, fragmentado y susceptible de
contaminarse con ADN moderno, por lo que se aplican métodos particularmente delicados que
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APORTAC10NES, METODOLOGÍAS y DESARROLLO TECNOLÓGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS ÉPOCAS
permiten, a pesar de la naturaleza de las muestras, recuperar pequeños fragmentos de ADN,
habitualmente menores de 200 pares de bases (pb). Por ello resulta necesario establecer criterios estrictos
de esterilización que garanticen la autenticidad de los resultados obtenidos, siendo imprescindible un
laboratorio exclusivamente dedicado al trabajo de aDNA y la consecuente separación física de los
procesos de pre-PCR, que implica la extracción y preparación de la reacción de amplificación y post-PCR
destinado al análisis de las muestras amplificadas (Ibídem).
Las dificultades inherentes a la utilización de PCR al amplificar pequeñas cantidades de ADN
dañado están siendo aún consideradas, en particular el riesgo de contaminación y accidentes en el
proceso de amplificación, dando lugar a resultados falso-positivos (Martínez et al. 1999: 195-213; Paabo,
1989: 1939-1943; Paabo et al. 1989: 9709-12). Se han llevado a cabo numerosas adaptaciones en los
procedimientos de extracción de ADN, eliminación de inhibidores a través de pasos de purificación y
protocolos de PCR con la finalidad de aumentar la calidad y cantidad del producto amplificado (Pusch et
al. 2002: 351-364; Montiel, 2001; Malgosa et al. 2005)
Streptococcus mutans
La caries dental es, actualmente, una de las enfermedades más prevalentes que padece el hombre
moderno. Esta prevalencia ha ido aumentando progresivamente con el avance de la civilización
coincidiendo con el incremento en el consumo de azúcar de caña y harinas refinadas (Roberts y
Manchester, 2000; Lerman, 1942: 29-36).
Décadas de estudios epidemiológicos, bioquímicos y experimentales con animales han implicado
a Streptococcus mutans como el principal agente causal de la caries dental humana. Aunque 200-300
especies bacterianas se encuentran asociadas a la placa dental, solo la presencia del Streptococcus mutans
ha sido consistentemente ligada a la formación de la caries (Sato et al. 2003: 66-69; Lindhe, 2001; Dzagana
et al. 2002: 14434-14439). La elevada potencialidad cariogénica de S. mutans es parcialmente atribuible a
su capacidad de acumularse sobre los dientes mediante la formación de glucanos extracelulares
(dextranos) sintetízados a partir de la sacarosa, predominantemente polímeros, que se forman a partir de
una mitad de la molécula de sacarosa por glicosiltransferasas presentes en la superficie del
microorganismo.
El Streptococcus mutans es un gran productor de la enzima dextranasa (Dex), la cual hidroliza las
uniones de las moléculas de glucanos sintetizados por la glucosiltransferasa Por consiguiente, la Dex
sería un importante factor de virulencia (Morisaki et al. 2002: 223-227; Igarashi et al. 2001: 341-348;
Igarashi et al. 1996: 294-298). Precisamente el gen responsable de este enzima se ha utilizado con
frecuencia para identificar y diferenciar el Streptococcus mutans. Recientemente, la utilización de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la secuencia genética de la dextranasa ha sido
desarrollada y aplicada con éxito para la identificación de este microorganismo (Redmo et al. 2003: 24-29;
Igarashi et al. 1996: 294-298).
El objetivo de este trabajo consiste en optimizar la técnica de extracción y amplificación del ADN
de Streptococcus mutans antiguo a partir de restos antiguos, siendo este integrante del grupo mutans el
organismo principalmente implicado en el desarrollo de la caries y componente de la placa bacteriana. A
partir del material genético extraído en distintas muestras se pretende observar la eventual
homogeneidad o heterogeneidad de las secuencias
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ANÁLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS
Material y métodos
Muestras
Se han analizado un total de 24 muestras pertenecientes a distintas series arqueológicas españolas
custodiadas en el laboratorio de Paleoantropología de la Universidad Autónoma de Barcelona:
S'Illot des Porros (Mallorca): siglo VI-II aC.
Can Reiners (Mallorca): siglo VII.
Esglesia San Pere (Terrassa, Barcelona): siglos V-XII.
Colección UAB (Granollers ,Barcelona): principios de siglo XX).
Además, dos grupos dentales de:
Tlatelolco: Ciudad de México, Post-clásico Tardío, siglo XV- principios del siglo XVI.
Los Olmos: Hidalgo,Colonial Tardío, siglo XIX.
Los dientes presentaban distintas lesiones: caries oclusal, caries cervical, dentina periférica a caries
(dentina desorganizada) y cálculo, obteniéndose el material de cada una de ellas.
Prevención de contaminación
Se tomaron estrictas precauciones para evitar la contaminación durante los procesos de
extracción y PCR para garantizar la fiabilidad de los resultados. Los mismos fueron realizados en
laboratorios independientes diferenciando proceso de extracción y post-PCR. Los reactivos fueron
preparados con soluciones estériles e instrumental de vidrio, siendo todo el material autoclavado dos
veces e irradiado con rayos UV (254 nm) antes de su utilización. La manipulación durante todo el trabajo
en laboratorio se realizó con guantes desechables, que se fueron cambiando frecuentemente en los
diferentes pasos durante todo el proceso, indumentaria estéril y mascarillas. En todos los proceso de
extracción y de amplificación fueron incluidos controles de contaminación.
Extracción de ADN, Tratamiento de las muestras
Dado que el objetivo primordial de este trabajo ha sido la optimización de una técnica que
permita amplificar ADN de Streptococcus mutans de restos antiguos, algunos pasos fueron modificándose
a lo largo de todo el estudio en función de los resultados, con el objeto de aumentar la eficiencia del
método.
Este trabajo se realizó siguiendo la metodología básica y utilizada habitualmente en el
laboratorio de ADN antiguo de la Unidad de Antropología, Departamento de Biología Animal, Biología
Vegetal y Ecología. UAB (Malgosa et al. 2005). Las extracciones se realizaron en grupos de 3 a 6 muestras
y un control negativo que contiene solo los reactivos (blanco de extracción o KE), para el control de la
contaminación.
Obtención de las muestras
Las muestras de caries, dentina y cálculo dental se obtuvieron dentro de una campana de flujo
laminar, utilizando un juego de instrumental diferente (fórceps, fresas redondas para instrumental
rotatorio, pinza de algodón) para cada una de las muestras (Figs. 1, 2 Y3). El cálculo dental se obtuvo de
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APORTACIONES, METODOLOG[AS y DESARROLLO TECNOLÓGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS ÉPOCAS
forma manual, utilizando curetas Gracey de periodoncia; la caries y la dentina con instrwnental
rotatorio: piedras de diamante y fresas redondas de carburo de tungsteno.
El aislamiento de ADN se realizó por una lisis previa con EDTA (quelante de cationes divalentes)
para desestabilizar las membranas e inhibir las DNAsas, y un detergente que produce finalmente la lisis
de la membrana citoplasmática (SDS), constituyendo esto el tampón de extracción, al cual se le incorpora
proteinasa K (Rodríguez et al. 2002: 80-88). Siguiendo este principio, se colocaron 5 mI de tampón de
extracción y 50 111 de proteinasa K en cada tubo, incluyendo el blanco de extracción (KE), el cual se trató
como una muestra más. Algunas de las muestras se lavaron con EDTA previo a la colocación del
tampón. Las muestras fueron incubadas a 37° durante toda la noche.
La extracción de ADN se realizó en tres pasos con fenal, fenal-cloroformo y cloroformo, Este
proceso se consigue mediante cinco etapas de centrifugación de entre 45 y 60 minutos en el cual los
lípidos quedan en el fenal (fase orgánica), los ácidos nucleicos en la fase acuosa y las proteínas en la
interfase. El cloroformo contribuye a retirar todo el fenal de la fase acuosa. Posteriormente se realiza el
filtrado y la concentración utilizando centricón 30 (Millipore®). El extracto así obtenido se almacena a
4°C durante 3 días quedando preparado para su amplificación mediante PCR.
Los primers utilizados han sido diseñados en nuestro laboratorio a efectos de este trabajo. Se
trata de un fragmento de 12~ pb específico para la especie S. mutans, que se corresponde con el gen de la
dextranasa. Los primers fueron diseñados con el programa PrimerDesign v. 1.10 (Napiwotzki, 1995) La
selección final de los primers se basó en el análisis de primer-dimers, utilizando el programa Primer
(Montiel, 2001) y verificando las posibilidades de hibridación con secuencias de otras especies mediante
el programa BLAST 2.2.9 (Altschul et al. 1997: 3389-3402) en el GenBank.
El proceso de PCR se llevó a cabo siguiendo los principios bifásicos de amplificación adaptados
para aDNA. El programa del termociclador consistió de un ciclo inicial de desnaturalización de 5
minutos a 94° C, 39 ciclos de desnaturalización de 50 segundos a 94° C, 1 minuto a temperatura de
"annealing" (hibridación o emparejamiento de primer) optimizada entre 54 y 56° C y finalmente
estandarizada en 55°; y 1 minuto de extensión a 72° C, terminando con un ciclo de extensión final de 5
minutos a 72° C, finalizando con la temperatura de almacenamiento a 4° C. El producto amplificado fue
analizado por medio de electroforesis en gel de agarosa a13% y visualizado a través de UV. (Fig. 4)
Secuencias del producto amplificado
El producto de PCR obtenido fue purificado con el fin de eliminar los residuos del tampón de
extracción así como de los primers, siguiendo la metodología de Montiel (2001), modificando
temperaturas y tiempos, lo que contribuyó a obtener un producto purificado de mejor calidad. El
producto purificado, se secuenció en el Servicio de Secuenciación de la Unidad de Microbiología de la
UAB, utilizando un secuenciador automático Alf-express (Phannacia) (Fig. 5). Las secuencias fueron
alineadas utilizando la base de datos del GenBank (NCBI) con el programa BLAST (Ibidem)
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi.
Resultados
Al ser ésta la primera experiencia en el aislamiento de ADN de S. mutans en restos antiguos,
muchos de los pasos del protocolo de extracción fueron modificándose a fin de obtener mejores
resultados. Se realizaron 8 extracciones en grupos de entre 3 y 6 muestras. La temperatura de
hibridación de los primers o annealing se estipuló en 55° C y 2111 de ADN en suspensión, como el
volumen indicado a utilizar en las amplificaciones.
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ANÁLlsrs DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS
Una vez confirmada la posibilidad de recuperar el ADN del microorganismo, los procedimientos
se orientaron a mejorar la calidad del producto final.
Limpieza previa de la muestra
Un grupo de extracción de 5 muestras no se lavaron con hipoclorito de sodio antes de comenzar
el procedimiento; solo fueron limpiadas con un cepillo de dientes y aclaradas con agua destilada, para
eliminar los restos de material provenientes de la excavación, en estos casos, no se obtuvo resultados
positivos. Tal vez, restos de material orgánico de la excavación actuaron como inhibidores del la PCR, y
de esta forma inutilizaron las muestras.
Estas muestras también se amplificaron con primers específicos de diferentes fragmentos de
ADN mitocondrial (humano) especialmente diseñados para aDNA (125 pb) con el fin de verificar la
presencia de ADN (careciendo de importancia el origen de éste) y así constatar de que las muestras
fueran viables y considerarlas como resultados negativos, pero tampoco hubo resultados, confirmando
la hipótesis de la presencia de gran cantidad de sustancias inhibidoras de la PCR. La metodología
utilizada fue ligeramente distinta y podría haber influido en la eficiencia de la extracción.
El lavado con EDTA tampoco fue determinante en la obtención de resultados.
Respecto al volumen del extracto
En algunos casos el volumen final de extracción superaba el volumen ideal. Tal vez partículas de
muestra que no hubieran sido lo suficientemente disueltas en el tampón de extracción obstruyeron parte
de la membrana del centricón 30 impidiendo de esta forma un total filtrado. Se decidió re-concentrar
estas muestras. Este proceso consiste en repetir la fase de centrifugado en iguales condiciones. En este
paso, si bien se obtiene un ADN más concentrado, también se corre el riesgo de aumentar la
concentración de los inhibidores de la PCR, además, otro riesgo de la reconcentración es el de la
contaminación. Es por esto que es preciso reconcentrar también el blanco de extracción. Como se ha
citado anteriormente, el blanco de extracción para el control de la contaminación es tratado como una
muestra más.
A pesar de estas consideraciones, de las tres muestras reconcentradas dos amplificaron con muy buenas
bandas. Esto podría indicar que la reconcentración sería una opción a tener en cuenta. Cuando el
volumen de la muestra sobrepasara excesivamente los 25¡.11, y si los resultados no fueran óptimos, la
posibilidad de no perder estas muestras justificaría el riesgo de una reconcentración.
Reamplificación
Tres de las muestras que resultaron positivas se re-amplificaron, a fin de conseguir mejor calidad
de bandas. Este proceso consiste en volver a someter el producto ya amplificado al termociclador (PCR)
con iguales características (master mix y programa de PCR), no obstante, los resultados no fueron
significativos.
Resultados finales
De un total de 24 muestras, de las cuales 5 fueron inutilizadas por la presencia de inhibidores, se
obtuvieron resultados positivos en 11
8 de las muestras que resultaron positivas, se purificaron y fueron secuenciadas. Las secuencias
obtenidas se introdujeron en la base de datos BLAST para alinearlas con las secuencias del S. mutans y
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APORTAClONES, METODOLOGíAS Y DESARROLLO TECNOLÓGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS ÉPOCAS
de otros microorganismos depositados en esta base de datos, resultando secuencias homólogas sólo con
el Streptococcus mutans en un 95%.
Discusión
El ADN acumula daños bioquímicos con el transcurso del tiempo y en consecuencia la molécula
se degrada, alterándose la secuencia y la información genética (Lanteri y Contalonieri). Algunos autores
afirman que la asociación íntima del ADN con moléculas más resistentes puede protegerlo de la
degradación. Diversos análisis confirman la capacidad del ADN para asociarse con superficies
minerales, y que esta unión puede conferirle una protección hasta 100 veces mayor contra las DNAsas.
Por lo tanto, el ADN no se perdería con la mineralización en el proceso de fosilización, sino que sería
absorbido en los minerales que reemplazan a las biomoléculas. En concreto se ha propuesto (persson,
1992: 33-34; Tuross, 1993; Nielsen et al. 1994) que el ADN se preserva mejor en tejidos con alto contenido
de hidroxiapatita. El ADN presenta una gran afinidad por este compuesto (Sambrook et al. 1989) al que
podría unirse con gran rapidez, quedando protegido de las enzimas líticas. Esto podría explicar por qué
el ADN sobrevive mejor en los dientes (Gusta et al. 1994: 13) ya que el esmalte y la dentina presentan un
alto contenido de hidroxiapatita
En principio, el ADN'recuperado de dientes puede proceder tanto del propio individuo como de
aquellos agentes bacterianos que colonizan la cavidad bucal por lo que es posible "a priori" identificar
bacterias de la flora bucal como Streptococcus mutans. La identificación molecular de microorganismos
está basada en diferentes estudios en los cuales se ha demostrado que es posible la recuperación de
material genético antiguo de organismos patógenos en suficiente calidad y cantidad utilizando primers
específicos y obteniendo productos de amplificación de aproximadamente 100-200 pb que proporcionan
una alta sensibilidad técnica para detectar aDNA (Perea et al. 2002; Zink et al. 2003: 359-367; Baron et al.
1996: 667-671; Zink et al. 2001: 355-356; Montiel et al. 2003: 413-414; Solórzano et al. 2003).
De todas las bacterias bucales, los estreptococos han sido los más exhaustivamente estudiados.
Actualmente es indiscutible el rol de Streptococcus mutans en el inicio y avance de la caries dental
(Linossier et al. 1996: 1005-1014; Sato et al. 2003: 66-69; Lindhe 2001; Dragana et al. 14434-14439; Morisaki
et al. 2002: 223-227; Igarashi et al. 2002: 193-196; 2001: 341-348; 1996: 294-298; Redmo et al. 2003: 24-29).
Distintos estudios han demostrado la especificidad en la obtención de ADN de Streptococcus mutans en
muestras actuales utilizando primers que amplifican fragmentos del gen de la dextranasa (Morisaki et al.
2002: 223-227; Igarashi et al. 2002: 193-196; 2001: 341-348; 1996: 294-298; Redmo et al. 2003: 24-29).
La molécula de dextranasa esta constituida por un péptido (Sp), una región estable (CR) y dos
regiones variables (nVR y cVR). La región estable es la responsable de la actividad enzimatica, y se
observa homología de esta región con el resto de Streptococci (S. dowenei, S. salivarius, S. sobrinus, etc)
(Igarashi et al. 2001: 341-348). En contraste, las regiones variables no presentan homología, el tamaño de
nVR y eVR es diferente entre las especies y no son funcionalmente importantes (Morisaki et al. 2002: 223227; Igarashi et al. 2002: 193-196; 2001: 341-348). Así pues las diferencias en la constitución de la
dextranasa permiten obtener un producto amplificado específico de Streptococcus mutans, en estas
regiones.
La región amplificada (344-467) no presenta homologías significativas con secuencias de ninguna
otra especie, según análisis con el programa BLAST 2.2.9 (Altschul et al. 1997: 3389-3402) en el GenBank.
En este gen, aparentemente no existen dominios conservados, según análisis con el programa üRF
Finder del NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/ gorf.html). Sumado a esto, la alineación
de las secuencias obtenidas a partir del producto amplificado con respecto al genoma de Streptococcus
mutans,
utilizando
la base
de
datos BLAST
(Altschul et al.
1997: 3389-3402)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) presenta una homología del 95%.
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ANÁLISIS DE ADN DE STREPTOCOCClIS MlITANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS
Estos resultados pueden considerarse válidos teniendo en cuenta las condiciones experimentales
estrictas del laboratorio que permiten evitar riesgos y garantizar los resultados.
En primer lugar, se han tomado medidas de prevención de contaminación con ADN de
microorganismos modernos, de la inhibición de la Taq polimerasa durante el proceso de PCR y de la
amplificación de productos no específicos: esterilización extrema de todo el material, lavado de las
muestras con hipoclorito de sodio yagua antes de su manipulación, y procesamiento paralelo de
numerosos blancos de control. Debe tenerse en cuenta además que en el laboratorio de aADN de la UAB
jamás se había trabajado con Streptococcus mutans antes de esta experiencia.
En base a estos resultados estamos en condiciones de afirmar que el aislamiento de ADN de
Streptococcus mutans en restos antiguos es posible. Dado que no se ha manipulado jamás información
genética de este microorganismo en nuestro laboratorio, los resultados positivos obtenidos se deben a la
presencia de ADN en las muestras procesadas. Por otro lado, las modificaciones realizadas al protocolo
de extracción del laboratorio de aDNA de la U.AB. con la finalidad de optimizar la recuperación de
ADN de Streptococcus mutans mejoraron la calidad del producto amplificado.
Hasta la fecha no se ha encontrado en la literatura ninguna prueba que especifique la obtención
de ADN de bacterias de la cavidad bucal en restos antiguos. Dado que el aislamiento de ADN de
Streptococcus mutans en estos restos es posible, se establece en el presente estudio experimental el primer
precedente del aislamiento de este microorganismo en restos antiguos.
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APORTACIONES, METODOLOGÍAS Y DESARROLLO TECNOLÓGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS ÉPOCAS
Figura 1
Figura 2
Figura 3
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ANÁLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS
Figura 4
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Figura 5
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